專利名稱：仿生骨的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)療用仿生骨的制作方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種仿生骨的制備方法，該仿生骨可促進(jìn)血管形成，改善血液循環(huán)，模仿體內(nèi)成骨過程中的多因子協(xié)同作用，從而很好地實(shí)現(xiàn)成骨。
解決上述技術(shù)問題的方案是一種仿生骨的制備方法，它包括準(zhǔn)備支架、復(fù)合成骨活性因子、滅菌、分裝工序，其區(qū)別之處是，它還包括復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子工序，具體步驟是A.將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶于醫(yī)用溶劑內(nèi)，加入量為0.001mg/ml-10mg/ml；B.將支架浸入上述溶劑浸泡后干燥。
上述仿生骨的制備方法，所述復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子工序中，所說支架在醫(yī)用溶劑中常溫浸泡，浸泡時(shí)間為10分鐘-24小時(shí)，然后抽真空0.01Mpa-0.10Mpa，凍干，所說醫(yī)用溶劑為水或醫(yī)用緩沖液、肝素溶液、NaCl溶液。
上述仿生骨的制備方法，所述醫(yī)用緩沖液為磷酸緩沖鹽溶液，所說滅菌工序采用環(huán)氧乙烷滅菌。
上述仿生骨的制備方法，所述復(fù)合成骨活性因子工序是用公知的方法將一種或幾種成骨活性因子復(fù)合到支架上。
上述仿生骨的制備方法，所述準(zhǔn)備支架工序?yàn)锳.選取支架材料選取新鮮牛骨、豬骨、人骨或其它動(dòng)物骨，切取骨骺端或椎體的松質(zhì)骨，加工成所需形狀；B.物理及化學(xué)處理破碎、清除細(xì)胞，脫脂、去除異物、脫蛋白去除抗原性；C.清洗、凍干、分裝、滅菌保存?zhèn)溆?；以上制備支架工序也可按其它已有技術(shù)進(jìn)行，或采用人工合成的支架。
上述仿生骨的制備方法，所述復(fù)合成骨活性因子工序?yàn)锳.制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于濃度為4-7M的鹽酸胍溶液或濃度為2-10M的尿素溶液中，加入量為鹽酸胍溶液或尿素溶液的0.01-3.0mg/ml；
B.制備轉(zhuǎn)化生長因子β溶液將轉(zhuǎn)化生長因子β加入濃度為10mM-1M的醋酸溶液中，加入量為0.01-3.0mg/ml，浸泡0.5-1小時(shí)，攪拌均勻；C.復(fù)合取上述A、B步驟制得的兩種溶液混合或上述兩種溶液中的任意一種，將支架置于其內(nèi)，浸泡0.5-24小時(shí)，再抽真空至0.01Mpa-0.10Mpa，用1℃-20℃蒸餾水透析24-96小時(shí)凍干。
可將支架先復(fù)合成骨活性因子，再復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；也可將支架先復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，再復(fù)合其它成骨活性因子，或?qū)⒀軆?nèi)皮細(xì)胞生長因子、其它成骨活性因子同時(shí)復(fù)合。
上述仿生骨的制備方法，還可將支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞或攜帶轉(zhuǎn)基因片段的上述細(xì)胞用公知技術(shù)復(fù)合。
上述仿生骨的制備方法，所述準(zhǔn)備支架工序的物理處理步驟為，a.沖洗用20-50℃高壓潔凈水脈沖、攪拌沖洗；b.甩干離心甩干；c.冷凍一升溫冷凍至-20℃～-80℃立即取出，投入0.1摩爾/升、PH值為7.2的緩沖液中放置1-24小時(shí)，升溫至室溫，該過程可重復(fù)1-5次，從而使原骨的細(xì)胞破碎，清除細(xì)胞，促進(jìn)成骨。
所述制備支架工序的化學(xué)處理步驟為脫脂、去除異物、脫蛋白去除抗原性，骨塊離心速度為100～3000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5～30分鐘。
上述仿生骨的制備方法，所述復(fù)合成骨活性因子工序中，還包括制備膠原及復(fù)合膠原將I型膠原凍干研磨呈微粒狀，加入濃度為10mM-1M醋酸溶液中，加入量為0.1-3.0mg/ml，與轉(zhuǎn)化生長因子β一同浸泡0.5-1小時(shí)，攪拌均勻，再將支架置于其內(nèi)，靜置0.5-24小時(shí)，然后抽真空至0.01Mpa-0.10Mpa凍干。
上述仿生骨的制備方法，在所述復(fù)合成骨活性因子工序的復(fù)合步驟中，所說取上述兩種溶液是按(1-4)∶(4-1)比例混合，超聲振蕩，攪拌；為提高支架強(qiáng)度，在制備支架的化學(xué)處理工序中，所述脫蛋白去除抗原性步驟之前，將骨塊放入體積百分濃度為1％-10％的甲醛或甲醛/戊二醛混合液內(nèi)處理1-24小時(shí)。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，呈弱堿性，遇熱遇酸穩(wěn)定，具有高度保守性。該因子對(duì)血管生成有重要作用，參與骨折愈合的全過程，尤其是骨折后72小時(shí)至3周是骨折處血管再生活躍的階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)可以強(qiáng)烈而特異地促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、增長、轉(zhuǎn)移，增加血管通透性并促進(jìn)新血管生成。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)還可以直接作用于成骨細(xì)胞，增加其移動(dòng)和分化功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等成骨因子之間具有協(xié)同作用，成骨及促進(jìn)血管形成的能力大大提高。因此將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)復(fù)合在上述人工植骨材料中必將促進(jìn)血管形成，改善血液循環(huán)，更好地實(shí)現(xiàn)成骨。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)在本發(fā)明的技術(shù)方案中，仿生骨支架材料除了復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子等因子之外還復(fù)合了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，這就解決了仿生骨成骨過程中血管形成和血液供應(yīng)的問題，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和血管形成，將損傷修復(fù)所需的營養(yǎng)物質(zhì)與成骨因子等輸送到骨折部位，同時(shí)把代謝產(chǎn)物帶離骨折部位，成骨及成血管能力大大提高。同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子作為多種生長因子網(wǎng)絡(luò)中的一員，它們之間相互影響，并且生物學(xué)效應(yīng)可以相互協(xié)同。在制備過程中還可采用脈動(dòng)加壓沖洗、冷凍—升溫的溫差處理新工藝，大大提高了支架材料的處理質(zhì)量。
a.沖洗用30℃高壓潔凈水脈動(dòng)攪拌沖洗；b.甩干以500轉(zhuǎn)/分的速度離心甩干；c.冷凍—升溫放入冰柜內(nèi)，冷凍至-80℃立即取出，投入0.1摩爾/升、PH為7.2的磷酸鹽緩沖液中浸20小時(shí)，升至室溫，再冷凍、浸泡，反復(fù)進(jìn)行2-4次；C.化學(xué)處理a.脫脂、去除異物在30℃下，用1∶1氯仿/甲醇溶液浸泡脫脂12小時(shí)，將骨塊以500轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，清除骨塊內(nèi)的異物，再放入20％濃度的氫氧化鈉溶液中浸泡18小時(shí)，清洗、離心清除骨塊中的異物；b.脫蛋白、去除抗原性將骨塊在30℃、體積百分濃度為30％的雙氧水溶液中浸泡12小時(shí)，再離心清除骨塊中的異物；c.重復(fù)步驟a、b；D.用公知方法進(jìn)行超聲波清洗、蒸餾水沖洗，凍干、分裝、滅菌、保存?zhèn)溆茫?2).復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白、膠原A.制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白鹽酸胍溶液將提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于鹽酸胍溶液中，加入量為鹽酸胍溶液的1.0mg/ml，鹽酸胍的濃度為5M；B.制備膠原和轉(zhuǎn)化因子溶液將提取的I型膠原凍干研磨呈微粒狀，加入醋酸溶液中，加入量為醋酸溶液的0.5mg/ml，將提取的轉(zhuǎn)化生長因子也加入上述醋酸溶液中，加入量為0.5mg/ml，浸泡1小時(shí)，攪拌均勻，醋酸的濃度為1M；C.復(fù)合仿生骨支架材料將上述兩種溶液混合，超聲振蕩，攪拌，兩者的比例為1∶4，將仿生骨支架材料置于其內(nèi)，靜置12小時(shí)，然后抽真空至0.09Mpa，用4℃蒸餾水透析48小時(shí)后凍干；
(3).復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子將提取的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶于PBS溶液內(nèi)，加入量為5mg/ml，再將已經(jīng)復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白、膠原、轉(zhuǎn)化生長因子的仿生骨支架材料投入到該P(yáng)BS溶液中，靜置12小時(shí)，溫度為4℃，抽真空至0.09Mpa凍干，環(huán)氧乙烷滅菌，分裝備用。
(2).復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子a.將提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于鹽酸胍溶液中，加入量為鹽酸胍溶液的2.0mg/ml，鹽酸胍的濃度為6M；將提取的轉(zhuǎn)化生長因子加入醋酸溶液中，加入量為醋酸溶液的0.7mg/ml，充分浸泡1小時(shí)，攪拌均勻，醋酸的濃度為1M。
b.將上述兩種溶液混合，超聲振蕩，攪拌，兩者的比例為1∶1；投入仿生骨支架材料，靜置20小時(shí)，再抽真空至0.09Mpa，用4℃蒸餾水透析72小時(shí)后凍干；(3).復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子將提取的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶于PBS溶液內(nèi)，加入量為5mg/ml；將已經(jīng)復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子的仿生骨支架材料投入到上述PBS溶液中，靜置20小時(shí)，溫度為4℃，抽真空，凍干；環(huán)氧乙烷滅菌，分裝備用。
本發(fā)明所述的骨生長因子可以是基因工程生產(chǎn)的，也可以從骨皮質(zhì)、血小板、牛腦、人等各種動(dòng)物組織中提??；骨形態(tài)發(fā)生蛋白等因子可以是修飾過的蛋白或其部分缺失物的異二聚體或多聚體或幾個(gè)基因的聯(lián)合基因表達(dá)產(chǎn)物，如BMP2-BMP7，BMP7-TGF-β，BMP7-VEGF等，可在支架上復(fù)合慶大霉素等抗生素、抗結(jié)核藥、抗腫瘤化療藥物。
權(quán)利要求
1.一種仿生骨的制備方法，它包括準(zhǔn)備支架、復(fù)合成骨活性因子、滅菌、分裝工序，其特征在于，它還包括復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子工序，具體步驟是A.將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子溶于醫(yī)用溶劑內(nèi)，加入量為0.001mg/ml-10mg/ml；B.將支架入上述溶劑浸泡后干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，在所述復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子工序中，所說支架在醫(yī)用溶劑中常溫浸泡，浸泡時(shí)間為10分鐘-24小時(shí)，然后抽真空0.01Mpa-0.10Mpa，凍干，所說醫(yī)用溶劑為水或醫(yī)用緩沖液、肝素溶液、NaCl溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，所述醫(yī)用緩沖液為磷酸緩沖鹽溶液，所說滅菌工序采用環(huán)氧乙烷滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，復(fù)合成骨活性因子工序是將一種或幾種成骨活性因子復(fù)合到支架上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，所述準(zhǔn)備支架工序?yàn)锳.選取支架材料選取新鮮牛骨、豬骨、人骨或其它動(dòng)物骨，切取骨骺端或椎體的松質(zhì)骨，加工成所需形狀；B.物理及化學(xué)處理破碎、清除細(xì)胞，脫脂、去除異物、脫蛋白去除抗原性；C.清洗、凍干、分裝、滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合成骨活性因子工序?yàn)锳.制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶液將骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于濃度為4-7M的鹽酸胍溶液或濃度為2-10M的尿素溶液中，加入量為鹽酸胍溶液或尿素溶液的0.01-3.0mg/ml；B.制備轉(zhuǎn)化生長因子β溶液將轉(zhuǎn)化生長因子β加入濃度為10mM-1M的醋酸溶液中，加入量為0.01-3.0mg/ml，浸泡0.5-1小時(shí)，攪拌均勻；C.復(fù)合取上述A、B步驟制得的兩種溶液混合或上述兩種溶液中的任意一種，將支架置于其內(nèi)，靜置0.5-24小時(shí)，再抽真空至0.01Mpa-0.10Mpa，用1℃-20℃蒸餾水透析24-96小時(shí)凍干。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，將支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞或攜帶轉(zhuǎn)基因片段的上述細(xì)胞復(fù)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述之仿生骨的制備方法，其特征在于所述準(zhǔn)備支架工序的物理處理步驟為，a.沖洗用20-50℃高壓潔凈水脈沖、攪拌沖洗；b.甩干離心甩干；c.冷凍—升溫冷凍至-20℃～-80℃立即取出，投入0.1摩爾/升、PH值為7.2的緩沖液中放置1-24小時(shí)，升溫至室溫，進(jìn)行1-5次；所述制備支架工序的化學(xué)處理步驟為脫脂、去除異物、脫蛋白去除抗原性，骨塊的離心速度為100～3000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為5～30分鐘；
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，在所述復(fù)合成骨活性因子工序中，還包括制備膠原及復(fù)合膠原將I型膠原凍干研磨呈微粒狀，加入濃度為10mM-1M醋酸溶液中，加入量為0.1-3.0mg/ml，與轉(zhuǎn)化生長因子β一同浸泡0.5-1小時(shí)，攪拌均勻，再將支架置于其內(nèi)，靜置0.5-24小時(shí)，然后抽真空至0.01Mpa-0.10Mpa凍干。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述之仿生骨的制備方法，其特征在于，在所述復(fù)合成骨活性因子工序的復(fù)合步驟中，所說取上述兩種溶液是按(1-4)∶(4-1)比例混合，超聲振蕩，攪拌；在制備支架的化學(xué)處理工序中，所述脫蛋白去除抗原性步驟之前，將骨塊放入體積百分濃度為1％-10％的甲醛或甲醛/戊二醛混合液內(nèi)浸泡1-24小時(shí)。
全文摘要
一種仿生骨的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，所要解決的技術(shù)問題是提供仿生骨的制備方法，該仿生骨可促進(jìn)血管形成，改善血液循環(huán)，模仿體內(nèi)成骨過程中的各因子協(xié)同作用，從而很好地實(shí)現(xiàn)成骨。技術(shù)方案是該制備方法包括準(zhǔn)備支架、復(fù)合成骨活性因子、滅菌、分裝工序，其獨(dú)特在于，它還包括復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子工序。支架除了復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白因子、轉(zhuǎn)化生長因子等之外還復(fù)合了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，解決了仿生骨成骨過程中血管形成和血液供應(yīng)的問題，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和血管形成，將損傷修復(fù)所需的營養(yǎng)物質(zhì)與成骨因子等輸送到骨折部位，同時(shí)把代謝產(chǎn)物帶離骨折部位，成骨及成血管能力大大提高。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1457898SQ03112269
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月28日
發(fā)明者王慶賢, 葛軍 申請(qǐng)人:王慶賢