專利名稱：用于診斷及治療胰島素抗性及相關(guān)病癥之方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰島素抗性及相關(guān)病癥的診斷及治療，適用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持是一個動態(tài)平衡過程，包括腸道對葡萄糖的吸收，腦、肌肉和脂肪組織對葡萄糖的利用、胰腺對葡萄糖的感知和胰島素釋放以及肝臟對葡萄糖的合成和存儲(參見綜述Shepherd和Kahn，1999，New England J Med.341248-57)。血液葡萄糖水平的調(diào)節(jié)是通過循環(huán)激素(主要是胰島素和胰高血糖素)、參與胰島素信號傳導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞蛋白以及尚有待確定的眾多遺傳因子所參與的復(fù)雜相互作用來完成的。危害全球1.5億多人健康的二型糖尿病的首要病因被認(rèn)為是胰島素效應(yīng)組織(肌肉與脂肪組織)對胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取的作用發(fā)生的抵抗。胰島素抗性(insulin resistance，IR)是一種常見的生化代謝紊亂現(xiàn)象，在普通人群中發(fā)生率近25％，而且與一組稱為X綜合征(胰島素抗性綜合征)的代謝疾病相關(guān)，這些疾病包括循環(huán)高密度脂蛋白水平降低、高血壓、腹部肥胖和冠狀動脈病等(參見Reaven，Diabetes 371595-1607(1988)；De Fronzo等，Diabetes Care 14173-194(1991)；Reaven，Metabolism4116-19(1992))。以上疾病是發(fā)達(dá)國家中致病和致死的主要原因(Reaven，1994，J Internal.Medicine 23613-22)。遺傳學(xué)方面的證據(jù)清楚地表明胰島素抗性是由功能相關(guān)途徑中的一系列基因的遺傳缺陷引起的，盡管目前這些途徑中的許多關(guān)鍵基因我們?nèi)匀晃疵?Pedersen，1999，Exp Clin Endocrinal Diabetes 107113-118)。在過去的20多年里，經(jīng)過深入研究已發(fā)現(xiàn)了胰島素、胰島素受體、胰島素受體底物、磷脂酰肌醇-3(PI3)-激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖原合成酶和葡萄糖激酶的基因。然而，上述基因中的突變卻很罕見，而且僅能解釋IR相關(guān)綜合征的一小部分原因(不足1％)。因此，有必要進(jìn)一步鑒定和研究與胰島素抗性及IR相關(guān)病癥相關(guān)的其它基因和蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及胰島素抗性標(biāo)記(insulin resistance markers，IRMs)。IRM基因在胰島素抗性個體中的表達(dá)水平與其在健康個體或胰島素敏感個體中的表達(dá)水平是有差異的。本發(fā)明的胰島素抗性標(biāo)記列于表1。IRM基因編碼RNA(IRM基因產(chǎn)物)，后者可以與具有表1中由GenBank登錄號標(biāo)識的序列或與之確切互補(bǔ)的序列的多核苷酸雜交(例如，在嚴(yán)緊條件下)。一方面，本發(fā)明提供了一個通過檢測來自胰島素抗性個體的生物樣品與來自非胰島素抗性個體的生物樣品之間IRM基因序列的差異或IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)差異而確定個體是否有發(fā)生胰島素抗性的危險的方法。在多種實(shí)施方案中，非胰島素抗性個體具有eIS表型，和/或胰島素抗性個體具有eIR表型。在一個實(shí)施方案中，該方法涉及檢測至少兩個，任選地至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或者至少25個IRM基因的序列差異或者檢測至少兩個，任選地至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或者至少25個IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)差異。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷個體是否具有胰島素抗性、IR相關(guān)病癥或者IR或IR相關(guān)病癥易感性的方法，該方法通過檢測該個體的生物樣本中至少一個表1所列胰島素抗性標(biāo)記(IRM)的表達(dá)與非胰島素抗性參考個體群的相似生物樣本中該IRM的特征性表達(dá)水平的差異來實(shí)施。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷個體是否具有胰島素抗性(IR)、IR相關(guān)病癥或IR或IR相關(guān)病癥易感性的方法，該方法通過如下方式實(shí)施測定個體生物樣本中至少一個表1所列胰島素抗性標(biāo)記基因(IRM)的表達(dá)水平，并與非胰島素抗性參考個體群(例如，具有eIS表型的個體)的相似生物樣本中此IRM的特征性表達(dá)水平相比檢測表達(dá)差異(例如，增高或降低)。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明給出了通過提供被測個體的生物樣本并對該樣本中的IRM基因產(chǎn)物表達(dá)水平與健康個體或群體同類樣本中的特征性表達(dá)水平進(jìn)行比較，從而確定被測個體是否具有胰島素抗性或是否具有發(fā)生胰島素抗性的危險性的方法，其中如果差異存在則說明該個體為胰島素抗性或具有發(fā)生胰島素抗性的危險性。在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供確定個體是否為胰島素抗性的方法，該方法通過如下方式實(shí)施鑒定具有發(fā)生胰島素抗性危險的患者，提供該個體的生物樣本，并對該樣本中的IRM基因產(chǎn)物表達(dá)水平與健康個體或群體同類樣本中的特征性表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中表達(dá)差異的存在說明該個體具有胰島素抗性。在多種實(shí)施方案中，IRM基因產(chǎn)物的鑒定可通過擴(kuò)增(例如，應(yīng)用具有與登錄序列相同或完全互補(bǔ)的至少10個連續(xù)堿基、任選地至少15個連續(xù)堿基的引物來進(jìn)行擴(kuò)增)、雜交(例如，應(yīng)用具有與登錄序列相同或完全互補(bǔ)的至少10個連續(xù)堿基、任選地至少15個連續(xù)堿基的探針來進(jìn)行雜交)或檢測IRM多肽來進(jìn)行。所述生物樣本可以是組織樣本，優(yōu)選使用來自血液的樣本，諸如血細(xì)胞(如白細(xì)胞，B細(xì)胞等)等血液級分。在一些實(shí)施方案中，分析一組IRM基因的表達(dá)變化，或者它們的基因多態(tài)性。在一個實(shí)施方案中，針對每個被測個體，至少分析2個不同的IRM。在其它實(shí)施方案中，分析至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20或25個IRM基因或基因產(chǎn)物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定某個體是否為胰島素抗性或是否具有發(fā)生胰島素抗性的危險性的方法，實(shí)施方式是從被測個體獲取生物樣本；將該樣本的一組IRM基因表達(dá)水平與參考值作比較，其中所述的一組IRM基因?yàn)橹辽?個，任選地至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20或25個IRM基因，所述參考值代表具有已知胰島素抗性狀態(tài)的個體(如，個體群)中的表達(dá)；若參考值代表胰島素抗性或具有發(fā)生胰島素抗性的危險性的個體中的表達(dá)，如果這些IRM基因中至少25％，50％或75％的基因在被測個體中的表達(dá)水平在統(tǒng)計學(xué)水平上與參考值相似，則判定該被測個體為胰島素抗性或具有發(fā)生胰島素抗性的危險性；或者，若參考值代表健康個體中的表達(dá)，如果這些IRM基因中至少25％，50％或75％的基因在被測個體中的表達(dá)水平與參考值相比具有差異，則判定該個體為胰島素抗性或具有發(fā)生胰島素抗性的危險性。在一個方面，本發(fā)明提供了通過比較胰島素抗性個體和非胰島素抗性個體的生物樣本中的IRM基因序列，鑒定與胰島素抗性表型或發(fā)生胰島素抗性的危險性相關(guān)的基因多態(tài)性的方法。在多種實(shí)施方案中，非胰島素抗性個體具有eIS表型和/或胰島素抗性個體具有eIR表型。在一個實(shí)施方案中，鑒定在IRM基因的內(nèi)含子、外顯子或者啟動子區(qū)域中的突變。在一個實(shí)施方案中，鑒定的是IRM基因的單堿基突變。一方面，本發(fā)明提供篩選藥劑以確定其在胰島素抗性治療中的有用性的方法，該方法通過如下方式實(shí)現(xiàn)提供表達(dá)IRM基因產(chǎn)物的細(xì)胞，將此細(xì)胞與測試藥劑相接觸，并確定IRM基因產(chǎn)物表達(dá)水平在測試藥劑存在下是否發(fā)生變化，如果發(fā)生變化則提示該測試藥劑對于胰島素抗性的治療有用。在多種實(shí)施方案中，上述接觸細(xì)胞的步驟涉及給動物(譬如，糖尿病、胰島素抗性、胰島素敏感性或胰島素抗性相關(guān)病癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?施用測試藥劑。在多種實(shí)施方案中，所述篩選方法涉及確定是否該藥劑能夠影響一個以上IRM基因的表達(dá)水平。一方面，本發(fā)明提供篩選藥劑或收集測試藥劑以確定其在胰島素抗性治療中的有用性的方法，該方法通過如下方式實(shí)現(xiàn)提供包含IRM蛋白質(zhì)的組合物，將此組合物與測試藥劑相接觸，并確定IRM蛋白質(zhì)活性在測試藥劑存在下是否發(fā)生變化，如果發(fā)生變化則提示該測試藥劑對于胰島素抗性的治療有用。另一方面，本發(fā)明提供了一個在哺乳動物中治療胰島素抗性的方法，該方法是通過給予能夠調(diào)節(jié)IRM基因產(chǎn)物之表達(dá)(例如，當(dāng)IRM基因產(chǎn)物為RNA，而該RNA能夠與具有登錄序列之序列或與之完全互補(bǔ)的序列的多核苷酸在嚴(yán)緊條件下雜交時)的藥劑的有效劑量來實(shí)現(xiàn)的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療哺乳動物的胰島素抗性的方法，包括施用能夠調(diào)節(jié)IRM基因產(chǎn)物之表達(dá)的藥劑的有效量。在多種實(shí)施方案中，所述藥劑導(dǎo)致IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)或者活性的上調(diào)或下調(diào)。在一個實(shí)施方案中，此哺乳動物為患有胰島素抗性癥狀或并發(fā)癥或者胰島素抗性相關(guān)病癥的人類患者。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供能夠調(diào)節(jié)IRM基因產(chǎn)物表達(dá)的藥劑在配制用于治療IR的藥物組合物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供適用于胰島素抗性(和IR相關(guān)病癥)的診斷或胰島素抗性(和IR相關(guān)病癥)治療藥劑的篩選的試劑盒。在一個實(shí)施方案中，本試劑盒包含多個不同IRM基因產(chǎn)物的特異探針(如多核苷酸或抗體探針)。在一個相關(guān)方面，本試劑盒包括其上固定有多個IRM探針或基因產(chǎn)物的基質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了通過比較表1中所列IRM基因的序列在胰島素抗性個體的生物樣本中與在非胰島素抗性個體的生物樣本中的差異，鑒定與胰島素抗性(IR)表型或發(fā)生胰島素抗性的危險性相關(guān)的基因多態(tài)性的方法。在一個實(shí)施方案中，非胰島素抗性個體具有eIS表型，在一個實(shí)施方案中，胰島素抗性個體具有eIR表型。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供判定個體是否有發(fā)生胰島素抗性的危險或是否患有胰島素抗性的方法，該方法包括步驟(a)獲取所述個體的核酸樣本；和(b)確定一個或多個IRM基因上存在的核苷酸是否指示發(fā)生胰島素抗性的危險性。此外，本發(fā)明還給出一個檢測基因型和胰島素抗性表型的相關(guān)性的方法，包括(a)在具有第一胰島素抗性表型的第一群體中分析至少一個IRM基因的基因型，(b)在具有第二胰島素抗性表型(有別于第一胰島素抗性表型)的第二群體中分析該IRM基因的基因型，和(c)分析上述基因型和表型之間是否具有統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性。在一個實(shí)施方案中，這第一群體是eIS群體而第二群體是eIR群體。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供估計群體中一組多核苷酸多態(tài)標(biāo)記的單元型頻率的方法，包括(a)針對群體中的個體鑒定表1所列IRM基因上的至少第一核苷酸多態(tài)；(b)針對群體中的個體鑒定IRM基因上的第二核苷酸多態(tài)，其中第二IRM基因可以和第一IRM基因相同也可以不同；和(c)通過單元型確定方法分析步驟(a)和(b)中確定的核苷酸多態(tài)身份，從而估計所述頻率。在一個不同方面，本發(fā)明提供了鑒定可用于診斷疾病狀態(tài)的基因表達(dá)模式(patter)的方法，包括鑒定第一群人類個體，其中所述個體為疾病患者或該疾病的高患病危險個體；鑒定第二群人類個體，其中所述個體為該疾病的低患病危險個體；和鑒定至少3個在該兩個群體間表達(dá)存在差異的RNA序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括獲取從這兩個群體所有個體的B淋巴細(xì)胞衍生的細(xì)胞系，繼而鑒定在一個細(xì)胞系中與在另一個細(xì)胞系中差異表達(dá)的基因。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系來自血液細(xì)胞。譬如，所述細(xì)胞系可以來源于Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞。一般說來，第一和第二群體各包含至少3個個體，常常至少5個或者更多個個體。在一個實(shí)施方案中，鑒定差異表達(dá)的RNA序列的步驟包括1)從第一和第二群體的每一個個體中，獲取由組織衍生的細(xì)胞系；2)從上述細(xì)胞系中提取RNA；3)制備同一組中不同的個體細(xì)胞系之RNA的探針池(pool)；4)將探針池與包含來自所述組織的多個表達(dá)序列標(biāo)簽(cDNAs)的核酸陣列進(jìn)行雜交。在一個實(shí)施方案中，核酸陣列具有至少100個不同的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。
發(fā)明詳述I.一般參考文獻(xiàn)及定義參考文獻(xiàn)下列文獻(xiàn)提供實(shí)施本發(fā)明時的有用信息(1)Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL)(第二版)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社及Sambrook和Russel(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第三版)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(后文中，合稱或單獨(dú)稱作”Sambrook”)；(2)Ausubel等(1987)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(2001增補(bǔ)版)John Wiley和Sons，紐約(后文以“Ausubel代替)；(3)Coligan等，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法指南(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(2001增補(bǔ)版)，John Wiley和Sons，紐約(后文以“Coligan”代替)；(4)Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(ANTIBODIES，A LABORATORYMANUAL)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，及Harlow和Lane(1999)抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室指南(USING ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(后文中合稱或單獨(dú)稱作“Harlow和Lane”)；(5)現(xiàn)代免疫學(xué)方法(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(J.E.Coligan等，編輯，1999，包括2001年增補(bǔ)版)；(6)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTHE POLYMERASE CHAIN REATION)(Mullis等編輯，1994)；(7)生物綴合技術(shù)(BIOCONJUGATE TECHNIQUES)(Greg T.Hermanson編輯，科學(xué)出版社，1996)；(8)Beaucage等編輯，現(xiàn)代核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY)(John Wiley & Sons，紐約，2000)。
定義下列定義有助于讀者實(shí)施本發(fā)明“等位基因”或“等位序列”，這里指的是編碼特定多肽的基因(即，IRM基因序列)的自然發(fā)生的可替代形式。“抗體”，這里指包含VL和/或VH序列的有專一結(jié)合性的分子，包括，例如，(1)多克隆抗體制備物、(2)單克隆抗體、(3)人源化抗體分子(參見例如Riechmann等.(1988)Nature 332323-327；Verhoeyan等.(1988)Science 2391534-1536)；(4)雜合(嵌和)抗體分子(參見例如Winter等(1991)Nature 349293-299；及美國專利號4,816,567)；(5)抗體片段，例如F(ab’)2和F(ab)片段；(6)Fv分子(非共價異二聚體，參見例如Ehrlich等(1980)Biochem 194091-4096)；(7)單鏈Fv分子(sFv)(參見例如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)；(8)二聚和三聚的抗體片段構(gòu)建體；(9)小抗體或微抗體(mini-antibody或minibody)(即，C端包含寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerization domain)的sFv多肽鏈，該結(jié)構(gòu)域通過鉸鏈區(qū)與sFv分開；參見Pack等(1992)Biochem 311579-1584)；(10)從這些分子獲得的保持了母體抗體分子的特異結(jié)合特性的任何功能性片段。“反義序列”，定義為其序列與RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸。該術(shù)語特別包括結(jié)合mRNA或其部分以阻斷mRNA被核糖體轉(zhuǎn)錄的核酸序列。反義技術(shù)在本領(lǐng)域已眾所周知(參見PCT公開WO 94/12633，及Nielsen等，1991，Science 2541497；寡核苷酸及類似物實(shí)踐方法(OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES，A PRACTICALAPPROACH)，F(xiàn).Eckstein編，IRL Press牛津大學(xué)出版社(1991)；反義研究及應(yīng)用(ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS)(1993，CRC出版))“保守替代”，當(dāng)描述多肽的時候指的是多肽中氨基酸組成的改變不引起該多肽活性的實(shí)質(zhì)上變化，也就是說替代的氨基酸和被替代的氨基酸具有相似的特性(例如，酸堿性，帶正電或負(fù)電，極性或非極性，等等)，這樣，即便是關(guān)鍵氨基酸發(fā)生這樣的替換也不實(shí)質(zhì)上改變多肽的活性。具有相似功能的氨基酸保守替換的列表早已研明。下列所分六組每組中的氨基酸彼此間替換都屬于保守替換1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(參見Creighton，1984，Proteins，W.H.Freeman and Company).“可檢測標(biāo)記的”，指試劑(如，探針)與可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、電磁學(xué)等相關(guān)分析技術(shù)進(jìn)行檢測的標(biāo)記物相偶聯(lián)?？梢岳玫目蓹z測標(biāo)記物包括，但不限制于，放射性同位素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)記(mass lable)、電子致密顆粒、磁顆粒、自旋標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子、酶底物。術(shù)語“標(biāo)記的”，當(dāng)涉及探針或抗體時，旨在包括通過可檢測物質(zhì)與探針或抗體的偶聯(lián)(即，物理連接)直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與直接標(biāo)記的另一試劑反應(yīng)間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括通過熒光標(biāo)記的二抗檢測一抗，和利用生物素標(biāo)記DNA探針末端以便通過熒光標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測。“表位”，即抗體識別抗原的位點(diǎn)，通常為屬于一整條多肽鏈上的一小部分的氨基酸片段。表位可以是構(gòu)象化的(即，不連續(xù)的)。也就是說，它們可以由一級結(jié)構(gòu)上的不連續(xù)部分編碼的氨基酸通過蛋白折疊相毗鄰而形成?！盎虍a(chǎn)物”，指基因轉(zhuǎn)錄出的RNA分子或者該基因編碼的多肽，也就是由RNA翻譯所得的多肽?！霸噭┖小保副灰黄鸢b或市售以便使用的成分。比如，一個試劑盒可以含有多個分別放置在不同容器中的多核苷酸或抗體探針?；蛘?，一個試劑盒可以將兩個成分放在一個容器中，而將第三成分和任何其它成分放在一個或者多個獨(dú)立的容器中。任選地，試劑盒還可以包括用于聯(lián)合這些成分的說明書。“天然的”，應(yīng)用于某化合物或組合物(如mRNA)時，表示該化合物或組合物能夠在自然界中發(fā)現(xiàn)?！昂怂帷薄ⅰ岸嗪塑账帷焙汀肮押塑账帷?，這里指任意長度的核苷酸聚合體，包括但不限于，核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。這三個術(shù)語之間并不著意于長度的區(qū)分。進(jìn)一步講，這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，在某些實(shí)施方案中，這三者可以包括三鏈、雙鏈和單鏈DNA，以及三鏈、雙鏈和單鏈RNA。它們也包括經(jīng)過諸如甲基化和/或加帽等修飾的多核苷酸，以及多核苷酸的未修飾形式。更具體地，術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”，包括多聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、為嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的任何其它類型的多核苷酸以及包含非核苷酸骨架的其它多聚體，如聚酰胺(如，肽核酸(PNA))和聚嗎啉代(商品可購買于Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，商品名Neugene)多聚體，以及其它合成的序列特異核酸多聚體，條件是這些多聚體中包含的核苷堿基的構(gòu)型應(yīng)允許進(jìn)行堿基配對，就象在DNA和RNA中的堿基配對一樣。除非有特殊說明，提及多核苷酸序列也旨在指與之完全互補(bǔ)的序列，所述互補(bǔ)遵守標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對原則，即A→(T/U)和G→C。因此，除非特別指出，否則，如果說某參考多核苷酸序列與第二多核苷酸序列雜交，就表示包括參考多核苷酸序列的任何一條鏈與第二多核苷酸序列的任何一條鏈之間的特異雜交?！翱刹僮鞯剡B接”，是指核酸表達(dá)調(diào)控序列(如啟動子、信號序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列)與第二多核苷酸之間發(fā)生的功能性連接，其中所述表達(dá)調(diào)控序列能夠影響所述第二多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。一般說來，發(fā)生可操作地連接的序列是毗鄰的，如果是信號肽發(fā)生可操作地連接，那么既指毗鄰的又指在閱讀框中。但是，與增強(qiáng)子發(fā)生可操作地連接而被增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄的編碼序列則不必鄰近該增強(qiáng)子?！翱伤幱谩?，是指載體、稀釋劑或賦形劑必須與制劑的其他成分相兼容，而且不能損害用藥者的健康?！岸嚯摹保诒旧暾堉信c“蛋白質(zhì)”可互換使用，指由通過酰胺鍵連接的多個氨基酸殘基形成的多聚體，包括其人工合成、天然與非天然類似物(氨基酸和鍵)。肽也代表多肽?！耙铩保侵冈谶m當(dāng)緩沖液中和適宜溫度下，于適當(dāng)條件(即，存在四種不同的三磷酸核苷以及諸如DNA或RNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶等具有聚合作用的試劑)下能夠作為模板指導(dǎo)的DNA合成的起始點(diǎn)的多核苷酸單鏈。引物不須完全與模板序列一致，但是必須具有足夠的互補(bǔ)性從而可以與模板雜交。術(shù)語“引物對”是指包括可與待擴(kuò)增的DNA序列的5’末端的互補(bǔ)鏈雜交的5’“上游引物”和可與此待擴(kuò)增序列的3’末端雜交的3’“下游引物”的一對引物。“完全互補(bǔ)”的引物上所有堿基都是與模板互補(bǔ)的，即沒有錯配堿基。“錯配”指的是當(dāng)引物與靶核酸比對(align)時引物上的某堿基與靶核酸上相應(yīng)位置的堿基不互補(bǔ)的現(xiàn)象。“基本上互補(bǔ)”，當(dāng)涉及引物時，指的是引物與其靶核酸并不完全互補(bǔ)，而是該引物僅具有充分互補(bǔ)性，這種互補(bǔ)性使其能選擇性地與相應(yīng)鏈在期望的引物結(jié)合位點(diǎn)雜交。引物通常具有大約7個或者更多個核苷酸，乃至大約100個核苷酸，一般長度為大約10到50個核苷酸，更多為大約12到50個核苷酸，而大約15到25個核苷酸的長度最為常用。本文中，“探針”，當(dāng)用于多核苷酸和抗體時，指的是該分子可以特異地結(jié)合另一分子。探針的一個例子是“核酸”探針，可以是DNA，RNA或其它多核苷酸。當(dāng)給出一個核酸探針的具體序列時，也就給出并包括了其互補(bǔ)鏈的序列。如果目標(biāo)分子是能夠特異地與實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的核酸結(jié)合(例如，退火或雜交)的雙鏈核酸時，該探針的互補(bǔ)鏈同樣也能很好地工作。探針的另一個實(shí)例是“抗體探針”，其能夠特異地結(jié)合至相應(yīng)的抗原或表位上。通過反轉(zhuǎn)錄RNA(例如，單種類或異質(zhì)群體)可以制備“cDNA探針”?！爸亟M體”，指體外合成的或經(jīng)其他方式操作的多核苷酸(例如，“重組多核苷酸”)，也指利用重組多核苷酸在細(xì)胞或其他生物體系中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，還可以指重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白”)。因此，“重組”多核苷酸既可以由其生產(chǎn)方法也可以由其結(jié)構(gòu)定義。關(guān)于其生產(chǎn)方法，這一過程為重組核酸技術(shù)的利用，例如，涉及人為地干預(yù)，典型地篩選或制備核苷酸序列?；蛘?，重組體可以是通過制備包含兩個天然不相毗鄰的片段的融合物的序列而產(chǎn)生的多核苷酸，該概念中排除了天然產(chǎn)物。因此，例如，此概念包括通過任何非天然載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞得到的產(chǎn)物，也包括含有通過任何合成寡核苷酸方法產(chǎn)生的序列的多核苷酸。同樣，“重組”多肽是指重組多核苷酸表達(dá)的產(chǎn)物?！爸亟M”當(dāng)涉及細(xì)胞時是指，該細(xì)胞復(fù)制異源核酸或表達(dá)異源核酸所編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可以含有細(xì)胞天然(非重組)狀態(tài)不含有的基因，也可以含有細(xì)胞天然狀態(tài)中含有的基因但是該基因是在經(jīng)過人工修飾以后重新導(dǎo)入細(xì)胞的。該術(shù)語也包括含有經(jīng)修飾的細(xì)胞內(nèi)源核酸的細(xì)胞，其中所述修飾是在未將該核酸移出細(xì)胞的情況下進(jìn)行的；該修飾包括通過基因置換、定點(diǎn)突變以及其它相關(guān)技術(shù)實(shí)現(xiàn)的修飾?！斑x擇性雜交”指的是在細(xì)胞總DNA或RNA制備物中存在特定靶DNA或RNA序列時，與此靶DNA或RNA序列雜交、形成雙鏈或結(jié)合的多核苷酸探針。“特異結(jié)合”(用于蛋白質(zhì)時)、“特異免疫交叉反應(yīng)”或簡稱“特異免疫反應(yīng)”(用于抗體時)，均指可以在異質(zhì)蛋白質(zhì)群體和其他生物產(chǎn)品存在時確定出目的蛋白存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定條件下，特異配體優(yōu)先結(jié)合特定蛋白，而不會以顯著的量結(jié)合樣品中存在的其他蛋白。特異結(jié)合蛋白的分子或配體(例如抗體)具有的結(jié)合常數(shù)為至少103M-1或104M-1，有時是105M-1或106M-1，或者106M-1或107M-1，優(yōu)選108M-1～109M-1，更優(yōu)選大約1010M-1～1011M-1或者更高的值。很多免疫分析方法可用于選擇與特定蛋白發(fā)生特異免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫分析常規(guī)用于篩選與蛋白質(zhì)發(fā)生特異免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見例如Harlow和Lane關(guān)于測定特異免疫活性的免疫分析方法和條件的敘述。本文中，“實(shí)質(zhì)上序列一致”指的是兩個或者更多個序列或者亞序列為獲得最大對應(yīng)而進(jìn)行比較和比對時，通過下面的序列比較算法之一或直接觀察法測量到具有至少60％(優(yōu)選80％，最優(yōu)選90％，95％，98％或99％)的核苷酸或氨基酸殘基同一性。兩個序列(核苷酸序列或者氨基酸序列)可以在全長(例如，如果兩者具有實(shí)質(zhì)上不同長度，則指較短序列的長度)水平進(jìn)行比較，也可以比較至少大約50、大約100、大約200、大約500或者大約1000個連續(xù)核苷酸或者至少大約10、大約20、大約30、大約50或大約100個連續(xù)氨基酸殘基的亞序列。進(jìn)行序列比較的時候，一般以其中一條序列作為參考序列來比較測試序列。運(yùn)用序列比較算法時，將測試序列和參考序列均輸入計算機(jī)，如果需要則指定亞序列的坐標(biāo)，并設(shè)定好序列算法程序參數(shù)。序列比較算法即可基于設(shè)定的程序參數(shù)計算出測試序列與參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。為進(jìn)行比較，可以按如下方式實(shí)現(xiàn)序列的最佳比對(align)例如，Smith和Waterman的局部同源分析(Local Homology)，Adv.Appl.Math.2482(1981)，Needleman和Wunsch的同源比對分析，J.Mol.Biol.48443(1970)，Pearson和Lipman的相似性檢索方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)，這些算法的計算機(jī)執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳軟件中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI))，或者直接觀察法(一般參見Ausubel等)。以上各種參考文獻(xiàn)及算法在此完整并入為參考文獻(xiàn)。當(dāng)使用上述任何算法時，對于視窗長度、空位罰值(Gap Penalty)等使用缺省參數(shù)。例如適用于確定序列一致性和相似性百分比的一個算法是BLAST，參見Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以在美國國家生物技術(shù)信息中心公眾網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲得。該算法涉及首先通過確定提交序列中長度為W的短字(word)，鑒定當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時能夠滿足或者符合某個正的閾值分?jǐn)?shù)T的高分值序列對(high scoringsequence pairs，HSPs)。閾值T被稱作相鄰字得分閾值(Altschul等，上述引文)。然后將這些初選的相鄰字命中點(diǎn)(hit)作為種子來啟動檢索以尋找包含這些命中點(diǎn)在內(nèi)的更長的HSP。將這些字命中點(diǎn)沿每一序列向兩個方向延伸，只要累計的比對分值可以得以增加即可。如果累積比對分值從其最大獲得值下降數(shù)量X；或者由于一個或者多個負(fù)值得分殘基比對造成累積比對分值趨向零或者更低；或者已經(jīng)延伸到一條序列的端部，那么停止這種字命中點(diǎn)(hit)向兩個方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T、X決定比對過程的靈敏度和速度。BLAST程序一般設(shè)定的缺省值為字長(W)11、BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))、比對數(shù)(alignments)(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，而且正負(fù)兩條鏈都進(jìn)行比較。兩個核酸序列實(shí)質(zhì)上一致的另一標(biāo)志是兩者在嚴(yán)緊條件下彼此雜交。如果嚴(yán)緊條件下一個區(qū)段能夠和另一區(qū)段的正鏈或者負(fù)鏈雜交，那么就說明此二者具有這種實(shí)質(zhì)一致性，所述雜交典型地利用具有來源于這些探針核苷酸序列的至少大約50個連續(xù)核苷酸的序列進(jìn)行?！敖Y(jié)合”指的是探針核酸和靶核酸之間的互補(bǔ)雜交，而且可以通過減少雜交介質(zhì)的嚴(yán)緊度允許小量錯配的存在從而達(dá)到檢測靶多核苷酸序列的目的。“嚴(yán)緊雜交條件”指低于靶序列熔解溫度(Tm)大約5℃到大約20℃或25℃的條件和完全或者幾乎完全互補(bǔ)于靶序列的探針。在此，熔解溫度是雙鏈核酸分子中半數(shù)解鏈為單鏈狀態(tài)的溫度。計算多核苷酸Tm值的方法眾所周知(參見例如Berger和Kimmel，1987，酶學(xué)方法(METHODSIN ENZYMOLOGY)152卷分子克隆指南(GUIDE TO MOLECULARCLONING TECHNIQUES)，圣地亞哥，Academic Press，Inc.Sambrook)。正如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中指出的，當(dāng)核酸在1M NaCl的水溶液中時，Tm值可通過等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)進(jìn)行簡單估算(參見例如，Anderson和Young，《核酸雜交》(Nucleic acid Hybridization)中的“定量濾膜雜交”(1985))。其他參考文獻(xiàn)中，計算Tm值時將序列特性與分子結(jié)構(gòu)考慮進(jìn)去從而導(dǎo)致更為復(fù)雜的計算。雜交體的熔解溫度(以及由此雜交嚴(yán)緊條件)受各種因素的影響，例如探針的長度和屬性(DNA、RNA、堿基組成)以及靶的屬性(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定化等等)以及鹽濃度和其他組分(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在與否)。這些影響因素的效果眾所周知，并在本領(lǐng)域的參考標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中有討論，見Sambrook，同上引文和Ausubel，同上引文。典型地嚴(yán)緊交雜條件是低于大約1.0M鈉離子的鹽濃度，通常大約0.01～1.0M鈉離子，pH值7.0～8.3，并且對于短探針(例如10～50個核苷酸)和長探針(例如超過50個核苷酸)分別至少為大約30℃和大約60℃的雜交溫度。正如所指出的，嚴(yán)緊雜交條件也可以通過添加甲酰胺等去穩(wěn)定劑而達(dá)到，此時可以采用較低的溫度?！皩?shí)質(zhì)性純的”或者“分離的”用來形容蛋白質(zhì)和多肽的時候，表示蛋白質(zhì)與和它天然相關(guān)的其它蛋白或者雜質(zhì)相分離。蛋白質(zhì)或多肽占組合物的總蛋白含量的大約50％以上(通常大約60％以上)的時候，可以稱之為實(shí)質(zhì)性純蛋白。更典型地，實(shí)質(zhì)性純的或分離的蛋白質(zhì)或多肽將占總蛋白的至少75％，更優(yōu)選至少90％。該蛋白優(yōu)選在組合物中占總蛋白的大約90％以上，更優(yōu)選大約95％以上。當(dāng)涉及多核苷酸時，此術(shù)語“實(shí)質(zhì)性純的”或“分離的”一般指與其通常相關(guān)的雜質(zhì)，例如脂、蛋白和其他多核苷酸相分離的多核苷酸。本發(fā)明中“實(shí)質(zhì)性純的”或“分離的”多核苷酸將有大于大約50％的純度，通常大于大約60％的純度，更為常見的是從大約75％到大約90％的純度，優(yōu)選純度為大約95％至大約98％?！爸委熡行Я俊笔侵秆芯咳藛T、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生所探尋的可以引起組織、系統(tǒng)、動物或人的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的對象化合物的量，例如，能夠改善疾病狀態(tài)或癥狀、或減緩、阻止、抑制或逆轉(zhuǎn)疾病或任何其它不良癥狀發(fā)展的化合物量。個體中胰島素抗性的改善可以通過觀察OGTT及SSPG曲線的改善來衡量。“預(yù)防(prophylactic)量”是指能夠充分地預(yù)防、阻止或延遲疾病的發(fā)生或發(fā)展的量。
II.引言本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)在人類胰島素抗性和血細(xì)胞中某些基因(在此稱作“胰島素抗性標(biāo)記基因”或“IRM基因”)的表達(dá)模式之間具有令人信服的相關(guān)性。IRM基因表達(dá)與胰島素抗性之間的這種相關(guān)性是通過對極端胰島素抗性群體和極端胰島素敏感群體的大規(guī)?；虮磉_(dá)譜分析得到證實(shí)的。雙親中至少有一人為二型糖尿病的600例早先鑒定的個體通過口服葡萄糖耐受測試和穩(wěn)態(tài)血漿葡萄糖檢測篩選極端胰島素抗性(“eIR”)或極端胰島素敏感(“eIS”)?？诜咸烟悄褪軠y試(OGTT)是一種體內(nèi)胰島素敏感度評估方法，參見Bergman等，內(nèi)分泌學(xué)綜述(EndocrinologyReview)645-86(1985)。一般75-g 2-hr OGTT＞140mg/dl的個體被確定為胰島素抗性，而75-g 2-hr OGTT＜120mg/dl的個體則為正常。穩(wěn)態(tài)血漿葡萄糖檢測(SSPG)是由胰島素抑制檢測法改良而來，在此檢測中被測個體連續(xù)靜脈輸注生長激素抑制素(Somatostatin)、胰島素和葡萄糖，參見Reaven等.，Diabetologia 1617-24(1979)。通常SSPG均值＞180mg/dl的個體被認(rèn)為具有胰島素抗性，而SSPG均值＜150mg/dl則為正常。如果某個體年齡在18周歲以上而且符合下列標(biāo)準(zhǔn)則歸為eIR組(即，具有eIR表型)120分鐘時OGTT葡萄糖(口服75g葡萄糖后120分鐘時的OGTT葡萄糖水平)＞140mg/dl；SSPG均值＞250mg/dl；60分鐘時OGTT胰島素＞100μIU/ml Et；120分鐘時OGTT胰島素＞100μIU/ml。如果某個體年齡在18周歲以上而且符合下列標(biāo)準(zhǔn)則歸為eIS組(即，具有eIS表型)120分鐘時OGTT葡萄糖＜100mg/dl；SSPG均值＜120mg/dl；60分鐘時OGTT胰島素＜60μIU/ml或120分鐘時OGTT胰島素＜40μIU/ml?！癝SPG均值”指的是穩(wěn)態(tài)血漿葡萄糖水平(SSPG測試中150、160、170和180分鐘時獲得的四個值的均值)。在此，“Xm時OGTT胰島素”指的是口服75g葡萄糖后X分鐘時的OGTT胰島素水平。從年齡性別匹配的6例eIR和6例eIS獲得建成的Epstein Barr病毒(“EBV”)轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系(即，12株細(xì)胞系)。使用50個已知的胰島素效應(yīng)基因進(jìn)行的分析證明EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系在接觸胰島素時的基因表達(dá)模式與胰腺這一經(jīng)典的“胰島素效應(yīng)器官”中的表達(dá)相似。在相同培養(yǎng)條件下，在存在15μIU/ml或100μIU/ml(IU＝國際單位，international unit)胰島素的環(huán)境中培養(yǎng)上述12個細(xì)胞系并進(jìn)行相同次數(shù)的細(xì)胞傳代，之后分別提取各細(xì)胞系的總RNA。從6例eIR細(xì)胞系得到的總RNA等量混合成為eIR-RNA池，從6例eIS細(xì)胞系得到的總RNA等量混合成為eIS-RNA池。通過oligo-dT引物反轉(zhuǎn)錄特異擴(kuò)增eIR和eIS池的mRNA制備不同標(biāo)記的探針。上述探針應(yīng)用于微陣列雜交，此微陣列包含大約10,000個人白細(xì)胞表達(dá)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽或者大約40,000個來自不同人類組織中的表達(dá)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。在一些情況下，還進(jìn)行了許多附加的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。鑒定到的幾個差異表達(dá)基因在表1中顯示并在下文中詳細(xì)討論。部分地基于這些IRM基因的鑒定，本發(fā)明給出如下方法及試劑，這些方法及試劑可用于設(shè)計和實(shí)施胰島素抗性及IR相關(guān)病癥的診斷和預(yù)后試驗(yàn)、評價發(fā)生胰島素抗性及IR相關(guān)病癥等疾病的危險度、設(shè)計胰島素抗性及IR相關(guān)病癥等疾病的預(yù)防和治療方案以及篩選胰島素抗性及IR相關(guān)病癥等疾病的有效治療藥劑?！耙葝u素抗性”在本文中具有通常為本領(lǐng)域接受的含義，指外周組織抵抗胰島素對葡萄糖吸收的促進(jìn)作用。如果胰腺能夠針對這種缺陷分泌更多的胰島素，那么就能夠維持正常的葡萄糖耐受。某些異常，包括高血壓和異常血脂癥，特征為升高的血漿甘油三脂(TG)、降低的高密度脂蛋白(HDL)、更小更密的LDL顆粒、升高的餐后脂血、高尿酸血癥、升高的血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)水平，它們傾向于簇集出現(xiàn)在具有胰島素抗性的胰島素分泌過多患者身上，被稱為IR相關(guān)病癥。胰島素抗性相關(guān)病癥包括糖尿病(例如，二型和妊娠糖尿病)和糖尿病癥狀和并發(fā)癥如X綜合征(例如，包括循環(huán)高密度脂蛋白水平降低、高血壓、腹部肥胖和冠狀動脈疾病)等等。
III.胰島素抗性標(biāo)記如前所述，本發(fā)明人已鑒定出在胰島素抗性個體與健康個體的細(xì)胞(如血液細(xì)胞)中差異表達(dá)的一系列基因。這些基因稱為胰島素抗性標(biāo)記或者IRM，它們編碼的RNA(即，IRM基因產(chǎn)物)可以在嚴(yán)緊條件下與具有(即，相同或者完全互補(bǔ))表1中登錄號標(biāo)識的多核苷酸(見下文，如具有所示登錄號的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)、IMAGE克隆插入片斷或cDNA序列)的序列的多核苷酸雜交。在某些實(shí)施方案中，登錄序列為基因組序列。例如，IRM基因的轉(zhuǎn)錄物可以和，例如，(1)具有表1的登錄序列或其互補(bǔ)序列(除poly(A)尾)的多核苷酸，以及(2)具有表1中所列IMAGE克隆插入片斷的序列的多核苷酸雜交。表1提供了各種信息。表1第一列是每個IRM基因的數(shù)字名稱。第二列是EST序列的GenBank登錄號，這些EST與來自eIR和eIS群體的RNA有差異雜交，參見上文§II描述以及下文的實(shí)施例。同時第二列還給出與某些表達(dá)序列標(biāo)簽相對應(yīng)的比較長的基因組或cDNA序列的GenBank登錄號，以及與每個EST對應(yīng)的IMAGE克隆的ID號。IMAGE克隆通常包含大約1kb到全長的插入片段。這些克隆可獲自ResearchGenetics，Inc.(http//www.resgen.com/resources/apps/cdna/index.php3)，IMAGE克隆的核苷酸序列可以通過常規(guī)方法確定。表1第三列提供特定IRM基因在eIR群體的細(xì)胞系中的表達(dá)相對于在eIS群體中的表達(dá)而言是上調(diào)還是下調(diào)，測定方法詳見下文實(shí)施例。“-”表示在eIR群體中該IRM基因相對于eIS群體而言下調(diào)(即，在eIR群體中具有較低表達(dá))，“+”則表示在eIR群體中該IRM基因相對于eIS群體而言上調(diào)。表1第四列表示的是與EST序列相應(yīng)(例如，通常＞95％的序列同一性)的全長基因的有關(guān)信息和/或該基因編碼的多肽的有關(guān)描述。IRM基因編碼的多肽序列在第四列中或在附隨著所指出的登錄號的GenBank注釋中給出，或者可以通過概念性翻譯給出的IRM核酸序列確定或從給出的核酸序列信息確定。為方便起見，IRM基因編碼的多肽或其亞序列有時稱作“IRM多肽”。相應(yīng)于這里描述的IRM的其它克隆和序列信息(如編碼序列、全長序列、側(cè)翼序列和基因組序列)可通過分子生物學(xué)家熟知的技術(shù)獲得。比如，可以獲得表1中的IMAGE克隆并測定克隆插入片斷的序列?？梢员粶y序的其他克隆可以通過含有本文提供的IRM序列的標(biāo)記探針掃描哺乳動物(如人類)cDNA文庫(如血液細(xì)胞文庫，如淋巴細(xì)胞cDNA文庫)或基因組文庫得到?；蛘?，可以用登錄序列、其亞序列或其中編碼的多肽序列基于實(shí)質(zhì)性序列同一性檢索計算機(jī)序列數(shù)據(jù)庫。由IRM基因編碼的RNA(IRM RNA)能夠(例如，在嚴(yán)緊條件下)與具有和表1中GenBank登錄號標(biāo)識的序列相同或完全互補(bǔ)的序列的多核苷酸雜交。IRM基因產(chǎn)物也包括RNA編碼的多肽，所述RNA能夠在嚴(yán)緊條件下與具有和登錄序列相同或完全互補(bǔ)的序列的多核苷酸雜交。本發(fā)明人鑒定的IRM基因產(chǎn)物包括表1所示核酸序列或其片段的序列、該序列編碼的序列、或該序列的互補(bǔ)序列。能夠特異雜交此處公開的IRM序列(包括互補(bǔ)序列)的多核苷酸探針和引物可用于監(jiān)控、檢測及測量編碼該IRM的基因的表達(dá)。例如，一般來說探針含有至少10個與表1所列多核苷酸相同或完全互補(bǔ)的堿基，常常至少大約15個、至少大約20個、至少大約25個、50個、至少大約100個或至少大約500個堿基。然而，在確定序列同一性、互補(bǔ)性或雜交的時候，任何3’末端poly(A)序列(例如，在cDNA衍生的序列中給出的)均不算在內(nèi)。在一個不同的實(shí)施方案中，能夠結(jié)合IRM基因編碼的多肽的試劑(如抗體)可用以監(jiān)控、檢測和測量IRM編碼基因的表達(dá)。已證實(shí)的在表1所列IRM基因的表達(dá)與胰島素抗性之間的相關(guān)性表明IRM基因的表達(dá)可用作胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的發(fā)生或發(fā)展可能性的診斷標(biāo)志。因此，對于能與具有表1所列登錄序列的多核苷酸或它的互補(bǔ)分子(包括具有表1所列IMAGE克隆的插入序列的多核苷酸)進(jìn)行雜交或與其實(shí)質(zhì)上序列一致的IRM RNA，檢測它的表達(dá)變化在本發(fā)明的診斷、預(yù)后和篩選方法中將是有用的。同樣，IRM基因編碼的多肽的表達(dá)或活性的變化也可用于本發(fā)明的診斷、預(yù)后和篩選方法中，詳見后述。類似地，已證實(shí)的在包含表1所給序列的IRM基因的表達(dá)與胰島素抗性之間的相關(guān)性也指出IRM基因可能是引起胰島素抗性表現(xiàn)的原因。因此，本發(fā)明給出治療胰島素抗性的方法，該方法包括施用能夠調(diào)節(jié)IRM蛋白(即，由例如在嚴(yán)緊條件下與本文公開的任一多核苷酸雜交的RNA編碼的蛋白)表達(dá)的藥劑(agent)或療法。本發(fā)明眾多其他方面和實(shí)施方案在此將會進(jìn)行詳述或者基于本公開的綜述將是明顯的。
表1 IRM多核苷酸和多肽(例如，用作探針、免疫原等等)可以通過本領(lǐng)域熟知方法制備，包括從頭(de novo)化學(xué)合成和重組表達(dá)。從頭(denovo)合成寡核苷酸和多核苷酸的方法是已知的(參見Beaucage等編，當(dāng)代核酸化學(xué)操作技術(shù)(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；以及Agrawal，編，寡核苷酸及類似物操作指南，合成與特性(Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties)Humana Press Inc.，New Jersey，1993)。關(guān)于蛋白的固相合成方法的實(shí)例在Grant(1992)《合成肽用戶指導(dǎo)》(Synthetic PeptidesA User Guide)，W.H.Freeman和Co.，N.Y；以及《肽合成原理》(Principles of Peptide Synthesis)(Bodansky和Trost，編，Springer-Verlag，Inc.N.Y.，(1993))中有具體闡述。重組表達(dá)多核苷酸和多肽的方法已眾所周知。例如，IRM多核苷酸可以插入用于制備IRM多肽或多核苷酸的表達(dá)載體中。表達(dá)載體一般包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制信號(如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及ATG起始密碼子)。而且，包含適合所用細(xì)胞體系的增強(qiáng)子能夠增加表達(dá)效率。例如，SV40增強(qiáng)子或CMV增強(qiáng)子可用于提高哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)效率。因此，在一個實(shí)施方案中，編碼IRM多肽的DNA可以插入能夠?qū)塍w外宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中，這些體外宿主細(xì)胞包括細(xì)菌(大腸桿菌(E.coli.)，枯草桿菌(Bacillus subtilus)等)、酵母(如酵母屬(Saccharomyces))、昆蟲(如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda))或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)等?？梢杂糜诒磉_(dá)和制備本發(fā)明多肽的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括人胚腎細(xì)胞系(293；Graham et al.，1977，J.Gen.Virol.3659)、CHO(ATCC CCL 61和CRL 9618)、人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa，ATCC CCL 2)以及其它熟知的細(xì)胞系。有用的人源及非人源細(xì)胞系均很容易得到，比如可購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108(參見http//www.atcc.org)。關(guān)于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物在蛋白表達(dá)中的應(yīng)用一般可以參見上文中提到的Sambrook和Ausubel等人著作。在一些實(shí)施方案中，來源于哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子被用于，例如，哺乳動物細(xì)胞系中的基因表達(dá)。適合的啟動子可以是組成型、細(xì)胞類型特異型、階段特異型和/或可調(diào)控型(如通過糖皮質(zhì)激素等激素作用來調(diào)控)。有用的啟動子包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導(dǎo)的MMTV啟動子、SV40啟動子以及本領(lǐng)域熟知的啟動子增強(qiáng)子聯(lián)合等等。IRM多肽和片段同樣可以通過能夠整合入宿主細(xì)胞染色體的適當(dāng)表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因動物(鼠、羊、牛等)和轉(zhuǎn)基因植物(煙草、擬南芥等)中表達(dá)。
IV.診斷和預(yù)后方法一方面，本發(fā)明給出一個確定被測個體是否患有胰島素抗性或IR相關(guān)病癥或有危險發(fā)生胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的方法，即通過一個或多個IRM基因表達(dá)譜的變化來檢測。在本發(fā)明的一個方面，通過監(jiān)測IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)來診斷個體是否為胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的患者或易感者。在一相關(guān)方面，通過監(jiān)測IRM表達(dá)進(jìn)行預(yù)后評價以檢出有發(fā)生胰島素抗性和IR相關(guān)病癥危險的個體。預(yù)后方法也可用于疾病嚴(yán)重度和適當(dāng)治療方法的評估。IRM基因產(chǎn)物可以進(jìn)行定性或定量(絕對或相對)分析，并可以根據(jù)分析方法的形式、分析樣本的屬性以及所尋求的信息以多種方式解釋分析結(jié)果。所以，一方面，本發(fā)明提供診斷被測個體是否具有胰島素抗性、IR相關(guān)病癥或者對胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的易感性的方法，方式是檢測表1中至少1個胰島素抗性標(biāo)記(IRM)在來自被測個體的生物樣本中的表達(dá)與此IRM在非胰島素抗性參考個體群(例如具有eIS表型的群體)的類似生物樣本中的特征性表達(dá)水平之間是否存在差異。參考群體可以與被測個體在性別、年齡和/或種族上匹配。在一個實(shí)施方案中，IRM表達(dá)水平通過檢測IRM RNA來獲悉，例如可以通過從被測個體之RNA衍生的探針與固定化多核苷酸靶雜交然后檢測雜交復(fù)合物的形成來確定IRM表達(dá)水平。可用的多核苷酸靶包括可與表1所列IRM基因雜交的多核苷酸。適宜的探針包括使用被測個體之RNA制備的任選標(biāo)記的cDNA探針、從被測個體分離出的任選標(biāo)記的RNA，任選標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物或者RNA或cDNA，或者其他的檢測探針(例如，所謂的侵入者指導(dǎo)的切割(invader-directed cleavage)，例如US Pat.No.6,001,567)。在一個實(shí)施方案中，與探針雜交的是固定化的多核苷酸陣列，這些固定化的多核苷酸中包含可以與表1所列的至少兩個不同的IRM基因雜交的多核苷酸?；谝葝u素抗性的診斷，醫(yī)生可給出適當(dāng)?shù)闹委煼桨负徒ㄗh以改善疾病的癥狀或結(jié)果、或者使患者恢復(fù)非胰島素抗性狀態(tài)。盡管以往胰島素抗性易感性的診斷取決于糖尿病家族史、高血壓、肥胖、OGTT和SSPG檢測結(jié)果以及其他本領(lǐng)域已知的危險因素(低HDL、高甘油三脂等)，然而本發(fā)明提供了另一種方法來鑒定患者為胰島素抗性高易感性(即，具有高于普通群體的平均水平的易感性，亦即高危險度或高于平均水平的危險度)。診斷為易感性的患者可以實(shí)施預(yù)防治療從而避免該病癥的發(fā)生或惡化。本發(fā)明給出了胰島素抗性患者或胰島素抗性易感性患者的診斷方法，即，測定患者樣本中IRM基因表達(dá)水平并且與具有已知的胰島素抗性狀態(tài)的群體(如非胰島素抗性群體)所特征的表達(dá)水平進(jìn)行比較。非胰島素抗性群體和/或被認(rèn)為無高度危險發(fā)生胰島素抗性的群體(“健康”群體，如eIS群體)中的IRM基因表達(dá)水平(例如，平均水平)被稱作“正常”水平。IRM基因表達(dá)水平的差異可以作為胰島素抗性或胰島素抗性易感性的診斷指標(biāo)，這種差異可以是相對于正常水平的降低，也可以是升高。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法涉及從被測個體獲取生物樣本，通常是組織樣本，優(yōu)選血液樣本。用于檢測IRM基因表達(dá)和本發(fā)明其它診斷方法的樣本可以通過多種途徑獲得。由于本發(fā)明方法主要設(shè)計用于人胰島素抗性和IR相關(guān)病癥(例如二型糖尿病)的診斷和危險因素評估，所以樣本通常都來源于人類被測個體。然而，本方法也可以使用來源于其它哺乳動物(例如非人靈長類動物，如猿和黑猩猩等，大鼠及小鼠)的樣本，或者是來源于體外細(xì)胞培養(yǎng)物的樣本，比如用于篩選藥物和/或進(jìn)行臨床前毒性及藥效試驗(yàn)?？梢詫⑦@些樣本稱為“生物樣本”。在本發(fā)明中應(yīng)用的生物樣本包括血液樣本、血清、細(xì)胞(包括完整細(xì)胞、細(xì)胞級分、細(xì)胞提取物和培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系)、組織(包括活檢組織)、來自體液的細(xì)胞(如尿液、痰、羊水、滑液、精液、唾液、眼淚和脊髓液)或培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。來源于患者的生物樣本在本文中有時被稱為“患者樣本”。當(dāng)然，在對樣本中的IRM基因產(chǎn)物的量進(jìn)行分析之前，生物樣本可以接受多種廣為人知的收集后制備和貯存技術(shù)(貯存或冰凍等)的操作。在一個實(shí)施方案中，生物樣本是來自患者的血液或血液組分。例如，可以在禁食8小時后抽血，并收集到含有例如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(濃度為1.5mg/ml血液)的抽真空后的管(例如，“vacutainer”采血管)中。如果需要，在采血2小時內(nèi)將血樣在4℃離心1500×g 30分鐘，收集白細(xì)胞。在上層血漿和下層紅細(xì)胞之間的界面含有白細(xì)胞(白細(xì)胞層)，收集并用于后續(xù)分析(例如，用常規(guī)方法提取RNA)。患者組織樣本中的IRM基因表達(dá)水平可以與具有已知的胰島素抗性狀態(tài)的群體(比如，健康個體)中的正常表達(dá)水平以多種方式進(jìn)行比較。例如，組織樣本中IRM基因表達(dá)水平可以與參考或基線值進(jìn)行比較。盡管參考值可以是具有已知的胰島素抗性狀態(tài)的某個個體的IRM表達(dá)水平，但是通常參考值都是具有已知的胰島素狀態(tài)(如eIS表型、eIR表型)的個體群中此IRM的特征性表達(dá)水平。通常，參考值是由具有至少3例，通常至少5例或更多例個體的群體確立的統(tǒng)計值(例如，均值)，詳見后文。后文中提到的個體的特征值應(yīng)理解為也指個體群的特征值。如下文所述，通常參考值或基線值是健康個體的特征性IRM表達(dá)水平。健康個體的實(shí)例包括未患有IR的個體或，在某些實(shí)施方案中，非胰島素抗性高危發(fā)生個體(包括，在某些實(shí)施方案中，具有eIS表型的個體或群體)。被測個體中的實(shí)驗(yàn)值或測量值(即，“檢測值”)與參考值之間的差異說明被測個體患有胰島素抗性或IR相關(guān)病癥，或者具有發(fā)生胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的危險性。為了診斷的目的，參考值可以是健康個體中的IRM基因表達(dá)水平。或者，參考值可以是在較早或較晚時間從被測個體獲得的組織樣本中的IRM表達(dá)水平。通常，參考值是基于對照細(xì)胞或個體的群體確立的統(tǒng)計值(例如，均值)。該對照群體的大小可變，可以少至1個成員，但是可能的是包括幾十例、幾百例或幾千例個體。通常確定參考值所基于的每個群體的群體大小為至少3例，任選地至少5例個體。當(dāng)對照是一個大群體時，參考值可以是群體各成員測定值的統(tǒng)計值，也可以是將對照群體作為一個集合體得到的測定值(例如，在一個孔內(nèi)測定細(xì)胞群體得到的值)。因此，參考值可以是例如反映普通群體(更通常地為未患有IR且不具有發(fā)生IR的增加危險性的健康個體，有時也可為具有eIS表型的個體群)的IRM水平的統(tǒng)計水平或范圍。為了確定參考值或基線值，健康個體(即，沒有IR的個體)可以通過如下標(biāo)準(zhǔn)確定禁食葡萄糖＜95mg/dl，75-g 2-hr OGTT葡萄糖＜120mg/dl且最好＜100mg/dl，SSPG均值＜150mg/dl且最好＜120mg/dl，75-g 1hr或2-hr胰島素＜60μIU/ml。具有eIS表型的個體(也即健康個體)也可用于確定基線值或參考值。確定某個體是否具有eIS表型的標(biāo)準(zhǔn)在上文中已給出。胰島素抗性也可以通過正常血糖胰島素鉗夾技術(shù)(Andres等，1966，分析化學(xué)的自動操作技術(shù)(Automation in AnalyticalChemistry)；Skeggs LT編P.486-91)和極小模型(Bergman等，1987，JClin Invest 79790-800)來確定。正常IRM表達(dá)水平可以在任何特定的生物群體、亞群體或組中依照本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計學(xué)方法可以確定表達(dá)的基線水平并識別出與參考值之間的顯著偏差。因此，例如，可以確定群體(如，至少3、至少5或至少10例個體)中IRM表達(dá)水平，并利用常規(guī)方法定義與該群體的統(tǒng)計學(xué)顯著差異。如果隨機(jī)發(fā)生所觀察到的差異的可能性(p值)小于某一預(yù)定水平，這種差異典型地被認(rèn)為具有“統(tǒng)計學(xué)上的顯著性”。本文中“統(tǒng)計學(xué)顯著差異”指p值＜0.05，優(yōu)選＜0.01且最優(yōu)選＜0.001。具有胰島素抗性或增加的胰島素抗性易感性的被測個體與由健康個體組成的群體相比，IRM基因表達(dá)差異的大小將隨基因的不同和疾病嚴(yán)重程度的不同而有差別。在一些實(shí)施方案中，測試個體中的IRM基因表達(dá)與參考值相比如果存在如下情況則被認(rèn)為存在差異(上調(diào))，所述情況指的是檢測值高于參考值至少大約25％，常常至少大約50％，有時增加50～100％，有時檢測值大約2～5倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)(即，3或4倍)，有時大約5～10倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約10～20倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約20～50倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約50～100倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，再有時100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，測試個體中的IRM基因表達(dá)與參考值相比如果存在如下情況則被認(rèn)為存在差異(下調(diào))，所述情況指的是檢測值低于參考值至少大約25％，常常至少大約50％，有時大約2～5倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約5～10倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約10～20倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約20～50倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，有時大約50～100倍或之間的任何整數(shù)倍數(shù)，再有時100倍或更多。在一些實(shí)施方案中，IRM蛋白或IRM mRNA水平是通過定量來自于被測個體(例如，人類個體)的生物樣本中的IRM蛋白和/或mRNA來決定的。但是，應(yīng)當(dāng)明了，分析方法無需測定IRM表達(dá)的絕對值，除非如此期望，因?yàn)閷τ诒景l(fā)明方法的多種應(yīng)用來說相對值即足夠。需要定量的時候，本發(fā)明可以提供試劑以便實(shí)際上任何已知的基因產(chǎn)物定量方法均可以使用。由于IRM表達(dá)水平在不同組織中可能有差異，因此優(yōu)選檢測值和參考值或基線值來源于同一組織(如血或特定血液級分——B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或其他白細(xì)胞等)。對于某些樣本和目的，可能期望定量單位細(xì)胞或單位體積的IRM基因產(chǎn)物。而且，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，通?？赡芷谕麥y試值和參考值是在相似條件下得到的。例如，如果使用血液樣本，一般在禁食條件下收集血液(即，至少8小時內(nèi)無卡路里攝取，如過夜禁食)。在一個實(shí)施方案中，例如，為評估胰島素抗性，采集數(shù)據(jù)用以獲得疾病嚴(yán)重程度或進(jìn)程與不同IRM表達(dá)模式的統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性，并針對來自具有已知臨床結(jié)果的個體的相同細(xì)胞或組織樣本確立IRM水平的預(yù)定范圍。為了產(chǎn)生用于比較的統(tǒng)計學(xué)顯著值(或值域)進(jìn)行足夠數(shù)量的測量。然后可以利用針對給定的細(xì)胞或組織樣本的預(yù)定IRM水平或活性范圍確定與有利(或不利)預(yù)后狀況相關(guān)的IRM基因產(chǎn)物水平或其范圍。之后可以對生物樣本(如患者樣本)的IRM基因產(chǎn)物水平進(jìn)行確定并與范圍的上限和下限進(jìn)行比較，以便進(jìn)行臨床結(jié)果的預(yù)測。如上說述，實(shí)施本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法時，有時提及“診斷值”和“預(yù)后值”是有用的。在此，“診斷值”描述的是針對樣本中檢測的IRM基因產(chǎn)物的測量值，通過該值與IRM基因產(chǎn)物的正常(或基線)范圍相比可以指示疾病(如胰島素抗性或II型糖尿病)的存在?！邦A(yù)后值”描述的是在給定細(xì)胞類型(如血細(xì)胞)中檢測到的IRM基因產(chǎn)物量，該值相應(yīng)于特定的疾病診斷和預(yù)后結(jié)果。將樣本中檢測到的IRM基因產(chǎn)物量(包括零)與針對該細(xì)胞的預(yù)后值進(jìn)行比較，以便通過這些值的相對比較指示疾病的存在或可能的疾病發(fā)展結(jié)果。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在實(shí)施分析試驗(yàn)之前或以后，確定被測個體是否為有危險或有增加的危險發(fā)生胰島素抗性的患者。例如，可以基于被測個體或被測個體家族的病史確定被測個體的發(fā)病危險性。胰島素抗性和IR相關(guān)病癥的診斷還可基于來自被測個體的生物樣本的IRM基因多態(tài)的檢測，詳見下文。因此，作為本發(fā)明的一個方面，分析IRM基因的序列(即，多態(tài))或表達(dá)以確定該個體與群體的平均情況相比是否更可能發(fā)生胰島素抗性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供確定個體是否為胰島素抗性的方法，方式是鑒定胰島素抗性危險患者(或懷疑為具有發(fā)生胰島素抗性危險的患者)、獲取個體的組織樣本并對該組織樣本中的IRM表達(dá)水平與參考值進(jìn)行比較。讀者需要認(rèn)識到的是，此處描述的方法也可以(在進(jìn)行明顯的改動下)用于具有極端胰島素敏感表型的個體的診斷或篩查。
IRM組的表達(dá)分析在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷、預(yù)后和藥物篩選分析方法(例如，下文所述)，其中監(jiān)測1個以上IRM基因(“系列IRM基因”)的表達(dá)水平。這些方法也用于監(jiān)控IR相關(guān)病癥的發(fā)展和療效。多個基因的表達(dá)監(jiān)控為更有力的分析方法提供了準(zhǔn)備。因此，在多種實(shí)施方案中，針對被測個體(例如，用于診斷和預(yù)后分析)或細(xì)胞系(如用于藥物篩選分析)確定包含IRM基因組合(如，至少2，3，4，5，6 7，8，9，10，11，12，15，20或25個或更多的表1所列基因，或其亞系列)的基因表達(dá)譜。可以通過任何(包括但不局限于下文所提的方法)檢測RNA或蛋白水平的方法(例如，膜雜交或微陣列雜交、RT PCR等)確定IRM表達(dá)水平。執(zhí)行這些分析試驗(yàn)時，可以利用包含針對特異IRM基因產(chǎn)物的探針陣列的裝置，例如，本文中所述的裝置。有用的IRM基因亞組的選擇可以基于結(jié)構(gòu)、功能或其他標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。IRM組的實(shí)例包括，但不僅限于包含例如下列的組(a)IRM 1，21，33，124，180，190，200，230，288，和290；(b)IRM 11，44，84，122，136，140，150，202，210，236，244，296，309，310，320，和336；(c)IRM 50，56，67，119，170，270，和280；(d)IRM 6，10，11，28，56，57，67，73，80，118，120，148，152，160，170，178，207，210，228，248，250，255，270，280，330，331，332，和340；(e)IRM110，278，和326；(f)IRM 6，74，78，266，和297；(g)IRM 4，12，16，18，19，20，25，27，29，40，49，51，52，60，62，66，68，75，77，85，90，92，94，100，146，182，188，217，240，250，259，260，314，328，和344；(h)IRM 69，220，228，244，277，和300；(i)IRM 10，20，40，50，60，120，130，180，190，200，210，220，和260；(j)IRM 90，150，160，170，250，和300；(k)IRM 30，70，81，130，和303；(l)IRM 10，20，40，50，60，120，130，220，和260；(m)IRM10，20，40，50，60，120，和130；(n)IRM 10，20，40，50，60，和130；(o)IRM90，160，170，250，和300；(p)IRM 120；(q)IRM 350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，和363；(r)IRM 350，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，和363；(s)IRM 350，351，353，354，355，356，357，358，359，360，361，和362；(t)選自于一個組的至少2，3，4，5，6，7，8，9，或至少10個IRM。正如所指出的，在多種實(shí)施方案中，診斷、預(yù)后、藥物篩選或其他分析方法可能會監(jiān)測任何IRM基因組合的表達(dá)(即，基因表達(dá)譜)，所述組合為例如包含至少2，3，4，5，6，7，8，9，或至少10個表1所列IRM基因的組合或表1所列IRM的亞組。本發(fā)明考慮到使用2個或2個以上IRM基因的所有聯(lián)合的分析方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明給出了鑒定個體是否具有胰島素抗性、胰島素抗性發(fā)生危險性或胰島素敏感性的方法，方式是從被測個體獲取生物樣本，分析樣本中IRM基因表達(dá)水平與參考值相比是否有差異，其中參考值代表具有已知的胰島素抗性狀態(tài)的個體的表達(dá)(例如，從個體群確定的值)。因此，在一個實(shí)施方案中，參考值可以是胰島素抗性或胰島素抗性危險個體中的特征性表達(dá)。相同的方法和參考水平可用于分析一組幾個IRM基因并可以用于單基因表達(dá)的測定和比較。當(dāng)使用一組IRM基因時，診斷可以由在被測個體中具有與給定的參考水平(即，具有已知的胰島素抗性狀態(tài)如eIR表型的群體的特征值)相似的表達(dá)的IRM基因的數(shù)量和身份來決定。在一個實(shí)施方案中，例如，如果至少50％(任選地至少25％或至少75％)的IRM基因的表達(dá)水平都與代表胰島素抗性或高易感性群體中的特征性表達(dá)的參考值相似，那么可以推斷該個體為胰島素抗性個體或有發(fā)生胰島素抗性的危險的個體。在另一實(shí)施方案中，參考值為健康個體的特征性表達(dá)值，因此當(dāng)至少50％(任選地至少25％或至少75％)的IRM基因的表達(dá)水平都與參考值不同時，可以推斷該個體為胰島素抗性個體或有發(fā)生胰島素抗性的危險的個體。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷個體是否為胰島素抗性或具有發(fā)生胰島素抗性的增加危險性的方法，方式為獲取被測個體的生物樣本，然后對樣本中表1所列至少3個IRM基因的表達(dá)水平與參考值進(jìn)行比較，其中參考值代表具有已知胰島素抗性狀態(tài)的個體群中的表達(dá)，如果參考值為胰島素抗性群體的特征性表達(dá)值且所述至少3個IRM基因中至少50％IRM的表達(dá)水平與參考值相比沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，或者如果參考值為非胰島素抗性群體的特征性表達(dá)值且所述至少3個IRM基因中至少50％IRM的表達(dá)水平與參考值相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，那么該個體即診斷為胰島素抗性患者或有發(fā)生胰島素抗性的危險患者。在一個實(shí)施方案中，胰島素抗性個體具有eIR表型，和/或非胰島素抗性個體具有eIS表型。
IRM基因產(chǎn)物表達(dá)的監(jiān)控一個方面，本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法涉及IRM基因產(chǎn)物(RNA或多肽)表達(dá)的檢測。此分析方法可以用于診斷、預(yù)后、藥物篩選和其他應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，如此處所述，對被測個體或細(xì)胞的IRM基因表達(dá)水平與參考值進(jìn)行比較分析?；诒竟_的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，對于IRM表達(dá)的定性、定量或半定量分析有很多不同的常規(guī)方法可用。例如，IRM基因表達(dá)可以通過檢測特異多核苷酸(如IRM RNA)或特異多肽(如IRM蛋白)來監(jiān)控。適用的特異多核苷酸檢測方法包括，但不限于，點(diǎn)雜交、Northern雜交、原位雜交、高密度多核苷酸或寡核苷酸陣列雜交、核酸擴(kuò)增方法(如定量反轉(zhuǎn)錄PCR)、RNA酶保護(hù)分析等等。適用的特異多肽檢測方法包括但不限于利用特異結(jié)合IRM多肽或其表位的抗體或其他試劑的免疫分析(如ELISA、Western雜交等等)或者可指示IRM多肽存在的酶活性分析等。關(guān)于IRM RNA和多肽的適宜檢測方法下文將列舉其中幾例詳述，這些例子僅用于舉例闡釋而非限制。
IRM多核苷酸的分析方法本發(fā)明的一部分診斷和預(yù)后方法涉及對生物樣本中IRM RNA轉(zhuǎn)錄本的檢測。為檢測RNA水平，獲取來自或衍生自生物樣本的核酸。從生物樣本衍生的核酸是指最終以樣本中的mRNA轉(zhuǎn)錄物(或其亞序列)為模板合成的核酸。例如，mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、由cDNA轉(zhuǎn)錄的cRNA、cDNA擴(kuò)增得到的DNA、從擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA都是由mRNA轉(zhuǎn)錄本“衍生”而來的，檢測上述衍生產(chǎn)物可以表明樣本中最初轉(zhuǎn)錄本的存在和/或豐度。因此，適宜的樣本包括，但不限于，IRM的mRNA轉(zhuǎn)錄本、從此mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、由此cDNA轉(zhuǎn)錄的cRNA、由IRM核酸擴(kuò)增得到的DNA和從擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA等等。在一些實(shí)施方案中，這些方法始于細(xì)胞裂解及隨后核酸從其他細(xì)胞物質(zhì)中的純化。然而，通常不必要將核酸與其它物質(zhì)完全分離。從個體生物樣本中提取RNA的本領(lǐng)域熟知方法有多種(參見Sambrook和Ausubel，前述引文)。例如，當(dāng)以禁食個體的血樣開始收集RNA時，可以裂解紅細(xì)胞并收集白細(xì)胞，之后按每10ml全血加入1.3ml TRIZOL(Life TechnologyIncorporation，GIBCOBRL，Cat#15596-018)來裂解白細(xì)胞。加入300微升氯仿以引起混合物分相，用力震蕩后靜置一段時間。用12,000rpm離心15分鐘，使得混合物完全分成含有RNA的水相和含有基因組DNA和蛋白的有機(jī)相。收集水相，乙醇沉淀法獲取RNA。提取的RNA的質(zhì)量和完整性通過與1μg和0.5μg的RNA標(biāo)準(zhǔn)(Stratagene catalogue#735026成年，胎盤總RNA)一起并行凝膠電泳(1％瓊脂糖凝膠，在含有0.1％DEPC處理后的1X TBE的電泳槽中，270伏之下電泳10分鐘)來鑒定。通過Alpha Imager 2200光密度計對比樣本條帶與標(biāo)準(zhǔn)RNA條帶的強(qiáng)度即可獲悉RNA樣本的量。用提取的RNA制備的探針可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行標(biāo)記(如在標(biāo)記核苷酸存在的條件下反轉(zhuǎn)錄和PCR)。很多熟知的方法，如擴(kuò)增和基于雜交的方法，都可用于檢測IRM基因表達(dá)水平(參見Sambrook和Ausubel，前述引文)，其它適合生物樣本的方法也可以使用。例如，可以使用基于雜交的分析(其中使多核苷酸探針與目標(biāo)多核苷酸雜交)。實(shí)例性多核苷酸探針和引物的有關(guān)描述詳見下文，用于多核苷酸雜交的多核苷酸探針序列的選擇方法是熟知的(參見，例如Sambrook和Ausubel，上述引文)。有的雜交方式需要至少一個目的序列或探針為固定化的。固定化的多核苷酸可以是DNA，RNA或其它形式的寡聚或多聚-核苷酸，并可以包含天然的或非天然的核苷酸、核苷酸類似物或骨架。這樣的分析試驗(yàn)可以通過多種形式來進(jìn)行，包括高密度多核苷酸或寡核苷酸陣列(Lipshutz，等.Nat Genet 1999，2120-4；U.S.Pat.Nos.5,445,934；5,578,832；5,556,752；及5,510,270)、高密度cDNA陣列(參見Schena et al.，1995，Science270467-70)、Southern印跡、Northern印跡雜交、點(diǎn)印跡及狹線印跡、dipsticks、針、芯片或小珠。以上方法均為本領(lǐng)域熟知的，而且是許多商業(yè)化的診斷試劑盒的基礎(chǔ)。雜交技術(shù)在Hames等人編輯的《NUCLEICACIDHYBRIDIZATION，APRACTICALAPPROACH》(IRL Press，1985)書中以及Gall和Pardue(1969，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，63378-383)、John等人(1969，Nature，223582-587)兩篇文獻(xiàn)中有一般性描述。點(diǎn)雜交可用于定量分析獲自測試個體的核酸樣本中IRM轉(zhuǎn)錄本的量。在這些分析方法中，來自于測試個體的樣本被點(diǎn)在支持物(如濾膜)上，然后用標(biāo)記后的核酸探針進(jìn)行探測，該探針可以與IRM核酸特異雜交。允許探針在濾膜上與固定化的核酸雜交以后，洗脫未結(jié)合的核酸，可以檢測雜交復(fù)合體并且通過與濾膜結(jié)合的標(biāo)記探針的數(shù)量進(jìn)行定量。Northern雜交用于樣本中IRM轉(zhuǎn)錄本的檢測和定量。此方法通常涉及最先分離細(xì)胞總RNA或poly(A)RNA，然后將RNA在瓊脂糖凝膠上電泳分離，用硝酸纖維素或活化的纖維素濾膜、或者玻璃或尼龍膜覆蓋在凝膠上，使膠上的分離RNA通過轉(zhuǎn)移緩沖液穿過凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。然后可以利用標(biāo)記后的與IRM互補(bǔ)的特異探針進(jìn)行探測以形成可以被檢測和任選地定量的標(biāo)記的雜交復(fù)合體，從而確定膜上IRM轉(zhuǎn)錄本的存在和量(參見，例如Sambrook和Ausubel，前述引文)。相關(guān)的雜交方法通過核酸探針陣列來檢測和定量IRM轉(zhuǎn)錄本。陣列中的探針的類型可以變化，包括例如合成的相對短探針(例如，20-mer或25-mer)、cDNA(全長基因或短于全長的片段)、擴(kuò)增的DNA、DNA片斷(如限制性內(nèi)切酶消化而成)以及反轉(zhuǎn)錄DNA(參見Southern等，1999，Nature Genetics Supplement 215-9)等等。定制陣列和普通陣列都可用于IRM表達(dá)水平的檢測。定制陣列可以使用與IRM mRNA基因序列的特定預(yù)先選定亞序列或其擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的探針制備。普通陣列不是專門制備用來結(jié)合IRM序列的，而是設(shè)計用來分析任何序列的mRNA的。然而，仍然可以使用此陣列，因?yàn)槭荌RM核酸僅能在包括其互補(bǔ)探針的位置雜交。因此，基于承載互補(bǔ)序列探針的位置的結(jié)合程度，仍可以確定IRM水平。在探針陣列方法中，一旦從測試樣本獲得核酸，通常要將它們反轉(zhuǎn)錄為標(biāo)記的cDNA，雖然也可使用標(biāo)記的mRNA。然后使包含標(biāo)記核酸的測試樣本與探針陣列相接觸。經(jīng)過充分的時間使得樣本中所有標(biāo)記的IRM核酸都能與探針雜交，然后典型地在高度嚴(yán)格洗滌條件下洗滌此陣列一次或多次以去除未結(jié)合的核酸，同時盡量減少與陣列核酸探針的非特異結(jié)合。通過多種商品化掃描設(shè)備和附隨的分析軟件便可檢測標(biāo)記IRM的結(jié)合情況。例如，如果來源于樣本的核酸進(jìn)行熒光標(biāo)記，則雜交的強(qiáng)度可以通過例如光子計數(shù)模式的掃描共聚焦顯微鏡來確定。有關(guān)適宜掃描裝置的描述參見Trulson等的U.S.5,578,832、Stem等的U.S.5,631,734，并且可以從Affymetrix公司獲得商品名GeneChipTM的此裝置。一些類型的標(biāo)記物提供了可以通過酶法擴(kuò)增的信號(參見Broude等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913072-76)。還可應(yīng)用其它多種標(biāo)記物，包括，如放射性同位素、發(fā)色團(tuán)、磁顆粒和密電子顆粒等等。與標(biāo)記核酸雜交的探針陣列的位置可以通過解讀器來識別，例如U.S.專利No.5,143,854，WO 90/15070，和U.S.5,578,832的描述。定制陣列中，然后可以分析雜交模式以確定所分析樣本中已知mRNA種類的存在和/或相對量或絕對量，見WO 97/10365。關(guān)于探針陣列使用的其他足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的教導(dǎo)可以參見WO 97/10365，PCVUS/96/143839和WO 97/27317。有關(guān)微陣列在表達(dá)分析中的用途的其他討論可參考Duggan等，1999，Nature Genetics Supplement 2110-14；Bowtell，1999，NatureGenetics Supplement 2125-32；Brown和Botstein，1999，Nature GeneticsSupplement 2133-37；Cole等，1999，Nature Genetics Supplement 2138-41；Debouck和Goodfellow，1999，Nature Genetics Supplement 2148-50；Bassett，Jr.，et al.，1999，Nature Genetics Supplement 2151-55；以及Chakravarti，1999，Nature Genetics Supplement 2156-60。核糖核酸酶保護(hù)分析法(RPA)可用于IRM表達(dá)的檢測。RPA方法涉及制備針對IRM的標(biāo)記反義RNA探針，隨后使探針在液相中與包含在生物樣本中的IRM轉(zhuǎn)錄本雜交形成RNARNA雜交體。未雜交的RNA用RNAase消化去除，而RNARNA雜交體卻在此消化過程中受到保護(hù)而不被降解。然后通過凝膠電泳分離標(biāo)記的RNARNA雜交體，檢測和定量分析IRM相應(yīng)的條帶。通常被標(biāo)記的RNA探針是由放射性同位素來標(biāo)記的，通過放射性自顯影進(jìn)行IRM條帶的檢測和定量。(有關(guān)RPA的進(jìn)一步討論參見Lynn et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802656；Zinn等，1983，Cell 34865；以及Sambrook和Ausubel，同前引文。)
在一個實(shí)施方案中，原位雜交用于檢測樣本中IRM序列。原位雜交分析為人熟知，一般地描述在Angerer等，酶學(xué)方法(METHODSENZYMOL.)，152649-660(1987)和Ausubel，同前引文。此方法通常涉及首先將測試細(xì)胞固定于支持物(如微量滴定板孔壁)上，然后用適宜的透化溶液使細(xì)胞透化，再用含有針對IRM的標(biāo)記探針的溶液與細(xì)胞接觸，允許探針與IRM核酸雜交，消化過量探針、洗滌，之后對雜交的探針定量。此方法詳見Harris，1996，Anal.Biochem.243249-256；Singer et al.，1986，Biotechniques 4230-250；Haase et al.，1984，METHODS IN VIROLOGY，vol.VII，pp.189-226；核酸雜交操作指南(NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATIONA PRACTICAL APPOACH)(Hames，et al.，eds.，1987)?；跀U(kuò)增的方法，如PCR和LCR，也可以用于檢測IRM表達(dá)。擴(kuò)增核酸有很多方法，例如(1)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(參見《PCR技術(shù)DNA擴(kuò)增的原理及應(yīng)用》(PCR TECHNOLOGYPRINCIPLESAND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION)(H.A.Erlich，Ed.)Freeman Press，NY，NY(1992)；《PCR操作方法和應(yīng)用指南》(PCRPROTOCOLSA GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS)(Innis，et al.，Eds.)Academic Press，San Diego，CA(1990)；以及U.S.專利號4,683,202和4,683,195)；(2)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)以及Landegren等，Science 2411077(1988))；(3)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))；(4)自動維持序列擴(kuò)增(參見Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874(1990))；(5)基于核酸的序列擴(kuò)增反應(yīng)(NABSA)(參見Sooknanan，R.和Malek，L.，BioTechnology 13563-65(1995))；(6)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)(參見Walker et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89392-396)；(7)基于核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)(NASBA)(參見Cangene，Mississauga，Ontario；Compton，1991，Nature 35091)，等等。PCR方法衍生的一個實(shí)用的方法是PCR ELISA(見BoehringerMannheim Cat.No.1 636 111)，該方法中用地高辛標(biāo)記的dUTP摻入PCR反應(yīng)產(chǎn)物中。PCR反應(yīng)混合物變性后與生物素標(biāo)記的寡核苷酸鏈雜交，該寡核苷酸鏈經(jīng)設(shè)計能夠在退火時結(jié)合到PCR產(chǎn)物的內(nèi)部序列上。雜交產(chǎn)物固定于鏈霉親和素包被的平板上并通過抗地高辛的抗體進(jìn)行檢測。多種所謂“實(shí)時擴(kuò)增”方法或“實(shí)時定量PCR”方法都可用于樣本中IRM mRNA的定量檢測分析。該方法涉及測量在擴(kuò)增的過程中形成的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。熒光核酸酶分析是可以用于檢測和定量IRM轉(zhuǎn)錄本的實(shí)時定量方法的一個具體實(shí)例。通常，此方法通過雙重標(biāo)記的熒光寡核苷酸探針連續(xù)測定PCR產(chǎn)物積累，此方法有時在文獻(xiàn)中簡稱為“TaqMan”方法。該方法中的探針通常為短(大約20-25個堿基)多核苷酸，并且由兩種不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。通常探針5’端連接報道染料，3’端連接淬滅染料，但這些染料也可以連接于探針的其它位置上。為測量IRM轉(zhuǎn)錄本，探針被設(shè)計為與IRM轉(zhuǎn)錄本上的探針結(jié)合位點(diǎn)具有至少實(shí)質(zhì)上的序列互補(bǔ)性。結(jié)合IRM兩側(cè)區(qū)域的上游和下游PCR引物也可以加入到反應(yīng)混合體系中，用以擴(kuò)增IRM多核苷酸。當(dāng)探針完整的時候，兩個熒光團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，報道染料的發(fā)光被淬滅染料所淬滅。在PCR的延伸期中，探針被Taq聚合酶等核酸聚合酶的5’核酸酶活性切割，從而使報道染料脫離探針-淬滅染料復(fù)合體，導(dǎo)致報道染料的發(fā)光強(qiáng)度增加，該熒光可被適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)測量?；跀U(kuò)增的檢測中使用的引物可以根據(jù)靶序列(待檢測的序列)的信息容易地設(shè)計。某些分析中特別適宜的引物具有近60℃的TM值，長度在100～600bp之間，并且與待擴(kuò)增區(qū)段具有特異性(這可以由GenBank的BLAST分析和預(yù)期引物，例如，使用軟件如Oligo 6(Molecular BiologyInsights，Inc.；http//www.oligo.net)來確定)。優(yōu)選引物跨越內(nèi)含子/外顯子拼接處，從而可以容易地將污染的基因組DNA的擴(kuò)增與所需的RNA/cDNA的擴(kuò)增分開。眾所周知，引物不應(yīng)自身內(nèi)形成雙螺旋，或是與用于擴(kuò)增的引物對(如果存在的話)的另一引物之間形成雙螺旋。Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)制造的ABI 7700分析儀是專門適用于檢測熒光發(fā)射(諸如在熒光分析中產(chǎn)生的熒光)的一種裝置。該裝置的配套計算機(jī)軟件能夠在擴(kuò)增過程中記錄報道劑和淬滅劑的熒光強(qiáng)度。這些記錄值然后可以用于計算標(biāo)化的報道劑發(fā)光強(qiáng)度的連續(xù)增加以及最終對所擴(kuò)增的mRNA進(jìn)行定量。實(shí)時PCR方法的另一實(shí)例中，PCR通過Cy5標(biāo)記的引物和單熒光標(biāo)記的探針來進(jìn)行。當(dāng)探針在退火過程中與Cy5標(biāo)記引物的延伸產(chǎn)物結(jié)合時，這些熒光團(tuán)被拉的足夠靠近以致可以引發(fā)能量共振轉(zhuǎn)移，從而增加Cy5的熒光強(qiáng)度。參見Stoitchkov et al.，Clin Chim Acta.2001，306133-8。另一個可以與多種設(shè)備系統(tǒng)一起使用的檢測方法是分子信標(biāo)(Molecular beacon)的應(yīng)用。分子信標(biāo)是有內(nèi)部淬滅的熒光團(tuán)的DNA分子，當(dāng)它們結(jié)合到互補(bǔ)的靶序列上時，熒光團(tuán)的熒光便得以恢復(fù)。分子信標(biāo)是一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，環(huán)部是與靶DNA序列互補(bǔ)的探針序列，莖部是探針序列的兩末端互補(bǔ)序列退火形成的。熒光分子結(jié)合到DNA序列的一端，淬滅分子結(jié)合到另一端。莖部的雜交使得兩分子彼此靠近，從而熒光團(tuán)的熒光通過共振能量轉(zhuǎn)移被淬滅。當(dāng)探針遇到靶分子時便與其互補(bǔ)序列雜交。該雜交迫使莖部打開，從而使熒光團(tuán)和淬滅劑彼此分離，導(dǎo)致可被檢測的熒光恢復(fù)。參見，Steuerwald等，1999，Mol.Hum.Reprod.51034-39。有關(guān)實(shí)時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物量的熒光方法的原理和操作的其他細(xì)節(jié)可參見Gelfand的U.S.Pat Nos.5,210,015，Livak等的5,538,848、Haaland的5,863,736、以及Heid等1996，Genome Research 6986-994、Gibson等，1996，Genome Research 6995-1001、Holland et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280、以及Livak等，1995，《PCR方法及應(yīng)用》(PCRMETHODS AND APPLICATIONS)357-362。如前作述，有時需要建立用于和被測個體中的IRM基因產(chǎn)物表達(dá)進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)參考cDNA。適用的標(biāo)準(zhǔn)參考cDNA可以由熟練技術(shù)人員用已知的各種方法來制備。例如，由來源于具有相似OGTT和SSPG值的IS個體群(即極端IS表型群體)的RNA預(yù)先制備的cDNA可作為此標(biāo)準(zhǔn)。從每例禁食后eIS對照個體中采集血樣，用標(biāo)準(zhǔn)方法(如Gibco-BRL的Trizol法)在采血后1小時內(nèi)提取總RNA。等量混合來自每例IS標(biāo)準(zhǔn)個體的RNA，用Cy3-脫氧鳥苷三磷酸(dUTP)標(biāo)記進(jìn)行初始檢測或用Cy5-dUTP標(biāo)記進(jìn)行確證檢測。為評估患者的基因表達(dá)譜，在同一條件下禁食采血并提取RNA，用此RNA制備Cy5-dUTP標(biāo)記的cDNA。該cDNA與等量的Cy3標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)cDNA混合，然后與含有針對1個或多個IRM基因的探針的微陣列(玻璃或膜)雜交。通過上述方法檢測相對于標(biāo)準(zhǔn)對照的基因表達(dá)水平，并可以基于相對于標(biāo)準(zhǔn)對照上調(diào)或下調(diào)的基因的組合數(shù)目，對患者發(fā)生胰島素抗性或相關(guān)病癥的危險度進(jìn)行評分。如需要，結(jié)果可以通過“flip-dye”技術(shù)(參見Wang et al.，2000，Nat Biotech.18457-59)進(jìn)一步確證，見實(shí)施例中的描述。明顯地，在備選實(shí)施方案中，預(yù)先制備的cDNA標(biāo)準(zhǔn)樣本可以來源于健康(“正?！?個體、胰島素抗性個體、胰島素敏感個體等等。一般，患者和標(biāo)準(zhǔn)的IRM基因(相對)表達(dá)水平相似，說明該患者與標(biāo)準(zhǔn)具有相同的表型(例如，正常、胰島素抗性等)。
核酸引物和探針前述方法中的引物和雜交探針為具有足夠長度的多核苷酸，所述長度使得該多核苷酸可以與樣本中的IRM mRNA轉(zhuǎn)錄本特異雜交(例如，在嚴(yán)緊條件下)。如前所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇和制備用于檢測IRMmRNA的適宜探針或引物。例如，在一個實(shí)施方案中，引物或探針可以與例如(1)具有表1登錄序列的多核苷酸和其互補(bǔ)序列(除去任何ploy-A尾巴)以及(2)具有表1所列IMAGE克隆的插入序列的多核苷酸雜交。在多種實(shí)施方案中，探針與上述(1)或(2)的多核苷酸或其互補(bǔ)序列具有實(shí)質(zhì)上的序列同一性。在多種實(shí)施方案中，探針能夠在嚴(yán)緊條件下與上述(1)或(2)的多核苷酸序列的互補(bǔ)分子進(jìn)行雜交。在多種實(shí)施方案中，探針包含至少10個與上述(1)或(2)的多核苷酸一致或完全互補(bǔ)的堿基，常常至少大約15個堿基、至少大約20個堿基、至少大約25個堿基、至少大約50個堿基、至少大約100個堿基或至少大約500個堿基。引物常常含有大約12到大約100個與IRM序列一致或完全互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸，更常見為大約12個到大約50個連續(xù)核苷酸，甚至更常見為大約15個到大約25個連續(xù)核苷酸。探針的設(shè)計可以基于包含表1所列多核苷酸或其片斷的天然mRNA的序列來進(jìn)行。雜交探針通常至少15個核苷酸，有時20～30個核苷酸，有時30～50個核苷酸，有時甚至達(dá)到全長IRM核酸。在一些實(shí)施方案中，引物和雜交探針小于大約下列任一長度(按堿基或堿基對計算)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；10。在一些實(shí)施方案中，引物或雜交探針大于大約下列任一長度(按堿基或堿基對計算)10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000?；蛘撸锘螂s交探針可以是在以10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；或10為上限并以10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；或7500為獨(dú)立選擇的下限(其中，下限低于上限)的范圍內(nèi)的任何長度。在多種實(shí)施方案中，探針序列或者以上描述的部分具有與IRM序列相同或完全互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，探針和引物可以經(jīng)過修飾，如引入限制性酶切位點(diǎn)等。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的引物或探針包含額外序列，如接頭。在再一些實(shí)施方案中，本發(fā)明引物或探針用可檢測的標(biāo)記物進(jìn)行修飾。例如，可以對引物和探針進(jìn)行化學(xué)修飾，例如衍生化、摻入修飾的核苷酸堿基或包含能與抗-配體(如生物素)結(jié)合的配體。在一些實(shí)施方案中，探針用可檢測標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，例如利于檢測的放射性同位素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或酶等。在一些實(shí)施方案中，探針也可是衍生的。本發(fā)明的引物和探針可以通過化學(xué)合成(參見Narang等，1979，《酶學(xué)方法》6890；Brown等，1979，《酶學(xué)方法》68109)或重組等常規(guī)方法制備。引物和探針可以是RNA，DNA，PNA或嵌合體(chimeric)，也可以包含非天然堿基，如脫氧次黃嘌呤核苷(參見Batzer等，1991，Nucleic Acid Res.195081；Ohtsuka等1985，J Biol.Chem.2602605-2608；Rossolini等，1994，Mol.Cell.Probes 891-98)或修飾的骨架殘基或鍵。在本文提供的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇特異擴(kuò)增樣本中的IRM基因、mRNA或cDNA之全長或片斷的引物對。
IRM多肽分析也可以檢測IRM多肽的表達(dá)水平。在這里，IRM多肽這個術(shù)語指的是此處所述IRM基因編碼的多肽(如天然多肽)。術(shù)語IRM多肽也包括等位基因變體以及修飾后的蛋白。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語IRM也包括部分序列(如表達(dá)序列標(biāo)簽，EST)編碼的截短多肽或變體多肽。通過參考附隨表1所列GenBank登錄號序列的注釋，示例性多肽序列將是明顯的，并且這些序列可以通過此處公開的多核苷酸序列的概念性翻譯進(jìn)行推導(dǎo)。IRM蛋白可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)分離方法(參考前面提到的Harlow和Lane引文的相關(guān)描述)從組織(如血液)中分離。檢測特定多肽的方法為人熟知，包括但不限于酶免疫分析(ELA)、放射性免疫分析(RIA)、Western雜交分析、免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)等等。應(yīng)知道有時無需分離IRM蛋白；例如，常?？梢栽诩?xì)胞裂解液中分析蛋白或者甚至分析在組織的細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)。憑借此處公開的IRM表達(dá)與胰島素抗性和IR相關(guān)病癥的相關(guān)性的教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以設(shè)計出分析試驗(yàn)來檢測(定量或定性)IRM多肽表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，使用免疫學(xué)方法，例如使用結(jié)合IRM多肽的抗體或其它特異結(jié)合劑?？笽RM抗體(單抗或多抗)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法制備。參見Harlow和Lane，同前引文，以及Coligan等，同前引文。這些技術(shù)包括通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫內(nèi)篩選抗體的抗體制備技術(shù)。參見Huse等，1989，Science 2461275-81；及Ward等，1989，Nature 341544-46。對于制備抗IRM抗體，IRM多肽(或更常用的是其免疫原性蛋白片斷)用來作為免疫原或篩選IRM結(jié)合片斷。IRM多肽或片斷可以通過本文其它地方所述的重組表達(dá)或化學(xué)合成的方法制備。對于多抗的制備，選擇適當(dāng)?shù)陌忻庖呦到y(tǒng)，常用的為小鼠或家兔，也可以用山羊、綿羊、奶牛、小雞、豚鼠、猴子和大鼠。可以通過親和純化等常規(guī)方法沉淀、分離和純化宿主產(chǎn)生的免疫球蛋白。多克隆血清層析純化后可得到基本上單特異性的抗體群。很多成熟的免疫結(jié)合分析方法都適宜用來對本發(fā)明的IRM蛋白進(jìn)行檢測和定量。參見U.S.專利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168，及《細(xì)胞生物學(xué)方法》(METHODS IN CELL BIOLOGY)37卷《細(xì)胞生物學(xué)中的抗體》(ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY)Asai等.Academic Press，Inc.New York(1993)；《基礎(chǔ)及臨床免疫學(xué)》(BASIC ANDCLINICAL IMMUNOLOGY)第7版Stites & Terr等著(1991)；Harlow和Lane，同前引文，Coligan和Ausubel，同前引文。檢測IRM多肽的免疫分析方法有競爭性和非競爭性兩種。通常所需分析的IRM基因產(chǎn)物通過可檢測標(biāo)記物直接或間接地檢測。分析中所用的具體標(biāo)記物或可檢測基團(tuán)通常不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面，只要它們不顯著地干擾分析中所用一種或多種抗體的特異結(jié)合就可以了。標(biāo)記物可以共價結(jié)合到捕獲物(如抗IRM抗體)上，也可以結(jié)合到第三者上，如能夠在與捕獲物識別位點(diǎn)不同的表位特異結(jié)合IRM多肽的其它抗體。非競爭性免疫分析直接檢測被捕獲的分析物(這里指IRM多肽)的量。利用單抗的雙位點(diǎn)免疫分析就屬于這樣的分析，這里使用的單抗與被捕獲的分析物上的兩個相互之間沒有干擾的表位發(fā)生反應(yīng)。相關(guān)背景知識參見Maddox等，1983，J Exp.Med.，1581211。此分析直接定量樣本中的IRM蛋白。例如，使用所謂的“夾心”分析，可以將捕獲物(這里指抗IRM抗體)直接結(jié)合于固相基質(zhì)上以固定化。然后這些固定化的抗體將捕獲測試樣本中的多肽。然后，由此固定的IRM可以與標(biāo)記試劑，如帶有標(biāo)記物的第二抗IRM抗體結(jié)合?；蛘撸诙笽RM抗體可以缺少標(biāo)記物，但是它又可以與標(biāo)記的三抗結(jié)合，所述三抗為特異地針對二抗來源物種之抗體的抗體。二抗可以用生物素等可檢測部分修飾，所述可檢測部分將能夠被第三標(biāo)記分子(酶標(biāo)記的鏈霉親和素)特異結(jié)合。某些夾心分析屬于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，該分析的檢測抗體是酶標(biāo)記的。通過加入該酶底物產(chǎn)生可被檢測的信號，可以達(dá)到對檢測抗體的檢測目的。在競爭性分析中，樣本中IRM多肽含量是通過測量被樣本中的分析物(如IRM多肽)從捕獲物(如抗IRM抗體)上替換(或競爭)下來的添加的(外源)IRM蛋白的量來間接得到的。在一個競爭性分析中，樣本中先加入已知量的IRM蛋白，然后樣本與能夠特異結(jié)合IRM蛋白的捕獲物(如，抗IRM抗體)接觸。與抗體結(jié)合的IRM蛋白的量與樣本中原來存在的IRM蛋白的濃度成反比?？贵w優(yōu)選固定在固相基質(zhì)之上。結(jié)合抗體的IRM蛋白量可以通過測量IRM蛋白/抗體復(fù)合物中的IRM蛋白量來得到，也可以通過測量剩余的未形成復(fù)合物的IRM蛋白的量來得到。IRM蛋白量可以通過提供標(biāo)記后的IRM分子來檢測。例如，半抗原抑制分析法中，分析物(這里指IRM蛋白)固定在固相基質(zhì)之上。樣本中加入已知量的抗IRM抗體，然后樣本與固定化的IRM蛋白相接觸。此時，結(jié)合固定化IRM蛋白的抗IRM抗體的量與樣本中存在的IRM蛋白量成反比。再者，固定的抗體的量可以通過檢測固定化抗體的分?jǐn)?shù)或剩余在溶液中的抗體分?jǐn)?shù)來檢測。該檢測可以直接的，即利用標(biāo)記的抗體進(jìn)行；或可以是間接的，即通過隨后添加特異結(jié)合上述抗體的標(biāo)記部分來完成。關(guān)于各種抗體分析的方法學(xué)和步驟的其它指導(dǎo)可參見下列文獻(xiàn)Greene的美國專利號4,376,110；《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》(ANTIBODIESALABORATORY MANUAL)一書中“使用單抗的免疫分析方法”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，14章(1988)；Bolton和Hunter的《免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》(HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY)(D.M.Weir，ed.)，第一卷26章，“放射性免疫分析及相關(guān)方法”，Blackwell科學(xué)出版社，1986；Nakamura等《免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》(D.M.Weir，ed.)，第一卷27章，“酶學(xué)免疫分析異源和同源體系”，Blackwell科學(xué)出版社，1986；Coligan，同前引文。上述分析中使用的抗體可以包括多克隆抗體、單克隆抗體及其片斷，見下文。單克隆抗體可通過已成熟的方法制備(參見Kohler和Milstein(1975)Nature 256495；及Harlow和Lane，同前引文)。除了IRM多肽的競爭性和非競爭性免疫分析方法，本發(fā)明還提供了檢測和定量分析IRM多肽的其它方法。例如，Western雜交(免疫印跡immunoblot)分析可用于樣本中IRM的檢測和定量。此技術(shù)一般包括利用凝膠電泳基于分子量分離樣本多肽，然后將分離的多肽轉(zhuǎn)移到適宜固相支持物(如硝酸纖維素濾膜、尼龍膜或衍生化的尼龍膜)上，繼而用可特異結(jié)合IRM的抗體與樣本孵育。該抗IRM抗體將能夠特異結(jié)合至固相支持物上的IRM。此抗體可以進(jìn)行直接標(biāo)記或可以使用特異結(jié)合此抗IRM抗體的標(biāo)記抗體(如標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體)進(jìn)行隨后檢測。除此以外，本發(fā)明還包括脂質(zhì)體免疫分析(LIA)等方法。LIA利用的脂質(zhì)體經(jīng)設(shè)計能夠結(jié)合特定分子(如抗體)并釋放出包囊在其中的試劑或標(biāo)記物。釋放的化學(xué)物質(zhì)即可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行檢測(參見Monroe等，1986，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41)。還可以測量各種IRM活性以檢測IRM多肽表達(dá)的升高變化。例如，當(dāng)IRM蛋白具有可分析的酶學(xué)活性的時候，酶活性的升高意味著IRM表達(dá)的升高。在一種分析試驗(yàn)中，檢測由IRM蛋白直接(即催化)或間接產(chǎn)生的代謝物。
時程分析某些評價患者發(fā)生胰島素抗性及其相關(guān)病癥的危險度的預(yù)后方法涉及監(jiān)測胰島素抗性或IR相關(guān)病癥易感患者的IRM表達(dá)水平，以跟蹤患者的IRM表達(dá)隨時間是否表現(xiàn)出變化。IRM表達(dá)隨時間的變化意味著該個體發(fā)生胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的危險性在升高。與其它的IRM測量一樣，危險患者的IRM表達(dá)水平可以與參考值(或基線值)進(jìn)行比較。分析中的基線值可以是針對相同個體的先前測定值或針對對照組(如無明顯危險度的群體，eIS表型群體等)確定的統(tǒng)計值(例如，平均值)?；颊叩腎RM表達(dá)水平表現(xiàn)出隨時間出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著升高可以促使醫(yī)師采取預(yù)防措施以減少個體發(fā)生胰島素抗性的可能性。
治療評估本發(fā)明的分析還可用于在動物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)或患者的監(jiān)控治療過程中評價特定治療方案的療效。在這些情況下，可能期望確立患者在開始治療前的基線水平，并且在整個治療過程中——通常規(guī)則地——重復(fù)此分析一次或多次，從而評價作為治療結(jié)果的IRM表達(dá)水平是否朝著期望的終點(diǎn)變化。因此，本發(fā)明給出了一個評估緩解或治療患者胰島素抗性之療效的方法，即通過比較來自患者的第一和第二樣本中IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，其中第一樣本得自患者接受至少一部分治療之前，而第二樣本從接受該部分治療后的該患者得到，其中所述IRM基因(或者優(yōu)選地，至少2、至少3或至少4個IRM基因)表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)顯著變化表明該療法對于治療胰島素抗性有效。本發(fā)明的分析方法也可用于胰島素抗性及其相關(guān)代謝疾病的候選藥劑的臨床試驗(yàn)研究。該試驗(yàn)的對象是接受治療的群體或?qū)φ杖后w，群體中的個體在規(guī)定的一組基因上具有相似或相同的表達(dá)譜。使用遺傳匹配的群體可以消除或減少遺傳因素引起的治療結(jié)果的差異，從而更準(zhǔn)確地評估潛在藥物的療效。此外，本發(fā)明的分析還可用于臨床試驗(yàn)完成之后闡釋對既定治療方案產(chǎn)生的應(yīng)答差異。例如，可以憑借一個或多個IRM基因和/或其相關(guān)基因多態(tài)性將所選患者分為疾病亞型或亞類。還可以使用這些基因鑒定具有相似表達(dá)譜的患者亞組，即對治療有不尋常(高或低)反應(yīng)的亞組或?qū)χ委熗耆珶o反應(yīng)的亞組。這樣，影響治療效果的根本遺傳因素的相關(guān)信息可用于治療方法研發(fā)的很多方面(從新靶的鑒定到新臨床試驗(yàn)的設(shè)計直至產(chǎn)物標(biāo)記和患者的靶向治療)。另外，IRM基因可用于鑒定與治療不良應(yīng)答(不良事件)相關(guān)的遺傳因素。例如，發(fā)生藥物不良反應(yīng)的患者也許具有相似的表達(dá)譜，而且這種相似性高于預(yù)期由隨機(jī)造成的相似性。這就使得可以早期地鑒定出這些個體并將他們排除到治療之外。而且，這還提供了可用于理解造成不良反應(yīng)的生物學(xué)原因并修改治療方案以避免這些結(jié)果的信息。
胰島素抗性易感性的相關(guān)基因多態(tài)的檢測基于本發(fā)明的教導(dǎo)，可以在表1所列一個或多個IRM基因中鑒定出與群體中的胰島素抗性或其相關(guān)表型有關(guān)的多態(tài)性。基因多態(tài)是指群體中對于特定的基因存在兩個或更多個的遺傳決定的可變序列(稱為等位基因)。預(yù)期一些IRM基因多態(tài)與幾種胰島素抗性相關(guān)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)病癥(包括糖尿病和X綜合征)有關(guān)系。這樣的多態(tài)可用于很多預(yù)后和診斷方法。在一個實(shí)施方案中，通過比較來源于胰島素抗性表型不同的個體群的IRM基因序列(如cDNA序列、包含啟動子和內(nèi)含子的基因組序列或它們的部分)，確定可用于篩選中的多態(tài)性。這里所說的“表型”指的是任何可被檢測或可被測量的生物體(如患者)性狀，例如胰島素抗性或IR相關(guān)病癥(如X綜合征或糖尿病)等疾病的癥狀或易感性。胰島素抗性表型不同的個體群的實(shí)例包括，但不限于(1)eIS表型個體和eIR表型個體，(2)有或無胰島素抗性的個體，(3)被認(rèn)為有或無增加的危險性發(fā)生胰島素抗性的個體，(4)患有和未患有胰島素抗性相關(guān)病癥(如糖尿病)的個體，(5)有和無增加的危險性發(fā)生胰島素抗性的個體，或(6)以上不同組中群體的組合。為了清楚但非限制的目的，下文將提及示例性eIS表型群體和eIR表型群體。然而，所有這些提及都應(yīng)理解為同樣提及到其他IRM相關(guān)表型。多態(tài)標(biāo)記包括限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、串聯(lián)重復(fù)的可變數(shù)目(VNTR)、高變區(qū)、微衛(wèi)星和簡單序列重復(fù)(雙、三或四核苷酸重復(fù))。單核苷酸多態(tài)性(SNP)發(fā)生在由單核苷酸占據(jù)的多態(tài)位點(diǎn)，該位點(diǎn)是等位基因序列之間的差異位點(diǎn)。該位點(diǎn)兩側(cè)通常為基因的高度保守序列。有時將最高頻率出現(xiàn)在所選群體中的等位基因形式稱作野生型。對于等位基因形式而言，雙倍體生物(如人)可以為純合子或雜合子。表1所列的一個或多個基因的多態(tài)形式被預(yù)期與胰島素抗性相關(guān)，可用于鑒定這些紊亂的危險個體。優(yōu)選的多態(tài)標(biāo)記有至少兩個等位基因，每個等位基因在所選人群中的發(fā)生頻率大于1％，更優(yōu)選地大于10％。個體或群體中IRM基因序列或多態(tài)性的確定在此有時稱為“基因型分析”?；蛐头治霭ㄍㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法確定IRM基因的多態(tài)性身份。多態(tài)可通過直接測序鑒定。對于基因組DNA的分析而言，事實(shí)上所有含DNA的生物樣本都是適宜的。對于分析cDNA，則從表達(dá)該IRM基因的器官中獲取組織樣本(如白細(xì)胞)。純化的基因組DNA或cDNA可通過PCR擴(kuò)增，該P(yáng)CR反應(yīng)使用特異設(shè)計以擴(kuò)增該基因組DNA或cDNA的一套重疊的引物，在橫跨全基因(包括啟動子序列)或cDNA的一系列500～1000bp的重疊片斷中進(jìn)行。eIS和eIR個體間這些PCR擴(kuò)增片斷中可能存在的多態(tài)可以通過多種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測，如(1)使用雙脫氧鏈終止法或Maxam-Gilbert法直接測序(參見Sambrook，Ausubel，同前引文)，(2)SSCP(Orita等PNAS 862766-2770(1989)，(3)變性梯度凝膠電泳(《DNA擴(kuò)增原理及應(yīng)用》(Principles and Application for DNAamplification)第7章“PCR技術(shù)”，Henry Erlich編，W.H.Freeman andCo.New York，1992，)以及其它本領(lǐng)域熟知方法(如單鏈多態(tài)分析、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、酶切分析和Southern雜交)。備選地或組合DNA測序，使用其它方法鑒定IRM基因中的改變。這些方法包括單鏈多態(tài)分析(SSPA)和雜合雙鏈分析法(Orita等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，862766)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)；錯配檢測技術(shù)；基因蛋白產(chǎn)物的存在或其存在形式分析(如等電聚焦及/或免疫分析)。這些IRM基因多態(tài)性可以是引發(fā)氨基酸替換或翻譯終止的單堿基替換，也可以是缺失、插入或基因重排。多態(tài)位點(diǎn)可以位于基因的內(nèi)含子、外顯子或啟動子或其它影響基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)。表2中所列的是通過測序IRM10(假定蛋白FLJ22297)檢測到的多態(tài)例子(+686位點(diǎn)SNP的其它相關(guān)數(shù)據(jù)也可以在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中查詢)。
表2 在另一實(shí)施方案中，通過檢查公眾數(shù)據(jù)庫中描述的存在于本文公開的IRM基因中的多態(tài)性可鑒定用于篩選的基因多態(tài)。此外，對通過數(shù)據(jù)庫檢索IRM基因(如SNP合作數(shù)據(jù)庫的檢索；www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)或通過其它方法鑒定到的推定多態(tài)性，可以通過DNA測序驗(yàn)證以確定這些多態(tài)的確切性質(zhì)。從公眾數(shù)據(jù)庫鑒定到的選定IRM基因編碼區(qū)中的多態(tài)性的實(shí)例列于表3。
表3 確定這些個體組在一個或多個IRM基因的一個或多個多態(tài)位點(diǎn)上存在的多態(tài)性之后，可分析該信息以檢測一個或多個IRM基因的特定等位基因與胰島素抗性表型之間的相關(guān)性。在一個實(shí)施方案中，該分析通過如下步驟實(shí)現(xiàn)確定一個或多個IRM基因中的每個多態(tài)等位基因的頻率，并在eIS和eIR個體之間進(jìn)行比較，然后選出在兩組之間有不同等位基因頻率的多態(tài)進(jìn)一步在大個體組(n＝250～500)中測試。標(biāo)準(zhǔn)卡方檢驗(yàn)可用于鑒定這些等位基因中的一個或多個與胰島素抗性之間在統(tǒng)計學(xué)水平上的顯著相關(guān)性(p＜0.05)(例如，通過標(biāo)準(zhǔn)分析確定)。例如，在最初的篩選中可能發(fā)現(xiàn)eIR組個體中IRM基因X的多態(tài)位點(diǎn)A上等位基因A1的頻率比eIS組的高。這種A1等位基因頻率差異被發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，而且在250～500個體的大群體中與胰島素抗性之間存在相關(guān)性。而且，可能發(fā)現(xiàn)，由更顯著的P值(如，在單多態(tài)性檢驗(yàn)中P為0.05而在雙多態(tài)性檢驗(yàn)中P為0.005)判斷，X基因多態(tài)位點(diǎn)A的A1等位基因與Y基因多態(tài)位點(diǎn)B的B1等位基因的組合存在與胰島素抗性表型在該組個體中具有更顯著的相關(guān)性。相關(guān)性研究方法，即單元型確定方法已為人所熟知，詳見例如WO01/64957(胰島素信號和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)通路的相關(guān)多態(tài)性)及美國專利號6,346,381，兩份文獻(xiàn)并入此處作為參考。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過檢測個體IRM基因中與胰島素抗性相關(guān)IRM多態(tài)有關(guān)的至少一個多態(tài)性，評估被測個體發(fā)生胰島素抗性的危險度的方法。對表1所列一個或多個基因的若干個這樣的多態(tài)形式的組合檢測將提高診斷的可信度(confidence)。例如，已知與胰島素抗性相關(guān)的單IRM多態(tài)形式的存在可能提示個體有20％的(推測的)可能發(fā)生胰島素抗性或易于發(fā)生胰島素抗性，然而多個多態(tài)形式(如5個，且每個都與20％的易感可能性相關(guān))的檢測通常將指示該個體有更高的(例如，80％)的可能性發(fā)生或易于發(fā)生胰島素抗性或IR相關(guān)病癥。個體或樣本中存在的多個等位基因的組合被稱作“單元型”。本發(fā)明上下文中，單元型指的是在給定個體中存在的與表型(例如，大于平均的胰島素抗性易感性)相關(guān)的一個以上IRM基因相關(guān)多態(tài)(等位基因)的聯(lián)合。IRM多態(tài)的分析可以與其它多態(tài)或胰島素抗性的其它危險因素(如II型糖尿病的個人和/或家族史等等)的分析相結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分析包括檢測2個或2個以上IRM基因(例如，一組至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或25個IRM)的多態(tài)性標(biāo)記的存在(或不存在)。因此，一方面本發(fā)明提供了確定個體是否有危險發(fā)生胰島素抗性或所述個體是否患有胰島素抗性的方法，即提取個體的核酸樣本，繼而確定一個或多個IRM基因上存在的核苷酸是否表明發(fā)生胰島素抗性的危險性。一方面，本發(fā)明提供了估計eIR或eIS個體群中等位基因頻率的方法，即從所述群體中多個個體之每一個獲得核酸樣本，并確定在來自所述群體的核酸樣本池中IRM基因多態(tài)性堿基的比例。一方面，本發(fā)明給出基因型和胰島素抗性表型之間相關(guān)性的檢測方法，即分析具有已知胰島素抗性狀態(tài)的第一群體中至少一個IRM基因的基因型；分析具有已知胰島素抗性狀態(tài)的第二群體中所述IRM基因的基因型；然后確定該基因型與表型之間是否具有統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性。一方面，本發(fā)明給出了估計群體中一套IRM多態(tài)的單元型頻率的方法，即分析該群體中至少第一IRM基因的基因型；分析該群體中第二不同IRM基因的基因型；確定每個IRM基因的多態(tài)身份；并將單元型確定方法應(yīng)用于所確定的核苷酸身份上以估計所述頻率。這里的“單元型確定方法”用于指本領(lǐng)域已知的所有確定單元型的方法，包括期望最大化算法(參見美國專利號6,346,381，Lange K.，《遺傳分析的數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)分析方法》(Mathematical and Statistical Methods for Genetic Analysis)，Springer，New York，1997；Weir，B.S.，《遺傳數(shù)據(jù)分析II離散群體遺傳數(shù)據(jù)分析方法》(Genetic data Analysis IIMethods for Discrete population geneticData)，Sinauer Assoc.，Inc.，Sunderland，Mass.，USA，1996；)。優(yōu)選地，利用期望最大化(EM)算法計算出最大似然單元型頻率(參見Dempster等，J.R.Stat.Soc.，39B1-38，1977；Excoffier L.和Slatkin M.，Mol.Biol.Evol.，12(5)921-927，1995)，該算法可以用計算機(jī)執(zhí)行方法進(jìn)行，如EM-HAPLO程序(Hawley M.E.等，Am.J.Phys.Anthropol.，18104，1994)或Arlequin程序(Schneider等，《Arlequin群體遺傳數(shù)據(jù)分析軟件》(Arlequina software tor population genetics data analysis)，Universityof Geneva，1997)在相關(guān)方面，本發(fā)明給出檢測單元型與表型之間相關(guān)性的方法，即評估具有上述第一表型(例如，eIS)的群體中至少一個單元型的頻率，評估具有上述第二表型(例如，eIR)的群體中所述單元型的頻率，并確定所述單元型是否與所述表型之間存在統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性。在一個實(shí)施方案中，單元型與eIR表型或eIS表型的相關(guān)性表現(xiàn)出0.001的p值。
V.IRM表達(dá)與活性的調(diào)節(jié)物的篩選本發(fā)明給出了鑒定可用于治療胰島素抗性和IR相關(guān)病癥的藥劑的篩選方法。此篩選方法通常涉及進(jìn)行多種分析試驗(yàn)來鑒定可以調(diào)節(jié)IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性的藥劑?？梢岳枚喾N不同的篩選方法鑒定在細(xì)胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)IRM表達(dá)水平的藥劑，所述細(xì)胞尤其可以是哺乳動物細(xì)胞，特別是人細(xì)胞?？偟膩碚f，篩選方法涉及篩選多種藥劑以鑒定出能通過例如結(jié)合IRM多肽、阻止抑制物結(jié)合IRM多肽或激活或抑制IRM表達(dá)從而改變IRM活性的藥劑。這里，IRM活性或表達(dá)的“調(diào)節(jié)物”可以抑制或刺激IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)。因此，在一個實(shí)施方案中，施用調(diào)節(jié)物可以降低細(xì)胞或動物中IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性(如，起到拮抗劑或抑制劑作用)。在一個不同的實(shí)施方案中，施用調(diào)節(jié)物可以增加細(xì)胞或動物中IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性(如，起到激動劑或刺激劑的作用)。在篩選分析中鑒定出的調(diào)節(jié)物和/或其活性類似物可配制成可以有效治療胰島素抗性和IR相關(guān)病癥的藥物組合物。
IRM多肽的結(jié)合及相互作用分析可以通過選擇能夠結(jié)合IRM的化合物進(jìn)行初步篩選，因?yàn)槿绱髓b定到的化合物中至少一部分可能是IRM調(diào)節(jié)物。在這些篩選中鑒定到的先導(dǎo)(Lead)化合物可作為合成活性更高的類似物的基礎(chǔ)。因此，一方面，本發(fā)明給出了篩選藥劑以確定其在胰島素抗性或IR相關(guān)病癥治療中的有用性的方法，該方法包括(a)用測試化合物與IRM基因編碼的多肽或表達(dá)該多肽的細(xì)胞相接觸，和(b)確定該多肽是否能夠結(jié)合測試化合物。一旦結(jié)合，則提示該測試藥劑可用于治療胰島素抗性或IR相關(guān)病癥。結(jié)合分析通常涉及IRM多肽與一個或多個測試化合物相接觸并給予足夠的時間使該蛋白質(zhì)能夠與測試化合物形成結(jié)合復(fù)合物。確定測試化合物直接結(jié)合IRM基因產(chǎn)物的能力可以通過例如如下方式實(shí)施在化合物上偶聯(lián)放射性同位素或酶標(biāo)記，以便可以通過檢測復(fù)合物中被標(biāo)記的IRM基因產(chǎn)物-化合物來確定化合物與IRM基因產(chǎn)物的結(jié)合。任何形成的結(jié)合復(fù)合物都可以通過多種成熟的分析技術(shù)之任一種進(jìn)行檢測。蛋白結(jié)合分析包括，但不限于，測量共沉淀、非變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的共遷移及Western印跡上的共遷移的方法(參見《A PRACTICALAPPROACH/THEPRACTICALAPPROACHSERIES》(D.Rickwood和BD Hames編的系列)中“受體配體相互作用”有關(guān)章節(jié)，E.C.Hulme，1992，牛津大學(xué)IRL出版社)等等。上述分析中使用的IRM多肽可以是純化的或重組的。本發(fā)明也考慮到對可以調(diào)節(jié)IRM基因產(chǎn)物或其生物活性部分的活性的測試化合物的分析。IRM基因產(chǎn)物可以在體內(nèi)與一個或多個細(xì)胞和細(xì)胞外分子(如，但不限于，肽、蛋白、激素、輔因子和核酸)相互作用，這里將這些細(xì)胞和細(xì)胞外分子稱為“結(jié)合伙伴”。用于鑒定IRM的天然體內(nèi)結(jié)合伙伴的方法是已知的，如雙雜交和三雜交分析(參見美國專利號5,283,317；Zervos等，1993，Cell 72223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene 81693-1696；BrentWO94/10300)。這些IRM基因產(chǎn)物結(jié)合伙伴可能通過IRM基因產(chǎn)物或IRM基因產(chǎn)物介導(dǎo)的信號通路下游元件參與信號傳播，或者，它們可能是IRM基因產(chǎn)物的抑制物。通過本發(fā)明的應(yīng)用可以設(shè)計分析試驗(yàn)以鑒定可以調(diào)節(jié)(例如，正面或負(fù)面影響)IRM基因產(chǎn)物及其結(jié)合伙伴的相互作用的化合物。典型地，用于分析干擾IRM基因產(chǎn)物及其結(jié)合伙伴的相互作用的化合物的試驗(yàn)涉及在足以允許IRM基因產(chǎn)物及其結(jié)合伙伴相互作用并結(jié)合的條件和時間下制備含有IRM基因產(chǎn)物及其結(jié)合伙伴的反應(yīng)混合物，由此形成復(fù)合物。為檢測藥劑的抑制活性，在有或無測試化合物存在下制備反應(yīng)混合物。測試化合物可以一開始就包括在反應(yīng)混合物中，也可以在IRM基因產(chǎn)物及其結(jié)合伙伴加入以后再行加入。干擾IRM基因產(chǎn)物與其結(jié)合伙伴的相互作用的化合物的分析，可以在溶液中進(jìn)行或通過將IRM基因產(chǎn)物或其結(jié)合伙伴錨定到固相表面或基質(zhì)上來進(jìn)行。本發(fā)明還包括在無進(jìn)一步的樣本處理的情況下在均質(zhì)或非均質(zhì)試驗(yàn)體系中直接檢測IRM基因產(chǎn)物與其天然結(jié)合伙伴和/或測試化合物的相互作用的方法。例如，可以使用熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(參見Lakowicz等，美國專利號5,631,169及Stavrianopoulos等，美國專利號4,868,103)。
表達(dá)及活性分析一些篩選方法包括篩選調(diào)節(jié)(例如，上調(diào)或下調(diào))細(xì)胞中IRM表達(dá)及其活性的化合物。這些方法通常包括使用基于細(xì)胞的分析(cell-basedassays)，其中測試化合物與一個或多個表達(dá)IRM的細(xì)胞接觸，然后檢測IRM表達(dá)(例如，IRM RNA的水平)的變化。在一個實(shí)施方案中，鑒定調(diào)節(jié)物的方法包括將一個或多個細(xì)胞(即“測試細(xì)胞”)與測試化合物接觸，確定測試化合物是否影響細(xì)胞內(nèi)IRM基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選藥劑以確定其在治療胰島素抗性或相關(guān)病癥中的有用性的方法，即提供表達(dá)至少一種表1所列胰島素抗性標(biāo)記(IRM)的細(xì)胞；將該細(xì)胞與測試藥劑接觸；并確定IRM基因表達(dá)水平是否在該測試藥劑存在時發(fā)生變化，其中有變化表示該測試藥劑對治療胰島素抗性有用。通常該確定包括將測試細(xì)胞中的所述活性或表達(dá)與沒有與測試化合物接觸的一種或多種類似細(xì)胞(即對照細(xì)胞)進(jìn)行比較。備選地，可以用細(xì)胞提取物替代完整細(xì)胞。在一個相關(guān)實(shí)施方案中，該測試化合物被施用于多細(xì)胞生物(例如，植物或動物)。IRM組分對該細(xì)胞或多細(xì)胞生物可以是完全內(nèi)源的，也可以是含有一種或多種重組表達(dá)的IRM基因產(chǎn)物的重組細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物。通常測定測試藥劑(test agent)對IRM RNA表達(dá)水平的影響。然而，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定藥劑是否可用于治療胰島素抗性的篩選方法，該方法包括(a)提供含有IRM蛋白或者表達(dá)該蛋白的細(xì)胞的組合物及測試化合物，(b)將該組合物與測試藥劑相互接觸和(c)確定測試物存在時IRM蛋白活性是否發(fā)生變化。有變化表明該測試藥劑對治療胰島素抗性有用。在一方面，本發(fā)明提供了確定測試藥劑是否可用于治療胰島素抗性的篩選方法，該方法包括(a)將IRM基因編碼的蛋白或表達(dá)該蛋白的細(xì)胞與測試化合物相接觸，其中所述蛋白具有可檢測的生物活性；(b)確定存在該測試藥劑時該蛋白的生物活性水平是否變化，有變化表明該測試藥劑對胰島素抗性的治療有用。在各種實(shí)施方案中，本分析可用任意一種類型的表達(dá)IRM基因的細(xì)胞，包括培養(yǎng)細(xì)胞(例如，原代培養(yǎng)細(xì)胞或確立的細(xì)胞系)和體內(nèi)細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞表達(dá)一種以上IRM基因，例如，至少約3種，至少約5種，或至少約10種IRM基因。細(xì)胞的實(shí)例包括EBV-轉(zhuǎn)化的B-淋巴細(xì)胞、熟知的胰島素效應(yīng)細(xì)胞系，如3T3-L1脂肪細(xì)胞、CHO和L6大鼠骨骼肌管。也可以使用其它的細(xì)胞系，如小鼠巨噬RAW細(xì)胞系、Jurkat細(xì)胞(急性白血病T細(xì)胞)、PC12細(xì)胞(大鼠神經(jīng)元細(xì)胞)、Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，如果在這些細(xì)胞中所需的IRM基因的表達(dá)水平在可檢測范圍內(nèi)的話。類似地，可使用來自患Burkitt淋巴瘤、B-細(xì)胞型幼淋巴細(xì)胞白血病(B-PLL)、B-細(xì)胞型慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)和B-細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)的病人的細(xì)胞系或原代培養(yǎng)細(xì)胞(例如，Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系(Raji，Daudi)、B-PLL細(xì)胞系(p11A-1-1)和B-ALL細(xì)胞系(MOLT-3，MOLT-4))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道許多其它合適的細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞類型是細(xì)胞培養(yǎng)物里的細(xì)胞，如穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。如所指出的，可以使用EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞?？梢杂檬熘募夹g(shù)制備轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞。例如，根據(jù)一種方法，在檸檬酸鹽(黃頂)或肝素(綠頂)Vacutainer管中收集全血樣本(12-15ml)，用一步離心技術(shù)(Boyum，1964，Nature 204793)分離淋巴細(xì)胞，用于分離淋巴細(xì)胞的離心溶液(IsoPrep，Red-Out)購自Robbins Scientific Corp(Cat#1070-03-0，和Cat#1069-01-0)。分離后的血淋巴細(xì)胞在補(bǔ)加了10％胎牛血清和必需氨基酸的RPMI 1640組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)。參考Henderson等人的方法(1977，Virology 76152-63)用EBV上清液感染培養(yǎng)物。通常3～4天以后細(xì)胞開始表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的變化，此時在倒置顯微鏡下可見分化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)啞鈴形。生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物表現(xiàn)出的典型形態(tài)學(xué)變化包括肉眼可見的細(xì)胞簇。通常需要6～8周時間才能獲得呈現(xiàn)典型的大細(xì)胞團(tuán)的完全轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物。在一個實(shí)施方案中，用來自于具有已知胰島素抗性狀態(tài)(如eIR或eIS表型)的個體的細(xì)胞制備細(xì)胞系。來自eIR表型個體的細(xì)胞系稱為“eIR細(xì)胞系”。來自B細(xì)胞的這樣的細(xì)胞系稱為“eIR B細(xì)胞系”。來自eIS表型個體的細(xì)胞系稱為“eIS細(xì)胞系”。來自B細(xì)胞的這樣的細(xì)胞系稱為“eIS B細(xì)胞系”。應(yīng)認(rèn)識到，盡管通常使用的是人的細(xì)胞，也可以使用動物細(xì)胞(例如，可以監(jiān)控人IRM基因的非人同系物的表達(dá)，或可以監(jiān)控IRM基因的轉(zhuǎn)基因動物如小鼠中人IRM基因的表達(dá))。當(dāng)使用非人細(xì)胞時，常常期望使用能夠識別人IRM基因的非人同系物的核酸或抗體探針(例如，通?？梢杂没谌薎RM序列的探針檢測)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)表1提供的信息鑒定上述同系物并且得到適用的探針。在一個實(shí)施方案中，將測試藥劑施用于動物并檢測該動物組織(例如，血液或血液級分)中該藥劑對IRM同系物表達(dá)的影響。細(xì)胞中的IRM表達(dá)可以通過多種方法進(jìn)行檢測，包括上文診斷方法章節(jié)中講述的方法。如前所述，為檢測細(xì)胞中IRM的表達(dá)水平，可先從細(xì)胞中分離RNA，然后用可以與IRM轉(zhuǎn)錄本(或來源于其的互補(bǔ)核酸)特異雜交的探針檢測細(xì)胞中表達(dá)的mRNA?；蛘?，可以通過免疫學(xué)方法用能夠與IRM多肽特異結(jié)合的抗體探測細(xì)胞裂解液以檢測IRM蛋白?；蛘?，可以測定IRM多肽的活性水平。藥劑對細(xì)胞或體外系統(tǒng)中IRM基因表達(dá)的影響可同基線值進(jìn)行比較，該基線值一般是沒有該測試藥劑存在時細(xì)胞或體外系統(tǒng)中的基因表達(dá)水平。還可以檢測不表達(dá)IRM的細(xì)胞的表達(dá)水平作為陰性對照。這樣的細(xì)胞除了不表達(dá)IRM外通常與檢測細(xì)胞在遺傳上是基本相同的。在其它實(shí)施方案中，基線值可以是來自于對照樣本的值或代表對照群體(如非胰島素抗性高危的健康個體群)的IRM表達(dá)水平的統(tǒng)計值。如前所述，本發(fā)明提供藥物篩選方法，其中監(jiān)控一個以上IRM基因的表達(dá)水平。通過多基因表達(dá)的監(jiān)控可以提供更強(qiáng)有力的分析。由此，在多種實(shí)施方案中，測定藥劑對IRM基因組合(例如，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或25或更多個表1所列IRM或選自本文公開的這些IRM基因的亞組的IRM基因組合)的表達(dá)的影響。通常，能夠改變一組多個IRM基因表達(dá)的藥劑是尤其有意義的，可以作為候選藥物或先導(dǎo)藥物。包含針對特定IRM基因產(chǎn)物的探針陣列的裝置，如本文所述裝置，可用于執(zhí)行此分析。如下所述，在本文描述的篩選分析中鑒定到的藥劑可以進(jìn)一步作用于施用給實(shí)驗(yàn)動物(如靈長類、狗、兔、鼠等嚙齒類)從而確定動物對該藥劑的反應(yīng)(例如，是否該藥劑能夠影響該動物對胰島素的應(yīng)答)。還可以使用被載體或表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其中所述載體或表達(dá)盒含有編碼IRM蛋白的核酸序列。在適宜該蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下維持細(xì)胞，并使細(xì)胞與推定的藥劑相接觸。其它的基于細(xì)胞的分析是使用不表達(dá)IRM的細(xì)胞的報導(dǎo)分析試驗(yàn)。這些分試驗(yàn)析中的某些利用異源核酸構(gòu)建體完成，所述構(gòu)建體包括與報道基因可操作地連接的IRM啟動子，該報道基因編碼能夠被檢測的產(chǎn)物。IRM基因啟動子通常在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(或5’)大約300～1000bp的區(qū)域內(nèi)。一些IRM基因啟動子的相關(guān)描述可通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov/鏈接在GenBank中查詢，也可見于科學(xué)文獻(xiàn)。許多不同的報道基因都可使用，示例性報道基因包括綠色熒光蛋白、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶等等。在這些分析試驗(yàn)中，包含報導(dǎo)構(gòu)建體的細(xì)胞與測試化合物相接觸。測試化合物如果能夠結(jié)合并激活該啟動子或者能夠引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生可激活該啟動子的分子，那么將引起可檢測報道分子的表達(dá)。此報導(dǎo)分析試驗(yàn)可以使用多種細(xì)胞類型(如酵母、COS、CHO、HepG2和HeLa細(xì)胞系等真核細(xì)胞)。
轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)一種或多種編碼IRM的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動物也可用于藥物篩選和本發(fā)明的其它方法。適宜的含有外源IRM基因序列(可以是編碼序列或調(diào)控序列)的轉(zhuǎn)基因生物包括非人多細(xì)胞生物(例如，植物和非人動物)或單細(xì)胞生物(例如，酵母)，非人動物如小鼠、大鼠、兔、猴、猿和豬。在一個實(shí)施方案中，該生物體能夠表達(dá)具有人IRM蛋白序列的外源IRM多肽。本發(fā)明還提供了單細(xì)胞和多細(xì)胞生物(或來自它們的細(xì)胞)，在所述生物中編碼人IRM的同系物的基因被突變或缺失(即，在編碼區(qū)或調(diào)控區(qū))導(dǎo)致與野生型細(xì)胞或生物相比，天然IRM蛋白不表達(dá)、低水平表達(dá)或具有不同活性。這樣的細(xì)胞或生物常稱為“基因敲除”細(xì)胞或生物。本發(fā)明還提供下列細(xì)胞和生物，其中內(nèi)源IRM基因或者存在或者可選地突變或缺失，且外源IRM基因或變體(例如，人IRM)被導(dǎo)入并表達(dá)。這種類型的細(xì)胞或生物可用于，例如，作為模式系統(tǒng)鑒定IRM活性或表達(dá)的調(diào)節(jié)物，或檢測IRM基因突變對胰島素抗性的影響。改變或破壞特定基因的方法對技術(shù)人員是熟知的，參見，例如，Baudin等，1993，Nucl.Acids Res.213329；Wach等，1994，Yeast 101793；Rothstein，1991，Methods Enzymol.194281；Anderson，1995，Methods CellBiol.4831；Pettitt等，1996，Development 1224149-4157；Ramirez-Solis等，1993，Methods Enzymol.225855；和Thomas等，1987，Cell 51503。典型地，上述方法包括改變或者替換控制待調(diào)節(jié)的特定基因表達(dá)的調(diào)控序列的所有或部分序列?？筛淖冋{(diào)控序列，例如，天然啟動子?；蚨ㄏ蛲蛔兊囊环N傳統(tǒng)技術(shù)包括，將含有目的基因的基因組DNA片段置入載體中，然后將與靶向基因連結(jié)的兩條基因組臂克隆到含有胸苷激酶的載體中位于選擇性新霉素抗性盒的兩側(cè)。然后將此“敲除”構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞，即小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞中，隨后對其進(jìn)行正篩選(例如，用G418篩選新霉素抗性)和負(fù)篩選(例如，用FIAU排除缺少胸苷激酶的細(xì)胞)，從而允許篩選出經(jīng)歷了和敲除載體的同源重組的細(xì)胞。該方法導(dǎo)致目的基因的失活，參見，例如，美國專利5,464,764；5,631,153；5,487,992；和5,627,059。內(nèi)源基因表達(dá)的“敲除”也可以通過同源重組方法在目的基因的調(diào)控序列(例如，啟動子)中導(dǎo)入異源核酸序列來實(shí)現(xiàn)。為了防止功能性酶或產(chǎn)物的表達(dá)，可以用改變開放閱讀框或破壞啟動子的簡單突變。為了上調(diào)表達(dá)，可以用能夠引發(fā)更高水平轉(zhuǎn)錄的異源啟動子替代原有的天然啟動子?！盎蛘T捕插入”(gene trap insertion)也可用來破壞宿主基因，小鼠ES細(xì)胞可用于制備敲除轉(zhuǎn)基因動物，參見，例如Holzschu(1997)Transgenic Res 697-106。其他方法是本領(lǐng)域已知的。通過同源重組改變內(nèi)源基因表達(dá)也可使用包含目的結(jié)構(gòu)基因的核酸序列來實(shí)現(xiàn)。上游序列用于使異源重組構(gòu)建體定向。利用結(jié)構(gòu)基因序列信息(可參考表1和發(fā)表資料(例如，GenBank中)確定)，僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法本領(lǐng)域技術(shù)人員即可構(gòu)建同源重組構(gòu)建體。改變內(nèi)源基因表達(dá)的同源重組方法參見美國專利5,272,071，及WO 91/09955，WO 93/09222，WO 96/29411，WO 95/31560，WO 91/12650，和Moynahan，1996，Hum.Mol.Genet.5875。
測試化合物本篩選方法可用基本上任何類型的潛在地能夠調(diào)節(jié)IRM表達(dá)的化合物進(jìn)行。因此，測試化合物可以是多種一般類型的，包括但不限于，小的有機(jī)分子、已知的藥物、多肽；寡糖和多糖等碳水化合物；多核苷酸；脂或磷脂；脂肪酸；類固醇或氨基酸類似物。測試藥劑可從例如，天然產(chǎn)物文庫或組合文庫等文庫中得到。組合化學(xué)方法學(xué)可用于制備大量的寡核苷酸(或其他化合物)，從中可以快速篩選出對任何靶標(biāo)(如此處描述的IRM蛋白及其基因)具有合適的結(jié)合親和力和特異性的特定寡核苷酸(或化合物)(有關(guān)一般背景信息參見Gold(1995)J.Biol.Chem.27013581-13584)。用組合化學(xué)中熟知的技術(shù)可以制備大規(guī)模的合成分子文庫并進(jìn)行同步篩選，例如，見vanBreemen(1997)Anal Chem 692159-2164；Lam(1997)Anticancer DrugDes 12145-167(1997)。對多種可以逐步合成的化合物，可以制備它們的組合文庫，這些化合物包括多肽、β轉(zhuǎn)角類似物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯并二氮雜唑(benzodiazepines)、寡聚N-取代的甘氨酸和oligocarbanate。多種不同類型的組合文庫及其制備方法參見如PCT公開WO 93/06121，WO 95/12608，WO 95/35503，WO 94/08051以及WO 95/30642，將它們都并入此處作為參考。近年來發(fā)展了幾種自動分析方法，從而使得可以短期內(nèi)篩選數(shù)萬的化合物。參見Fodor等.，1991，Science 251767-73以及化學(xué)多樣性文庫的其他說明書，這些說明書描述了通過一組化合物來測試結(jié)合親和力的方法。也可以用噬菌體展示方法產(chǎn)生肽文庫。
IRM表達(dá)或活性的調(diào)節(jié)物本發(fā)明還提供了(i)通過上述篩選分析鑒定的新藥劑，(ii)含有通過上述篩選分析鑒定到的藥劑的藥物組合物和(iii)通過施用用上述篩選分析鑒定到的藥劑來治療患者的方法，該患者對胰島素有抗性或具有胰島素抗性相關(guān)癥狀(例如，糖尿病)，或者易于產(chǎn)生胰島素抗性或者胰島素抗性相關(guān)癥狀。用任一種前述篩選方法初步鑒定的化合物可進(jìn)一步檢驗(yàn)以驗(yàn)驗(yàn)其表現(xiàn)的活性。優(yōu)選地用適宜的動物模型進(jìn)行這些研究，這些方法的基本模式包括將初篩選確定的先導(dǎo)化合物施用于作為人的模型的動物，而后確定施用該藥劑是否影響動物對胰島素的反應(yīng)(如施用胰島素后對血液葡萄糖水平的影響)。適宜的動物的例子包括，但不限于哺乳動物、靈長類，如小鼠和大鼠。胰島素抗性和II型糖尿病的典型動物模型包括Zucker糖尿病肥胖型(ZDF)大鼠，GK大鼠，Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)大鼠，db/db小鼠和BSB小鼠。一方面，本發(fā)明提供了用于治療胰島素抗性或IR相關(guān)病癥的藥物的制備方法，該方法包括通過在此描述的方法確定藥劑對于治療胰島素抗性的有效性，并將該藥劑配制成可施用于靈長類動物(例如，人)的藥物。例如，適宜的藥制劑可是無菌和/或基本上等滲的和/或完全符合美國食品和藥物管理局藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的所有規(guī)定和/或?yàn)閱挝粍┝啃问健?br> VI.用于診斷應(yīng)用的裝置及試劑盒本發(fā)明提供了用于診斷、預(yù)后、藥物篩選及其它方法的裝置及試劑。一方面，提供了包含對一個或多個IRM基因產(chǎn)物(多核苷酸或蛋白)特異的固定化探針的裝置。這些探針可以結(jié)合多核苷酸(例如，基于對IRMRNA或cDNA的雜交)或多肽(例如，基于對IRM多肽的特異結(jié)合)。在一個實(shí)施方案中，使用了陣列形式，其中固定了很多(至少2個，通常至少3個或更多)不同的探針。術(shù)語“陣列”采用的是其通常含義，指通常固定到基質(zhì)上的多個探針的每一個在例如基質(zhì)上都有明確的位置(地址)。陣列上探針的數(shù)目可以依賴于裝置的性質(zhì)和用途而變化。例如，用于檢測IRM表達(dá)的dipstick式陣列可以少至2個不同的探針，雖然通常將存在2個以上，并且常常更多。正如指出的，在一些實(shí)施方案中，也考慮到可以使用含有單個固定探針的裝置，雖然這樣的裝置本身通常不被稱為“陣列”。已知存在多種結(jié)合和雜交形式，包括寡核苷酸陣列、cDNA陣列、dip sticks、針、芯片或珠、southern雜交、northern雜交、點(diǎn)雜交和狹線雜交。因此，可以考慮包含固定于固相基質(zhì)上的針對IRM基因產(chǎn)物的探針的裝置?？梢允褂迷S多固相支持物的任何一種，這些支持物可以由玻璃(例如，載玻片)、塑料(例如，聚丙烯、尼龍)、聚丙烯酰胺、硝化纖維素或其他材料制成。將核酸附著到表面上的一種方法是印刷于玻璃板上，如Schena等，1995，Science 270467-470；Shalon等，1996，Genome Res.6639-645的一般描述。制作微陣列的另一種方法是制作高密度寡核苷酸陣列。參見Fodor等，1991，Science 251767-73；Lockhart等，1996，NatureBiotech 141675；以及美國專利號5,578,832；5,556,752和5,510,270)。在一些實(shí)施方案中，考慮其上固定探針的基質(zhì)(例如芯片或載片)包括多個IRM特異探針(例如不同于含有針對生物體、細(xì)胞或組織中表達(dá)的所有基因的探針的芯片或載片)。例如，可以根據(jù)此處教導(dǎo)專門設(shè)計一種陣列，其包括針對至少2個，至少3個，至少4個，至少5個，至少6個或至少10個此處所公開的胰島素抗性標(biāo)記的探針。這樣，在一個實(shí)施方案中，裝置或陣列上至少約10％，有時至少約25％或甚至至少約50％的固定探針將特異結(jié)合(例如，雜交到)IRM基因產(chǎn)物。在一個實(shí)施方案中，基質(zhì)含有少于約4000個不同的探針，常少于約1000個，少于約100個不同探針，少于約50個不同探針，少于約10個不同探針，少于約5個不同探針，或少于約3個不同探針。如本上下文所用的，如果兩個探針不特異結(jié)合同一種多肽或多核苷酸(例如，針對不同基因的cDNA探針)，那么這兩個探針是“不同”的。在一個實(shí)施方案中，探針選自特異結(jié)合IRM蛋白的單克隆抗體或其他特異結(jié)合蛋白(例如，抗體衍生物或片段)。用于多肽的探針也可固定為陣列形式，例如多孔板中的ELISA形式。本發(fā)明還考慮到含有評估一種或多種IRM基因表達(dá)的試劑，如檢測或擴(kuò)增IRM基因產(chǎn)物的探針和/或引物的試劑盒。在一個實(shí)施方案中，這些探針是能與從IRM基因轉(zhuǎn)錄的多核苷酸特異結(jié)合的核酸探針。在一個實(shí)施方案中，試劑盒含有特異針對多種(至少2種，優(yōu)選3種，常常4種，有時5種或更多)不同IRM基因產(chǎn)物的探針(如本文中別處描述的針對一組IRM中選出的1、2、3、4、5或更多種IRM的結(jié)合或雜交靶標(biāo))。在一個實(shí)施方案中，探針選自特異雜交此處公開的IRM多核苷酸的多核苷酸。能與核酸(如mRNA，已剪接的mRNA、cDNA等)結(jié)合的適宜的試劑包括互補(bǔ)核酸。例如，核酸試劑可以包括固定于基質(zhì)上的寡核苷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記)、不與基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記寡核苷酸、PCR引物對等等。這些試劑可以用于例如，促進(jìn)患者樣本中多個IRM的同步檢測。本發(fā)明的試劑盒也可以備選地含有對實(shí)施本發(fā)明的方法有用的額外成分。作為例子，該試劑盒可以含有適用于退火互補(bǔ)核酸或使抗體與其特異結(jié)合的蛋白結(jié)合的液體(如SSC緩沖液)、一個或多個樣品區(qū)室、實(shí)施本發(fā)明檢測方法的說明書，還可以包括校準(zhǔn)曲線、用于校準(zhǔn)或比較所測定的個體表達(dá)水平的參考樣品(或蛋白或核酸)、打印版或電子版的正常和非正常群體的IRM表達(dá)的參考值。
VII.胰島素抗性和IR相關(guān)病癥的治療方法在另一方面，本發(fā)明提供了胰島素抗性或相關(guān)癥狀(如II型糖尿病)的治療方法，即對此病患者或有危險患該病或癥狀的患者施用治療有效量的IRM功能調(diào)節(jié)劑，如IRM功能或基因表達(dá)的激動劑(刺激劑)或拮抗劑(抑制劑)。對于IRM功能的抑制，調(diào)節(jié)劑的例子包括小分子拮抗劑(即分子量小于5000道爾頓、通常小于3000道爾頓、常小于500道爾頓，例如，核酸、肽、碳水化合物、脂、有機(jī)或無機(jī)分子)、抗IRM結(jié)合劑(例如，抗IRM單克隆抗體)、多肽抑制劑(例如，IRM的顯性負(fù)突變體)、多核苷酸抑制劑(例如，反義多核苷酸、核酶和三鏈體多核苷酸)、基因治療(例如基因敲除)等等。對于IRM功能的刺激，調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括IRM功能和IRM多肽的小分子激動劑(可以以例如多肽或核酸表達(dá)載體形式施用)等。根據(jù)個體狀況，藥劑可以以治療或預(yù)防的量施用。在一個實(shí)施方案中，為了闡明而不是限定，施用提高IRM活性或表達(dá)的藥劑以治療胰島素抗性或IR相關(guān)癥狀，其中與eIS群體相比，在eIR群體中該IRM被下調(diào)(即，以較低水平表達(dá))。在一個不同的實(shí)施方案中，為了闡明而不是限定，施用降低IRM活性或表達(dá)的藥劑以治療胰島素抗性或IR相關(guān)癥狀，其中與eIS群體相比，在eIR群體中該IRM被上調(diào)(即，以較高水平表達(dá))。一方面，本發(fā)明的治療方法利用已知或被認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)此處公開的IRM的表達(dá)或活性、但是過去卻沒有認(rèn)識到其對胰島素抗性的影響的藥劑或藥物。在相關(guān)方面，以前未認(rèn)識到所述藥劑對一種或多種IR相關(guān)癥狀有影響。本發(fā)明的方法和試劑可用于治療動物，如哺乳動物(例如，人、非人靈長類動物、奶牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠)用于人類疾病的動物和或體外(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)模型中。
抑制IRM表達(dá)的方法本領(lǐng)域中有多種已知方法可用于減少IRM的表達(dá)或活性。在一個實(shí)施方案中施用了一種抑制性多核苷酸。抑制性多核苷酸的例子包括能夠靶向或雜交IRM多核苷酸的反義試劑、三鏈體試劑和核酶試劑。本發(fā)明的一些治療方法包括施用寡核苷酸，該寡核苷酸在體內(nèi)生理條件下起抑制IRM活性的功能，并且能在這些條件下在足夠達(dá)到療效的一段時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定。可對多核苷酸進(jìn)行修飾以得到這種穩(wěn)定性并且利于寡核苷酸向期望組織、器官或細(xì)胞的靶向輸送。
反義多核苷酸根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸和多核苷酸用于抑制IRM基因的表達(dá)。本發(fā)明有用的反義多核苷酸包含能夠與轉(zhuǎn)錄自IRM基因的mRNA中的序列特異雜交的至少約10個堿基，典型地至少12或14個，至多約1000或更多個連續(xù)核苷酸的反義序列。更常見的，本發(fā)明的反義多核苷酸長度為約12～約50個核苷酸或約15～25約個核苷酸。一般來說，反義多核苷酸應(yīng)當(dāng)足夠的長從而能夠形成穩(wěn)定的雙螺旋，但是又應(yīng)當(dāng)足夠短(取決于輸送的方式)以便體內(nèi)施用(如果需要)。特異雜交到靶序列所需的多核苷酸最小長度取決于幾種因素，如G/C含量、錯配堿基(如果有)的位置、與靶多核苷酸群相比此序列的獨(dú)特程度、和多核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(例如，甲基膦酸酯骨架、肽核酸、硫代磷酸酯)等。通常為保證雜交的特異性，反義序列應(yīng)當(dāng)與靶IRM mRNA序列基本上互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，反義序列和靶序列完全互補(bǔ)。然而，反義多核苷酸也可以包括核苷酸的置換、添加、缺失、轉(zhuǎn)換、易位、修飾或其他核酸序列或非核酸部分，只要該反義多核苷酸與對應(yīng)于IRM RNA或者其基因的相關(guān)靶序列的特異結(jié)合可以作為該多核苷酸的功能特性保留下來即可。在一個實(shí)施方案中，反義多核苷酸序列與IRM mRNA的相對易接近序列(例如，相對缺乏二級結(jié)構(gòu))互補(bǔ)。這可通過用例如MFOLD程序(遺傳計算組，Madison WI)分析預(yù)測的RNA的二級結(jié)構(gòu)，并且利用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行體外或體內(nèi)檢驗(yàn)來確定。另一個鑒定有效反義組合物的方法使用寡核苷酸組合陣列(見例如，Milner等，1997，NatureBiotechnology 15537)。反義核酸(DNA、RNA及其修飾物、類似物等)可以通過任何一種合適的核酸制備方法，如化學(xué)合成和此處公開的重組方法制備。在一個實(shí)施方案中，例如，本發(fā)明的反義RNA分子可以用從頭化學(xué)合成制備。備選地，可以通過將IRM DNA序列插入(連接)在載體(例如，質(zhì)粒)中并使其與啟動子可操作的反向連結(jié)以制備與IRM mRNA雜交的反義RNA。如果啟動子，以及優(yōu)選地終止和聚腺苷酸化信號正確地安置，相應(yīng)于非編碼鏈的插入序列的鏈將被轉(zhuǎn)錄并成為本發(fā)明的反義寡核苷酸。本發(fā)明的反義寡核苷酸可用于抑制無細(xì)胞提取物、細(xì)胞和動物(包括哺乳動物和人)中IRM的活性。在一個實(shí)施方案中，與未處理情況相比，反義多核苷酸可以抑制測試細(xì)胞系中IRM的表達(dá)至少約25％，優(yōu)選至少約50％。測試細(xì)胞系通常是已建立的人細(xì)胞系(即，可從ATCC得到，或者如此處描述的通過EBV轉(zhuǎn)化白細(xì)胞制備)。關(guān)于反義多核苷酸的一般方法參見D.A.Melton編，1988，《反義RNA和反義DNA》(Antisense RNA and DNA)冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY.以及Dagle等，1991，核酸研究(Nacleic Acid Research)，191805。
三鏈體寡核苷酸和多核苷酸本發(fā)明提供能與雙鏈或雙鏈體IRM核酸(例如，IRM RNA的折疊區(qū)域或IRM基因內(nèi))結(jié)合而形成三螺旋或“三鏈體”核酸的寡核苷酸和多核苷酸(DNA、RNA、PNA等)。三螺旋形成將導(dǎo)致IRM表達(dá)的抑制，例如，通過阻礙IRM基因的轉(zhuǎn)錄從而減少或消除細(xì)胞內(nèi)IRM的活性。不想被任何特定機(jī)理所束縛，但認(rèn)為三螺旋配對危害了雙螺旋充分打開以結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子的能力。用三螺旋形成的堿基配對原則(參見例如，Cheng等，1988，J Biol.Chem.26315110；Ferrin和Camerini-Otero，1991，Science 3541494；Ramdas等，1989，J.Biol.Chem.26417395；Strobel等，1991，Science2541639；和Rigas等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.839591)和IRMmRNA和/或基因序列可以構(gòu)建本發(fā)明的三鏈體寡核苷酸和多核苷酸。典型地，本發(fā)明的形成三鏈體的寡核苷酸包含由約10個到至少約25個或更多個核苷酸組成的特定序列，該序列“互補(bǔ)”于IRM RNA或其基因中的特定序列(即，該寡核苷酸應(yīng)足夠大以形成穩(wěn)定的三螺旋，但是又應(yīng)足夠小，以便如果需要可根據(jù)遞送方式而實(shí)現(xiàn)體的施用)。在該上下文中，“互補(bǔ)”指能夠形成穩(wěn)定的三螺旋。
核酶本發(fā)明還提供可用于抑制IRM活性的核酶。本發(fā)明的核酶能夠結(jié)合并且特異切割I(lǐng)RM mRNA從而使IRM mRNA失活。有用的核酶可以包含與IRM mRNA互補(bǔ)的5’-和3’-端序列，并且可以基于此處公開的IRM mRNA序列由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行構(gòu)建(參見PCT出版物WO93/23572，見前)。本發(fā)明的核酶包括那些具有I型內(nèi)含子核酶的特征(Cech，1995，Biotechnology 13323)和錘頭型核酶的特征(Edgington，1992，Biotechnology 10256)的核酶。本發(fā)明的核酶包括具有如GUA、GUU和GUC等切割位點(diǎn)的核酶。根據(jù)本發(fā)明，用于核酶介導(dǎo)的IRM活性抑制的其它最適切割位點(diǎn)包括在PCT公開WO 94/02595和WO 93/23569中所描述的切割位點(diǎn)。可以評估含有切割位點(diǎn)的、相應(yīng)于靶IRM基因區(qū)的長度為15到20個核糖核苷酸的短RNA寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)特征，這些二級結(jié)構(gòu)特征可能使得該寡核苷酸更合意。也可以以如下方式評估切割位點(diǎn)是否合適利用核糖核酸酶保護(hù)測定來檢驗(yàn)與互補(bǔ)寡核苷酸雜交的易接近性，或根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法對體外核酶活性進(jìn)行檢驗(yàn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明中的核酶是體外產(chǎn)生后導(dǎo)入細(xì)胞或患者體內(nèi)的。在另一個實(shí)施方案中，基因治療方法用于離體或在體內(nèi)在靶細(xì)胞中表達(dá)核酶。
寡核苷酸的施用典型地，本發(fā)明的治療方法包括寡核苷酸的施用，該寡核苷酸能夠在體內(nèi)生理條件下抑制或刺激IRM活性，并且能在這些條件下在足夠產(chǎn)生療效的一段時間內(nèi)保持相對的穩(wěn)定。如前所述，可通過修飾核酸來賦予這種穩(wěn)定性以及實(shí)現(xiàn)向目的組織、器官或細(xì)胞的靶向遞送。寡核苷酸和多核苷酸可以作為藥物以適宜的藥物制劑形式直接輸送，也可以通過脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、彈道(ballistics)、直接攝入細(xì)胞等將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法間接輸送，參見此處所述。對于疾病的治療，將對患者施用治療有效量的本發(fā)明寡核苷酸。治療有效量是足夠緩解疾病癥狀或調(diào)節(jié)靶細(xì)胞中IRM活性的量。用于治療的寡核苷酸的輸送方法描述于美國專利5,272,065。在另一個實(shí)施方案中，可通過基因治療和重組DNA表達(dá)質(zhì)粒輸送寡核苷酸和多核苷酸。
抗體在本發(fā)明的一個方面，在IR或IR相關(guān)病癥的治療中，使用能夠特異結(jié)合IRM多肽的抗體，例如，單克隆抗體來抑制IRM活性。如上面所討論的，抗IRM抗體也可以用于本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法中。本發(fā)明的抗體將特異識別并結(jié)合具有與此處所述的IRM的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。本發(fā)明的抗體通常顯示出的特異結(jié)合親和力為至少約107、108、109或1010M-1。可以用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備抗IRM抗體。多克隆和單克隆抗體的制備方法在本領(lǐng)域公知。參見例如，前面的Kohler和Milstein，1975，Nature 256495-97以及Harlow和Lane的方法。這些技術(shù)包括從噬菌體或類似載體的重組抗體文庫中篩選抗體的抗體制備方法。參見Huse等，1989，Science 2461275-81；和Ward等，1989，Nature341544-46。對于多抗的制備，可以選擇合適的靶免疫系統(tǒng)，常用的為小鼠和兔，也可以用山羊、綿羊、奶牛、小雞、豚鼠、猴和大鼠?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法沉淀、分離并純化(包括親和純化)宿主產(chǎn)生的免疫球蛋白。通過多克隆血清的層析純化可以得到基本上具有單一特異性的抗體群。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，為了減少潛在的抗原性而不降低與目的蛋白的親和性，抗IRM單克隆抗體是人源化的，人的或嵌合的。人源化抗體的描述可參見Queen等，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8610029；美國專利號5,563,762；5,693,761；5,585,089及5,530,101。用于人源化的人抗體序列可以是天然發(fā)生的人抗體序列，也可以是幾種人抗體的共有序列。參見Kettleborough等，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等，Protein Engineering 6971(1993)?？笽RM的人源化單克隆抗體也可以用具有人免疫系統(tǒng)成分的轉(zhuǎn)基因動物來制備(參見美國專利號5,569,825；5,545,806；5,693,762；5,693,761；及5,7124,350)。也可以用噬菌體展示技術(shù)制備有用的抗IRM結(jié)合組合物(參見Dower等，WO 91/17271及McCafferty等，WO 92/01047)。在這些方法中，噬菌體文庫中的成員在其外表面展示不同的抗體?？贵w通常展示為Fv或Fab片段?？梢酝ㄟ^相對于IRM多肽進(jìn)行親和富集篩選出具有所需的特異性的噬菌體展示抗體。當(dāng)制備物中至少約80％，更通常至少約90％，更通常至少約95％，最通常至少約99％或以上的多肽分子能特異結(jié)合相同抗原(例如，IRM多肽)時，抗體(例如，抗IRM抗體)為基本上純的。藥用抗IRM免疫球蛋白優(yōu)選具有至少約90～95％的同質(zhì)性，最優(yōu)選98～99％或以上的同質(zhì)性。本發(fā)明的抗體可以修飾以后或未經(jīng)修飾而使用。時常，通過共價地或非共價地連接上可提供可檢測信號的物質(zhì)來標(biāo)記抗體。這些標(biāo)記物包括本領(lǐng)域熟知的標(biāo)記物，如放射性、熒光、生物活性(例如，酶)標(biāo)記物等等。以標(biāo)記的結(jié)合實(shí)體形式存在的本發(fā)明抗體可能在診斷中尤其有用。
提高IRM基因產(chǎn)物水平的方法基因治療的方法可用于提高IRM表達(dá)。這種方法通常包括給個體施用編碼IRM多肽或其活性片段的核酸分子。此施用的核酸可以提高一種或多種組織中IRM的表達(dá)水平。核酸的施用應(yīng)使得合成的IRM的量能夠?qū)邮茉撝委煹膫€體產(chǎn)生有效的治療或預(yù)防效果。這里所用的“基因治療”指的是使用單次治療可以獲得持久的效果的療法和多次施用基因治療劑以便獲得或維持所需的IRM表達(dá)的增加的方法。編碼IRM的核酸分子可以離體(ex vivo)或體內(nèi)(in vivo)施用。離體基因治療方法包括將核酸體外施用于細(xì)胞然后將含有導(dǎo)入的核酸的細(xì)胞移植回被治療的個體體內(nèi)。適于將IRM核酸體外轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)包括，但不限于，使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖和磷酸鈣沉淀方法。細(xì)胞一經(jīng)轉(zhuǎn)染，隨后便可導(dǎo)入患者體內(nèi)。體內(nèi)基因治療方法包括直接將核酸或核酸/蛋白復(fù)合體施用于被治療的個體。體內(nèi)施用可根據(jù)許多以建立的方法完成，包括，但不限于，注射裸露的核酸、病毒感染、脂質(zhì)體運(yùn)輸或內(nèi)吞作用運(yùn)輸。其中，病毒載體轉(zhuǎn)染和病毒外殼蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是常用的方法(參見Dzau等，1993，Trends in Biotechnology 11205-210)。適宜的病毒載體包括，例如，腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在相關(guān)方面，通過施用IRM多肽提高細(xì)胞中或患者體內(nèi)IRM多肽的水平。該多肽可通過常規(guī)重組技術(shù)制備，備選地，該多肽可以通過本領(lǐng)域已知的純化方法制備。
藥物組合物、劑量和施用本發(fā)明還提供含有IRM的激動劑、拮抗劑或配體的藥物組合物。藥物組合物可在無菌條件下直接施用于要治療的宿主。然而，雖然活性成分可單獨(dú)施用，但是通常優(yōu)選將其以藥物制劑形式施用。制劑典型地包含至少一種活性成分及其一種或多種可接受的載體。每種載體都必須在藥理上和生理上與其他成分可配伍，并且不會危害患者。例如，可以在施用前將生物活性劑與載體蛋白如卵白蛋白或血清白蛋白復(fù)合以提高穩(wěn)定性或藥理性質(zhì)如半衰期。可用制藥領(lǐng)域中任何熟知的方法制備此藥物制劑，見，如Gilman等編，1990《GOODMAN ANDGILMAN’SThe Pharmacological Basis ofTherapeutics》第8版Pergamon Press和Remington’s PharmaceuticalSciences，(1990)第17版Mack Publishing Co.，Easton、PA.；Avis等編(1993)《Pharmaceutical Dosage FormsParenteral medications》Dekker，N.Y.?？梢允┯盟幬锝M合物以進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性治療?；钚猿煞值亩拘院童熜Э稍诩?xì)胞培養(yǎng)物和/或?qū)嶒?yàn)動物中據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法確定，這些方法包括，例如，測定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體的治療有效劑量)。毒性和療效的劑量比是治療指數(shù)，可用LD50/ED50比值來表示。優(yōu)選表現(xiàn)出大治療指數(shù)的化合物。從細(xì)胞培養(yǎng)物和/或動物研究得到的數(shù)據(jù)可用于制定用于人的劑量范圍?；钚猿煞莸膭┝客ǔＮ挥诎‥D50并且毒性很小或無毒的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可在該范圍內(nèi)變化，取決于所用的劑量形式和給藥途徑。這里所描述的藥物組合物可以通過多種不同方式施用。這些方式的實(shí)施例包括通過口、鼻內(nèi)、直腸、局部、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、真皮下、透皮、鞘內(nèi)和顱內(nèi)的方法施用含有可藥用載體的組合物。用于配制藥物組合物的成分優(yōu)選具有高純度且基本上沒有潛在的有害污染物(例如，至少國家食品(National Food)(NF)級，通常至少為分析級，更典型地，至少為制藥級)。而且，預(yù)期體內(nèi)使用的組合物通常是無菌的。就使用前必需合成的給定化合物而言，所得產(chǎn)物典型地基本上沒有任何潛在毒性成分，尤其是可能在合成或純化過程中存在的任何內(nèi)毒素。腸胃外施用的組合物也是無菌的，基本上等滲的，并在GMP條件下制備。
VIII.疾病或癥狀相關(guān)基因序列的鑒定方法在一個不同的方面，本發(fā)明提供了表達(dá)水平與疾病狀態(tài)或醫(yī)學(xué)癥狀(以后稱作“疾病”)相關(guān)的一個基因或一組基因的鑒定方法。這樣鑒定的基因，包括相應(yīng)的基因產(chǎn)物，是進(jìn)行干擾以預(yù)防或治療該疾病的靶標(biāo)，可用于該疾病的診斷或預(yù)后(例如，通過檢測可用于診斷疾病狀態(tài)的基因表達(dá)模式)，可用作藥物篩選靶標(biāo)以尋找可用于治療該疾病的藥劑，以及用于許多其他用途。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該方法包括鑒定第一群人類個體，這些個體已經(jīng)患有或者有高度危險患有該疾?。徊㈣b定第二群人類個體，其中這些個體患該疾病的危險性低。此方法可用于任何疾病，只要該病的患病或高易感性群體能夠與非患病或相對低易感性群體區(qū)分即可。這些疾病的例子包括胰島素抗性及IR相關(guān)疾病(例如，II型糖尿病)、心血管疾病，包括異常脂血癥(dyslipidemia)(例如，禁食LDL和/或甘油三脂水平偏高，或者禁食HDL水平偏低)，動脈粥樣硬化相關(guān)疾病，包括如心肌梗死，再狹窄、腦血管疾病和外周血管疾病。其它例子包括自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和過敏。在一個實(shí)施方案中，第一和第二群體都包括至少3例，常至少5例，有時至少10例個體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)年齡、性別、種族和/或其它臨床相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)匹配這些個體。年齡和性別匹配指的是在最初選取研究對象的時候匹配第一組研究群體(如eIR組，通常稱為病例組)和第二組研究群體(如eIS組，通常稱為對照組)的過程。年齡匹配的組指病例組的平均年齡與對照組的平均年齡相似(即無顯著差異)，該相似性經(jīng)p值＞0.05的標(biāo)準(zhǔn)卡方檢驗(yàn)確定。性別匹配的組指病例組與對照組的男性和/或女性數(shù)量或男/女比例相同或相似。相似性(或非顯著差異)可經(jīng)p值＞0.05的標(biāo)準(zhǔn)卡方檢驗(yàn)確定。除了年齡和性別匹配，種族匹配在所有遺傳學(xué)研究中也是一個重要的過程。對于相對同源的人群，如中國臺灣人，通過選擇來自同一城市或省份的病例和對照個體即可實(shí)現(xiàn)種族匹配。對于異源人群，如美國人群，通常有5個主要種族歐洲美國人、非洲美國人、墨西哥美國人、本土美國人和亞洲美國人。這種情況下的種族匹配通常指研究中選擇5個種族之一同時用于病例和對照組。獲得每組群體的細(xì)胞，鑒定在第一組群體和第二組群體的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。在一個實(shí)施方案中，來自每例個體的組織的細(xì)胞都用以建立細(xì)胞系，例如，無限增殖化細(xì)胞系，例如，無限增殖化B細(xì)胞系，并鑒定在一個群體的細(xì)胞系中比在另一群體的細(xì)胞系中以較高水平表達(dá)的基因。在一個實(shí)施方案中，通過使個體血細(xì)胞無限增殖化得到細(xì)胞系，在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞系為無限增殖化B淋巴細(xì)胞。從血液淋巴細(xì)胞中建立細(xì)胞系的方法已熟知，包括，例如，EBV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。參見，例如，Henderson等，1977，Virology 76152-63。如所指出的，可以從分離的血液淋巴細(xì)胞制備EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞，該方法用EBV上清液進(jìn)行感染并培養(yǎng)細(xì)胞6到8周后得到完全轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物。有多種方法可用于鑒定在兩組群體間差異表達(dá)的基因。通常，從細(xì)胞系中分離RNA，并用其制備探針。在一個實(shí)施方案中，將來自每組個體的細(xì)胞系的RNA(或相應(yīng)的cDNA或其它探針)合并。例如，可在合并來自每個細(xì)胞系的RNA(等量混合來自每個個體細(xì)胞系的RNA)之后進(jìn)行標(biāo)記，備選地，相應(yīng)于幾個細(xì)胞系的探針在標(biāo)記后混合。通常對應(yīng)于各組群體的探針用不同方式標(biāo)記以便區(qū)分。這些任選地合并的探針(例如，cDNA、RNA等)可通過常規(guī)方法用于鑒定在組織中差異表達(dá)的基因。參見，例如，Lockhart等，1996，Nature Biotech 141675，美國專利號5,578,832；5,556,752；5,510,270，Schena等.，1995，Science 270467-70。在一個實(shí)施方案中，該組織是血液，例如，血液淋巴細(xì)胞。用以鑒定的一種方法是用探針與寡核苷酸或cDNA序列(如表達(dá)序列標(biāo)簽)陣列雜交，如下文的實(shí)施例所述(例如，將合并的探針與包含了來自于組織的＞100個表達(dá)序列標(biāo)簽的核酸陣列雜交)。這樣，在一個實(shí)施方案中，通過鑒定患有疾病或有增加的患病危險性的第一組人群，鑒定具有低患病危險性的第二組人群，并鑒定與第二組人群相比，在第一組人群中差異表達(dá)的RNA序列來鑒定該疾病相關(guān)的基因序列。在一個實(shí)施方案中，鑒定步驟包括從第一組和第二組人群的每例個體的組織中分別制備各自的細(xì)胞系、從所述細(xì)胞系中得到RNA、制備相應(yīng)于每個細(xì)胞系的RNA的探針(所述探針任選地進(jìn)行合并，例如，反轉(zhuǎn)錄之前合并RNA或反轉(zhuǎn)錄之后合并cDNA)、并將合并的探針雜交到含有在人組織(如血)中表達(dá)的序列的核酸陣列上。典型地，通過該方法可確定至少3個在第一組群體和第二組群體之間有表達(dá)差異的基因(RNA序列)。在一個舉例說明性實(shí)施方案中，第一組群體為極端胰島素抗性群體(例如，120分鐘時OGTT Glu＞140mg/dl；SSPG均值＞250mg/dl；60分鐘時OGTT Ins＞100μIU/ml Et；120分鐘時OGTT Ins＞100μIU/ml)，第二組群體為極端胰島素敏感群體(例如，120分鐘時OGTT Glu＜100mg/dL；SSPG均值＜120mg/dl；60分鐘時OGTT Ins＜60μIU/ml或；120分鐘OGTT Ins＜40μIU/ml)。在另一個舉例說明性實(shí)施方案中，第一組為極端高HDL群體(例如，禁食HDL＞60mg/dl、年齡＞18歲、葡萄糖耐量試驗(yàn)正常、非糖尿病、無心血管疾病)，第二組為極端低HDL群體(例如，禁食HDL＜30mg/dl；年齡＞18歲)。在再一個舉例說明性實(shí)施方案中，第一組為極端肥胖/高體重群體(體重指數(shù)＞30；年齡＞18歲；可獲得細(xì)胞系)，第二組為極端瘦型/低體重群體(體重指數(shù)(Kg/M2)＜20；年齡＞18歲；葡萄糖耐量試驗(yàn)正常；非糖尿病、無心血管疾病)。
通常，第一組和第二組的年齡、性別和種族相互匹配。
IX.實(shí)施例下面的實(shí)施例僅為更詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明的某些方面，并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1臺灣胰島素抗性家系(TWIR)研究采樣和表型分析TWIR家系按三個判斷方案收集(1)雙親為NIDDM患者；(2)雙親之一為NIDDM患者；(3)雙親臨床表型正常。由于胰島素抗性在雙親之一或兩者為患者的家系中以高頻率分離，本方法使找到連鎖關(guān)系的可能性最大化。此外，也包括一些雙親臨床表型正常的家系，因?yàn)橐葝u素抗性也可以發(fā)生在無NIDDM的個體中。1993-1996年間在臺灣三軍總醫(yī)院的糖尿病門診部(DiabetesClinics of Tri-service General Hospital in Taiwan)收集了總共112個中國人核心家系。其中，81個家系符合遺傳連鎖研究(linkage study)的入選標(biāo)準(zhǔn)每個家系如果雙親入選，至少入選一對同胞；每家系至少入選雙親之一；每家系如僅入選雙親之一，則至少入選3個同胞。這81個家系中，18個家系的雙親皆證明為NIDDM患者，46個家系的雙親之一為NIDDM患者，17個家系的雙親臨床表型正常。在該研究中，從此81個家系共選擇了432例個體，包括152例親本和280例非糖尿病子女，他們是否患糖尿病用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和穩(wěn)態(tài)血漿葡萄糖試驗(yàn)(SSPG)來定義。基本臨床數(shù)據(jù)，如年齡、性別、體重、身高、腰臀比、NIDDM初次發(fā)病年齡以及病史，在每個患者初次就診時獲取。BMI用作一般肥胖指數(shù)，等于體重(kg)除以身高(m)的平方。腹部肥胖通過腹圍與臀圍的比例來估計(WHR表示腰臀比)。腰圍的測量在臍的水平上進(jìn)行，臀圍根據(jù)臀部最寬的部分確定。收縮壓和舒張壓的測量采用坐姿三次測量，每次測量間隔20分鐘，由熟練護(hù)士通過傳統(tǒng)血壓測量法和基于示波技術(shù)的自動便攜裝置兩種方法進(jìn)行測量。這些三數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值分別用于確定收縮壓和舒張壓的水平。通過OGTT確定口服葡萄糖后葡萄糖和胰島素的反應(yīng)。每例研究對象通過飲用口服75g葡萄糖(Glucola)，分別在葡萄糖攝取之前10分鐘，葡萄糖攝取時(0分鐘)、及口服葡萄糖后30、60、90、120及180分鐘采血。這些樣本中的血漿葡萄糖和胰島素水平通過酶學(xué)比色法以及自動免疫分析測定。隔夜禁食后，在研究對象兩臂分別插入靜脈導(dǎo)管，一臂采血用于測量血漿葡萄糖和胰島素濃度，另一臂用于施用測試物質(zhì)。通過Harvard輸注泵將溶于含有2.5％(w/v)人血清白蛋白的溶液中的Sandostatin以25ug/h施用以抑制內(nèi)源胰島素的分泌。同時，胰島素和葡萄糖分別以25mU/m2/min注入。于如下時間點(diǎn)采血(每次7ml)輸注開始前-10min，0min，進(jìn)入研究每半小時直到150分鐘，然后每10分鐘直到180分鐘。到60分鐘胰島素濃度通常達(dá)到平臺，而葡萄糖濃度在120分鐘后才達(dá)到平臺。將150、160、170以及180min四點(diǎn)所得數(shù)據(jù)平均，并認(rèn)為這些均值代表在輸注過程中達(dá)到的穩(wěn)態(tài)血漿葡萄糖(SSPG)和穩(wěn)態(tài)血漿胰島素(SSPI)濃度。由于SSPI濃度在所有個體中具有定量和定性的可比性，而葡萄糖輸入速率一致，所以所得SSPG濃度的大小可用于定量估計胰島素處理葡萄糖負(fù)荷的效率，即個體的SSPG越高，胰島素抗性越顯著。分別于不同的兩天進(jìn)行隔夜禁食后采血(每次15ml)，一天為OGTT的那一天，另一天為SSPG試驗(yàn)的那一天。采用標(biāo)準(zhǔn)酶學(xué)方法檢測脂和脂蛋白。用標(biāo)準(zhǔn)EB病毒轉(zhuǎn)化分別從245個研究對象的B淋巴細(xì)胞建立細(xì)胞系。
實(shí)施例2IRM序列鑒定基于上述表型分析，6例個體被鑒定為具有極端胰島素抗性(“eIR”)表型，另有6例個體被鑒定為具有極端胰島素敏感(“eIS”)表型。符合下面的標(biāo)準(zhǔn)的對象被歸為eIR組120分鐘時OGTT Glu＞140mg/dl；SSPG均值＞250mg/dl；60分鐘時OGTT Ins＞100μIU/ml Et；120分鐘時OGTT Ins＞100IU/ml。符合下面標(biāo)準(zhǔn)的對象被歸為eIS組120分鐘時OGTT Glu＜100mg/dl；SSPG均值＜120mg/dl；60分鐘時OGTTIns＜60μIU/ml或者120分鐘時OGTT Ins＜40μIU/ml。來自每例個體的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約兩周，然后將這些細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到含3％FBS的RPMI-1640中培養(yǎng)72小時，之后轉(zhuǎn)移到含3％FBS以及15μIU/ml胰島素或者100μIU/ml胰島素的RPMI-1640培養(yǎng)基中再孵育72小時。在提取RNA的時候，來自IR和IS人群的細(xì)胞系在完全相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)并傳了相同代數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)Trizol方法(Gibco-BRL)提取每個細(xì)胞系的總RNA。來自6例eIR細(xì)胞系的總RNA等量混合成為IR-RNA池，來自6例eIS細(xì)胞系的總RNA等量混合成為IS-RNA池。以oligo-dT為引物反轉(zhuǎn)錄從總RNA池特異擴(kuò)增mRNA以制備不同標(biāo)記的探針。通過反轉(zhuǎn)錄將IR池用Cy5-dUTP(脫氧尿苷三磷酸)標(biāo)記，IS池用Cy3-dUTP標(biāo)記。將來自各池的標(biāo)記cDNA混合并同時與微陣列雜交，這些微陣列含有約10,000個來自血細(xì)胞中表達(dá)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(參見PCT公開WO 00/40749)，或者含有約40,000個來自各種人組織表達(dá)的基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(http//genome-www4.stanford.edu/cgi-bin/sfgf/home.pl/)。cDNA標(biāo)記、微陣列雜交和洗滌都遵循廠商Corning提供的用于CMT-GAPS載片的標(biāo)準(zhǔn)使用說明書進(jìn)行(http//www.corning.com/CMT/TechInfo/PDFs/cmt_amino_silane_im.pdf)。通過GenePix 4000A掃描儀用GenePix Pro 3.0微陣列分析軟件(Axon Instruments，Inc，F(xiàn)oster City，Calif.)掃描微陳列鑒定出差異表達(dá)的基因?？蓮膾呙鑸D像識別基因，即在IR池中具有更高mRNA豐度的基因(標(biāo)記為紅點(diǎn)(Cy5))，以及在IS池中具有更高mRNA豐度的基因(標(biāo)記為綠點(diǎn)(Cy3))。黃點(diǎn)表示對這些特定cDNA點(diǎn)，在IR池和IS池之間基因表達(dá)沒有顯著差異。
實(shí)施例3IRM表達(dá)的補(bǔ)充分析本發(fā)明的IRM基因還可以用許多測定方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，這些方法包括(a)Northern分析實(shí)驗(yàn)，其測定來源于eIS和eIR群體的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系中IRM基因表達(dá)。Northern分析可使用來自多個細(xì)胞系的RNA池，也可使用單個細(xì)胞系的RNA。
(b)Northern分析實(shí)驗(yàn)，其測定具有已知胰島素抗性狀態(tài)(例如，具有eIS或eIR表型)的個體的IRM基因表達(dá)。此Northern分析可使用來自若干個體的RNA池，也可使用單個體的RNA。
(c)定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)，其測定來源于eIS和eIR群體的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系中IRM基因的表達(dá)。此qRT-PCR可使用來自多個細(xì)胞系的RNA池，也可使用來自單細(xì)胞系的RNA。
(d)定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)，其測定具有已知胰島素抗性狀態(tài)(例如，具有eIS或eIR表型)的個體的IRM基因表達(dá)。此qRT-PCR可使用來自若干個體的RNA池，也可使用來自單個體的RNA。按照本說明書的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就能夠很好的完成所有這些分析，并且至少有一些補(bǔ)充分析已針對此處公開的許多IRM基因進(jìn)行了。下面概括地對每個分析進(jìn)行描述“Flip-Dye”陣列雜交通過來自eIR和eIS細(xì)胞系的探針與陣列cDNA序列進(jìn)行補(bǔ)充輪的雜交，可以驗(yàn)證或檢測多套IRM基因的差異表達(dá)，其中包括利用“flip-dye”技術(shù)的雜交循環(huán)，在這些雜交循環(huán)中用于制備每種探針的標(biāo)記物被互換。參見Wang等，2000，Nat Biotech.18457-59。例如，在第一實(shí)驗(yàn)中用Cy5(紅色)標(biāo)記的eIR cDNA池可在第二實(shí)驗(yàn)中用Cy3(綠色)標(biāo)記，而原來用Cy3標(biāo)記的eIS cDNA池可在第二次實(shí)驗(yàn)中用Cy5標(biāo)記。通過此方法，如果基因X(與固定探針“X”雜交)在eIR細(xì)胞系中過表達(dá)，“X”的位置應(yīng)該在第一實(shí)驗(yàn)中在陳列上呈現(xiàn)紅點(diǎn)而在第二實(shí)驗(yàn)中在陣列上呈現(xiàn)綠點(diǎn)。Northern分析可以用能與IRM基因雜交的探針進(jìn)行Northern分析以監(jiān)測群體中基因表達(dá)的差異。進(jìn)行Northern分析的方法已熟知(參見Sambrook，同前)。在一個分析中，從來源于eIS或eIR表型個體的EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系提取總RNA。備選地，從具eIS或eIR表型的個體的血樣中提取總RNA。在每種情況下，樣本或來自樣本的RNA可獨(dú)立分析(條件是可以得到足夠用量的RNA)或混合后分析。取20ug各樣本的總RNA加到1％變性瓊脂糖凝膠(2.2M甲酰胺，20mM MOPS(3-[N-嗎啉代]丙磺酸)，2mM乙酸鈉，1mM EDTA，和5ng/ml溴化乙啶)的加樣孔中。于100伏電泳4小時。凝膠在電泳完后置于紫外光下拍照檢查上樣量的RNA樣本的完整性和濃度。過夜將膠上的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜(Hybond-N，Amersham)上。之后將尼龍膜在80℃烘2小時固定RNA。轉(zhuǎn)移的RNA先經(jīng)預(yù)雜交再與標(biāo)記后的探針雜交。用隨機(jī)引發(fā)試劑盒(High Prime，Roche Inc.)和IRM基因片段制備32P標(biāo)記的IRM探針。例如，從IMAGE克隆1909455的PCR擴(kuò)增物得到的純化的500bp DNA片段可以作為探針檢測免疫球蛋白κ鏈前體V-III基因的RNA水平。在65℃于rotisserie雜交爐中用Church緩沖液(0.5M磷酸鈉緩沖液，7％SDS，10mM EDTA)對雜交膜進(jìn)行預(yù)雜交4小時，然后與32P-dCTP標(biāo)記的探針在相同條件下雜交16小時。用2×SSC(300mM氯化鈉，30mM檸檬酸三鈉pH 7.0)以及0.1％SDS在室溫洗膜2次，每次15分鐘，之后用0.1×SSC，0.1％SDS在50℃洗膜一次30分鐘，濾膜干燥后用BioMaxMR膠片(Kodak)在-70℃自顯影3天。根據(jù)廠商說明書，用凝膠記錄和分析系統(tǒng)，Alpha Imager 2200(Alpha Innotech Corp)掃描并分析Northern印跡的每張膠片。測定每個條帶的信號強(qiáng)度，其用相對于背景的強(qiáng)度單位(RIU)來表示，來源于eIS樣本的強(qiáng)度均值作為參考值。為每個IR樣本確定倍數(shù)差異，其用eIR強(qiáng)度除以eIS強(qiáng)度均值得到。鑒于eIS樣本間的標(biāo)準(zhǔn)差，通常認(rèn)為2～3倍的差異即是顯著的。定量實(shí)時PCR多種“實(shí)時定量PCR”方法也可以用于確定樣本中IRM mRNA的量。參見，例如，Higuchi等，1992，Biotechnology10413-17；Weis等，1992，Trends in Genetics 8263-64；Ausubel等，同前，Current Protocols in Molecular Biology；Sambrook，等，同前；用于ABIPRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(ABI)的Bulletin#2。在一個實(shí)施方案中，將從6個不相關(guān)的eIR或eIS個體中分離的總RNA等量混合用于分析。5微克混合的總RNA用于cDNA合成。先通過SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和隨機(jī)六聚體制備cDNA第一條鏈。然后熱變性使反轉(zhuǎn)錄酶失活，用RnaseH消化樣本以除去RNA。用Qiaquick DNA純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA以除去引物、未反應(yīng)的dNTP和酶。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的終產(chǎn)量在OD260測定，并將cDNA稀釋到1ng/μl。SYBR-green實(shí)時定量PCR分析可以用于測定目的基因的表達(dá)水平。該P(yáng)CR反應(yīng)為300nM引物對，10ng cDNA，2x SYBR green PCRready mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，終體積50μl。PCR和實(shí)時檢測在ABI’s Prism Sequencing Detection System 7700(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)上進(jìn)行。PCR循環(huán)條件為50℃ 2分鐘，95℃10分鐘，之后40個循環(huán)的95℃ 15秒、58℃ 60秒。在實(shí)時運(yùn)行過程中及終點(diǎn)收集信號。用ABI的序列檢測軟件1.6分析序列。目的基因的表達(dá)水平被翻譯成Ct(循環(huán)閾值)。高表達(dá)水平有較早的Ct(較小的數(shù))，低表達(dá)水平有較遲的Ct(較大的數(shù))。在兩個不同試驗(yàn)樣本(例如，eIR細(xì)胞系和eIS細(xì)胞系，eIR個體和eIS個體的血樣)中表達(dá)的同一基因有兩個Ct值。這兩個Ct的差值(ΔCt)用于計算兩個不同樣本中基因的差異表達(dá)。在檢測范圍內(nèi)(15-35Ct)，1個ΔCt代表兩倍差異。
實(shí)施例4定量和診斷性IRM分新本實(shí)施例描述了胰島素抗性標(biāo)記補(bǔ)充分析的示例性結(jié)果。補(bǔ)充雜交分析依照例2中所描述的并使用flip dye方法進(jìn)行。IRM 120基因的差異表達(dá)在8輪雜交的6輪中被檢測到。qRT-PCR用于檢測血中IRM的表達(dá)。收集禁食后9例無關(guān)eIR或eIS個體的血樣，分離總RNA，并將分離的總RNA等量混合。從各組得到的5微克總RNA池用于cDNA合成。先通過SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和隨機(jī)六聚體合成cDNA第一條鏈。加熱變性使反轉(zhuǎn)錄酶失活后，用RnaseH消化樣本以除去RNA。用Qiaquick DNA純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA以除去引物、未反應(yīng)的dNTP和酶。 YBR-green實(shí)時定量PCR分析用于測定IRM 120的表達(dá)水平。此PCR反應(yīng)體系為300nM引物對，10ng cDNA，2x SYBR green PCRready mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，終體積50μl。PCR反應(yīng)和實(shí)時檢測在ABI的Prism Sequencing Detection System 7700(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)上進(jìn)行。PCR循環(huán)條件如下50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，然后40個循環(huán)的95℃ 15秒、58℃ 60秒。在實(shí)時運(yùn)行過程中和終點(diǎn)收集信號，用ABI的序列檢測軟件1.6分析此序列。目的基因的表達(dá)水平被翻譯成Ct(循環(huán)閾值)。高表達(dá)水平有較早的Ct(較小的數(shù))，低表達(dá)水平有較遲的Ct(較大的數(shù))。在兩個不同試驗(yàn)樣本(例如，eIR和eIS)中表達(dá)的同一基因有兩個Ct值。這兩個Ct的差值(ΔCt)用于計算兩個不同樣本中基因的差異表達(dá)。在檢測范圍內(nèi)(15-35Ct)，1個ΔCt代表兩倍差異(ABI使用手冊2)。
表4 用定量RT-PCR進(jìn)行補(bǔ)充雜交分析，所用血樣來自eIR和eIS表型個體。根據(jù)TRIZOL RNA分離實(shí)驗(yàn)指南(GIBCOBRL，Cat#15596-018)從禁食后eIR和eIS個體的10ml血樣中提取RNA，用100μl DEPC處理的Tris緩沖液(10mM，pH 7.0)重懸純化后的總RNA。各來自于6例無關(guān)eIR個體的大約0.5微克血樣RNA分別用于cDNA的合成，作為比較，用等量的來源于9例eIS個體的總RNA池(eIS池)合成cDNA。通過SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和隨機(jī)六聚體制備cDNA第一條鏈。加熱變性使反轉(zhuǎn)錄酶失活后，用RnaseH消化樣本以除去RNA。用QiaquickDNA純化試劑盒(Qiagen)純化cDNA以除去引物、未反應(yīng)的dNTP和酶。為測定IRM 120基因的表達(dá)水平，SYBR-green實(shí)時定量PCR分析使用IRM 120基因的特異引物(正向引物5’-CAG AAG GAA ATT AAGCAA ACA-3’；反向引物5’-CCG TAT ATG GCA ATT CAA TAA-3’；擴(kuò)增子長度為98bp)進(jìn)行。此PCR反應(yīng)體系為300nM引物對，10ng cDNA，2x SYBR green PCR ready mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，終體積50μl。PCR和實(shí)時檢測在ABI的Prism Sequencing Detection System7700(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上進(jìn)行。PCR條件設(shè)定如下50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，之后40個循環(huán)的95℃ 15秒和58℃ 60秒。對每個樣本做三份相同的定量RT-PCR，在實(shí)時運(yùn)行過程中和終點(diǎn)收集信號，最后用ABI的序列檢測軟件1.6分析此序列。另外，在每次運(yùn)行結(jié)束后，通過和1μg DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Cat#E-3048-1，ISC BioExpress)并行凝膠電泳(電泳槽中含有3％瓊脂糖凝膠，1X TBE，100伏45分鐘電泳)鑒定擴(kuò)增子大小和質(zhì)量，確保無非特異擴(kuò)增和/或引物二聚體帶。
Ct(循環(huán)閾值)表示目的基因的表達(dá)水平，Ct為用戶定義的閾值，在此閾值時由于雙鏈DNA結(jié)合SYBR green，熒光強(qiáng)度為背景值(PCR反應(yīng)早期測定)的10倍。高水平表達(dá)的基因會有較早的Ct(較小的數(shù))，低水平表達(dá)的基因有較遲的Ct(較大的數(shù))。分析物的Ct先相對于對照基因(這里采用GAPDH)進(jìn)行標(biāo)化。分析物和對照Ct的差值定義為ΔCt。將ΔCt與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)(這里采用eIS池)作比較得到ΔΔCt。在檢測范圍內(nèi)(15～35 Ct)，1個Ct表示2倍的差異?；谝陨锨疤幔捎?-ΔΔCt得到分析物的相對表達(dá)水平(ABI使用手冊#2)。
表5 以上數(shù)據(jù)表明IRM120基因在eIR患者血液中的表達(dá)水平均低于在eIS患者血液中的表達(dá)水平。由此證明IRM120基因可用作診斷標(biāo)記并且可用于藥物篩選。值得注意的是，IRM50和IRM120都在182,943bp BAC(GenBank Acc#AC016251.9)的大約8000bp基因組區(qū)段(大致相當(dāng)于BAC的第3000-11000位堿基)中。已知4個IRM120的外顯子，分別定位于BAC序列的nt9969-10386(外顯子1)、nt 9603-9911(外顯子2)、nt7547-8076(外顯子3)和nt4375-4804(外顯子4)。IRM5 EST序列定位于nt3682-4016，位于IRM120外顯子4下游大約350bp。IRM120和50除了在物理上連鎖外，在對比來自eIR個體和來自eIS個體的細(xì)胞系時，IRM120和50都以相似程度下調(diào)。數(shù)據(jù)表明IRM50同IRM120基因一樣，在eIR患者血液中的表達(dá)水平均低于在eIS患者血液中的表達(dá)水平。此外，這些數(shù)據(jù)表明IRM50可能是IRM120的一種剪接變體。另外，cDNA克隆AK025842(1590bp；此后稱為IRM 393)定位于IRM120的3號外顯子和4號外顯子之間。而且，一些IMAGE克隆(例如，Acc#4849984，4862951，731736，4900978，5199490，5200043)也定位于包含IRM50和IRM120的BAC AC016251.9的8000bp基因組片段內(nèi)。因此，此BAC序列、克隆AK025842或者這些IMAGE克隆也是胰島素抗性的標(biāo)記。在各種實(shí)施方案中，與此BAC序列、克隆AK025842或者這些IMAGE克隆雜交的探針以及由相應(yīng)于這些序列的基因編碼的多核苷酸和蛋白可用于此處公開的診斷、預(yù)后、篩選及其它方法中。
***應(yīng)理解，此處描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為通過舉例達(dá)到闡釋清楚的目的，而且鑒于這些描述本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了各種修飾或改動，并且這些修飾和改動都包括在本申請的精神和范圍及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文所引用的所有出版物、專利、專利申請和登錄號(包括自提交日和/或在先申請?zhí)峤蝗掌鸬亩嗪塑账岷投嚯男蛄幸约跋鄳?yīng)注釋)為所有目的整體并入作為參考，并且等同于專門單獨(dú)地指出并入各出版物、專利和專利申請作為參考。
權(quán)利要求
1.診斷個體的胰島素抗性(IR)、IR相關(guān)病癥或者IR或IR相關(guān)病癥易感性的方法，所述方法包括檢測來自被測個體的生物樣本中至少一個表1所列胰島素抗性標(biāo)記(IRM)的表達(dá)水平與非胰島素抗性參考個體群的相似生物樣本中的此IRM的特征性表達(dá)水平的差異。
2.權(quán)利要求1的方法，其中非胰島素抗性的個體群具有極端胰島素敏感(eIS)表型。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中IRM表達(dá)的增加可用于診斷被測個體是否具有胰島素抗性、IR相關(guān)病癥或者IR或IR相關(guān)病癥易感性。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中IRM表達(dá)的減少可用于診斷被測個體是否具有胰島素抗性、IR相關(guān)病癥或者IR或IR相關(guān)病癥易感性。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中生物樣本為血液或血液級分。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中生物樣本包含B淋巴細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其中IRM表達(dá)水平通過檢測IRM RNA來確定。
8.權(quán)利要求7的方法，其中RNA的檢測包括使衍生自被測個體的RNA的探針與固定化的多核苷酸雜交，并檢測雜交復(fù)合物的形成，其中所述固定化的多核苷酸可與表1所列的IRM基因雜交。
9.權(quán)利要求8的方法，其中RNA的檢測包括使被測個體的RNA或從被測個體的RNA衍生的探針與固定化多核苷酸陣列雜交，其中所述固定化多核苷酸包含可以與至少2個不同的表1所列IRM基因雜交的多核苷酸。
10.權(quán)利要求7的方法，其中RNA的檢測包括使cDNA探針與多個固定化多核苷酸雜交。
11.權(quán)利要求7-10的方法，其中IRM編碼的RNA從被測個體的血液樣本中分離。
12.權(quán)利要求1-6的方法，其中所述至少一個IRM的表達(dá)水平是通過檢測表1所列IRM基因編碼的多肽來確定的。
13.權(quán)利要求1-6的方法，其中檢測表達(dá)水平與非胰島素抗性參考個體群的相似生物樣本中的IRM特征性表達(dá)水平的差異之步驟包括確定所述表達(dá)水平是否與胰島素抗性參考個體群的相似生物樣本中的此IRM的特征性表達(dá)水平相似。
14.權(quán)利要求13的方法，其中胰島素抗性個體群具有極端胰島素抗性(eIR)表型。
15.權(quán)利要求1-14的方法，其還包括預(yù)先地基于被測個體或其家族的病史確定被測個體是否為胰島素抗性危險患者。
16.權(quán)利要求1-15的方法，其中檢測IRM 120或IRM 50的表達(dá)差異。
17.診斷個體具有胰島素抗性或有增加的危險發(fā)生胰島素抗性的方法，包括(a)從被測個體獲取生物樣本，和(b)將樣本中一組至少3個表1所列胰島素抗性標(biāo)記的表達(dá)水平與參考值相比，所述參考值代表具有已知胰島素抗性狀態(tài)的個體群中的表達(dá)，其中當(dāng)符合下面條件時可以將個體診斷為胰島素抗性或有發(fā)生胰島素抗性的危險(i)若參考值代表胰島素抗性個體群中的表達(dá)，則所述至少3個胰島素抗性標(biāo)記的至少50％的表達(dá)水平與參考值相比無統(tǒng)計學(xué)差異，或者(ii)若參考值代表非胰島素抗性個體群中的表達(dá)，則所述至少3個胰島素抗性標(biāo)記的至少50％的表達(dá)水平與參考值相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。
18.權(quán)利要求17的方法，其中胰島素抗性個體群具有eIR表型。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中非胰島素抗性個體群具有eIS表型。
20.分析胰島素抗性相關(guān)基因的表達(dá)的裝置，其包含固定化的能與表1所列IRM雜交的至少一個多核苷酸探針，其中基質(zhì)包含少于4000個的不同多核苷酸探針。
21.權(quán)利要求20的裝置，其中所述基質(zhì)包含少于100個的不同多核苷酸探針。
22.權(quán)利要求20或21的裝置，其中基質(zhì)包含少于10個的不同多核苷酸探針。
23.權(quán)利要求20-22的裝置，其包含能與至少4種不同IRM基因雜交的探針。
24.權(quán)利要求20-23的裝置，其中至少10％的固定化探針為能與IRM基因產(chǎn)物雜交的多核苷酸。
25.權(quán)利要求20-24的裝置，其中多核苷酸被固定在載玻片上。
26.權(quán)利要求20-25的裝置，其包含至少一個能與IRM 120或IRM 50雜交的多核苷酸探針。
27.權(quán)利要求8的方法，其中固定化多核苷酸被固定于權(quán)利要求21的裝置上。
28.篩選藥劑以確定其在胰島素抗性治療中的有用性的方法，包括a)提供表達(dá)至少1個表1所列胰島素抗性標(biāo)記(IRM)的細(xì)胞；b)將該細(xì)胞與測試藥劑相接觸；和c)檢測在測試藥劑存在下IRM基因表達(dá)水平是否變化，如果發(fā)生變化則提示該測試藥劑可用于胰島素抗性的治療。
29.權(quán)利要求28的方法，其中細(xì)胞為培養(yǎng)細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的方法，其中細(xì)胞為原代培養(yǎng)物或確立的細(xì)胞系。
31.權(quán)利要求30的方法，其中細(xì)胞選自3T3-L1脂肪細(xì)胞、CHO細(xì)胞、L6大鼠骨骼肌管細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞RAW、Jurkat細(xì)胞、PC12(大鼠神經(jīng)元)細(xì)胞、Hela細(xì)胞、HEP G2細(xì)胞、Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞系Raji、Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞系Daudi、B-PLL細(xì)胞系(p11A-1-1)、B-ALL細(xì)胞系MOLT-3和B-ALL細(xì)胞系MOLT-4。
32.權(quán)利要求30的方法，其中細(xì)胞選自來自于Burkitt氏淋巴瘤、B-細(xì)胞型幼淋巴細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞型慢性淋巴細(xì)胞白血病或B-細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病患者的細(xì)胞系或原代培養(yǎng)細(xì)胞。
33.權(quán)利要求29的方法，其中細(xì)胞為EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞。
34.權(quán)利要求28-33的方法，其中檢測RNA表達(dá)水平的變化。
35.權(quán)利要求28-33的方法，其中檢測IRM基因編碼的蛋白的表達(dá)水平變化。
36.權(quán)利要求28-35的方法，其包括檢測測試藥劑存在下至少2個胰島素抗性標(biāo)記的表達(dá)水平是否發(fā)生變化，如果至少1個IRM的表達(dá)水平發(fā)生變化則提示該測試藥劑可用于胰島素抗性的治療。
37.權(quán)利要求36的方法，其包括確定至少5個胰島素抗性標(biāo)記的表達(dá)水平。
38.權(quán)利要求34的方法，其中表達(dá)水平通過擴(kuò)增分析來確定。
39.權(quán)利要求34或35的方法，其中表達(dá)水平通過雜交分析來確定。
40.權(quán)利要求28-39的方法，其還包括給動物施用所述藥劑以確定該藥劑是否影響動物對胰島素的反應(yīng)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中動物為嚙齒類動物。
42.權(quán)利要求28-41的方法，其中細(xì)胞至少表達(dá)IRM 120和IRM 50兩者之一。
43.篩選藥劑以確定其在胰島素抗性治療中的有用性的方法，包括a)提供包含IRM蛋白質(zhì)的組合物，b)使該組合物與測試藥劑接觸，和c)確定在測試藥劑存在時IRM蛋白質(zhì)的活性是否發(fā)生改變，如果發(fā)生改變，則提示該測試藥劑可用于治療胰島素抗性。
44.篩選藥劑以確定其在胰島素抗性治療中的有用性的方法，包括(a)將IRM基因編碼的多肽或表達(dá)該多肽的細(xì)胞與測試化合物相接觸，其中該多肽具有可檢測的生物活性；和(b)檢測在該測試藥劑存在下蛋白的生物活性水平是否發(fā)生變化，如果變化則提示測試藥劑可用于胰島素抗性的治療。
45.篩選藥劑以確定其在胰島素抗性治療中的有用性的方法，包括(a)將IRM基因編碼的多肽或表達(dá)該多肽的細(xì)胞與測試化合物相接觸；和(b)檢測多肽是否與測試化合物結(jié)合，如果結(jié)合則提示測試藥劑可用于胰島素抗性的治療。
46.用于胰島素抗性或IR相關(guān)病癥治療的藥物的制備方法，包括(a)使用權(quán)利要求28-45之任一項的方法確定藥劑是否可用于治療胰島素抗性；和(b)配制藥劑以用于給靈長類動物施用。
47.篩選可用于胰島素抗性治療的藥劑的方法，包括(a)使用權(quán)利要求28-45之任一項的方法確定藥劑是否可用于治療胰島素抗性；和(b)將藥劑施用給非人類的動物以確定藥劑的效果。
48.在哺乳動物中治療胰島素抗性的方法，包括施用有效量的能夠調(diào)節(jié)表1所列胰島素抗性標(biāo)記表達(dá)的藥劑。
49.權(quán)利要求48的方法，其中藥劑能夠調(diào)節(jié)IRM 120或IRM 50的表達(dá)。
50.與胰島素抗性(IR)表型或發(fā)生胰島素抗性的危險性相關(guān)的多態(tài)的鑒定方法，包括對比來自胰島素抗性個體的生物樣本中和來自非胰島素抗性個體的生物樣本中的表1所列IRM基因的序列差異。
51.權(quán)利要求50的方法，其中非胰島素抗性個體具有eIS表型。
52.權(quán)利要求50的方法，其中胰島素抗性個體具有eIR表型。
53.確定個體是否有發(fā)生胰島素抗性的危險或所述個體是否患有胰島素抗性的方法，包括步驟(a)從所述個體獲得核酸樣本；和(b)確定存在于一個或多個IRM基因上的核苷酸是否指示發(fā)生胰島素抗性的危險性。
54.檢測基因型和胰島素抗性表型之間的相關(guān)性的方法，包括步驟(a)鑒定第一組具有第一胰島素抗性表型的群體中至少1個IRM基因的基因型；(b)鑒定第二組具有不同于第一胰島素抗性表型的第二胰島素抗性表型的群體中上述IRM基因的基因型；和(c)檢測所述基因型和所述表型之間是否存在統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性。
55.權(quán)利要求54的方法，其中第一組群體具有eIS表型，第二組群體具有eIR表型。
56.群體中一套核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的單元型頻率的估計方法，包括(a)鑒定群體中個體的表1所列IRM基因的至少第一核苷酸多態(tài)，(b)鑒定群體中個體的IRM基因的第二核苷酸多態(tài)，其中所述第二IRM基因與第一IRM基因相同或不同；和(c)對步驟(a)和(b)中確定的核苷酸多態(tài)的身份應(yīng)用單元型確定方法進(jìn)行分析以估計所述頻率。
57.檢測單元型與表型之間的相關(guān)性的方法，包括步驟(a)依照權(quán)利要求56的方法估計在具有第一胰島素抗性表型的第一群體中至少一個單元型的頻率，(b)依照權(quán)利要求56的方法估計上述單元型在不同于第一胰島素抗性表型的第二胰島素抗性表型中的頻率，和(c)確定所述單元型與第一胰島素抗性表型之間是否存在統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性。
58.權(quán)利要求57的方法，其中第一胰島素抗性表型為eIR。
59.權(quán)利要求57的方法，其中胰島素抗性表型為eIS。
60.疾病狀態(tài)相關(guān)基因的鑒定方法，包括(a)鑒定第一群人類個體，其中所述個體患有該疾病或?yàn)樵摷膊〉母呶；疾€體；(b)鑒定第二群人類個體，其中所述個體無該疾病或?yàn)樵摷膊〉牡臀；疾€體，(c)從第一和第二群體的每個個體的B淋巴細(xì)胞制備細(xì)胞系，(d) 比較第一群的細(xì)胞系和第二群的細(xì)胞系中RNA的表達(dá)，由此鑒定在第一和第二群之間存在表達(dá)差異的RNA，其中所述在第一和第二群之間存在表達(dá)差異的RNA是由疾病狀態(tài)相關(guān)基因編碼的。
61.權(quán)利要求60的方法，其中細(xì)胞系通過用Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)化而建立。
62.權(quán)利要求60的方法，其中第一和第二群體分別至少包括3名個體。
63.權(quán)利要求60的方法，其中第一群為極端胰島素抗性群體，第二群為極端胰島素敏感群體，或者第一群為極端高HDL群體，第二群為極端低HDL群體，或者第一群為極端肥胖/高體重群體，第二群為極端消瘦/低體重群體。
全文摘要
本發(fā)明提供用于胰島素抗性和胰島素抗性相關(guān)病癥的診斷、預(yù)后和治療的方法、試劑和裝置，以及用于鑒定胰島素抗性和胰島素抗性相關(guān)病癥治療藥劑的方法及由此鑒定的藥劑。
文檔編號A61P5/00GK1533435SQ02814499
公開日2004年9月29日 申請日期2002年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者馬元紅, 栗志堅, 陳帆, 杰弗·法爾曼, Y－D·I·陳, 陳, 法爾曼 申請人:克林杰尼克斯公司