專利名稱：重組γ－干擾素預(yù)防和治療奶牛隱性乳房炎的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)多肽藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
根據(jù)IFN蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞來源，可將IFN分為兩類即I型IFN和II型IFN。I型IFN又分為α、β兩個亞型，分別由白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，它們作用于同一受體，可抑制病毒DNA和蛋白質(zhì)合成，活化NK細(xì)胞，促進(jìn)MHC I類分子提呈抗原。II型干擾素又稱γ-干擾素或免疫干擾素，主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，與I型干擾素相比有著多種生物學(xué)活性。自八十年代初人的γ-IFN首先被克隆表達(dá)后，許多動物如牛、羊、豬、鹿、鼠、犬、兔、海豚的γ-IFN相繼被克隆。Cerretti(1986)首先克隆出牛γ-IFN后，國際上對利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組牛γ-IFN(rBoIFN-gamma)的研究開始興起，先后利用CHO細(xì)胞(Hogan，1993)、釀酒酵母(Krupnova，1995)、cos-7細(xì)胞(Beyer，1998)、PGEX-5X-1融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Kashima，1999)、巴斯德畢赤氏酵母系統(tǒng)(Weclock，2000)、牛I型皰疹病毒載體(BHV-1)(Raggo，2000)、昆蟲細(xì)胞和家蠶細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)(MuraKami，2001)表達(dá)出有生物學(xué)活性的rBoIFN-gamma，而且在流產(chǎn)布魯氏菌病、牛的嗜血桿菌病、大腸桿菌性乳房炎、李氏桿菌病、毛癖菌病、牛白血病、牛病毒性腹瀉、牛皰疹病毒感染、立克次氏體病、牛焦蟲病等諸多疾病的預(yù)防和治療中顯示出一定的效果。Pighetci(1996)證實(shí)rBoIFN-gamma作為乳房炎免疫反應(yīng)的佐劑非常有效，Wedlock(2000)用rBoIFN-gamma乳房內(nèi)灌注也證實(shí)可以激活和增強(qiáng)乳腺中白細(xì)胞的殺菌能力，盡管這方面研究報道不多，但在牛乳房炎的預(yù)防和控制方面開辟了一條新的途徑。目前，國內(nèi)在對牛rBoIFN-gamma的研究方面幾乎空白，奶牛乳房炎和其他一些疾病的控制僅僅依靠藥物和疫苗，不僅效果不明顯，而且存在耐藥性、藥物殘留、免疫失敗等諸多方面的缺陷，因此，利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)rBoIFNgamma，并應(yīng)用于牛乳房炎的控制和作為疫苗使用的佐劑，不失為一條高效、經(jīng)濟(jì)、安全的途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案1.在原核系統(tǒng)中表達(dá)奶牛γ-IFN基因，獲得具有治療和預(yù)防奶牛隱性乳房炎的細(xì)胞活性因子設(shè)計(jì)合適的引物，從奶牛脾臟淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞總mRNA，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出BovIFN-γ成熟肽段cDNA，并克隆進(jìn)PGEX-6P-1(pharmacia公司)載體質(zhì)粒中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)篩選得到陽性克隆，37℃培養(yǎng)和加入0.5mM的IPTG誘導(dǎo)，使γ-IFN基因表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，分子量16KD，與理論值相符。
將工程菌大量培養(yǎng)并表達(dá)γ-IFN，取培養(yǎng)上清用超聲波裂解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，在VSV-MDBK細(xì)胞系統(tǒng)上通過細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)按常規(guī)測定其干擾素抗病毒效價。
將本研究中所獲得的rBovIFN-γ，經(jīng)親和層析純化，將純化產(chǎn)品應(yīng)用于患隱性乳房炎的奶牛，進(jìn)行預(yù)防和治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案2.利用真核細(xì)胞酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)rBovIFN-γ將上述克隆到的BovIFN-γ基因，通過酶切插入酵母高效表達(dá)載體PIC9K(Invitrogen公司)，經(jīng)篩選得到陽性克隆，27℃培養(yǎng)，使γ-IFN基因表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，分子量16KD，與理論值相符。
將工程菌大量培養(yǎng)并表達(dá)γ-IFN，取培養(yǎng)上清用超聲波裂解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，在VSV-MDBK細(xì)胞系統(tǒng)上通過細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)按常規(guī)測定其干擾素抗病毒效價。
將本研究中所獲得的rBovIFN-γ，經(jīng)親和層析純化，將純化產(chǎn)品應(yīng)用于患隱性乳房炎的奶牛，進(jìn)行預(yù)防和治療。
本發(fā)明的技術(shù)方案3.將上述克隆到的BovIFN-γ基因，通過酶切插入pcDNA3(Invitrogen公司)表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到陽性克隆。制備含BovIFN-γ基因的pcDNA3質(zhì)粒DNA，通過轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，使γ-IFN基因表達(dá)，取培養(yǎng)上清在VSV-MDBK細(xì)胞系統(tǒng)上通過細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)按常規(guī)測定其干擾素抗病毒效價。
將表達(dá)BovIFN-γ基因的pcDNA3質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大量培養(yǎng)，通過堿變性法大量純化制備質(zhì)粒DNA。以純化質(zhì)粒DNA直接注射奶牛乳腔，使其在乳腺細(xì)胞中表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防和治療作用。
乳房炎的控制的關(guān)鍵是加快乳腺中嗜中性白細(xì)胞的吞噬和殺菌能力，加快病原菌的清除，從而減輕炎癥反應(yīng)，避免乳腺腺體組織進(jìn)一步的損傷。本發(fā)明的效果是γ-干擾素具有增強(qiáng)乳腺中白細(xì)胞的吞噬力、殺菌力和趨化作用的功能，同時可有效激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，維持CTL和B細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)MHC II類分子的表達(dá)，促進(jìn)APC細(xì)胞向Th細(xì)胞遞呈抗原，增強(qiáng)乳腺中各種免疫細(xì)胞的活性，加快乳腺中病原菌的清除，從而能有效起到預(yù)防和治療乳房炎的作用。
具體實(shí)施例方式
1.引物設(shè)計(jì)及合成上游引物P15，--GGGGAATTCCAGGGCCAATTTTTTAGA--3，含EcoRI酶切位點(diǎn)和3個保護(hù)性堿基，下游引物P25，--GCAGGCAGGAGGACCATTACGTTGA--3，P1與P2間橫跨整個ORF去除信號肽后的成熟肽編碼區(qū)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為440bp左右，引物由寶(大連)生物工程公司合成。
2.淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)及總RNA的提取無菌采集初生犢牛脾臟，按常規(guī)制取脾淋巴細(xì)胞，并經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離，然后用含10％小牛血清的DMEM液37℃5％CO2培養(yǎng)1h，棄去貼壁的單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106/ml，加入500μg/ml PHA，于41℃5％CO2培養(yǎng)10h后收集細(xì)胞，按Gibco公司Trizol試劑提供的程序提取總RNA，取2μl用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，取5μl用于甲醛變性凝膠電泳觀察其完整性，其余置于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.RT-PCR擴(kuò)增采用Access RT-PCR試劑盒一步法擴(kuò)增奶牛γ-干擾素基因在DEPC處理PCR管中依次加入無RNAse水11μl、AMV/TFI5×Buffer 5μl、引物P1 1μl(50Pmol)、引物P21μl(50pmol)、25mM MgSO4 1μl，彈勻后瞬時離心，加入AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl、TFI DNA聚合酶0.5μl、總RNA 5μl，瞬時離心，加入25μlRNAse Free礦物油后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR程序如下48℃反轉(zhuǎn)錄45min，94℃2min，然后94℃1min→55℃1min→72℃2min 40個循環(huán)，72℃7min，4℃10min，反應(yīng)結(jié)束后取5μl產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。
4.奶牛γ-干擾素基因的克隆和序列測定RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后用QIAquick瓊脂糖回收試劑盒進(jìn)行回收，按常規(guī)與Pucm-T Vector進(jìn)行連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落轉(zhuǎn)接種含Amp的LB培養(yǎng)液中37℃搖蕩過夜，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，利用Pucm-T Vector外源片段插入位點(diǎn)上游酶切位點(diǎn)具一個EcoRI的特點(diǎn)，用EcoRI單酶切鑒定，挑取反向插入陽性重組質(zhì)粒，接種半固體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)后直接寄送寶(大連)生物工程公司進(jìn)行測序。
5.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的陽性質(zhì)粒和PGEX-6P-1質(zhì)粒分別用EcoRI、NotI雙酶切，回收后按常規(guī)連接，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，通過氨芐青抗性和EcoRI、NotI雙酶切篩選陽性質(zhì)粒。將篩選到的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，挑取單個菌落接種于含100μg/ml氨芐青的LB中37℃搖震過夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接種于含100μg/ml氨芐青的2×γT培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)3h后，加入終濃度為0.5mM的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)5h，收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌，經(jīng)PBS洗滌后懸浮于1/10體積的PBS中，加等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10min，按常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。重組菌誘導(dǎo)離心后進(jìn)行超聲波裂解(300W，3S，180次)，4℃12000g離心15min后各取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，以確定融合蛋白以何種形式存在，并運(yùn)用薄層掃描技術(shù)對上清中的目的蛋白進(jìn)行含量分析。
6.重組干擾素抗病毒活性測定取重組菌誘導(dǎo)后的超聲裂解上清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，在VSV-MDBK細(xì)胞系統(tǒng)上通過細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)按常規(guī)測定其干擾素抗病毒效價，步驟如下向生長于96孔板上的MDBK細(xì)胞單層加入倍比維持液稀釋的裂解上清，每個稀釋度兩孔，于37℃作用24小時，吸去上清，每孔接種100個TCID50的VSV，37℃吸附2h，棄去病毒液，加入1％維持液繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對照孔出現(xiàn)100％病變，觀察各孔細(xì)胞病變，以能抑制50％細(xì)胞病變的樣品的最高稀釋度定義為1單位干擾素。
有效劑量105U/乳區(qū)動物試驗(yàn)數(shù)據(jù)患乳房炎的產(chǎn)奶奶牛，四乳區(qū)中有一個乳區(qū)發(fā)生乳房炎，乳汁黃白色，擠出時含絮狀物，經(jīng)多種抗生素和中藥反復(fù)治療無效，乳房炎診斷液檢測為++++，采用重組γ-干擾素105U乳池內(nèi)灌注，治療后14天，明顯好轉(zhuǎn)，乳房炎診斷液檢測為++。
藥效證明判定方法用藥前后分別采集2ml乳汁，于平皿內(nèi)滴加等量乳房炎診斷液(自行配制)，搖晃10s后根據(jù)其凝集情況出現(xiàn)與否及凝集程度，并進(jìn)行前后對比，判斷療效。
權(quán)利要求
1.一種重組γ-干擾素的應(yīng)用，其特征在于以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BovIFN-γ基因，將BovIFN-γ基因與PGEX-6P-1連接，以其表達(dá)融合蛋白作為制備奶牛隱性乳房炎預(yù)防和治療的藥物。
2.一種重組γ-干擾素的應(yīng)用，其特征在于將BovIFN-γ基因克隆到酵母高效表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，獲得陽性克隆，并大量表達(dá)基因產(chǎn)物，通過親和層析純化，大量制備表達(dá)產(chǎn)物，作為制備奶牛隱性乳房炎預(yù)防和治療的藥物。
3.一種重組γ-干擾素的應(yīng)用，其特征在于將BovIFN-γ基因插入到pcDNA3，通過大量制備質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA直接注射奶牛乳腔，使其BovIFN-γ基因在乳腺中大量表達(dá)，從而制備預(yù)防或治療奶牛隱性乳房炎的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)多肽藥物的技術(shù)領(lǐng)域。應(yīng)用一步法逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)技術(shù)對奶牛γ－干擾素(BovIFN－γ)基因的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，從奶牛脾淋巴細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出特異性片段。將BovIFN－γ基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體PGEX－6P－1谷光甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的下游，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)融合蛋白；或?qū)ovIFN－γ基因克隆到酵母高效表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，獲得陽性克隆，并大量表達(dá)基因產(chǎn)物；通過親和層析純化，大量制備表達(dá)產(chǎn)物，通過細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)產(chǎn)物有極好的抑制VSV病毒的活性。或?qū)ovIFN－γ基因插入到pcDNA3，通過大量制備質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA直接注射奶牛乳腔，使其BovIFN－γ基因在乳腺中大量表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防或治療奶牛隱性乳房炎的目的。
文檔編號A61P15/08GK1403155SQ0213839
公開日2003年3月19日 申請日期2002年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月8日
發(fā)明者秦愛建, 許金俊, 金文杰, 劉岳龍 申請人:揚(yáng)州大學(xué)