專(zhuān)利名稱(chēng)：脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)分泌胰腺分化及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，其被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的特征。也提供了用于治療胰腺內(nèi)分泌疾病的方法。
背景技術(shù)：
胰島的內(nèi)分泌細(xì)胞團(tuán)包括四種細(xì)胞類(lèi)型，它們是根據(jù)主要調(diào)控的分泌產(chǎn)物分類(lèi)的。這些細(xì)胞包括產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞、產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞、產(chǎn)生胰多肽的γ細(xì)胞以及產(chǎn)生生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞(Henquin，2000，Diabetes 49，1751-1760；Slack，1995，Development 121，1569-1580)。在發(fā)育期間，這些不同的細(xì)胞群被認(rèn)為起源于與胰管上皮相關(guān)的共同的干細(xì)胞前體(Rao等，1989，Am.J.Pathol.134，1069-1086；Rosenberg和Vinik，1992，Adv.Exp.Med.Biol.32195-104；Swenne，1992，Diabetologia 35，193-201；Hellerstrom，1984，Diabetologia 26，393-400；Gu和Sarvetnick，1993，Development 118，33-46)。該前體細(xì)胞通過(guò)一系列逐步的分化途徑，獲得各種細(xì)胞群的特征。早期觀(guān)察顯示α細(xì)胞是胰島第一個(gè)可檢測(cè)的群體，然后依次為β細(xì)胞、δ細(xì)胞和γ細(xì)胞(Slack，1995，Development 121，1569-1580)。胰島沿著導(dǎo)管上皮作為由α細(xì)胞或γ細(xì)胞圍繞的β細(xì)胞以及交錯(cuò)突的δ細(xì)胞的團(tuán)塊而形成。然后未成熟的胰島遷往周?chē)南倥萁M織并發(fā)生血管化(Slack，1995，Development 121，1569-1580)。
胰島細(xì)胞的主要功能是生理性營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)。例如，正常行使功能的β細(xì)胞合成并分泌胰島素以維持血糖水平。這通過(guò)與胰島素控釋分泌途徑相連的內(nèi)源葡萄糖傳感器完成。在這種刺激-分泌偶聯(lián)的范例中，升高的血漿葡萄糖(如餐后)改變?chǔ)录?xì)胞代謝，通過(guò)關(guān)閉ATP-敏感的K+通道導(dǎo)致膜電位的改變。這種去極化事件打開(kāi)電壓-敏感的Ca2+通道，而Ca2+的流入引發(fā)胰島素的受控釋放(Henquin，2000，Diabetes 49，1751-1760)。然后血漿胰島素發(fā)揮作用刺激葡萄糖攝入骨骼肌和脂肪組織，并抑制肝葡萄糖產(chǎn)生，總結(jié)果是降低血漿葡萄糖(Cheatham和Kahn，1995，Endocr.Rev.16，117-142)。
I.胰島素1型(胰島素依賴(lài)型)糖尿病是與內(nèi)分泌胰腺功能喪失相關(guān)的嚴(yán)重疾病。在多數(shù)情況下，這通過(guò)自身免疫攻擊胰島發(fā)生。目前1型糖尿病的療法需要每日單次至多次的胰島素注射。在絕大多數(shù)情況下，這種方案不足以維持對(duì)血糖水平的充分控制，導(dǎo)致眾多的糖尿病晚期并發(fā)癥，這極大地增加了患病個(gè)體的發(fā)病率和死亡率。每日胰島素注射的替代療法是通過(guò)胰腺或胰島移植治愈糖尿病(Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。研究顯示雖然移植完整胰腺組織為有效的治療，該操作遭遇到3個(gè)主要障礙1)供體材料不足；2)需要較大的手術(shù)操作以及3)需要具有短期獲益的長(zhǎng)期的免疫抑制療法。同樣，胰島移植只在某種程度上有效。該操作包括從供體胰腺分離胰島并注射到門(mén)靜脈中。而且，該操作涉及多次注射，需要數(shù)次住院治療(Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。另外，這些患者還必須經(jīng)歷強(qiáng)化的免疫抑制療法。此外，如在胰腺組織移植中那樣，分離胰島的操作也受到極為有限的供體群的影響。利用異種移植的豬胰島的研究正在進(jìn)行中，不過(guò)，利用該途徑的免疫排斥依然是一個(gè)顯著的障礙(Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。
綜上所述，上文的數(shù)據(jù)表明了對(duì)可供選擇的細(xì)胞治療途徑的需求。沿著這些主線(xiàn)，已經(jīng)利用鼠源和人源的胰管干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞通過(guò)控制誘導(dǎo)其沿內(nèi)分泌胰腺途徑的分化來(lái)產(chǎn)生胰島樣細(xì)胞系(Assady等，2001，Diabetes 50，1691-1697；Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Lumelsky等，2001，Science 292，1389-1394；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。被誘導(dǎo)分化為產(chǎn)生胰島激素的細(xì)胞的鼠源干細(xì)胞已經(jīng)被成功地用來(lái)重建糖尿病小鼠模型(Serup等，2001，BMJ322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。再次地，這些途徑的障礙包括免疫排斥以及極為有限的用于人類(lèi)的前體細(xì)胞系來(lái)源。
人胚胎干細(xì)胞(HES)已被成功地分化為產(chǎn)胰島素的細(xì)胞(Assady等，2001，Diabetes 50，1691-1697)。多能未分化HES細(xì)胞的應(yīng)用潛在地代表了用于疾病如糖尿病的分化胰腺β細(xì)胞的來(lái)源。不過(guò)，這些方法有許多缺點(diǎn)。首先是HES細(xì)胞本身的來(lái)源問(wèn)題。盡管?chē)@HES細(xì)胞領(lǐng)域研發(fā)的迫切需求近來(lái)已公諸于眾，但仍存在政治和倫理爭(zhēng)議。因此，合適HES細(xì)胞的可獲得性得不到保證。利用HES細(xì)胞產(chǎn)生分化的胰島細(xì)胞的第二缺陷是證明培養(yǎng)的未分化細(xì)胞的葡萄糖反應(yīng)性的不可預(yù)知性。確實(shí)，Assady及其同事(Diabetes 50，1691-1697)提示由HES細(xì)胞分化的細(xì)胞不顯示葡萄糖應(yīng)答。不應(yīng)答可以歸結(jié)于培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞群的異質(zhì)性的差異、使胰島素應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)化為參數(shù)諸如蛋白或DNA含量的困難或長(zhǎng)期暴露于培養(yǎng)物中高葡萄糖水平。因此為了利用分化的β細(xì)胞，有必要證明該分化的細(xì)胞具有胰島素的刺激-分泌偶聯(lián)。HES細(xì)胞療法還具有發(fā)生畸胎瘤的潛在高風(fēng)險(xiǎn)。
胰腺本身是胰島先祖細(xì)胞的來(lái)源。佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)的WO01/23528公開(kāi)了體外生長(zhǎng)的胰島先祖細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物中用于體內(nèi)糖尿病治療的用途。
胰管來(lái)源的干細(xì)胞或分離的胚胎干細(xì)胞沿內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞系的分化特征在于表達(dá)特異性的標(biāo)記酶和轉(zhuǎn)錄因子。令人感興趣的是，在胚胎發(fā)育期間，胰島和神經(jīng)細(xì)胞享有許多共同的標(biāo)記，包括神經(jīng)特異性烯醇化酶、突觸泡蛋白、兒茶酚合成酶、酪氨酸羥化酶、巢蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子HNF3β、Isl-1、Brain-4 Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、胰腺和十二指腸同源框基因1(PDX-1)、Nkx6.2、Nkx2.2以及neurogenin-3(Ngn-3)(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282；Schwitzgebel等，2000，Development 127，3533-3542；Fernandes等，1997，Endocrinology 138，1750-1762；Zulewski等，2001，Diabetes 50，521-533；Gradwohl等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97，1607-1611)。更成熟胰島細(xì)胞的功能標(biāo)記是胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素、胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Glut2)以及胰多肽的表達(dá)。
II.胰高血糖素胰高血糖素是胰島α細(xì)胞中釋放的29個(gè)氨基酸的肽激素。產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞代表了在發(fā)育的內(nèi)分泌胰腺中最早可檢測(cè)的胰島細(xì)胞群之一。胰高血糖素原的組織特異性釋放受激素原轉(zhuǎn)化酶(PC)細(xì)胞特異性表達(dá)的調(diào)控。PC2在加工胰島胰高血糖素原中的重要作用由PC2基因敲除小鼠的研究揭示。該小鼠具有輕微的低血糖癥、升高的胰島素原，并在胰高血糖素原向成熟胰腺胰高血糖素的加工中表現(xiàn)出較大的缺陷，并且鼠胰島α細(xì)胞從非典型的分泌顆粒分泌胰高血糖素原(J Biol Chem.1998年2月6日，273(6)3431-7；J Biol Chem.2001年7月20日，276(29)27197-202)。
胰高血糖素的關(guān)鍵生物學(xué)作用集中于通過(guò)增強(qiáng)肝中葡萄糖的合成和動(dòng)員而調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。胰高血糖素受體也表達(dá)在人胰島β細(xì)胞上，并有助于調(diào)節(jié)葡萄糖刺激的胰島素分泌(Diabetologia，2000年8月；43(8)1012-9)。
胰高血糖素通常作為反向調(diào)節(jié)激素起作用，對(duì)抗胰島素的作用，并維持血糖水平，尤其是在低血糖癥患者中。在糖尿病患者中，過(guò)量的胰高血糖素分泌在與糖尿病相關(guān)的代謝紊亂如高血糖癥中起著主要作用。具有反復(fù)的低血糖癥的糖尿病患者的主要問(wèn)題在于形成了缺陷的反向調(diào)控應(yīng)答，其包括降低或缺失的對(duì)低血糖的胰高血糖素應(yīng)答。因此理解如何以及為什么自主神經(jīng)系統(tǒng)和胰島α細(xì)胞發(fā)生胰高血糖素分泌缺陷導(dǎo)致低血糖不敏感，是糖尿病研究中的重大挑戰(zhàn)。
給予胰高血糖素在藥理學(xué)上導(dǎo)致血糖的迅速升高，因此可注射胰高血糖素被用作為處于重大低血糖癥風(fēng)險(xiǎn)中的糖尿病患者的藥理學(xué)治療。糖尿病長(zhǎng)期以來(lái)被視為一種雙激素紊亂，其中胰高血糖素過(guò)量顯著地促成了高血糖癥的形成。Shah及其同事(Am.J.Physiol 1999 277E283-E290)調(diào)查了在膳食糖負(fù)荷之后人類(lèi)受試者中周?chē)葝u素濃度對(duì)形成胰高血糖素介導(dǎo)的高血糖癥的重要性。作者發(fā)現(xiàn)在存在相對(duì)胰島素不足時(shí)，胰高血糖素過(guò)量明顯促成受損的葡萄糖產(chǎn)生抑制和高血糖癥。因此胰高血糖素分泌或胰高血糖素作用的抑制劑可能用于治療具有胰島素不足和/或胰高血糖素過(guò)量的糖尿病。2型糖尿病患者的研究表明缺乏胰高血糖素抑制部分地通過(guò)加速的糖原分解促成餐后的高血糖。在口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)期間在存在或不存在生長(zhǎng)抑素誘導(dǎo)的胰高血糖素抑制時(shí)的血糖分析顯示在具有較高胰高血糖素水平的受試者中葡萄糖的顯著增加(參見(jiàn)J Clin Endocrinol Metab.2000年11月；85(11)4053-9)。
已有許多研究證明胰高血糖素在細(xì)胞制備物及在體內(nèi)都促進(jìn)脂肪降解(稱(chēng)為脂解作用)。因而，胰高血糖素可能促進(jìn)人類(lèi)脂肪組織的脂解作用。不過(guò)，過(guò)去的研究是矛盾的，其中有些報(bào)道證實(shí)胰高血糖素在人類(lèi)脂肪細(xì)胞脂解作用中的作用。人類(lèi)胰高血糖素和血管活性腸肽(VIP)在體外刺激游離脂肪酸從人類(lèi)脂肪組織中釋放，而其它實(shí)驗(yàn)在分離的人類(lèi)脂肪細(xì)胞中未能證明胰高血糖素對(duì)脂解作用的明顯效果(Int.J.Obes.1985；9(1)25-7)。胰高血糖素撤退或者體內(nèi)生理性高胰高血糖素血癥在正?；蛱悄虿∪祟?lèi)受試者中不引起軟脂酸流量(脂解指數(shù))的顯著變化(J Clin Endocrinol Metab.1991年2月；72(2)308-15)。最近報(bào)道了相似的陰性發(fā)現(xiàn)，其中7個(gè)健康男性受試者在腹壁上植入留置微透析導(dǎo)管，并檢測(cè)胰高血糖素灌輸對(duì)間質(zhì)甘油、血漿甘油以及FFA的作用。在有或無(wú)外源葡萄糖的全身胰高血糖素灌輸中未檢測(cè)到對(duì)甘油或游離脂肪酸的作用(J Clin Endocrinol Metab.2001年5月1日；86(5)2085-2089)。對(duì)在腹部脂肪組織中植入了留置微透析導(dǎo)管的正常男性受試者的脂解研究中得到了相似的陰性結(jié)果(J Clin EndocrinolMetab.2001年5月；86(5)2085-9)。因此，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)不支持胰高血糖素對(duì)脂解的重要生理學(xué)作用。
當(dāng)在藥理學(xué)上給予人類(lèi)受試者時(shí)，胰高血糖素對(duì)胃腸道(食道、胃以及小腸和大腸)具有抗運(yùn)動(dòng)性效果(Dig Dis Sci.1979年7月；24(7)501-8；Gut.1975年12月；16(12)973-8；N Engl J Med.1999年11月11日；341(20)1496-503)。胰高血糖素也可以松弛膽囊和輸尿管中的平滑肌，導(dǎo)致在膽囊和腎臟的放射學(xué)研究中的偶爾應(yīng)用。
III.生長(zhǎng)抑素生長(zhǎng)抑素是胰腺δ細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源肽，它在體內(nèi)行使多種重要功能。生長(zhǎng)抑素是高度柔性的環(huán)肽，具有非常短的生物學(xué)半衰期。生長(zhǎng)抑素最初發(fā)現(xiàn)作為下丘腦-垂體系統(tǒng)的經(jīng)典內(nèi)分泌激素起作用，從那以后被證明另外作為對(duì)廣泛種類(lèi)的細(xì)胞類(lèi)型的旁分泌和自分泌信號(hào)傳導(dǎo)因子起作用。目前公認(rèn)的受生長(zhǎng)抑素影響的眾多生理學(xué)過(guò)程包括激素和肽因子分泌、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞增殖、平滑肌收縮、營(yíng)養(yǎng)吸收和炎癥。受生長(zhǎng)抑素調(diào)節(jié)的激素和肽包括生長(zhǎng)激素(GH)、促甲狀腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、胰島素和P物質(zhì)(SP)。
生長(zhǎng)抑素影響許多重要的生物系統(tǒng)的功能，例如內(nèi)分泌系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、以及免疫系統(tǒng)連同中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)。在內(nèi)分泌系統(tǒng)中，生長(zhǎng)抑素在生長(zhǎng)激素、胰島素和胰高血糖素分泌的調(diào)控中起著重要作用(Koerker等，Science 1974，184，482-484)。生長(zhǎng)抑素對(duì)胃腸道及血管生物系統(tǒng)的作用導(dǎo)致生長(zhǎng)抑素療法在這些鄰域的臨床應(yīng)用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，生長(zhǎng)抑素似乎是認(rèn)知功能的一種重要調(diào)節(jié)劑(Schettini，Pharmacological Research 1991，23，203-215)，并且在大腦的特定區(qū)域，似乎起著神經(jīng)遞質(zhì)的作用，或者作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)例如乙酰膽堿(Gray等，J.ofNeuroscience 1990，10，2687-2698)和多巴胺(Thal等，Brain Research1986，372，205-209)的釋放。在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)中，生長(zhǎng)抑素與P物質(zhì)一起存在于含兒茶酚胺的纖維和感覺(jué)末梢中(Green等，Neuroscience 1992，50，745-749)，并起著抑制它們釋放和介導(dǎo)效果的作用。
象生長(zhǎng)抑素本身一樣，生長(zhǎng)抑素受體被定位到廣泛種類(lèi)的組織和細(xì)胞類(lèi)型中，包括屬于內(nèi)分泌、胃腸道、血管、免疫、CNS和PNS系統(tǒng)的那些組織和細(xì)胞。也已在許多人類(lèi)腫瘤中證明了生長(zhǎng)抑素受體的高發(fā)生率。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一類(lèi)展現(xiàn)出高密度功能活性生長(zhǎng)抑素受體的腫瘤。功能活性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤由于腫瘤細(xì)胞激素釋放過(guò)量而表現(xiàn)出諸如促胃泌素瘤及胰高血糖素瘤綜合征的臨床癥狀。此類(lèi)癥狀可以通過(guò)生長(zhǎng)抑素受體活化治療。
IV.胰多肽已知胰腺γ細(xì)胞分泌胰多肽(PP)，它是神經(jīng)肽Y蛋白家族的成員。對(duì)于該肽的確切生理學(xué)機(jī)制知之甚少。PP已知通過(guò)抑制迷走神經(jīng)刺激抑制胰腺消化酶的分泌而直接在胰腺中發(fā)揮作用。PP的這種效果被認(rèn)為是通過(guò)直接作用于迷走神經(jīng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)的對(duì)背側(cè)迷走神經(jīng)復(fù)合體及弓狀核的作用而發(fā)生的(Deng等，Brain Res 2001；90218-29)。通過(guò)它的迷走神經(jīng)作用，還認(rèn)為PP可抑制胰島素釋放。PP還似乎抑制在非胰島素依賴(lài)型糖尿病中所觀(guān)察到的胰島細(xì)胞肥大。循環(huán)水平的PP也對(duì)肝臟發(fā)揮作用，并導(dǎo)致肝糖產(chǎn)生的下降。因而，給予PP可能在治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病中具有作用。
V.干細(xì)胞的非胚胎來(lái)源成體細(xì)胞已表現(xiàn)出分化能力。例如，最近的研究證明骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞在體外經(jīng)歷神經(jīng)元分化的特定能力(Woodbury等(2000)JNeuroscience Research 61364；Sanchez-Ramos等(2000)ExpNeurology 164247)。在這些研究中，用抗氧化劑、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)處理骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)該細(xì)胞經(jīng)歷與神經(jīng)元分化相一致的形態(tài)變化，即，長(zhǎng)細(xì)胞突延伸終止于生長(zhǎng)錐和絲狀偽足(Woodbury等，(2000)J Neuroscience Research 61364；Sanchez-Ramos等(2000)Exp Neurology 164247)。另外，這些制劑誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性蛋白的表達(dá)，包括巢蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲M(NF-M)、NeuN以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體trkA(Woodbury等(2000)J Neuroscience Research 61364；Sanchez-Ramos等(2000)Exp Neurology 164247。
具有分化能力的成人細(xì)胞的其它實(shí)例描述在下列專(zhuān)利中Osiris的美國(guó)專(zhuān)利No.5,486,359涉及能夠分化為不止一種結(jié)締組織類(lèi)型的細(xì)胞的分離的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞均質(zhì)群體。該專(zhuān)利公開(kāi)了分離、純化以及在培養(yǎng)物中，即在體外極大地復(fù)制這些細(xì)胞的方法。
Case Western和Osiris的美國(guó)專(zhuān)利No.5,942,225描述了用于誘導(dǎo)分離的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞系定向分化為單一特定的間充質(zhì)細(xì)胞系的組合物，它包括人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞以及一種或多種生物活性因子，用以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為單一特定的細(xì)胞系。
Case Western的美國(guó)專(zhuān)利No.5,736,396描述了誘導(dǎo)分離的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞離體細(xì)胞系定向分化的方法，它包括使間充質(zhì)干細(xì)胞與生物活性因子接觸，以便藉此誘導(dǎo)其離體分化成單一特定的間充質(zhì)細(xì)胞系。該專(zhuān)利還描述了治療需要特定間充質(zhì)細(xì)胞系的間充質(zhì)細(xì)胞的個(gè)體的方法，它包括向需要其的個(gè)體給藥一種組合物，所述組合物包括已經(jīng)被誘導(dǎo)離體分化的分離的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞，其中干細(xì)胞通過(guò)與生物活性因子接觸以便藉此誘導(dǎo)這種細(xì)胞離體分化成單一特定的間充質(zhì)細(xì)胞系。
Case Western的美國(guó)專(zhuān)利No.5,908,784公開(kāi)了用于人類(lèi)間充質(zhì)前體細(xì)胞體外軟骨發(fā)生以及由其體外形成人類(lèi)軟骨細(xì)胞的組合物，該組合物包括被緊密濃縮為壓縮的細(xì)胞小球的分離的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞，以及與之接觸的至少一種軟骨誘導(dǎo)劑。該專(zhuān)利也描述了通過(guò)使間充質(zhì)干細(xì)胞與軟骨誘導(dǎo)劑體外接觸誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨發(fā)生的方法，其中干細(xì)胞被緊密濃縮為壓縮的細(xì)胞小球。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利No.5,902,741描述了體外制備的活軟骨組織，它包括產(chǎn)生軟骨的基質(zhì)細(xì)胞和該基質(zhì)細(xì)胞天然分泌的結(jié)締組織蛋白，其連接于且實(shí)質(zhì)上包被由生物相容性無(wú)生命材料構(gòu)成的三維構(gòu)架，其形成具有通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞橋接的間質(zhì)間隙的三維結(jié)構(gòu)。該專(zhuān)利也公開(kāi)了用于生長(zhǎng)新軟骨的組合物，包括間充質(zhì)干細(xì)胞，其處于適合該細(xì)胞增殖并分化為軟骨的聚合物載體中。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利No.5,863,531公開(kāi)了體外制備的管狀的活基質(zhì)組織，包含基質(zhì)細(xì)胞和該基質(zhì)細(xì)胞天然分泌的結(jié)締組織蛋白，其連接于且實(shí)質(zhì)上包被由生物相容性無(wú)生命材料構(gòu)成的三維管狀構(gòu)架，所述構(gòu)架具有通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞橋接的間質(zhì)間隙。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利No.6,022,743描述了基于基質(zhì)細(xì)胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，來(lái)自于位于活的基質(zhì)組織構(gòu)架上的胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。該基質(zhì)細(xì)胞可以包括臍帶細(xì)胞、胎盤(pán)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或胎兒細(xì)胞。該培養(yǎng)系統(tǒng)因而用于提供功能性胰腺組織和器官材料。
Osiris的美國(guó)專(zhuān)利No.5,811,094描述了產(chǎn)生結(jié)締組織的方法，它包括通過(guò)向需要其的個(gè)體給予含有從人類(lèi)骨髓中回收且基本上沒(méi)有血細(xì)胞的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞制備物，而在所述個(gè)體中產(chǎn)生結(jié)締組織。
Thiede等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,030,836描述了體外維持人類(lèi)造血干細(xì)胞的方法，包括將人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞與該造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，從而至少有些造血干細(xì)胞維持它們的干細(xì)胞表型。
Torok-Storb等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,103,522描述了與人造血前體細(xì)胞組合體外培養(yǎng)的輻照的永生化人類(lèi)基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系。
Torok-Storb等的WO 9602662A1和美國(guó)專(zhuān)利No.5,879,940描述了維持造血作用的人類(lèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系。
Morphogen的美國(guó)專(zhuān)利No.5,827,735描述了純化的多能間充質(zhì)干細(xì)胞，它基本上沒(méi)有多核肌原細(xì)胞系定向細(xì)胞，并且它主要是星形的，其中間充質(zhì)干細(xì)胞在含有10％胎牛血清的組織培養(yǎng)基中與肌肉形態(tài)發(fā)生蛋白接觸時(shí)主要地形成成纖維細(xì)胞，并且在含有10％胎牛血清的組織培養(yǎng)基中與肌肉形態(tài)發(fā)生蛋白和疤痕抑制因子接觸時(shí)主要地形成自發(fā)收縮的分枝的多核結(jié)構(gòu)。
Hahnemann University的WO 99/43286描述了間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的用途以及指導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的方法。
OSiris的WO 98/20731描述了間充質(zhì)巨核細(xì)胞前體組合物以及通過(guò)分離巨核細(xì)胞而分離與分離的巨核細(xì)胞相關(guān)的MSC的方法。
Osiris的WO99/61587描述了人類(lèi)CD45和/或成纖維細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞。
Ixion Technology的WO01/079457描述了在體外培養(yǎng)并分化為胰腺樣細(xì)胞的骨髓及血液來(lái)源的干細(xì)胞的用途。德克薩斯大學(xué)(University of Texas)的WO01/78752描述了植入胰腺的神經(jīng)干細(xì)胞用于治療胰腺疾病的用途。
不過(guò)，前述段落中所描述的技術(shù)有賴(lài)于難以獲得而且使供體痛苦的前體細(xì)胞來(lái)源如骨髓。所以，本發(fā)明的目的是提供輔助治療胰腺內(nèi)分泌疾病的細(xì)胞、材料和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，它分離自人或其它哺乳動(dòng)物，并被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞(且優(yōu)選為內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞)的基因型或表型特征。該細(xì)胞可表現(xiàn)出產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞、產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞、產(chǎn)生胰多肽的γ細(xì)胞或產(chǎn)生生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞的特性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備的是產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞能夠在體外或者植入患者后被誘導(dǎo)分化。
本發(fā)明的細(xì)胞可以摻入到二維或三維結(jié)構(gòu)中，以產(chǎn)生可植入或植入的基質(zhì)，如在下文更詳細(xì)地描述的那樣。例如，本發(fā)明提供了將分化的脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞或分化的細(xì)胞用適于移植到哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人的生物材料包封。包封材料不會(huì)妨礙由脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞或分化細(xì)胞分泌的蛋白或激素的釋放。所用的材料，包括但不限于，膠原衍生物、水凝膠、藻酸鈣、瓊脂糖、透明質(zhì)酸、聚乳酸/聚羥基乙酸衍生物和纖維蛋白。
本發(fā)明的細(xì)胞也可以被基因改造以包括外源遺傳材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用能夠?qū)⒛康幕蛐蛄姓系剿拗骷?xì)胞染色體中的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引入的核酸分子被摻入到能夠在受體宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒載體中。廣泛種類(lèi)的載體中的任何一種均可用作此目的。優(yōu)選的真核載體包括，例如，痘苗病毒、SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種商業(yè)上可獲得的以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。一旦制備了用于表達(dá)的載體或核酸分子，該DNA構(gòu)建物可以通過(guò)各種合適的方法中的任何一種，即轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、病毒感染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接微注射等被引入到合適的宿主細(xì)胞。在引入載體之后，受體細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，它可選擇含有載體的細(xì)胞的生長(zhǎng)?？寺』蚍肿拥谋磉_(dá)導(dǎo)致異源蛋白的產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了分化分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞以表達(dá)胰腺細(xì)胞如產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞、產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞、產(chǎn)生胰多肽的γ細(xì)胞或產(chǎn)生生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞的至少一種基因型或表型特征，包括使分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞與胰腺誘導(dǎo)物，優(yōu)選內(nèi)分泌胰腺誘導(dǎo)物接觸的步驟。該物質(zhì)處于化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基中，如在下文更詳細(xì)地描述的那樣，它可以包括足以誘導(dǎo)分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞標(biāo)志的濃度的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、化學(xué)制劑和/或激素。
本發(fā)明還提供了治療宿主中由產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞、產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞、產(chǎn)生胰多肽的γ細(xì)胞或產(chǎn)生生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞的胰腺功能介導(dǎo)的疾病的方法，其包括誘導(dǎo)分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)對(duì)宿主在治療上有益的胰腺細(xì)胞的至少一種基因型或表型特征；然后將誘導(dǎo)的細(xì)胞移植到宿主中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞可以直接分離自宿主，分化并自體再移植。備選地，治療可以通過(guò)同種異體完成。
可用本發(fā)明治療的胰腺內(nèi)分泌紊亂或變性疾病的非限制性實(shí)例包括I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)疾病、化學(xué)誘導(dǎo)疾病、胰腺炎相關(guān)疾病或外傷相關(guān)疾病。
本發(fā)明的細(xì)胞可以作為均質(zhì)的或基本上均質(zhì)的細(xì)胞群利用，或者作為細(xì)胞群的一部分利用，其中其它細(xì)胞分泌物質(zhì)支持該內(nèi)分泌胰腺樣細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化，或者與分泌或表現(xiàn)出其它目的治療因子的其它細(xì)胞一起。
本發(fā)明還包括通過(guò)處理的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生激素的方法。也包括通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于本發(fā)明的細(xì)胞而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的方法。然后培養(yǎng)基可用來(lái)培養(yǎng)其它脂肪來(lái)源的細(xì)胞。
本發(fā)明還構(gòu)思產(chǎn)生已被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的基因型或表型特征的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的試劑盒，它可以包括從脂肪組織殘余中分離基質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞的說(shuō)明書(shū)，并確實(shí)包括分化干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的基因型或表型特征或者一般來(lái)說(shuō)是胰腺原性的。還公開(kāi)了包括產(chǎn)生本發(fā)明的組織的所有必需組分的試劑盒。這種試劑盒包括本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞群、生物相容性網(wǎng)格(lattice)、以及由水化劑、細(xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基、其它細(xì)胞、抗生素化合物和激素組成的組分。
本發(fā)明的其它目的和特點(diǎn)由于下述公開(kāi)將會(huì)更加充分明顯。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了來(lái)自人或其它哺乳動(dòng)物的分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，其被誘導(dǎo)表達(dá)胰腺細(xì)胞(優(yōu)選內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞)的至少一種基因型或表型特征。該細(xì)胞可以表現(xiàn)出產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞、產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞、產(chǎn)生胰多肽的γ細(xì)胞或產(chǎn)生生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞的特點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備的是產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可在體外或植入患者后被誘導(dǎo)分化。
由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細(xì)胞可以提供部分或完全分化的具有成熟胰腺細(xì)胞特征的功能細(xì)胞的來(lái)源，用于研究、移植和研發(fā)細(xì)胞治療產(chǎn)品以治療動(dòng)物疾病優(yōu)選人類(lèi)疾病、組織修復(fù)或改善以及矯正改變生命或威脅生命的代謝紊亂。還包括制備此類(lèi)細(xì)胞的方法。
I.定義“發(fā)育表型”是細(xì)胞通過(guò)分化過(guò)程獲得特定表型的潛能。
“基因型”是指與分化途徑相關(guān)的基因的至少一個(gè)信使RNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。
“胰腺β胰島細(xì)胞”是指能夠優(yōu)選以受控方式，更優(yōu)選以葡萄糖濃度依賴(lài)性的方式分泌胰島素、胰島素類(lèi)似物、胰島素前體或胰島素樣因子的任何細(xì)胞。
“胰腺α細(xì)胞”是指能夠優(yōu)選以受控方式分泌胰高血糖素、胰高血糖素類(lèi)似物、胰高血糖素前體或胰高血糖素樣因子的任何細(xì)胞。
“胰腺δ細(xì)胞”是指能夠優(yōu)選以受控方式分泌生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)抑素前體或生長(zhǎng)抑素樣因子的任何細(xì)胞。
“胰腺PP細(xì)胞”或“γ細(xì)胞”是指能夠優(yōu)選以受控方式分泌胰多肽、類(lèi)似物、前體或相似因子的任何細(xì)胞。
“胰島素”是指已知的各種胰島素、胰島素類(lèi)似物或胰島素樣因子中的任一種。這包括激素原或胰島素前體蛋白、完全加工的蛋白或者任何這些分子實(shí)體的代謝物。
“糖尿病”是指其中胰腺β胰島細(xì)胞功能出現(xiàn)機(jī)能障礙從而喪失對(duì)循環(huán)的葡萄糖水平的應(yīng)答的任何疾病狀態(tài)。所述疾病狀態(tài)可以是先天代謝缺陷、外傷損害、化學(xué)損傷、感染性疾病、慢性乙醇攝入、內(nèi)分泌病、遺傳病如唐氏綜合征、或者是直接或間接地導(dǎo)致內(nèi)分泌胰腺損害的任何其它病因的結(jié)果。
“青年成熟期突發(fā)型糖尿病”包括不能清楚地歸類(lèi)為1型或2型糖尿病表型的小百分比的糖尿病患者。其特征在于早期發(fā)病(通常在25歲以前)的β細(xì)胞功能的遺傳缺陷。
“自身免疫病”涵蓋導(dǎo)致宿主內(nèi)分泌胰腺排斥和破壞的任何免疫介導(dǎo)的過(guò)程(體液或細(xì)胞免疫)。該過(guò)程的病因?yàn)?，但不限于，針?duì)諸如柯薩奇病毒或肺炎支原體的因子的感染的免疫應(yīng)答、自身免疫機(jī)能障礙的先天代謝傾向或者化學(xué)暴露。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)根據(jù)大小實(shí)現(xiàn)多肽分級(jí)分離最常用的技術(shù)(雖然不是唯一的)就是聚丙烯酰胺凝膠電泳。該方法的原理在于多肽分子穿過(guò)凝膠遷移，就好像凝膠是一個(gè)篩子，它最大程度地阻滯最大分子的運(yùn)動(dòng)，而最小程度地阻滯最小分子的運(yùn)動(dòng)。多肽片段越小，在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳條件下的運(yùn)動(dòng)性越大。電泳之前和期間，多肽典型地持續(xù)暴露于去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，在此條件下多肽被變性。天然凝膠是在不存在SDS時(shí)跑膠的。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分級(jí)分離的多肽可以直接通過(guò)染色操作觀(guān)看。
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移操作蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移操作(也稱(chēng)之為免疫印跡)的目的是將通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分級(jí)分離的多肽物理轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾器或另一種合適的表面上，同時(shí)保留分級(jí)分離操作產(chǎn)生的多肽的相對(duì)位置。然后用特異性與感興趣的多肽結(jié)合的抗體探測(cè)該印跡。
“純化的”蛋白或激素是已經(jīng)從細(xì)胞組分中分離的蛋白或激素。“純化的”蛋白或激素已經(jīng)被純化到天然未見(jiàn)過(guò)的純度水平?！盎旧霞兊摹钡鞍谆蚣に厥莾H含有實(shí)質(zhì)上不影響該激素或蛋白的性質(zhì)的其它組分的制備物。
“內(nèi)分泌胰腺基因”是指包括但不限于任何與分化中或分化的內(nèi)分泌胰腺的α、β、δ或PP細(xì)胞的表型相關(guān)的那些基因。這些基因包括但不限于pdxl、pax4、pax6、neurogenin 1、neurogenin 2、neurogenin3、neuro D、GLUT2、胰島素、Isl1、Hlxb9、Nkx2.2。
II.脂肪來(lái)源的干細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞脂肪干細(xì)胞或“脂肪基質(zhì)細(xì)胞”是指起源于脂肪組織的細(xì)胞?！爸尽笔侵溉魏沃窘M織。脂肪組織可以是來(lái)自皮下、網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳腺、性腺或其它脂肪組織部位的褐色或白色脂肪組織。優(yōu)選地，脂肪為皮下白色脂肪組織。此類(lèi)細(xì)胞可以包括原代細(xì)胞培養(yǎng)物或者永生化的細(xì)胞系。脂肪組織可以來(lái)自于具有脂肪組織的任何生物體。優(yōu)選地，脂肪組織是哺乳動(dòng)物的，最優(yōu)選地該脂肪組織是人類(lèi)的。脂肪組織便利的來(lái)源是來(lái)自吸脂外科手術(shù)，不過(guò)，脂肪組織的來(lái)源或分離脂肪組織的方法對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。吸脂術(shù)是一個(gè)具有美容效果的相對(duì)非侵入性的操作，為大多數(shù)患者所接受。已經(jīng)充分證明脂肪細(xì)胞是可補(bǔ)充的細(xì)胞群。即使是通過(guò)吸脂術(shù)或其它操作在外科手術(shù)除去后，常見(jiàn)個(gè)體中脂肪細(xì)胞隨著時(shí)間在同一部位的重現(xiàn)。這提示脂肪組織含有基質(zhì)干細(xì)胞，其能夠自我更新為脂肪細(xì)胞。
病理證據(jù)提示脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞能夠沿著多種細(xì)胞系途徑分化。最常見(jiàn)的軟組織腫瘤脂肉瘤是從脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的。混合起源的軟組織腫瘤相對(duì)常見(jiàn)。這些腫瘤可能包括脂肪組織、肌肉(平滑肌或骨骼肌)、軟骨和/或骨的成分。在患有被稱(chēng)為進(jìn)行性骨發(fā)育異常的罕見(jiàn)疾病的患者中，皮下脂肪細(xì)胞由于未知原因形成骨。
人類(lèi)脂肪組織來(lái)源的成人基質(zhì)細(xì)胞能夠離體擴(kuò)增，沿著獨(dú)特的細(xì)胞系途徑分化，基因工程改造，以及作為自體或者同種異體移植物重新引入到個(gè)體中。
匹茲堡大學(xué)(University of Pittsburgh)和加州大學(xué)董事會(huì)(TheRegents of the University of California)的WO 00/53795以及轉(zhuǎn)讓給匹茲堡大學(xué)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2002/0076400公開(kāi)了基本上沒(méi)有脂肪細(xì)胞和紅細(xì)胞的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞和網(wǎng)格，以及結(jié)締組織干細(xì)胞克隆群。所述細(xì)胞可以在體內(nèi)和體外單獨(dú)或者處于生物相容性組合物中使用，以產(chǎn)生分化的組織和結(jié)構(gòu)。另外，細(xì)胞可以擴(kuò)增并培養(yǎng)以產(chǎn)生激素并提供支持其它細(xì)胞群生長(zhǎng)和擴(kuò)增的條件培養(yǎng)基。在另一個(gè)方面，這些出版物公開(kāi)了基本上無(wú)細(xì)胞的脂肪來(lái)源的網(wǎng)格，它包括來(lái)自脂肪組織的胞外基質(zhì)材料。網(wǎng)格可用作為基質(zhì)(substrate)在體內(nèi)或體外促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化為原基或成熟組織或結(jié)構(gòu)。沒(méi)有一種出版物公開(kāi)被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的表型或基因型特征的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)讓給Artecel Sciences的美國(guó)專(zhuān)利No.6,391,297公開(kāi)了分離的人類(lèi)脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的組合物，其已經(jīng)被分化表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的至少一種特征，能夠用于體內(nèi)修復(fù)骨骼和治療骨病。這種脂肪來(lái)源的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞可任選地被遺傳修飾或與基質(zhì)組合。
轉(zhuǎn)讓給BioHoldings International的美國(guó)專(zhuān)利No.6,426,222公開(kāi)了通過(guò)在必須含有糖皮質(zhì)激素的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中溫育脂肪組織細(xì)胞，從人類(lèi)髓外脂肪組織誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的方法。
列舉Halvorsen等為發(fā)明人的WO00/44882和美國(guó)專(zhuān)利No.6,153,432公開(kāi)了將分離自脂肪組織的人類(lèi)前脂肪細(xì)胞分化為帶有與在分離的原始脂肪細(xì)胞中所觀(guān)察到的相似的生物化學(xué)、遺傳以及生理學(xué)特征的脂肪細(xì)胞的方法和組合物。
Artecel Sciences的WO01/62901以及公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2001/0033834公開(kāi)了已經(jīng)被誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、造血先祖細(xì)胞和肝細(xì)胞的至少一種表型特征的分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。另外，也公開(kāi)了已經(jīng)被去分化從而缺乏脂肪細(xì)胞表型標(biāo)志的分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)讓給Artecel Sciences的美國(guó)專(zhuān)利No.6,429,013公開(kāi)了涉及已經(jīng)被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種軟骨細(xì)胞特征的分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的組合物。也公開(kāi)了分化這些細(xì)胞的方法。
Peterson等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,200,606公開(kāi)了具有產(chǎn)生骨骼或軟骨的潛能的前體細(xì)胞可以從包括外周血、骨髓和脂肪組織在內(nèi)的多種造血及非造血組織中分離。
可用于本發(fā)明的方法的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法分離的，例如象匹茲堡大學(xué)等的WO 00/53795和Zen-Bio，Inc.的WO 00/44882和美國(guó)專(zhuān)利No.6,153,432中所描述的。在優(yōu)選的方法中，脂肪組織分離自哺乳動(dòng)物受試者，優(yōu)選為人類(lèi)受試者。優(yōu)選的脂肪組織來(lái)源是皮下脂肪。在人類(lèi)中，脂肪典型地通過(guò)吸脂術(shù)分離。如果本發(fā)明的細(xì)胞要移植到人類(lèi)受試者中，優(yōu)選脂肪組織分離自該同一個(gè)受試者，以便提供自體移植。備選地，移植的細(xì)胞可以是同種異體的。
作為非限制性實(shí)例，在分離脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)方法中，脂肪組織用0.01到0.5％之間，優(yōu)選0.04到0.2％，最優(yōu)選0.1％濃度的膠原酶、用0.01到0.5％之間，優(yōu)選0.04到0.04％，最優(yōu)選0.2％濃度的胰蛋白酶在25°到50℃之間，優(yōu)選在33°到40℃之間，最優(yōu)選在37℃的溫度下處理10分鐘到3小時(shí)，優(yōu)選30分鐘到1小時(shí)，最優(yōu)選45分鐘。細(xì)胞通過(guò)20微米到800微米之間，更優(yōu)選40微米到400微米之間，最優(yōu)選70微米的尼龍或粗棉布網(wǎng)孔過(guò)濾器。然后將細(xì)胞直接在培養(yǎng)基中或在Ficoll或Percoll或其它粒子梯度中進(jìn)行差速離心。細(xì)胞在4°到50℃之間，優(yōu)選在20°到40℃之間，最優(yōu)選在25℃的溫度下以100到3000Xg之間，更優(yōu)選200到1500Xg，最優(yōu)選以500Xg的速度離心1分鐘到1小時(shí)，更優(yōu)選2到15分鐘，最優(yōu)選5分鐘。
又在另一種分離脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的方法中，利用了諸如在Katz等的US 5,786,207中所描述的機(jī)械系統(tǒng)。使用系統(tǒng)將脂肪組織樣品引入到自動(dòng)化裝置中，使其進(jìn)入洗滌階段和解離階段，其中組織被攪拌并旋轉(zhuǎn)，從而在離心預(yù)備狀態(tài)的容器中收集所得的細(xì)胞懸液。以這種方式，從組織樣品中分離脂肪來(lái)源的細(xì)胞，保持目的細(xì)胞的細(xì)胞完整性。
III.誘導(dǎo)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出胰腺細(xì)胞的至少一種特征本發(fā)明包括處理脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞以誘導(dǎo)形成表達(dá)胰腺細(xì)胞的至少一種基因型或表型特征的細(xì)胞。如何誘導(dǎo)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化的非限制性實(shí)例包括1)細(xì)胞培養(yǎng)基的利用；2)支持細(xì)胞的利用；3)將未分化的細(xì)胞直接植入患者組織中；和4)細(xì)胞工程技術(shù)。
A)細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)雖然本發(fā)明不束縛于任何操作理論，人們相信用含有血清、胚胎提取物、純化或重組的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素和/或化學(xué)制劑的組合的培養(yǎng)基在二維或三維微環(huán)境中處理脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，將會(huì)誘導(dǎo)分化。
更具體地，本發(fā)明提供了將脂肪來(lái)源的細(xì)胞分化為具有胰腺細(xì)胞的基因型或表型特點(diǎn)的細(xì)胞的方法，包括以預(yù)期的密度平板接種分離的脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞，包括但不限于約1,000到約500,000細(xì)胞/cm2的密度；在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含從由生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子、血清因子、核激素受體液體或任何其它明確的化學(xué)制劑組成的組中選擇的至少一種化合物。
可用于本發(fā)明的方法的基本培養(yǎng)基包括但不限于NeurobasalTM(補(bǔ)充有或未補(bǔ)充胎牛血清或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF))、N2、B27、Eagle極限必需培養(yǎng)基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培養(yǎng)基(有或無(wú)Fitton-Jackson改良)、Eagle基本培養(yǎng)基(BME-添加Earle′s鹽基)、Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM-無(wú)血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、Leibovitz L-15培養(yǎng)基、McCoy′s 5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199(M199E-帶Earle′s鹽基)、培養(yǎng)基M199(M199H-帶Hank′s鹽基)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-E-帶Earle′s鹽基)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-H-帶Hank′s鹽基)以及Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-NAA-帶非必需氨基酸)，還有眾多其它培養(yǎng)基，包括培養(yǎng)基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams′G、Neuman& Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC153。優(yōu)選的用于本發(fā)明的培養(yǎng)基為DMEM。這些及其它有用的培養(yǎng)基可獲自GIBCO，Grand Island，紐約，美國(guó)以及Biological Industries，Beth Aemek，以色列等。許多這些培養(yǎng)基概述于(Academic Press，Inc.，Jakoby和Pastan編輯)Methods inEnzymology，卷LVIII，″Cell Culture″，62-72頁(yè)中。
可用于將脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化為表達(dá)至少一種胰腺β細(xì)胞的基因型或表型特征的培養(yǎng)基包括如在Ontogeny，Inc.等的WO00/47721中描述的已經(jīng)證明對(duì)于先祖細(xì)胞分化為分泌胰島素的β細(xì)胞很重要的腸促胰液素或任何腸促胰液素類(lèi)似物或激動(dòng)劑?？捎糜诒景l(fā)明的方法的培養(yǎng)基將含有?；蚱渌锓N來(lái)源的胎血清，濃度至少1％到約30％，優(yōu)選至少約5％到15％，最優(yōu)選約10％。雞或其它物種來(lái)源的胚胎提取物以約1％到30％，優(yōu)選至少約5％到15％，最優(yōu)選約10％的濃度存在。
可用于本發(fā)明的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素包括但不限于在pg/ml到mg/ml水平之間濃度的生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、c-kit配體/干細(xì)胞因子、osteoprotegerin配體、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白。例如在此濃度下，可用于本發(fā)明的方法的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素在集落形成單位(CFU)測(cè)定中能夠誘導(dǎo)從脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞高達(dá)100％形成血細(xì)胞(淋巴系、紅系、髓系和血小板系)(Moore等(1973)J.Natl.Cancer Inst.50603-623；Lee等(1989)J.Immunol.1423875-3883；Medina等(2993)J.Exp.Med.1781507-1515。
已被證明能夠輔助制備胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的生長(zhǎng)因子包括肽GLP-1、extendin-4以及具有基本上同源的氨基酸序列的類(lèi)似物，如Egan等的WO 00/09666中所描述的。
已進(jìn)一步確認(rèn)可以向培養(yǎng)基中添加額外的組分。此類(lèi)組分可以是抗生素、白蛋白、氨基酸及本領(lǐng)公知的用于培養(yǎng)細(xì)胞的其它組分。另外，可以添加組分以促進(jìn)分化過(guò)程。其它化學(xué)制劑可以包括但不限于，類(lèi)固醇、類(lèi)視黃醇及相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照誘導(dǎo)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化至少25-50％的其它化學(xué)化合物或制劑。
已確認(rèn)上文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基條件產(chǎn)生表達(dá)單一類(lèi)型的胰腺細(xì)胞即胰腺α、β、δ或PP細(xì)胞的至少一種基因型或表型特征的細(xì)胞。該特定的細(xì)胞類(lèi)型通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法分離。尤其有用的是利用該分化細(xì)胞表達(dá)的基因型或表型特征的方法。如下文所列的目的細(xì)胞的表型標(biāo)志是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并已在文獻(xiàn)中充分地公開(kāi)。額外的表型標(biāo)志繼續(xù)有待公開(kāi)或無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可鑒定。這些標(biāo)志中的任何一種都可用來(lái)確認(rèn)脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞已經(jīng)被誘導(dǎo)至分化狀態(tài)。
細(xì)胞系特異性表型特征可包括但不限于細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和/或分泌產(chǎn)物。胰腺α細(xì)胞特別表達(dá)胰高血糖素及其它標(biāo)志。胰腺β胰島細(xì)胞特征包括表達(dá)包括但不限于巢蛋白、pdx1(也被稱(chēng)之為IDX-1、IPF-1和STF-1)、GLUT2、NeuroD、neurogenin和胰島素的標(biāo)志。而且，胰腺β細(xì)胞含有大量鋅。利用無(wú)毒性鋅敏感熒光探針將選擇性地標(biāo)記活β細(xì)胞中不穩(wěn)定的鋅，并在可見(jiàn)光譜中表現(xiàn)出激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，使得該技術(shù)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)儀器使用(Lukowiak B等，JHistochem Cytochem.2001 Apr；49(4)519-28)。解離的NewportGreen-標(biāo)記的細(xì)胞的細(xì)胞分選導(dǎo)致β細(xì)胞的完全分離，如通過(guò)胰島素含量(per DNA)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析所判斷的那樣。利用流式細(xì)胞儀或相似的細(xì)胞分選工具，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠運(yùn)用這種或相當(dāng)?shù)募夹g(shù)高純度地純化β細(xì)胞。
胰腺δ細(xì)胞特別表達(dá)生長(zhǎng)抑素及其它標(biāo)志，而胰腺PP細(xì)胞表達(dá)胰多肽。這些細(xì)胞類(lèi)型的其它標(biāo)志包括膽囊收縮素受體(CCKA)和KIT受體酪氨酸激酶(Schweiger等Anat Histol Embryol.2000年12月；29(6)357-61；Rachdi等Diabetes 2001年9月；50(9)2021-8)。
備選的方法利用特異性地針對(duì)見(jiàn)于多種細(xì)胞類(lèi)型上的標(biāo)志的抗體通過(guò)許多本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的充分證明的技術(shù)用于純化。這些技術(shù)包括但不限于，免疫化學(xué)流式細(xì)胞儀分析和細(xì)胞分選以及免疫磁性純化。免疫磁性純化的非限制性實(shí)例包括利用為包被有特異性抗體(即胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素或胰多肽)的均一順磁顆粒的dynabeads。
本領(lǐng)域技術(shù)普通人員將會(huì)意識(shí)到已知的量熱、熒光、免疫化學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、化學(xué)或放射化學(xué)方法可容易地確定細(xì)胞系特異性標(biāo)志的存在或不存在。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了去分化的、分離的脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞，其能夠在能夠進(jìn)行此類(lèi)分化的培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá)胰腺細(xì)胞的至少一種基因型或表型特征。去分化的脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞通過(guò)成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)志的缺失進(jìn)行鑒定。
B)利用支持細(xì)胞促進(jìn)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，支持細(xì)胞被用來(lái)促進(jìn)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化。支持細(xì)胞可以是人源或非人動(dòng)物源的細(xì)胞。如果利用非人動(dòng)物支持細(xì)胞，所得的分化細(xì)胞通過(guò)異種移植植入。
本發(fā)明的脂肪來(lái)源的細(xì)胞被分離并培養(yǎng)在細(xì)胞群中，該群最優(yōu)選是確定的群。該細(xì)胞群是異質(zhì)的，包括為本發(fā)明的細(xì)胞提供因子的支持細(xì)胞。支持細(xì)胞包括促進(jìn)目的細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和維持的其它細(xì)胞類(lèi)型。作為非限制性實(shí)例，如果需要表達(dá)至少一種胰腺β細(xì)胞的基因型或表型特征的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，首先通過(guò)上文所述的任何方法分離脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，并在存在其它支持細(xì)胞時(shí)在培養(yǎng)中生長(zhǎng)。例如，這些支持細(xì)胞優(yōu)選具有其它胰腺細(xì)胞類(lèi)型即α、δ、γ、PP的特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，支持細(xì)胞來(lái)自于從培養(yǎng)的胰腺組織中取得的這些細(xì)胞類(lèi)型的原代培養(yǎng)物。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，支持細(xì)胞來(lái)自于永生化的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，支持細(xì)胞是自體獲得的。在其它實(shí)施方案中，支持細(xì)胞是同種異體獲得的。
本發(fā)明也構(gòu)思用于支持目的細(xì)胞分化的細(xì)胞可被基因工程改造為支持細(xì)胞。細(xì)胞通過(guò)下文所述的或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法被基因改造以表達(dá)外源基因或阻遏內(nèi)源基因的表達(dá)。
C)植入在另一方面，本發(fā)明提供了可用于自體及同種異體移植的表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞基因型或表型特征的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞和分化細(xì)胞。分化在體內(nèi)通過(guò)環(huán)境中天然存在的因子或引入的因子而發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，移植部位是患病的胰腺。在其它實(shí)施方案中，移植部位是皮下或腹膜內(nèi)。優(yōu)選地，受試者為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地，受試者為人類(lèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞與或不與附加的生長(zhǎng)因子一起植入到需要胰高血糖素、胰多肽、生長(zhǎng)抑素或胰島素的區(qū)域。本發(fā)明的細(xì)胞可以在體外或在植入患者后被誘導(dǎo)分化。
因此，又在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開(kāi)了向受試者提供能夠表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的基因型或表型特征的分化細(xì)胞的方法，包括
a)分離脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞；b)在適于該細(xì)胞分化的培養(yǎng)基中平板接種并培養(yǎng)該細(xì)胞；c)將分化細(xì)胞引入到受試者中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，涉及向受試者提供未分化的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞的方法，包括a)分離脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞；b)將該未分化的細(xì)胞引入到受試者中。
本發(fā)明構(gòu)思當(dāng)向受試者引入未分化的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞時(shí)，在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，將它們與或不與附加的生長(zhǎng)或分化因子一起直接引入到患病的胰腺中。又在本發(fā)明的另一方面，未分化的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞與如本文所述的將會(huì)提供適于該基質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)分化的環(huán)境的任何支持細(xì)胞或分化因子一起引入。例如，這些支持細(xì)胞優(yōu)選具有其它胰腺細(xì)胞類(lèi)型即α、β、δ、γ、PP的特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，支持細(xì)胞來(lái)自于從培養(yǎng)的胰腺組織中取出的這些細(xì)胞類(lèi)型的原代培養(yǎng)物。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，支持細(xì)胞來(lái)自于永生化的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，支持細(xì)胞是自體獲得的。在其它實(shí)施方案中，支持細(xì)胞是同種異體獲得的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，去分化的脂肪來(lái)源的細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的載體相組合提供用于治療應(yīng)用，包括但不限于組織修復(fù)、再生、重建或增強(qiáng)。脂肪來(lái)源的細(xì)胞通過(guò)美國(guó)專(zhuān)利No.6,153,432(特此并入作為參考)中公開(kāi)的方法培養(yǎng)以去分化該細(xì)胞，由此該去分化的成體干細(xì)胞可然后被誘導(dǎo)表達(dá)不同于脂肪組織來(lái)源細(xì)胞的細(xì)胞的基因型或表型特征。去分化的脂肪來(lái)源的細(xì)胞可以被修飾以包括非內(nèi)源性基因序列用以產(chǎn)生目的蛋白或肽。分化的脂肪來(lái)源的細(xì)胞可以，在備選的實(shí)施方案中，在二維或三維基質(zhì)中向宿主給藥以用于預(yù)期的治療目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，去分化的細(xì)胞是從患者自身細(xì)胞中自體獲得的。備選地，去分化的細(xì)胞同種異體獲得。
又在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的分化細(xì)胞被解聚并轉(zhuǎn)移到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸液中，與佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)的WO 97/15310的方法相似，其中公開(kāi)了從胰腺組織來(lái)源的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)功能性胰島的方法，并培養(yǎng)直至觀(guān)察到胰島細(xì)胞簇形成的跡象。然后通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)分析技術(shù)分析含有該細(xì)胞簇的培養(yǎng)基中可指示胰腺內(nèi)分泌功能的胰島素或其它激素的存在。然后可以將該細(xì)胞簇或聚集物注射或移植到宿主組織中用于組織產(chǎn)生或再生目的。
包封本發(fā)明提供了用適于移植到哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類(lèi)的生物材料包封分化的脂肪來(lái)源的細(xì)胞的方法。包封材料應(yīng)當(dāng)選擇不妨礙由脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的目的蛋白的釋放。所用材料包括但不限于膠原衍生物、水凝膠、藻酸鈣、瓊脂糖、透明質(zhì)酸、聚乳酸/聚羥基乙酸衍生物和纖維蛋白。
D)遺傳操作本發(fā)明的脂肪來(lái)源的細(xì)胞又在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)胰腺細(xì)胞的至少一種基因型或表型特征的脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞被基因改造以表達(dá)外源基因或阻遏內(nèi)源基因的表達(dá)。本發(fā)明提供了基因改造此類(lèi)細(xì)胞和細(xì)胞群的方法。
可以將包含啟動(dòng)子和感興趣序列的核酸構(gòu)建體作為非復(fù)制型DNA(或RNA)分子引入到受體原核或真核細(xì)胞中，它可以是線(xiàn)性分子，或者更優(yōu)選地為閉合共價(jià)環(huán)狀分子。由于此類(lèi)分子沒(méi)有復(fù)制起點(diǎn)不能自主復(fù)制，所述基因的表達(dá)可通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)引入的序列而發(fā)生。備選地，永久表達(dá)可通過(guò)引入的DNA序列整合到宿主染色體中而發(fā)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用能夠?qū)⒛康幕蛐蛄姓系剿拗骷?xì)胞染色體中的載體。在其染色體中穩(wěn)定整合了引入的DNA的細(xì)胞可以通過(guò)還引入一個(gè)或多個(gè)允許選擇含有目的核酸序列的宿主細(xì)胞的標(biāo)記進(jìn)行選擇。如果期望，標(biāo)記可以向營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)、生物殺滅劑抗性如對(duì)抗生素或者重金屬如銅等的抗性。所述可選擇標(biāo)記基因序列可以直接連接于待表達(dá)的DNA基因序列，或者通過(guò)共轉(zhuǎn)染引入到同一個(gè)細(xì)胞中。優(yōu)選地，標(biāo)記的表達(dá)可以定量并線(xiàn)性作圖。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引入的核酸分子被摻入到能夠在受體宿主中自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《据d體中。廣泛種類(lèi)的載體中的任何一種均可用作此目的。選擇特定質(zhì)?；虿《据d體的重要因素包括含有載體的受體細(xì)胞能夠被識(shí)別并從不含載體的受體細(xì)胞中選擇的容易性；特定宿主中期望的載體拷貝數(shù)；以及是否期望能夠在不同物種的宿主細(xì)胞之間“穿梭”該載體。
優(yōu)選的真核載體包括，例如，痘苗病毒、SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種商業(yè)上可獲得的以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
一旦制備了用于表達(dá)的含有所述構(gòu)建體的載體或核酸分子，該DNA構(gòu)建體可以通過(guò)多種合適的方法中的任何一種，即轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、病毒感染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接微注射等被引入到合適的宿主細(xì)胞。在引入載體之后，受體細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，它可選擇含有載體的細(xì)胞的生長(zhǎng)?？寺』蚍肿拥谋磉_(dá)導(dǎo)致異源蛋白的產(chǎn)生。
引入的DNA被“維持”在細(xì)胞內(nèi)應(yīng)當(dāng)理解為引入的DNA在所關(guān)注細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)和增殖的時(shí)候繼續(xù)存在于基本上所有的細(xì)胞中。也就是說(shuō)，引入的DNA不隨著多輪的細(xì)胞分裂而被稀釋出大多數(shù)細(xì)胞。相反，它在細(xì)胞增殖期間復(fù)制，并且引入的DNA的至少一個(gè)拷貝保留在幾乎每一個(gè)子細(xì)胞中。引入的DNA可能以?xún)煞N方式中的任何一種維持在細(xì)胞中。其一，它可能直接整合到細(xì)胞的基因組中。這以相當(dāng)?shù)偷念l率發(fā)生。其二，它可能作為染色體外元件或游離體存在。為使游離體在細(xì)胞增殖期間不被稀釋掉，可以在引入的DNA中包括可選擇標(biāo)記基因，并使細(xì)胞在需要表達(dá)標(biāo)記基因的條件下生長(zhǎng)。即便是在引入的DNA被整合到基因組中的情況下，也可以包括可選擇標(biāo)記基因以防止DNA從染色體切除。
可以通過(guò)許多方法在轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)表達(dá)的條件下將遺傳改變的細(xì)胞引入到生物體中。因而，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以編碼胰島素的產(chǎn)生。然后可以將含胰島素轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞引入到患病人類(lèi)或其它哺乳動(dòng)物的胰腺中。備選地，含轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞被腹膜內(nèi)注射或注射到其它合適的器官貯庫(kù)部位。
E)細(xì)胞表征對(duì)所得的分化細(xì)胞的“表征”旨在鑒定可指示基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系定型到特定終末分化狀態(tài)的表面及胞內(nèi)蛋白、基因和/或其它標(biāo)志。這些方法可包括但不限于(a)利用用第二熒光標(biāo)記連接的蛋白特異性單克隆抗體通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白，包括利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法；(b)利用用第二熒光標(biāo)記連接的蛋白特異性單克隆抗體通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)胞內(nèi)蛋白，包括利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法；(c)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、原位雜交和/或RNA印跡分析檢測(cè)細(xì)胞基因。終末分化細(xì)胞可以通過(guò)鑒定可指示基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系定型到特定終末分化狀態(tài)的表面及胞內(nèi)蛋白、基因和/或其它標(biāo)志來(lái)表征。這些方法如上所述，包括但不限于(a)通過(guò)對(duì)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞表面蛋白例如堿性磷酸酶、CD44、CD146、整聯(lián)蛋白β1或骨橋蛋白(Gronthos等1994 Blood 844164-4173)、胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素、胰多肽、巢蛋白、PDX1、GLUT2、neuroD和neurogenin進(jìn)行免疫熒光測(cè)定例如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或者原位免疫染色而檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白，(b)通過(guò)對(duì)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞利用特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光測(cè)定法例如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或者原位免疫染色而檢測(cè)胞內(nèi)蛋白；(c)通過(guò)諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、原位雜交和/或其它印跡分析的方法檢測(cè)細(xì)胞系選擇性mRNA的表達(dá)，例如HNF3β、Isl-1、Brain-4、Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、PDX-1、Nkx6-2、Ngn-3、胰島素和Glut-2(參見(jiàn)Gimble等1989 Blood74303-311)。
F)利用本發(fā)明的細(xì)胞作為治療劑本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞群可作為治療劑使用。一般而言，此類(lèi)方法包括將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到期望的組織或貯庫(kù)。細(xì)胞通過(guò)任何合適的方法被轉(zhuǎn)移到期望的組織中，這通常根據(jù)組織類(lèi)型而變化。例如，可通過(guò)用含有細(xì)胞的培養(yǎng)基浸泡移植物或者灌注移植物而將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到移植物上。備選地，細(xì)胞可被種植在組織內(nèi)期望的部位上以建立細(xì)胞群。細(xì)胞可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的裝置，例如種植有細(xì)胞的導(dǎo)管、套針、套管或支架而轉(zhuǎn)移到體內(nèi)部位。
本發(fā)明的細(xì)胞可用于治療許多疾病。尤其是，與胰腺內(nèi)分泌機(jī)能障礙相關(guān)的紊亂或者能夠用胰高血糖素、胰島素、胰多肽或生長(zhǎng)抑素治療的紊亂是令人感興趣的。
i)胰島素相關(guān)紊亂轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可用于治療任何胰島素相關(guān)紊亂，例如糖尿病，尤其是I型糖尿病、II型糖尿病以及青年成熟期突發(fā)型糖尿病(MODY)。本發(fā)明的細(xì)胞用于治療的糖尿病狀況可由任何病因引起，包括但不限于遺傳、感染、外傷或化學(xué)。本發(fā)明的細(xì)胞治療的其它疾病包括脂肪營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)疾病、化學(xué)誘導(dǎo)疾病、胰腺炎相關(guān)疾病或外傷相關(guān)疾病。疾病狀態(tài)可以是例如自身免疫機(jī)能障礙或者病毒或某些其它感染因子感染的結(jié)果。
ii)胰高血糖素相關(guān)紊亂產(chǎn)生胰高血糖素的細(xì)胞可用于治療作為系統(tǒng)地或按需要釋放胰高血糖素的植入物治療慢性低血糖癥患者；腸易激綜合征或者需要平滑肌松馳的相似疾?。灰约巴ㄟ^(guò)胰高血糖素刺激脂肪細(xì)胞脂解作用以降低脂肪組織量而治療肥胖。
iii)胰多肽相關(guān)紊亂分泌胰多肽的細(xì)胞可被植入并用于治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病、肥胖或任何導(dǎo)致胰腺β胰島細(xì)胞肥大、胰島素抗性或肝異常葡萄糖產(chǎn)生的疾病。
iv)生長(zhǎng)抑素相關(guān)紊亂轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可用于治療給予生長(zhǎng)抑素有益的任何紊亂。因而，本發(fā)明構(gòu)思表達(dá)至少一種胰腺δ(即生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生)細(xì)胞的特征的分化細(xì)胞用于治療和預(yù)防涉及生長(zhǎng)抑素本身或其調(diào)控的生理過(guò)程的紊亂。這些紊亂包括內(nèi)分泌、胃腸道、CNS、PNS、血管和免疫系統(tǒng)的紊亂以及癌癥。因而分化的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞可用于1)抑制哺乳動(dòng)物中多種激素分泌和營(yíng)養(yǎng)因子；2)治療涉及例如營(yíng)養(yǎng)因子自分泌或旁分泌的紊亂，包括乳腺癌、腦癌、前列腺癌和肺癌(小細(xì)胞和非小細(xì)胞表皮樣瘤)以及肝細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、結(jié)腸和胰腺腺癌(導(dǎo)管型)、軟骨肉瘤以及黑素瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞被用于直接治療癌癥或者致敏癌細(xì)胞用于使用其它方案包括放射療法或化療的聯(lián)合治療。
這些細(xì)胞的其它用途還包括抑制某些內(nèi)分泌的分泌，例如胰島素、胰高血糖素、催乳素和GH，這接著可進(jìn)一步抑制多種營(yíng)養(yǎng)因子例如IGF-1的分泌。本發(fā)明的細(xì)胞因此可用于治療具有包括或與過(guò)量GH和營(yíng)養(yǎng)因子分泌相關(guān)的病因?qū)W的紊亂。抑制這些分泌的能力可用于治療諸如肢端肥大癥的紊亂。這種活性也可用于治療神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，例如類(lèi)癌、VIP瘤、胰島素瘤和胰高血糖素瘤。本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞也可用于治療糖尿病和糖尿病相關(guān)病變，包括血管病、黎明現(xiàn)象、神經(jīng)病、腎病和視網(wǎng)膜病(Grant等，Diabetes Care 2000，23，504-509)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞被用于治療血管疾病，包括胃腸道系統(tǒng)的出血性疾病，例如涉及內(nèi)臟血流和與疾病如肝硬化相關(guān)的食道靜脈曲張的那些疾病。生長(zhǎng)抑素介導(dǎo)血管收縮的能力也使得生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞可用于治療群集性頭痛和偏頭痛。
本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞也可用于抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，因而指示可用于治療移植血管疾病，例如在血管損害例如血管成形術(shù)之后的再狹窄或血管閉塞、同種或異種移植血管病、移植血管動(dòng)脈粥樣硬化癥以及用于器官移植中(如心臟、肝、腎臟或胰腺移植(Weckbecker等，Transplantation Proceedings 1997，29，2599-2600))。本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞也可用于抑制血管生成，并指示可用于傷口愈合以及治療轉(zhuǎn)移階段癌癥，包括但不限于肺癌、乳腺癌和前列腺癌。
本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞也可用于抑制胃及外分泌和內(nèi)分泌胰腺分泌以及胃腸道多種肽的釋放。因而，生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞可用于治療胃腸疾病，例如治療胃潰瘍、NSAID誘導(dǎo)的潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、急性胰腺炎(如ERCP后患者)、腸皮膚和胰腺皮膚瘺、GI動(dòng)力障礙、腸梗阻、慢性萎縮性胃炎、非潰瘍性消化不良、硬皮病、腸易激綜合征、局限性回腸炎、傾倒綜合征、水樣瀉綜合征以及與諸如AIDS和霍亂的疾病相關(guān)的腹瀉(參見(jiàn)O’Dorisio等，Advances inEndocrinology Metabolism 1990，1175-230)。
在具體的實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞在需要生長(zhǎng)抑素作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)調(diào)質(zhì)時(shí)也具有功能，可應(yīng)用于神經(jīng)變性疾病例如中風(fēng)、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病及其它形式的癡呆、精神健康障礙(例如焦慮、抑郁和精神分裂癥)，以及其它神經(jīng)疾病例如疼痛和癲癇的治療(A.Vezzani等，European Journal ofNeuroscience 1999，11，3767-3776)。
生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生細(xì)胞也可以和其它治療劑聯(lián)合應(yīng)用。例如，在治療器官移植的情況下，其它治療劑的實(shí)例包括環(huán)孢菌素和FK-506。對(duì)于治療腫瘤，其它治療劑的實(shí)例包括他莫昔芬和α干擾素。對(duì)于糖尿病，其它化合物的實(shí)例包括二甲雙胍或其它雙胍、阿卡波糖、磺酰脲、噻唑烷二酮或其它胰島素敏化劑，包括但不限于，對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活的受體γ(PPAR-γ)起激動(dòng)劑作用的化合物、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子I、胰高血糖素樣肽I(glp-I)以及可用的飽感促進(jìn)劑例如右旋酚氟拉明或苗條蛋白。
IV.組織工程本文所述的細(xì)胞可以在組織工程中使用。本發(fā)明提供了產(chǎn)生動(dòng)物物質(zhì)的方法，包括在足以使其擴(kuò)增并分化為期望物質(zhì)的條件下維持本發(fā)明的細(xì)胞。所述物質(zhì)可以包括，例如胰腺的一部分，甚至于整個(gè)胰腺。對(duì)此，本文所述的細(xì)胞可與任何已知的組織工程技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，所述組織工程技術(shù)包括但不限于下面描述的那些技術(shù)AdvancedTissue Sciences，Inc.的美國(guó)專(zhuān)利No.5,902,741和5,863,531；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No,6,139,574；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,759,830；Vacanti的美國(guó)專(zhuān)利No.5,741,685；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,736,372；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,804,178；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,770,417；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,770,193；Griffith-Cima等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,709,854；Atala等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,516,532；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,855,610；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,041,138；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,027,744；Vacanti等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,123,727；Kemp等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,536,656；Skjak-Braek等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,144,016；Vacanti的美國(guó)專(zhuān)利No.5,944,754；Tubo等的美國(guó)專(zhuān)利No.5,723,331以及Sittinger等的美國(guó)專(zhuān)利No.6,143,501。
為產(chǎn)生這樣的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞群在適于其擴(kuò)增并分裂形成器官的條件下維持。這可以通過(guò)將它們轉(zhuǎn)移到動(dòng)物中典型地期望新物質(zhì)的部位而實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明能夠在其中這樣的組織中植入了該細(xì)胞的動(dòng)物中促進(jìn)胰腺的再生。
又在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化并擴(kuò)增為組織。就此，細(xì)胞在促進(jìn)形成有助于組織發(fā)育形成的三維結(jié)構(gòu)的基質(zhì)上培養(yǎng)。因此，例如，細(xì)胞可以培養(yǎng)于或者種植在生物相容性網(wǎng)格上，例如包括胞外基質(zhì)材料、合成聚合物、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等的網(wǎng)格上。這樣的網(wǎng)格可以被塑造成期望的形狀以促進(jìn)組織類(lèi)型的發(fā)育形成。
因此，本發(fā)明提供了包括細(xì)胞和細(xì)胞群以及生物相容性網(wǎng)格的組合物。網(wǎng)格可以從聚合材料形成，具有作為網(wǎng)孔或海綿的纖維，典型地具有在100μm和約300μm之間數(shù)量級(jí)的空間。這種結(jié)構(gòu)提供細(xì)胞能夠在上面生長(zhǎng)和增殖的充足面積。期望地，網(wǎng)格隨著時(shí)間可生物降解，這樣它將隨著動(dòng)物物質(zhì)的形成而被其吸收。合適的聚合物可從單體例如羥基乙酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己內(nèi)酯等形成。其它聚合物材料可包括蛋白、多糖、多羥基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈或合成聚合物，尤其是生物可降解聚合物，或其任何組合。而且，根據(jù)需要，網(wǎng)格可以包括激素，例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、形態(tài)發(fā)生素(如視黃酸等)、期望的胞外基質(zhì)材料(如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原等)或其它材料(如DNA、病毒、其它細(xì)胞類(lèi)型等)。
為形成該組合物，細(xì)胞被引入到網(wǎng)格中，從而它們滲進(jìn)其中的間質(zhì)間隙。例如，基質(zhì)可以用含有細(xì)胞的溶液或懸液浸泡，或者該細(xì)胞溶液或懸液可以注入或注射到基質(zhì)中。優(yōu)選地，利用通過(guò)交聯(lián)包括聚合物并且其中分散有本發(fā)明細(xì)胞的懸液而形成的水凝膠。這種形成方法允許細(xì)胞分散在整個(gè)網(wǎng)格中，促進(jìn)網(wǎng)格更加均勻地被細(xì)胞滲透。當(dāng)然，組合物還可以包括期望表型的成熟細(xì)胞或其前體，特別地增強(qiáng)對(duì)網(wǎng)格內(nèi)本發(fā)明細(xì)胞的誘導(dǎo)，或者促進(jìn)網(wǎng)格內(nèi)激素例如胰島素或胰高血糖素的產(chǎn)生。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解適于包括在組合物中的網(wǎng)格可來(lái)自任何合適的來(lái)源，如基質(zhì)凝膠(matrigel)，并且當(dāng)然可以包括合適網(wǎng)格的商業(yè)來(lái)源。另一種合適的網(wǎng)格可來(lái)自于脂肪組織的無(wú)細(xì)胞部分，例如基本上沒(méi)有細(xì)胞的脂肪組織胞外基質(zhì)。典型地此類(lèi)脂肪來(lái)源的網(wǎng)格包括蛋白例如蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纖連蛋白、膠原等，它們?nèi)孔鳛榧?xì)胞生長(zhǎng)的出色基質(zhì)。另外，此類(lèi)脂肪來(lái)源的網(wǎng)格可以包括激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知曉分離這種脂肪來(lái)源的網(wǎng)格的方法，例如匹茲堡大學(xué)的WO 00/53795中所公開(kāi)的，特此并入作為參考。
又在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，利用固體自由形式的制造方法產(chǎn)生胰腺樣組織以允許組織再生和生長(zhǎng)。例如，這類(lèi)技術(shù)公開(kāi)在Vacanti等的專(zhuān)利U.S.6,138,573中，并允許產(chǎn)生部分或完整的器官用于移植到需要其的人體中。尤其是，這些技術(shù)將允許產(chǎn)生部分或完整的胰腺用于移植。產(chǎn)生此類(lèi)部分或完整的器官可用以自體方式獲得的本發(fā)明的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)?；蛘?，此類(lèi)部分或完整的器官由以同種異體方式獲得的本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生。構(gòu)思本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法可用于改造來(lái)自本發(fā)明的細(xì)胞的組織。例如Naughton等(Advanced TissueSciences)的專(zhuān)利US 6,022,743和5,516,681公開(kāi)了用于培養(yǎng)胰腺樣組織的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的方法。這些技術(shù)包括將細(xì)胞種植并植入到基質(zhì)上以形成可額外提供控釋生物活性劑的器官組織和結(jié)構(gòu)組分?；|(zhì)的特征在于與天然存在的組織脈管系統(tǒng)功能上等同的內(nèi)腔網(wǎng)絡(luò)，其由植入的細(xì)胞形成，并且進(jìn)一步襯有內(nèi)皮細(xì)胞。該基質(zhì)在植入時(shí)進(jìn)一步與血管或其它導(dǎo)管偶合以在整個(gè)基質(zhì)中形成血管或?qū)Ч芫W(wǎng)絡(luò)。自由形式的制造技術(shù)是指本領(lǐng)域公知的構(gòu)建作為一系列二維層的復(fù)雜三維物體的任何技術(shù)。該方法可被改造利用許多聚合、無(wú)機(jī)及復(fù)合材料產(chǎn)生具有明確組成、強(qiáng)度和密度的結(jié)構(gòu)。因而，利用此類(lèi)方法，可在基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生精確的通道和孔，以控制隨后一種或多種具有明確功能的細(xì)胞類(lèi)型在基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。以這種方式，本發(fā)明的分化細(xì)胞，相應(yīng)于各種類(lèi)型的胰腺細(xì)胞(即具有至少一種胰腺α、β、γ或δ細(xì)胞的基因型或表型特征的細(xì)胞)可被組合以形成部分或完整的器官。此類(lèi)細(xì)胞在基質(zhì)中組合以提供散布于整個(gè)細(xì)胞中的襯有內(nèi)皮的血管網(wǎng)絡(luò)。也可以形成其它結(jié)構(gòu)用作為淋巴管、膽管及器官內(nèi)的其它外分泌或排泄管。
本發(fā)明的細(xì)胞、細(xì)胞群、網(wǎng)格和組合物可用于組織工程和再生。因此，本發(fā)明涉及合并任何公開(kāi)的本發(fā)明的特征的可植入結(jié)構(gòu)。植入物的確切性質(zhì)將根據(jù)期望的用途變化。植入物可以包括成熟組織或可以包括未成熟組織或網(wǎng)格。因此，例如，植入物可以包括正在經(jīng)歷胰腺分化的本發(fā)明的細(xì)胞群，任選地種植在適當(dāng)大小和維度的網(wǎng)格內(nèi)。這樣的植入物被注射或移植到宿主內(nèi)，以促進(jìn)患者體內(nèi)成熟胰腺組織的產(chǎn)生或再生。
脂肪來(lái)源的網(wǎng)格可便利地作為細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的一部分使用。因此，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括本發(fā)明的脂肪來(lái)源的網(wǎng)格和一種或多種其它組分，例如水化劑(如水、生理相容性鹽溶液、制備的細(xì)胞培養(yǎng)基、血清或其組合或衍生物)、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)(如皿、板、瓶等)、細(xì)胞培養(yǎng)基(無(wú)論液體還是粉末形式)、抗生素、激素等。雖然試劑盒可以包括任何此類(lèi)成分，優(yōu)選地它包括所有在適當(dāng)組合后支持目的細(xì)胞培養(yǎng)和生長(zhǎng)的必要成分。期望的試劑盒也可以包括如所述種植到網(wǎng)格中的細(xì)胞。
現(xiàn)在將通過(guò)下列實(shí)施例更加充分地描述本發(fā)明。不過(guò)，本發(fā)明可具體體現(xiàn)為許多不同的形式，而不應(yīng)當(dāng)理解為限于本文所列的實(shí)施方案。確切地講，提供這些實(shí)施方案，從而使公開(kāi)更加徹底和完整，并將充分地向本領(lǐng)域技術(shù)人員傳達(dá)本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1體外誘導(dǎo)方法脂肪來(lái)源的肝細(xì)胞按照描述分離自吸脂術(shù)廢物材料(Sen等，2001，J.Cell Biochem.81312-319)。這些細(xì)胞在存在(但不限于)下列培養(yǎng)基的情況下繼續(xù)培養(yǎng)補(bǔ)充有或未補(bǔ)充胎牛血清(FBS)的NeurobasalTM(InVitrogen)、N2、B27(InVitrogen)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。對(duì)培養(yǎng)基中的葡萄糖水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)胞以多種密度種植，并以每3-6天的時(shí)間間隔飼喂。最優(yōu)選地，它們以約1000到約500,000細(xì)胞/cm2的密度種植。
在培養(yǎng)期間，利用商業(yè)上可獲得的放射免疫測(cè)定或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定對(duì)條件培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)分泌胰腺激素胰島素(American LaboratoryProducts)、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽(Peninsula Labs Inc)的分析。
與各種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞細(xì)胞系相關(guān)的表型標(biāo)記的表達(dá)利用對(duì)如下(但不限于)基因HNF3β、Isl-1、Brain-4、Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、PDX-1、Nkx6.2、Nkx2.2、Ngn-3、胰島素和Glut2特異性的引物通過(guò)RT-PCR分析mRNA進(jìn)行評(píng)估。這些標(biāo)記的存在以及它們與內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的關(guān)系以前已有描述(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282；Schwitzgebel等，2000，Development 127，3533-3542；Fernandes等，1997，Endocrinology 138，1750-1762；Zulewski等，2001，Diabetes 50，521-533；Gradwohl等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97，1607-1611)。還將利用針對(duì)(但不限于)任何上文所述的表型標(biāo)志的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)分析。
實(shí)施例2基因治療方法該方法包括插入和表達(dá)任何導(dǎo)致誘導(dǎo)成體干細(xì)胞分化為表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的基因型或表型特征的細(xì)胞的基因。這些基因可以包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子HNF3β、Isl-1、Brain-4、Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、PDX-1、Nkx6.2、Nkx2.2和Ngn-3的受控表達(dá)。將核酸引入細(xì)胞的潛在方法包括但不限于電穿孔、磷酸鈣、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或脂質(zhì)介導(dǎo)的遞送，如上文詳細(xì)描述。細(xì)胞如在上文以及在實(shí)施例1中所詳細(xì)描述的進(jìn)行分化分析。
實(shí)施例3體內(nèi)移植本發(fā)明的細(xì)胞體內(nèi)植入用于動(dòng)物的治療應(yīng)用以及治療因內(nèi)分泌胰腺組織機(jī)能失常引起的人類(lèi)疾病如1型糖尿病。用于這些應(yīng)用的現(xiàn)有的嚙齒動(dòng)物模型包括胰島素依賴(lài)型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠，以及通過(guò)用鏈脲菌素處理破壞胰島致使糖尿病的小鼠或大鼠(Lumelsky等，2001，Science 292，1389-1394；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。NOD小鼠已被用來(lái)植入胰腺胰島和由胰管干細(xì)胞產(chǎn)生的胰島(Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415；Lumelsky等，2001，Science 292，1389-1394；Stegall等，2001)。本發(fā)明表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的基因型或表型特征的分化的細(xì)胞被用于植入到NOD動(dòng)物中，它們通常必須靠每日注射胰島素維持生存。移植用動(dòng)物的制備包括外科手術(shù)操作，其中如以前所描述的利用27號(hào)標(biāo)準(zhǔn)針頭在腎被膜的被膜下區(qū)產(chǎn)生小通道(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282)。起始范圍為103-106的衍生自人類(lèi)成人干細(xì)胞的內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞利用小套管和通道上燒灼的開(kāi)口被植入。可檢查備選的操作，其中在肩上制造皮下部位并植入細(xì)胞(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282)。在這兩種植入模型中，假手術(shù)NOD小鼠和未經(jīng)歷任何操作的NOD小鼠作為對(duì)照。在手術(shù)操作后2-7天的周期內(nèi)，動(dòng)物被中斷日常胰島素注射。作為功能性胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的指數(shù)，在不同階段利用AccuChek-EZ葡萄糖監(jiān)測(cè)儀(Roche)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的血糖水平。進(jìn)行有關(guān)人類(lèi)胰島素和其它內(nèi)分泌胰腺激素的ELISA分析。另外，利用針對(duì)胰島素及由該植入物潛在地產(chǎn)生的其它蛋白的人類(lèi)特異性抗體進(jìn)行植入部位的免疫組織化學(xué)分析。
實(shí)施例4包封如上所述植入的細(xì)胞可以被免疫排斥。作為防備這種情況的努力，設(shè)計(jì)了利用包封基質(zhì)的方法，所述基質(zhì)允許來(lái)自包封組織的分泌激素的通過(guò)，但起著對(duì)抗宿主免疫攻擊的保護(hù)屏障的作用。參見(jiàn)Ramiya等，2000，Nat.Med.6278282。此類(lèi)屏障可以包括透明質(zhì)酸為基礎(chǔ)的凝膠RestalyneTM(Q-Med Sweden，烏普薩拉，瑞典)。對(duì)于此方法，起始范圍為103-106的衍生自人類(lèi)成人干細(xì)胞的內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞被包封入凝膠中。植入物被置入皮下部位，動(dòng)物中斷胰島素并進(jìn)行分析，如上文實(shí)施例3中所描述的。
實(shí)施例5同種異體移植檢查同種異體移植的動(dòng)物模型的一個(gè)實(shí)例已有描述(Stegall等，2001，Transplantation 71，1549-1555)。兩個(gè)品系(品系A(chǔ)和品系B，例如CBA(H-2k)和BALB/c(H2-d)小鼠被用作為成體干細(xì)胞供體以及作為衍生自成體干細(xì)胞的內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的受體。供體內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞由品系A(chǔ)或品系B的成體干細(xì)胞制備，所述干細(xì)胞以類(lèi)似于上文所述的用于人類(lèi)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞的方法分離自鼠性腺脂肪細(xì)胞的供體群。品系A(chǔ)或品系B的受體通過(guò)用鏈脲菌素處理導(dǎo)致糖尿病(Stegall等，2001，Transplantation 71，1549-1555)。建立移植，使供體\受體組合為1)同基因，品系A(chǔ)對(duì)品系A(chǔ)以及品系B對(duì)品系B；2)同種異基因，品系A(chǔ)對(duì)品系B以及品系B對(duì)品系A(chǔ)；3)第三種模型利用鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病裸(免疫缺陷)鼠作為來(lái)自品系A(chǔ)或品系B的供體細(xì)胞的受體。接受移植的動(dòng)物如實(shí)施例3所述進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析。
實(shí)施例6胰島素檢測(cè)分析在本發(fā)明的任何細(xì)胞培養(yǎng)物中，胰島素的產(chǎn)生檢測(cè)如下。簡(jiǎn)要地，如上文任一實(shí)施例中培養(yǎng)的細(xì)胞用含有5到25mmol/l葡萄糖的無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，并在3ml無(wú)血清培養(yǎng)基中溫育至少2小時(shí)。隨后，收集條件性培養(yǎng)基，并利用與胰島素原或C肽無(wú)交叉反應(yīng)性的檢測(cè)人類(lèi)胰島素的微顆粒酶免疫分析(AXSYMTMsystem Insulin kitcodeB2D010；Abbott Laboratories)檢測(cè)胰島素水平。
實(shí)施例7胰島簇形成例如，根據(jù)Lumelsky等的方法構(gòu)建三維胰島簇(2001，Science1389-1394)。簡(jiǎn)要地，根據(jù)本文所述的實(shí)施例1中概述的方法培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞最初生長(zhǎng)以在懸液中產(chǎn)生高度富集的巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞群，并補(bǔ)充無(wú)血清ITSFn培養(yǎng)基。這些條件已經(jīng)證明可提高巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的比例。然后在bFGF存在下在N2無(wú)血清培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)胞。為誘導(dǎo)分泌胰島素的胰島簇的分化和形態(tài)發(fā)生，然后從含有補(bǔ)充了煙酰胺的B27培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中撤掉bFGF。然后鑒定所得的聚集物或簇并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法確認(rèn)為產(chǎn)生胰島素。
實(shí)施例8分離由脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化的特定胰腺細(xì)胞類(lèi)型單個(gè)大鼠胰島細(xì)胞最初與β細(xì)胞表面特異性抗體(K14D10小鼠IgG)溫育20-60分鐘。添加包被有二抗(抗小鼠IgG)的Dynabead懸液進(jìn)一步溫育15分鐘，之后Dynabead包被的細(xì)胞通過(guò)試管和磁體(Dynal MPC)之間的接觸被瞬間沉淀。利用免疫細(xì)胞化學(xué)確認(rèn)Dynabead包被的細(xì)胞含有胰島素并對(duì)該方法的效率進(jìn)行定量。對(duì)Dynabead包被和未包被的細(xì)胞進(jìn)行胰島素和胰高血糖素染色。
Dynabead免疫純化產(chǎn)生純度95％的含胰島素的β細(xì)胞，它響應(yīng)異丁基甲基黃嘌呤和胰高血糖素樣多肽1而釋放胰島素。Dynabead包被的β細(xì)胞中的胰島素含量顯著高于未包被的細(xì)胞。成功的分離利用少至30個(gè)胰島作為起始材料而實(shí)現(xiàn)。利用“彗星”分析，Dynabead包被的β細(xì)胞表現(xiàn)出與非包被細(xì)胞等同的對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DNA損傷的易感性(Hadjivassiliou等Diabetologia.2000年9月；43(9)1170-7)。
對(duì)于得益于前述說(shuō)明書(shū)中呈現(xiàn)的教導(dǎo)的本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的修飾和其它實(shí)施方案將是顯而易見(jiàn)的。因而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于所公開(kāi)的具體實(shí)施方案，并且修飾和其它實(shí)施方案旨在包括在所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。雖然本文使用了具體術(shù)語(yǔ)，它們僅僅是以通稱(chēng)和描述性的意義使用的，而并非用于限制目的。
權(quán)利要求
1.分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，其被誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)分泌胰腺來(lái)源細(xì)胞的至少一種特征。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞在體外被誘導(dǎo)分化。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞在體內(nèi)被誘導(dǎo)分化。
4.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中該細(xì)胞中引入了外源遺傳材料。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞是人類(lèi)的。
6.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中細(xì)胞分泌激素。
7.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中激素從由胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素或胰多肽組成的激素組中選擇。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中激素為胰島素。
9.分化分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞以展示至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞標(biāo)志的方法，包括使分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)分泌胰腺誘導(dǎo)物質(zhì)接觸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中內(nèi)分泌胰腺誘導(dǎo)物質(zhì)在化學(xué)成分確定的細(xì)胞培養(yǎng)基中。
11.治療宿主中胰腺內(nèi)分泌紊亂或變性疾病的方法，包括i)誘導(dǎo)分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞標(biāo)志；和ii)將誘導(dǎo)的細(xì)胞移植到宿主中。
12.權(quán)利要求11的方法，其中脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分離自該宿主。
13.權(quán)利要求11的方法，其中胰腺內(nèi)分泌紊亂或變性疾病是I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)疾病、化學(xué)誘導(dǎo)疾病、胰腺炎相關(guān)疾病或外傷相關(guān)疾病。
14.植入物，包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的植入物，進(jìn)一步包含生物相容性聚合物。
16.權(quán)利要求15的植入物，其中生物相容性聚合物為水凝膠。
17.權(quán)利要求15的植入物，其中生物相容性聚合物為膠原衍生物、聚羥基乙酸、聚乳酸、聚羥基乙酸/聚乳酸、透明質(zhì)酸鹽或纖維蛋白。
18.生產(chǎn)激素的方法，包括(a)在足以讓細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌激素的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的細(xì)胞和(b)從培養(yǎng)基中分離激素。
19.權(quán)利要求18的方法，其中產(chǎn)生的激素選自胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素或胰多肽。
20.權(quán)利要求19的方法，其中產(chǎn)生的激素是胰島素。
21.分離的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，其在體外去分化，然后被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的特征。
22.權(quán)利要求21的去分化細(xì)胞，其在體內(nèi)被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的特征。
23.分離的脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞，其在培養(yǎng)中被誘導(dǎo)表達(dá)至少一種內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞的特征，其中誘導(dǎo)的細(xì)胞a)被解聚并轉(zhuǎn)移到懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中；b)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物直至觀(guān)察到胰島細(xì)胞簇形成的跡象；并且，其中c)將所得的胰島細(xì)胞簇植入到宿主中。
24.權(quán)利要求1的細(xì)胞，進(jìn)一步被包封在適于移植到宿主中的生物材料中。
25.權(quán)利要求24的方法，其中包封材料選自膠原衍生物、水凝膠、藻酸鈣、瓊脂糖、透明質(zhì)酸、聚乳酸/聚羥基乙酸衍生物以及纖維蛋白。
26.植入宿主中的權(quán)利要求1-8或21-25中任一項(xiàng)的細(xì)胞的用途。
27.植入宿主中的權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的植入物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞分化為表達(dá)至少一種胰腺細(xì)胞的基因型或表型特征的細(xì)胞的細(xì)胞、組合物和方法。該方法產(chǎn)生的細(xì)胞可用來(lái)提供分化的和功能性細(xì)胞的來(lái)源，用于研究、植入、移植和研發(fā)組織工程產(chǎn)品以治療胰腺疾病以及胰腺組織修復(fù)+。
文檔編號(hào)A61P3/06GK1596305SQ02823717
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者B·奇塔姆, Y－D·C·霍爾沃森, J·M·金貝爾 申請(qǐng)人:阿特塞爾科學(xué)公司