專利名稱：高純度白蛋白生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純化從血清中提取的人血清白蛋白(HSA)或用編碼人血清白蛋白氨基酸序列的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化一種微生物生產(chǎn)的重組人白蛋白(rHA)。在此說明書中，術(shù)語“白蛋白”通常指人血清白蛋白和/或重組人白蛋白。
背景技術(shù)：
白蛋白用于治療有嚴(yán)重?zé)齻菘嘶蚴а牟∪?。也用作補(bǔ)充培養(yǎng)高等真核細(xì)胞的培養(yǎng)基和作為治療用蛋白配方中的賦形劑。目前，從人血液中提取的白蛋白可以滿足對這種產(chǎn)品的需求。提取和分離技術(shù)的實(shí)例包括那些公開于如下專利中JP 03/258 728關(guān)于一種陽離子交換劑的使用；EP428 758關(guān)于陰離子交換緊接著陽離子交換的應(yīng)用；和EP 452 753關(guān)于加熱、加鹽和滲濾的使用。
微生物中重組人白蛋白的生產(chǎn)已在EP 330 451和EP 361 991中公開。重組人白蛋白的純化技術(shù)已公開在WO 92/04367，源于基質(zhì)的染料的去除，EP 464 590，源于酵母的著色劑的去除；和EP 319067堿沉淀及隨后的將重組人白蛋白應(yīng)用于對白蛋白有特異親和力的親脂相。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供高度純化的白蛋白。
本發(fā)明一方面提供了一種純化白蛋白的技術(shù)，該技術(shù)包括將相對不純的白蛋白溶液加入白蛋白可非特異結(jié)合的層析材料以便白蛋白與該材料結(jié)合，和用含可與白蛋白特異結(jié)合的化合物的溶液從該材料上洗脫結(jié)合的白蛋白的步驟。優(yōu)選地，層析材料是一種陽離子交換劑，如SP-瓊脂糖FF，SP-多孔微球硅膠等，列于實(shí)施例2之中。與白蛋白有特異親和力的化合物可以是辛酸鹽(如辛酸鈉)，其它長鏈(C6至C22)脂肪酸，水楊酸鹽，辛酰丁二酸鹽，N-乙酰色氨酸或兩種或多種這類化合物的混合物。
本發(fā)明的第二方面提供一種純化白蛋白的方法，該方法包括的步驟有將白蛋白溶液進(jìn)行陽離子交換層析。其中白蛋白與陽離子交換物質(zhì)結(jié)合，然后進(jìn)行陰離子交換層析，其中白蛋白與陰離子交換物質(zhì)結(jié)合。
從陽離子交換物質(zhì)洗脫的白蛋白可在進(jìn)行所說陰離子交換層析之前用親和層析、超濾和凝膠滲透中的一種或多種方法處理。因此，在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括的步驟有(a)在白蛋白能與一種陽離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下，將白蛋白溶液通過該基質(zhì)；(b)從所說的基質(zhì)上洗脫出包含白蛋白的陽離子交換洗脫液；(c)將所說的洗脫液通過一種包含一種白蛋白結(jié)合化合物的親和基質(zhì)；(d)從所說的基質(zhì)上洗脫出一種含有白蛋白的親和基質(zhì)的洗脫液；(e)在超濾之后，任選地將洗脫液通過一種凝膠滲透基質(zhì)以獲得一種富含白蛋白的組分；(f)在白蛋白能與一種陰離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下，將所說的富含白蛋白的組分通過該基質(zhì)；并(g)從所說的陰離子交換基質(zhì)中洗脫出一種純化的含白蛋白的產(chǎn)品。
另一種選擇是，從陽離子交換物質(zhì)中洗脫的白蛋白可直接通過所說陽離子交換物質(zhì)而不需加入任何處理(不包括稀釋)。因此，第二種優(yōu)選的提供純化白蛋白的方法的實(shí)施方案包括的步驟有(a)在白蛋白能與一種陽離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下，將白蛋白溶液通過該基質(zhì)；(b)從該基質(zhì)中洗脫出一種含有白蛋白的陽離子交換洗脫液；(c)在白蛋白能與一種陰離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下，將陽離子交換洗脫液通過該基質(zhì)；(d)從該陰離子交換基質(zhì)中洗脫出一種含白蛋白陰離子交換洗脫液；(e)將陰離子交換洗脫液通過一種包含一種白蛋白結(jié)合化合物的親和基質(zhì)；(f)從該親和基質(zhì)中洗脫出一種含白蛋白的親和基質(zhì)洗脫液；(g)將該親和基質(zhì)洗脫液通過一種凝膠滲透基質(zhì)以獲得富含白蛋白的組分。
優(yōu)選地，在進(jìn)行陽離子交換的步驟之前，通過加入辛酸鹽和/或其它白蛋白穩(wěn)定劑(如乙酰色氨酸鈉)至其達(dá)終濃度約為1-10mM，并調(diào)節(jié)pH至約4.0-5.0而調(diào)節(jié)該白蛋白溶液。
在將陽離子交換步驟中的白蛋白進(jìn)行洗脫之前，如用一種高鹽溶液(如在pH4.0，用10-100mM，優(yōu)選地為20-40mM，例如27mM乙酸鈉作為緩沖的0.5-2.0M氯化鈉)洗脫則更為有益。
優(yōu)選地，在陽離子交換洗脫液直接過陰離子交換劑的方法中，在陽離子交換一步中的白蛋白的洗脫采用一種含有與白蛋白有特殊親和力的化合物的緩沖液，尤其是該化合物是一種酸或其鹽，例如辛酸鹽或任何其它長鏈(C6-C22)脂肪酸，水楊酸鹽，辛酰丁二酸鹽或N-乙酰色氨酸。
一種含高濃度(如至少50mM，50-200mM較好，例如80-150mM)硼酸鹽，例如四硼酸鈉或四硼酸鉀的緩沖液適于從陰離子交換劑中洗脫白蛋白。
按本發(fā)明純化的白蛋白經(jīng)過或不經(jīng)介入的工藝步驟后，用含有可選擇性結(jié)合糖綴合物和多糖的固化的化合物，如氨基苯硼酸(PBA)的樹脂進(jìn)行層析。
在本發(fā)明中涉及親和層析的任何步驟中，親和層析優(yōu)選地采用一種包含有固化染料，諸如Cibacron藍(lán)型染料的樹脂，固化于樹脂上優(yōu)選地通過諸如1，4-二氨基丁烷基的間隙基團(tuán)或另一個C1-8的且優(yōu)選地為C1-6，如C1-5，最優(yōu)選地是C4長度，優(yōu)選地α-ω-二氨基取代基團(tuán)的間隔基團(tuán)。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)這種染料事實(shí)上對能夠由分泌HA的微生物的培養(yǎng)生產(chǎn)的45KD的白蛋白片段比對全長的白蛋白分子具有更高的親和力。這種45KD片段通常由1-403至1-409區(qū)組成，并在Sleep等(1990)生物技術(shù)(Bio/Technology)8，42-46及WO 95/23857中公開。
應(yīng)用本發(fā)明的方法制備的純的白蛋白溶液可根據(jù)其預(yù)定的用途進(jìn)一步加工。例如，其可通過超濾膜超濾獲得白蛋白濃度至少達(dá)每升80克白蛋白的超濾保留液，超濾保留液用至少相當(dāng)其5倍體積的水透濾。在某些層析步驟中，有銨離子是有利的，如在涉及固化的氨基苯硼酸鹽的步驟。令人吃驚的是，我們發(fā)現(xiàn)這些銨離子與白蛋白結(jié)合得相當(dāng)緊密。優(yōu)選地，從白蛋白中去除這些銨離子，我們已發(fā)現(xiàn)這可使用抗衡離子來實(shí)現(xiàn)。在本領(lǐng)域的現(xiàn)有方法中沒有出現(xiàn)需要將白蛋白加入抗衡離子，因?yàn)槠錄]有涉及銨離子而且沒有理由假設(shè)銨離子結(jié)合于白蛋白。
因而，本發(fā)明的下一個方面提供一種純化白蛋白溶液的方法，其包括將該溶液加入一種抗衡離子溶液以使銨離子從白蛋白中被取代并從溶液中去除。
抗衡離子(優(yōu)選地為一種金屬離子如鈉離子)加入到白蛋白溶液中，銨離子通過透析去除，或者通過半透膜將白蛋白與抗衡離子溶液隔開的透濾去除，或通過凝膠滲透層析去除。透濾通常用至少5倍保留物體積的50mM的氯化鈉是合適的。
所得到的白蛋白含極低水平的，或基本去除了著色劑、乳酸、檸檬酸、金屬、人源蛋白如免疫球蛋白，前激肽釋放酶激活因子，轉(zhuǎn)鐵蛋白，α1-酸性糖蛋白，血紅蛋白和凝血因子，真核細(xì)胞蛋白，白蛋白片段，白蛋白聚合體或多聚體，內(nèi)毒素，膽紅素，血紅素，酵母蛋白和病毒?！盎救コ币馕吨陀诳蓹z測水平。術(shù)語“著色劑”用于此處代表任何使白蛋白著色的化合物。例如色素是一種源自有機(jī)體，特別是用于制備重組白蛋白的酵母的著色劑，而染料是出現(xiàn)在用于白蛋白純化的層析步驟的著色劑。以本發(fā)明的方法純化的白蛋白制劑中以蛋白重量計，至少有99％，優(yōu)選為至少99.9％是白蛋白。這樣高純度的白蛋白不太可能會引起有害副作用。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的白蛋白至少99.5％是單體，優(yōu)選地是通過還原性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定的實(shí)際100％的單體，并具有如下的一個或多個特征。以一克白蛋白計，其鋁離子含量低于150ng，優(yōu)選為低于100ng；鐵離子含量低于3,000ng，優(yōu)選為低于1,000ng；銅離子水平低于10,000ng，優(yōu)選為低于5,000ng；鎂離子水平低于3,000ng，優(yōu)選為低于1,500ng；鋅離子水平低于5,000ng，優(yōu)選為低于3,000ng；錳離子水平低于50ng；以摩爾己已糖/摩爾蛋白計，糖化水平低于0.6，優(yōu)選地低于0.15(更優(yōu)選地低于0.05)；按下列實(shí)施例9的方法測定，低分子量雜質(zhì)的水平低于20V.sec，優(yōu)選地低于10V.sec；毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖中單一峰，完整的，即均一的羧基末端和氨基末端；至少0.8molSH/mol蛋白中不含硫醇；不超過0.3mol/mol C10至C20脂肪酸和實(shí)質(zhì)上的無C18或C20脂肪酸。
最初的原料可能是含有白蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基，或者不純的白蛋白溶液可能是用過去50年中發(fā)展起來的過多的提取和純化技術(shù)從血清中獲得的溶液，這些技術(shù)如Stoltz等(199)國際制藥技術(shù)(Pharmaceut.Tech.Int.)1991年6月，60-65以及More和Harvey(199)在“血液分離和血漿分級分離”Ed.Harris，Wiley-Liss出版261-306.中所公開的。
尤其是當(dāng)白蛋白是由缺乏蛋白酶的酵母或其它微生物生產(chǎn)所得的重組人白蛋白，其純化方法通常不包括作為純化工藝一部分的加熱處理步驟(與EP 428 758和EP 658 569對比)。類似的，如果白蛋白是從微生物(而不是人)制備，它通常不需要最后的巴斯德滅菌步驟(通常為60℃，一小時)。
最終的產(chǎn)物需配制以增加其穩(wěn)定性。優(yōu)選地，本發(fā)明的高純白蛋白產(chǎn)品至少包含100g，更優(yōu)選地為1kg或10kg，其可用大量小藥瓶分裝。
盡管本發(fā)明的方法可用于從許多來源，如血清中獲得的不純白蛋白溶液中獲取更純的白蛋白，但它特別可應(yīng)用于純化重組人白蛋白(rHA)。按本發(fā)明制備白蛋白可以是任何哺乳類白蛋白，如大鼠、牛或綿羊的白蛋白，但優(yōu)選地是人白蛋白。編碼白蛋白的DNA可在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)生產(chǎn)白蛋白。因此，DNA可按已知的技術(shù)用于構(gòu)建一表達(dá)載體，然后用基轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞以表達(dá)和生產(chǎn)白蛋白。這些技術(shù)包括在EP-A-73 646，EP-A-88 632，EP-A-201 239和EP-A-387-319中公開的技術(shù)。
已知有許多表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌(如大腸桿菌和枯草桿菌)，酵母(如啤酒糖酵母，巴斯德畢赤氏酵母，和乳克魯維氏酵母)，絲狀真菌(如曲霉)，植物細(xì)胞，動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。優(yōu)選的微生物是啤酒糖酵母。
可考慮用于本發(fā)明操作的酵母的典型的屬是畢赤氏酵母屬(漢遜氏酵母屬)，糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，假絲酵母屬，球擬酵母屬，有孢圓酵母屬，裂殖糖酵母屬，固囊酵母屬，Pachysolen，德巴利氏酵母屬，梅奇酵母屬，紅冬孢屬，Leucosporidium，Botryoascus，鎖擲酵母屬，擬內(nèi)孢霉屬和類似的屬。優(yōu)選的屬是選自畢赤氏酵母屬(漢遜氏酵母屬)，糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，Yarrowia和漢遜氏酵母屬。糖酵母屬種的例子是啤酒糖酵母、意大利糖酵母和魯氏糖酵母。克魯維氏酵母屬種的例子是脆壁克魯維氏酵母和乳克魯維氏醇母。畢赤氏酵母屬(漢遜氏酵母屬)的例子是P.angusta(原多形漢遜氏酵母)，P.anomala，巴斯德畢赤氏酵母和P.capsulata。Y.lipolytica是一個合適的yarrowia種的例子。
使用一種有一種或多種蛋白酶缺陷的酵母菌株是有益的。這類菌株包括熟知的pep4-3突變株和含有PRA1和/或PRB1基因突變的菌株，這些菌株在Woolford等(1993)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)268，8990-8998，Cabezon等(1984)美國國家科學(xué)院院報(P.N.A.S.)81，6594-6598，EP-A-327 797和Jones等(1982)遺傳(Genetics)102，665-677.中公開。另一種方法是，發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白酶可通過加熱使之失活。在整個操作過程中蛋白酶的存在會降低白蛋白的產(chǎn)量。
酵母的Yap3p蛋白酶和/或hsp 150熱休克蛋白的水平最好很低(或?yàn)榱?，例如由破壞各個基因?qū)е碌慕Y(jié)果，這可在我們公開的專利WO 95/23857和WO 95/33833中分別獲知。Yap3p能引起下述45KD白蛋白片段的形成，hsp 150在某些分離步驟中與白蛋白一起被純化。
酵母可用基于啤酒糖酵母的2μm質(zhì)粒構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化酵母時，質(zhì)粒包含細(xì)菌的復(fù)制子和所選的序列，該序列在轉(zhuǎn)化后可能通過根據(jù)EP 286 424所述的內(nèi)部重組而被切除。質(zhì)粒也可包含一表達(dá)盒，包括一個公開在EP 431 880中的酵母啟動子(如啤酒糖酵母PRB1啟動子)；一段編碼分泌前導(dǎo)區(qū)的序列，如在WO 90/01063中公開的一段包括絕大部分天然人血清白蛋白分泌前導(dǎo)區(qū)，加上一小部分啤酒糖酵母α-交配因子分泌前導(dǎo)區(qū)的順序；人血清白蛋白編碼順序，可通過已知的分離和人類基因相對應(yīng)的cDNA的方法獲得，這在例如EP 73 646和EP286 424中公開；一段轉(zhuǎn)錄中止子，如EP 60057中公開的來源于糖酵母ADH 1的終止子。
盡管上述質(zhì)粒中的不同成分對增加產(chǎn)量的收獲有不同的作用，但并不認(rèn)為它們的選擇直接與獲得的白蛋白產(chǎn)物的純度相關(guān)。
本發(fā)明涉及一種純化白蛋白的方法，該方法包括施加相對不純的白蛋白溶液到該白蛋白無特異親和力的，因而能結(jié)合的層析材料，以及采用一種對白蛋白有特異親和力的化合物的溶液從該層析材料洗脫結(jié)合的白蛋白的步驟。
上述的方法，其中的層析材料是一種陽離子交換樹脂。
上述的方法，其中的化合物是一種如辛酸鹽的脂肪酸鹽。
本發(fā)明還涉及一種純化白蛋白的方法，該方法包含將白蛋白溶液用白蛋白可以結(jié)合的一種陽離子交換材料進(jìn)行陽離子交換層析，然后白蛋白可以結(jié)合的一種陰離交換材料進(jìn)行陰離子交換層析的步驟。
上述的方法，其中從陽離子交換材料洗脫的白蛋白在進(jìn)行所說的陰離子交換層析之前依次用親和層析、超濾和凝膠滲透中的一種或幾種方法處理。
上述的方法，其中從陽離子交換材料洗脫的白蛋白適用于所說的陰離子交換材料不需任何除稀釋外的中間步驟處理。
本發(fā)明還涉及一種純化白蛋白的方法，包括的步驟(a)在白蛋白將與陽離子交換材料結(jié)合的條件下，將白蛋白通過陽離子交換基質(zhì)。
(b)從所說的基質(zhì)中洗脫含白蛋白的陽離子交換洗脫液。
(c)將所說的洗脫液通過包含有白蛋白結(jié)合化合物的親和基質(zhì)。
(d)從所說的基質(zhì)中洗脫含白蛋白的親和基質(zhì)洗脫液。
(e)將所說的洗脫液通過一種凝膠滲透基質(zhì)以獲得富集白蛋白的組分，這一步也可任意地在起濾之后進(jìn)行。
(f)將所說的白蛋白富集的組分在白蛋白將結(jié)合陰離子交換基質(zhì)的條件下通過該基質(zhì)；并(g)從所說的陰離子交換基質(zhì)中洗脫純化的含白蛋白的產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及一種純化白蛋白的方法，包含的步驟(a)在白蛋白將結(jié)合陽離子交換基質(zhì)的條件下，將白蛋白溶液通過該基質(zhì)；(b)從該基質(zhì)洗脫包含白蛋白的陽離子交換洗脫液；(c)在白蛋白將與陰離子交換基質(zhì)結(jié)合的條件下，將陽離子交換洗脫液通過該基質(zhì)；(d)從陰離子交換基質(zhì)中洗脫含有白蛋白的陰離子交換洗脫液；(e)將陰離子交換洗脫液通過一種包含一種白蛋白結(jié)合化合物的親和基質(zhì)；(f)從該親和基質(zhì)中洗脫含白蛋白的親和基質(zhì)洗脫液；(g)將親和基質(zhì)洗脫液通過凝膠滲透基質(zhì)以得到一種富含白蛋白的組分。
上述的方法，其中在陽離子交換步驟白蛋白的洗脫使用一種含有對白蛋白有特異親和力的化合物的緩沖液。
上述的方法，其中的化合物是一種辛酸鹽。
上述的方法，其中在陽離子交換步驟中白蛋白在洗脫之前用高鹽溶液洗滌。
前面任一所述的方法，其中白蛋白是用一種含50-200mM硼酸鹽的緩沖液從陰離子交換劑中洗脫。
前面任一所述的方法，其中經(jīng)或不經(jīng)中間處理步驟獲得的白蛋白在含有一種將選擇性結(jié)合糖綴合物和多糖的固相化的化合物的樹脂上進(jìn)行層析。
上述的方法，其中的化合物是氨基苯基硼酸(PBA)。
任一前述的針對特異親和層析的方法，其中親和層析使用一種包含固相化的、白蛋白特異的染料的樹脂。
上述的方法，其中的染料是一種Cibacron藍(lán)型染料。
上述的方法，其中的染料是通過一間隔基團(tuán)固相化在樹脂上。
本發(fā)明還涉及一種根據(jù)任一前述方法的方法，其中在陽離子交換步驟之前，白蛋白溶液通過加入辛酸鹽至終濃度為約1至10nm并調(diào)節(jié)pH至約4.0-5.0而調(diào)整。
前述任一方法，其中得到的最終的含白蛋白的溶液再通過超濾膜超濾以得到白蛋白濃度至少約每升80克白蛋白的超濾保留液并用至少相當(dāng)于該保留液5倍體積的水透濾該超濾保留液。
任一前述方法，其中最初的白蛋白溶液是通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)用編碼白蛋白核苷酸順序轉(zhuǎn)化的酵母得到的酵母培養(yǎng)基，而其中的酵母表達(dá)并分泌白蛋白。
上述的方法，其中所說發(fā)酵培養(yǎng)基是不含金屬螯合劑。
上述的方法，其中在培養(yǎng)基施用于陽離子交換材料之前，酵母從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。
本發(fā)明還涉及一種純化白蛋白的方法，該方法包括將相對不純的白蛋白接觸含有硼酸或其鹽的層析材料和從白蛋白溶液中分離該材料以獲得純化的白蛋白的步驟。
上述的方法，其中的白蛋白溶液含有糖綴合物和/或多糖。
上述的方法，其中糖綴合物和/或多糖包括酵母糖蛋白。
上述方法，其中的硼酸是氨基苯基硼酸或其鹽。
上述的方法，其中的氨基苯基硼酸固相化在一種瓊脂糖凝膠上。
上述的方法，其中的白蛋白溶液用乙酸根離子、氯離子、辛酸根離子和銨離子中的一種或多種緩沖。
上述的方法，其中的溶液含10-100mM乙酸根離子，10-100mM銨離子，20-200mM氯離子和1-20mM辛酸根離子并且pH值9.0-9.5。
前述任一方法，其中純化的白蛋白進(jìn)一步純化和/或制劑成可用于人靜脈給藥。


現(xiàn)在將通過實(shí)施例并參照

本發(fā)明優(yōu)選的方面，

為圖1圖示用于生產(chǎn)重組人白蛋白的發(fā)酵罐。
圖2是C18 PTH反向HPLC柱(Applied Biosgstem Inc)的紫外掃描圖，顯示本發(fā)明提供的白蛋白中低分子量雜質(zhì)的水平低。
圖3與圖2類似，但顯示的是現(xiàn)有技術(shù)提供的白蛋白中的低分子量雜質(zhì)。
圖4是一氣相色譜圖顯示市場上提供的白蛋白中的脂肪酸含量。
其中各峰表示1.辛酸(C80)；2.癸酸(C100)；3.十二酸(C120)；4.十四酸(C140)；5.十六酸(C160)；6.順-9-十六酸(C160)；7.HEPTADECANOIC ACID INTERNAL STD；8.十八酸(C180)；9.順-9-十八酸(C181)；10.順-9.12-十八酸(C182)；11.順-9.12.15-十八酸(C183)；12.順-5.8.11.14-二十酸(C200)。
圖5與圖4一樣但顯示的是本發(fā)明提供的白蛋白，其中各峰表示如上。
圖6a和圖6b分別顯示本發(fā)明提供的白蛋白和現(xiàn)有技術(shù)提供的白蛋白的電子流質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1不純白蛋白溶液的制備構(gòu)建生產(chǎn)白蛋白的微生物的克隆策略公開在EP 431 880中。質(zhì)粒pAYE316用Hinnen等(1978)美國科學(xué)院院刊(P.N.A.S.)75，1929中描述的方法導(dǎo)入一啤酒糖酵母萄株(MATa，Leu2，pep43，[cir°])。轉(zhuǎn)化體用缺乏亮氨酸的基本培養(yǎng)基(酵母氮基質(zhì)，Difco)篩選。當(dāng)轉(zhuǎn)化體在含有10ml復(fù)合物(YEP，1％(w/v)醇母浸膏，2％(w/v)細(xì)菌蛋白胨和2％(w/v)蔗糖)或特定的液體培養(yǎng)基(0.15％(w/v)不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮基質(zhì)，0.5％(w/v)硫酸銨，0.1M檸檬酸/十二水磷酸氫二鈉pH6.5，5.2％(w/v)蔗糖)的燒瓶中，在200rpm，30℃下生長72小時，在無細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中可用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和/或用火箭凝膠免疫電泳檢測到重組人白蛋白。
在特定液體培養(yǎng)基(緩沖的基本培養(yǎng)基(BMM)鹽培養(yǎng)基酵母氮基質(zhì)[不含氨基酸和硫酸銨Difco]，1.7g/L；一水檸檬酸6.09g/L；無水磷酸氫二鈉，20.16g/L，pH6.5±0.2，蔗糖加于20g/L中培養(yǎng)的原種主細(xì)胞用于制備生產(chǎn)適宜于用冷凍分裝的含20％(w/v)海藻糖的培養(yǎng)物制備燒瓶振蕩培養(yǎng)物的酵母工藝的流通原種(制造商使用的細(xì)胞庫)。
發(fā)酵這一部分涉及從原種培養(yǎng)到最母的發(fā)酵以生產(chǎn)重組人白蛋白，是人重組白蛋白發(fā)酵過程總的定義，其不局限于特殊設(shè)備或尺寸的具體的細(xì)節(jié)。震蕩燒瓶培養(yǎng)酵母[cir°pAYE 316]以生理上適宜于種子管的接種的無菌培養(yǎng)方式生長。當(dāng)種子管的時間選擇重復(fù)時，確定生長期(基本碳水化合物過量)和接種物生物量(12±2mg/L，每10升培養(yǎng)基需接種物100ml)是必要的。一菌種管的菌種接種至含100ml BMM+2％(w/v)蔗糖的振蕩燒瓶中并在30℃下用軌道振蕩器(每分鐘200rpm轉(zhuǎn)率)孵育直至得到0.6-1.2g/L(通過在600nm處的光密度值估計)的細(xì)胞干重。這一培養(yǎng)物再接種至種子發(fā)酵管至12±2mg/L水平。
種子發(fā)酵主產(chǎn)物發(fā)酵罐的接種物是通過生產(chǎn)產(chǎn)物的有機(jī)體，優(yōu)選地是啤酒糖酵母[cir°pAYE 316]，在種子發(fā)酵罐(在本實(shí)施例，為20L工作體積)生長至高達(dá)約100gL-1細(xì)胞干重(cdw)隨后采用補(bǔ)料分批的培養(yǎng)方式以使乙醇和乙酸的積累降至最少而因此使細(xì)胞產(chǎn)物最多。每次發(fā)酵的整個過程通過計算機(jī)控制系統(tǒng)監(jiān)沿和控制，計算控制系統(tǒng)如多發(fā)醇罐計算機(jī)系統(tǒng)(MFCS)軟件由B.Braun提供。由B.Braun提供的軟件是一個監(jiān)視控制和數(shù)據(jù)獲取軟件包；其它的公司可提供相似的軟件包。補(bǔ)料控制規(guī)則用于控制補(bǔ)加的蔗糖以通過避免Crabtree效應(yīng)獲得最多的生物量，因而使乙醇和/或乙酸的產(chǎn)量降至最低。發(fā)酵管用熱氫氧化鈉清洗并用無熱原的水(PFW)淋洗。熱的無菌的容器將含約10L無菌的MW10培養(yǎng)基(表1)分批鹽加上微量元素。用于人重組白蛋白的培養(yǎng)基能經(jīng)超濾(截流分子量10,000)去除內(nèi)毒素。
表1MW10培養(yǎng)基成份 分批培養(yǎng)基補(bǔ)料培養(yǎng)基鹽磷酸二氫鉀 2.74g/L 10.9g/L七水硫酸鎂 0.58g/L 2.3g/L二水氯化鈣 0.06g/L 0.24g/L磷酸(85％w/w) 0.88ml/L 1.76ml/L維生素泛酸鈣 20mg/L180mg/L尼克酸 33.3mg/L 300mg/Lm-肌醇 20mg/L180mg/Ld-生物素 0.133mg/L 0.8mg/L鹽酸硫胺素 16mg/L32mg/L微量元素貯存液 10ml/L20ml/L蔗糖 0*500g/L微量元素貯存液成分七水硫酸鋅 3g/L七水硫酸亞鐵 10g/L四水硫酸錳 3.2g/L五水硫酸銅 0.079g/L硼酸 1.5g/L碘化鉀 0.2g/L二水錳酸鈉 0.5g/L六水氯化鈷 0.56g/L微量元素加在去礦物質(zhì)水中，用98％的硫酸按35ml/L酸化。
*在20L種子發(fā)酵階段加入20g蔗糖/L于分批培養(yǎng)基中?？捎萌魏畏奖愕姆椒ǔ嘧鳛槌裏嵩姆椒?，例如超濾。維生素通常過濾除菌。
培養(yǎng)基加入容器后，設(shè)置操作溫度為30℃，及最低攪拌速率，通常為400-500rpm。超始pH用pH控制器設(shè)置在5.7±0.2，以氨溶液(特殊的比重為0.901)調(diào)節(jié)。2M的硫酸也用作pH校正劑。容器中加入蔗糖至20gL-1，MW10批培養(yǎng)維生素和Breox FMT30除泡劑至0.04gL-1。
過濾除菌的空氣以0.5v/v/m(即每分鐘每升培養(yǎng)基0.5升非壓縮空氣)速率注入容器中，培養(yǎng)基用無菌震蕩培養(yǎng)物接種至每升含12±2mg細(xì)胞干重并啟動MFCS計算機(jī)系統(tǒng)。完成批生長期(以30分鐘內(nèi)溶解氧的壓力(tension)上升大于15％為標(biāo)志)之后，MFCS系統(tǒng)控制下的開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基。控制策略實(shí)際上與下述的生產(chǎn)發(fā)酵是一樣的。發(fā)酵時氣流分兩步增加以維持約1v/v/m的氣流。通過改變攪拌速率將溶解氧壓力(DOT)控制在20％空氣飽和度。一旦攪拌速率不能進(jìn)一步增加且氣流率達(dá)到最高值，補(bǔ)料控制規(guī)則系統(tǒng)控制補(bǔ)料率以使發(fā)酵產(chǎn)物的形成降于最低。在補(bǔ)料結(jié)束時，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入生產(chǎn)容器。
發(fā)酵生產(chǎn)酵母[cir°，pAYE 316]的無菌培養(yǎng)物是通過補(bǔ)料發(fā)酵獲得細(xì)胞外重組人白蛋白生產(chǎn)所需的高水平的細(xì)胞干重(＞80gL-1)而產(chǎn)生的。本實(shí)施例中的發(fā)酵罐工作容積為8000L，用種子發(fā)酵罐中生長的培養(yǎng)物接種生產(chǎn)發(fā)酵罐，其細(xì)胞干重優(yōu)選地大于80gL-1。移入種子發(fā)酵罐的培養(yǎng)物后，生產(chǎn)發(fā)酵罐的初始細(xì)胞干重濃度優(yōu)選地在0.25-1.00gL-1。盡管優(yōu)選地在一個小時內(nèi)開始補(bǔ)料，但如果需要也可以延遲。由于在補(bǔ)料期的開始階段OUR和CER的值很低及其檢測導(dǎo)致的誤差，使用RQ的補(bǔ)料率的自動控制在最初不可行。補(bǔ)料方法是試圖使乙醇和乙酸的積累降至最低，從而使細(xì)胞和產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到最高。
發(fā)酵是在發(fā)酵罐中進(jìn)行，如圖1所示的具有最佳氣體溶解和大量混合設(shè)計的發(fā)酵罐。經(jīng)熱氫氧化鈉洗滌和無熱原水淋洗的容器將容納約4000L的無菌MW10(表1)，批量鹽和微量元素。該培養(yǎng)基可在容器外以加熱或過濾的方式除菌。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，在諸如MW10的培養(yǎng)基中不含乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽或其它重金屬鰲合劑有益，因?yàn)檫@些物質(zhì)的存在導(dǎo)致所得的白蛋白中有色雜質(zhì)的程度明顯升高。
工作溫度設(shè)置為30℃，且攪拌速率調(diào)至足夠維持溶液的均勻，通常約50rpm。啟始pH用氨溶液(特定比重0.901)(控制器設(shè)置為5.7±0.2)。2M硫酸可作為第二種pH校正劑。加入MW10的批發(fā)酵的維生素，如需要加入適當(dāng)?shù)某輨?如Breox FMT 30至0.125gL-1)。
向容器中以最初0.5v/v/m的速率注入過濾除菌的空氣至耗氣分析達(dá)最大靈敏度，并啟動MFCS計算機(jī)系統(tǒng)。耗氣量的分析，可以使用諸如連續(xù)質(zhì)譜儀(如Fisons VG氣體分析儀)。容器用所有的種子容器培養(yǎng)物(最低0.4％v/v)接種。補(bǔ)料的MW 10的體積與批培養(yǎng)的體積相等。補(bǔ)料開始，RQ不能控制，直至OUR和CER的值足夠高時才能使控制有效。在沒有RQ控制的階段，如果RQ持續(xù)大于1.2，補(bǔ)料率要手動調(diào)節(jié)。按照下面的計算公式，補(bǔ)料率通過計算機(jī)控制而上升。
補(bǔ)料率(FR)＝Keμt這里K是初始補(bǔ)料率，μ是指數(shù)生長率，t是時間。K值作為初始補(bǔ)料率是由經(jīng)驗(yàn)決定的，它是達(dá)到使乙醇和乙酸的積累降低最低的生長率所必需的。對于本實(shí)施例，K確定為每升培養(yǎng)物每分鐘加0.08mL的MW10補(bǔ)料培養(yǎng)基。μ值與完全呼吸的生物的最大生長率有關(guān)，在本實(shí)施例為0.1h-1。
t是從0開始的變化的計數(shù)，每分鐘增加1，除非RQ＞1.2或DOT＜15％。在那種情況下，t值下降。
容器必要的時候可加壓以加強(qiáng)OTR。在補(bǔ)料終結(jié)時，培養(yǎng)物維持在下游處理。
這一維持時間應(yīng)保持一分鐘，但如果需要可以處長至48小時或更長。在同步期，培養(yǎng)溫度盡可能降至最低，通常在4至15℃，優(yōu)選地為4℃，DOT可降至0％。停止補(bǔ)料，關(guān)閉通氣，降低過壓。但維持pH控制。維持足夠的攪動以使細(xì)胞處于懸浮并有助于冷卻和pH的均勻，優(yōu)選地在約50rpm。
根據(jù)上述步驟的預(yù)期收獲是生物量＞80g細(xì)胞干量/L培養(yǎng)物；重組人白蛋白＞1.5g單體/L培養(yǎng)物(用SDS-PAGE確定，與整個培養(yǎng)有關(guān))。
當(dāng)白蛋白是重組人白蛋白時，為了制備用于純化處理的按本發(fā)明獲得的不純的白蛋白溶液，將微生物細(xì)胞從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。細(xì)胞優(yōu)選在所描述的純化步驟之前分離，但也可在一定條件下和第一步同時進(jìn)行，如在流化床上進(jìn)行的第一步純化。在同步期，無通氣條件下將于發(fā)酵罐中冷卻至15℃以下的發(fā)酵培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至一罐中稀釋使生物量的濃度達(dá)180-210g/kg，如需要可進(jìn)一步冷卻。稀釋的培養(yǎng)物在無通氣時降溫應(yīng)保持盡量短的時間同時有足夠的攪拌以防止酵母細(xì)胞的沉淀。
細(xì)胞和上清進(jìn)行初步分離，例如微孔濾膜過濾或用諸如Alfa LavalBTUX 510連續(xù)出樣口型的任何適宜的離心機(jī)以5700rpm運(yùn)行進(jìn)行離心。這樣獲得的濃縮液(centrate)可一起過濾，例如用Cuno提供的深度過濾器(1μm孔徑)，轉(zhuǎn)移所有的殘留物和破碎的酵母細(xì)胞和其它顆粒。至少75％的存在于稀釋培養(yǎng)物中的重組人白蛋白可僅通過離心操作回收。這步操作中的細(xì)胞漿渣可任意地重懸于水或緩沖液中并再次離心以獲得第二次濃縮液(centrate)，以增加產(chǎn)物的回收。所得的溶液按本發(fā)明的方法純化白蛋白，如實(shí)施例2所示。
實(shí)施例2根據(jù)本發(fā)明純化白蛋白準(zhǔn)備或調(diào)整發(fā)酵物的濃縮液(centrate)(如實(shí)施例1所述)，或其它任何來源(如血清)的不純的白蛋白溶液以便用陽離子交換基質(zhì)進(jìn)行層析，同時防止白蛋白的多聚化(通過加入正率酸)和蛋白酶活性(通過加熱或選擇不含損害水平的蛋白酶的酵母)。優(yōu)選地是加入辛酸鈉(色譜溶液13(CS13)-表2)至終濃度1-10mM，例如約5mM以穩(wěn)定白蛋白。用乙酸(CS09)調(diào)pH至4.3-4.8，優(yōu)選地為4.5±0.1(最優(yōu)選地為±0.05)，電導(dǎo)率檢測應(yīng)小于5.5mScm-1。
來源于某些宿主菌株或種的培養(yǎng)物上清含有在后續(xù)過程中能降解重組人白蛋白的蛋白酶。這種情況下，這種蛋白酶的活性可通過對含有重組人白蛋白的培養(yǎng)物上清加熱處理以破壞。通常1-10mM辛酸鈉足以防止重組人的蛋白的熱變性，在60-80℃的溫度下30秒至10分鐘足以使蛋白酶失活。隨后，上清可進(jìn)一步如前所述地調(diào)節(jié)。如果不存在蛋白酶的降解作用，優(yōu)選地省略熱處理。
層析所有的操作均可在室溫下(20±50℃)進(jìn)行。層析柱中白蛋白的上樣量(g白蛋白/L基質(zhì))取決于用SDS-PAGE(在SP-FF柱的情況下)或GP-HPLC(對所有其它柱)確定的白蛋白滴度(g/L)。每一步驟的過程可用連機(jī)的紫外吸收，如在254或280nm處的測定來監(jiān)測。
這里所描述的層析步驟的程序在許多方面是新穎的和創(chuàng)造性的。第一步純化步驟中陽離子基質(zhì)的使用使大部分從酵母發(fā)酵中得到低分子量有色物質(zhì)直接通過柱子，而那些與基質(zhì)結(jié)合的也是弱的結(jié)合且能用諸如1M氯化鈉的高離子強(qiáng)度的鹽洗滌液去除。因此，不象陰離子基質(zhì)，其不可逆地吸附那類物質(zhì)，陽離子基質(zhì)可再生并用于純化中第一步的層析的多次循環(huán)。因而，這一步驟形成了耐用的商品化的層析方法的基礎(chǔ)。
在本實(shí)施例中應(yīng)用Cibacron藍(lán)型柱作為第二步純化對于特異地用于去除一種由于其物理化學(xué)特征，如大小和等電點(diǎn)而難以從白蛋白中去除的45KDa的白蛋白片段是新穎的。該片段令人吃驚地比全長的白蛋白能更強(qiáng)地與染料結(jié)合，因而可將它們分離。
白蛋白純化中所用的層析液詳細(xì)列于表2中。因?yàn)樵诎椎鞍准兓写罅渴褂?，并且相對廉價，這種緩沖鹽溶液因其工業(yè)上可提供高純度的形式和與其它通常用于緩沖液的如Tris、HEPES或MOPS相比廉價而最適于本方法。其它的緩沖液可代替表2中所列，如相近pKa值的緩沖液(如蘋果酸對乙酸)，但在大多數(shù)情況下，價錢如在大范圍的適用性排除了他們的應(yīng)用。其它的鹽形式的使用取決于其可溶性，可工業(yè)上提供及低價格。然而，在CS06和CS10柱中包含四硼酸鹽離子有特殊的益處因?yàn)槠湓谂c大分子的碳水化合物部分復(fù)合和使其與基質(zhì)中的陰離子基團(tuán)緊密結(jié)合起特別的作用。這一結(jié)果可以增加洗脫液中白蛋白的純度。
層析可使用軸流式柱(axial flow columns)，如由Pharmacia提供的那種，或輻流式柱(radial flow columns)，如由Sepragen提供的那種。在本實(shí)施例中，所用的柱子都是軸流式。
緩沖溶液可按下述濃度配制，或者配制濃縮的貯存液，使用時即時混和或稀釋。
表2用于純化實(shí)施例2中白蛋白層析溶液


對比具體的實(shí)施例而言，所有稱量都是±2％。
陽離子交換層析白蛋白是用陽離子交換層析，從至少是酵母蛋白(如果白蛋白是來源于酵母發(fā)酵的重組人白蛋白)和其它抗原，低分子量雜質(zhì)和色素化合物中純化和濃縮。本方法采用的是商品化的陽離子交換基質(zhì)，如SP-瓊脂糖FF，SP-球狀硅(Spnerosil)，CM-瓊脂糖FF，CM-纖維素，SE-纖維素或S-葡聚糖凝膠。優(yōu)選的基質(zhì)是SP-瓊脂糖FF(Pharmacia)床高5-25cm，優(yōu)選地為10-15cm，本實(shí)施例為12.5cm，柱的上樣量為10至50g白蛋白/L基質(zhì)，優(yōu)選地為40±10g白蛋白/L基質(zhì)?；|(zhì)以緩沖液平衡以去除堿性貯存液，緩沖液優(yōu)選地應(yīng)具足夠的緩沖能力以降低pH至約pH6.0。如CS01的緩沖液用于去除柱中的CS07貯存液；然而，任何pH小于6.0的緩沖液都可使用。當(dāng)柱流出液的pH值約6.0時，即可判斷為平衡完成。
調(diào)整的濃縮液(centrate)以一定的流率加入層析柱，例如以1.0-8.0cm/min，優(yōu)選地為4.0-70cm/min，本實(shí)施例為6.36cm/min，然后以一種溶液洗滌柱子以去除殘留的雜質(zhì)。這種洗滌溶液應(yīng)為pH＜6.0并且電導(dǎo)率低于5mScm-1，優(yōu)選地低于3mScm-1以防白蛋白被洗脫。合適的溶液是CS01。前面的步驟都以6.36cm/min的流率進(jìn)行；對于洗脫和所有隨后的步驟流率降至0.5-5.0cm/min，優(yōu)選地為2.0-4.0cm/min，本實(shí)施例為3.18cm/min，以減少洗脫的體積。增加離子強(qiáng)度將有效地洗脫白蛋白；使用電導(dǎo)率范圍在5-10mScm-1的溶液，優(yōu)選地為6-8mScm-1，本實(shí)施例使用CS02。當(dāng)紫外吸收信號上升至1.0A280/cm以上時開始收集白蛋白，直至紫外吸收信號降至0.6A280/cm或收集的最大體積達(dá)6.5倍柱體積時為止。層析柱然后用CS03和04清洗，貯藏于CS07。
親和層析。這一步進(jìn)一步純化白蛋白以去除45KDa白蛋白N-末端片段，酵母抗原(如果白蛋白是來源于酵母發(fā)酵的重組人白蛋白)和色素。親和基質(zhì)可包括任何型的結(jié)合白蛋白的Cibacron藍(lán)染料，如活性藍(lán)2，Procion藍(lán)HB，藍(lán)瓊脂糖，藍(lán)丙烯?；推渌祯突衔?。該基質(zhì)優(yōu)選地是下述的“Delta藍(lán)瓊脂糖”基質(zhì)。這可降低基質(zhì)產(chǎn)生藍(lán)浸出液的程度和增強(qiáng)基質(zhì)的堿穩(wěn)定性以有助于洗滌和去熱原。和商品化的基質(zhì)相比，進(jìn)一步改進(jìn)的基質(zhì)是在染料(活性藍(lán)2)和基質(zhì)之間引入-間隔基團(tuán)，1，4-二氨基丁烷。這對于白蛋白純品的洗脫而言，間隔基團(tuán)的長度是合適的。
活性藍(lán)2的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示如下。
鄰位，間位或?qū)ξ划悩?gòu)體或任何其混合物都可使用。優(yōu)選的異構(gòu)體是鄰拉SO3-型但難以制備理想的純度，故使用間位異構(gòu)體。氨丁酰-活性藍(lán)2的制備達(dá)到用分析型高效液相色譜測定至少整個峰區(qū)占98％的純度。還可通過使用粗的商品化的染料，其必須純化氨丁酰衍生的染料，或使用純的合成的染料。在后一種方法中，開始用的染料物質(zhì)應(yīng)在分析型高效液相色譜280nm測定純度至少為98％。這種材料由ACL，Isle of Man提供。通過加熱混和物至60℃，使活性藍(lán)2與1，4-二氨基丁烷在水中反應(yīng)，然后以混合物中純化修飾的染料，如通過沉淀。然后氨丁酰-活性藍(lán)2與基質(zhì)偶合，例如與3-氯-1-2-環(huán)氧丙烷活化的瓊脂糖CL-6B(Pharmacia，瑞典)偶合。見Porath等(1971)色譜雜志(J.Chromatog.)60，167-177。這種Delta藍(lán)瓊脂糖(DBA)基質(zhì)的染料的含量優(yōu)選地是50±5mmol/g干重。
藍(lán)基質(zhì)的使用。本方法使用DBA，床高10-30cm，優(yōu)選地為20-30cm(本實(shí)施例為25cm)，柱的上樣量為7-14g重組人白蛋白/L基質(zhì)，優(yōu)選地為8-12g/L(本實(shí)施例為10±1g白蛋白/L基質(zhì))。所有步驟以0.3-2.0cm/min的流率進(jìn)行，優(yōu)選地為1.0-2.0cm/min，本實(shí)施例中為1.53cm/min。DBA在來源自CS07的CS01中平衡；當(dāng)柱中流出液的pH約為9.5時，平衡完成。層析之前，SP-FF的洗脫液用氨調(diào)節(jié)pH約為8.5-9.5，優(yōu)選地pH9.0，然后上樣至層析柱。上樣完畢后，層析柱以1-5倍體積的電導(dǎo)率10-30mScm-1，優(yōu)選地是15-25m5cm-1的緩沖液洗滌以去除雜質(zhì)，例如用CS12，優(yōu)選地以5倍體積。白蛋白用電導(dǎo)率大于100mScm-1，優(yōu)選地為125-165mScm-1的高離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫，例如用CS03。當(dāng)紫外信號(A280/cm)升至高于0.4時開始收集洗脫液，在信號再次低于0.4時停止。層析柱再用CS04洗滌并貯存于CS07。
中間體超濾。這一步為進(jìn)行凝膠滲透層析而濃縮白蛋白。超濾裝置中的纖維素型濾膜(最小分子量截留低于或相當(dāng)于30,000，例如10,000)用于濃縮DBA洗脫液以保持白蛋白濃度20-120g/L，優(yōu)選地為80-100g/L。使用后，濾膜以水或表3中的CS03或CS05沖洗去殘留的蛋白質(zhì)，并以0.1M的氫氧化鈉清洗。濾膜可貯存于20mM的氫氧化鈉中。
凝膠滲透層析。這一步純化白蛋白是針對酵母蛋白(如果白蛋白是來源于酵母發(fā)醇的重組人白蛋白)，色素和二聚化的白蛋白并進(jìn)行緩沖液交換的步驟。本方法使用商品化的凝膠滲透基質(zhì)，如交聯(lián)葡聚糖凝膠G100，G150，G250，Sephacryl S-100，S-200或S-300，Toyopearl HW50S或瓊脂糖凝膠6或12。優(yōu)選地，基質(zhì)為Sephacryl S-200HR(Pharmacia)凝膠床高度大于60cm，最好在90±cm(3×30cm)。層析柱在CS05中平衡并以0.1-1.5(cm/min，優(yōu)選地為0.5-1.0cm/min的流率進(jìn)行層析，在本實(shí)施例流率為0.75cm/min；然后當(dāng)層析柱的pH達(dá)到9.5時，將中間體超濾所得的白蛋白上樣至層析柱。上樣體積約相當(dāng)2-9％細(xì)層析柱體積，優(yōu)選地為5-8％，本實(shí)施例為柱體積的7.5％。白蛋白組分分三部分收集棄去最初小量的白蛋白二聚體直至A280/cm上升至指針滿偏(FSD)的10％；這時開始連續(xù)收集回收的組分直至達(dá)滿偏的90％；然后所收集的白蛋白作為初級產(chǎn)品組分。這一連續(xù)收集直至A280降至5％滿偏值之下，之后的流出液再直接棄去?；厥粘跫壆a(chǎn)品組分分開收集。重復(fù)這一步驟直至所有原料上樣至層析柱。
S-200HR回收超濾。一種最小分子量截留等于或小于30,000，或如本實(shí)施例所用的10,000的纖維素型濾膜置于超濾裝置中，用以濃縮匯集的回收組分至保留濃度為20-120g/L白蛋白，優(yōu)選地為80-110g/L。使用后的濾膜按中間體超濾中所述方法處理。
另一種選擇是，在本方法的任何超濾步驟中，最低分子量截留≤30,000的聚醚砜或PVDF膜可代替纖維素型的濾膜。這種膜由Amicon和Millipore提供。最好選用適宜用NaOH貯存和清洗的濾膜。
S-200HR回收超濾保留物的純化。從回收超濾所得的保留物上樣至和初級S-200純化同樣的層析柱，從每個峰收集產(chǎn)物組分，然后與前面收集的大量的初級產(chǎn)物組分混和。重復(fù)這一步驟直至所有的原料上樣至層析柱。
陰離子交換層析。這一步的目的是純化白蛋白以去除至少酵母抗原(如果白蛋白是來源自酵母發(fā)酵的重組人白蛋白)和含色素的白蛋白。本方法使用的陰離子交換基質(zhì)，如QMA-球狀硅(Spherosil)，DEAE-Spherodex，Q-HyperD，DEAE-纖維素，QAE-纖維素或TMAE-DMAE或DEAE分級凝膠(Fractogel)優(yōu)選地，基質(zhì)用商品化的陰離子交換基質(zhì)二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠-FF(DEAE Sepharose-FF)(Pharmacia)，床高在5-25cm范圍內(nèi)根據(jù)方便選擇，優(yōu)選地為10-15cm，如12.5cm，柱的上樣量為每升基質(zhì)10-60g，優(yōu)選地為35±15g/L基質(zhì)。層析柱首先以強(qiáng)的緩沖液平衡將pH迅速降至工作范圍，如pH4.5-6.0，優(yōu)選地為約pH5.5的乙酸鈉，以CS11為例。使用濃的緩沖液之后，在加S200洗脫液于柱子之前，用一種低電導(dǎo)率，即范圍在1-4mSm-1，優(yōu)選地為2.5-3.5mScm-1，例如CS08的溶液平衡層析柱。所用的線性流率為1.0-8.0cm/min，優(yōu)選地為3.0-7.0cm/min，本實(shí)施例為4.4cm/min。上樣完畢后，層析柱以5-30mM范圍，優(yōu)選地是15-25mM的四硼酸鈉溶液洗滌，例如用CS10。這導(dǎo)致洗脫白蛋白組分之前，任何含碳水化合物的雜質(zhì)更強(qiáng)地粘附在層析柱上。用任何范圍在10-20mScm-1的高離子強(qiáng)度的溶液可有效地洗脫，優(yōu)選地用CS06。當(dāng)A280/cm達(dá)到0.4時開始連續(xù)收集洗脫液直至吸收峰降至0.8以下。
因此，在本實(shí)施例中，純化步驟的順序是陽離子交換，親和層析，超濾，凝膠滲透(加上回收組分的超濾)和陰離子交換。
用TSK SW3000XL柱，上樣量為25μl的含10.0mg/ml白蛋白的洗脫液，GP高效液相色譜的分析發(fā)現(xiàn)從DE-FF柱所得的洗脫液中白蛋白二聚體的含量低于0.1％(w/w)，白蛋白多聚體或聚合體低于檢測水平。
實(shí)施例3將純化的白蛋白配制成最終產(chǎn)品本實(shí)施例說明將高度純化的白蛋白經(jīng)濃縮透濾和加工成適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，在此為25％(w/v)的白蛋白。這一過程經(jīng)過兩個階段實(shí)，稱為終末超濾(UF)和制劑。最后的UF開始時將二乙氨基乙基(DEAE)洗脫液(用磷酸調(diào)pH7.0±0.3)轉(zhuǎn)移至最后的UF加料容器中，在保留物和如果有的任何的洗滌物轉(zhuǎn)移至配制劑容器的中止。含白蛋白的加工流出液隨后在適于用纖維素的或更優(yōu)選的標(biāo)稱分子量截流限于10,000的聚醚砜濾膜的超濾系統(tǒng)中進(jìn)行初級濃縮，透濾和次級濃縮。最初的濃縮步驟使白蛋白濃度增加至約100gL-1，并立即進(jìn)行對透濾液為至少5倍，優(yōu)選地至少為7倍的連續(xù)的透濾階段，保留物的體積與注射用水體積相當(dāng)。
在本發(fā)明的某些純化過程，如在實(shí)施例7中使用固相化的氨基苯基硼酸鹽，胺離子可能在這一步出現(xiàn)。令人吃驚的是，我們發(fā)現(xiàn)這些胺離子與白蛋白結(jié)合相當(dāng)緊密，不能通過對水的透濾完全去除。我們發(fā)現(xiàn)用鹽溶液透濾是有效的。所用的氯化鈉與白蛋白的比率為0.5％至10％(w/w)，例如1.0％至5％或大約3％。鹽可加在白蛋白保留液中或更通常是加在透濾的水中。對于最終5％(w/v)的制劑來說，可直接從透濾步驟得到約100g/L的溶液。對于最終25％(w/v)的制劑，可從進(jìn)一步的濃縮(UF)得到約275-325g/L的溶液。最后，所得的溶液轉(zhuǎn)移至大的產(chǎn)品配制容器。
制劑步驟使白蛋白處于適宜于大量無菌過濾(0.22μm親水性的聚偏二氟乙烯濾膜)和灌裝的合適的化學(xué)環(huán)境和濃度。分析轉(zhuǎn)入的溶液以確定白蛋白，鈉和辛酸的濃度。計算這些量并進(jìn)一步加入必需的一定量的氯化鈉儲存液和丁酸鈉賦形劑及適當(dāng)級的水以獲得特定的大量制劑。最終的白蛋白濃度可為235-265gL-1(即約25％)，鈉的濃度130-140mM。可制造其它任何可能的白蛋白濃度，但以最底濃度至少4％(w/v)為例。最優(yōu)選地在4％至2.5％(w/v)。在加入適當(dāng)?shù)?、方便的、藥學(xué)上可接受的賦形劑，如在美國或歐洲藥典中對人白蛋白所說，和稀釋用水后，制劑完成。
最終濃度為每克白蛋白0.08毫摩爾辛酸鈉是理想的。產(chǎn)品是無菌和無熱原的。用TSK SW 3000XL柱的GP高效液相分析檢測，可能會有約1％(w/w)的二聚體白蛋白但無大的多聚體或聚合體。
實(shí)施例4陽離子交換后直接陰離子交換在實(shí)施例2方法的變化中，步驟的順序會改變，工藝條件中會有一些變化。因此提供另一層析溶液表，如表3。此外，除了凝膠滲透一步外，所有的層析柱是輻流式的。
表3實(shí)施例4中的層析溶液全部稱量允許偏差±0.5％

開始的陽離子交換步驟與實(shí)施例2中同樣是必需的，但有如下的變化。柱床的流經(jīng)高度是11.0±1.0cm。層析按下述進(jìn)行。
SP-FF(Pharmacia)層析柱用4倍柱體積的10-100mM的乙酸鹽，優(yōu)選地是20-40mM，例如30mM的CS20平衡，上柱的白蛋白溶液流率為每分鐘0.07至0.75倍的柱床體積，優(yōu)選地是0.3-0.6倍，本實(shí)施例是0.5倍柱床體積每分鐘。柱子用8倍柱體積的10-100mM，優(yōu)選地是30-70mM，例如50mM的乙酸鹽(CS21)洗滌然后用10倍柱體積CS20洗滌，白蛋白用乙酸鹽/辛酸鹽緩沖液(例如40-120，優(yōu)選地為60-100，即85mM乙酸鹽和2-50，優(yōu)選地為2-20，即5mM辛酸，如(CS23)洗脫，并用A254/cm值0.6和0.36為標(biāo)志開始和停止收集洗脫液。柱子用0.25-3.0M的鹽和0.05-2％的去污劑(CS24)再用0.1-1.0M氫氧化鈉(CS25)清洗，并貯存在稀釋的(10-50mM)氫氧化鈉(CS26)中。在本實(shí)施例中，平衡、上樣和洗滌步驟中的流率為每分鐘0.5倍柱床體積。白蛋白洗脫的流率為每分鐘0.04-0.6倍柱床體積，優(yōu)選地0.15-0.35，在本實(shí)施例中為0.25倍柱床體積/分鐘。預(yù)期的重組人白蛋白單體的回收率在44％和66％之間。
白蛋白用辛酸溶液從陽離子交換柱洗脫，成為一種新的從陽離子交換材料上對重組人白蛋白的生物特異的洗脫。pH值與白蛋白的等片點(diǎn)接近以致辛酸鹽的結(jié)合引起明顯的整個的電荷不同，例如，pH值至少4.5，優(yōu)選地pH約為5.5。
從陽離子交換所得的洗脫液直接上樣(即代替如實(shí)施例2中親和凝膠滲透之后，但優(yōu)選地在稀釋之后)在陰離子交換樹脂，其pH4.5-6.5優(yōu)選約5.5，電導(dǎo)率最好在1.5至5.0mScm-1范圍，例如2.5±0.5mScm-1。這會導(dǎo)致在陽離子交換層析過程中形成的任何二聚體白蛋白在陰離子交換層析的條件下轉(zhuǎn)變成白蛋白單體。在這一步可獲得約110％白蛋白單體的收率。
更詳細(xì)的是，柱床流經(jīng)高度11.0±1.0cm的二乙氨基乙基瓊脂糖快流柱(Pharmacia)用陽離子交換洗脫緩沖液(CS23)預(yù)平衡，然后在以每升基質(zhì)30.0±10g單體白蛋白上樣之前用乙酸鹽緩沖液(例如CS20)平衡。
柱子然后用如同實(shí)施例2中硼酸溶液(CS27)洗滌，如同實(shí)施例2洗脫，與陽離子交換柱一樣用鹽/去污劑(CS24)，氫氧化鈉(CS25)清洗并貯存在稀釋的氫氧化鈉(CS26)。所有步驟的流率為每分鐘0.07至0.75柱床體積，優(yōu)選地是0.3-0.6，本實(shí)施例為每分鐘0.5柱床體積。
從陰離子交換樹脂(如DE-FF)獲得的洗脫液仍含有不純物質(zhì)并直接用親和基質(zhì)(如實(shí)施例2中所述的Delta藍(lán)瓊脂糖)處理。柱床高度從實(shí)施例2中的25cm降至11.0±1.0cm，以使在常規(guī)操作壓力下能有較高的流率。因此，11.0cm的床高是最佳的，不會負(fù)面影響白蛋白的回收或白蛋白的純度。層析柱以乙酸銨(100-300mM，優(yōu)選地200-275，例如象CS29中250mM)平衡，上樣的白蛋白量按每升基質(zhì)7.0-14.0g，優(yōu)選地8.0-12.0g本實(shí)施例為10.0±1.0g。操作平衡、上樣和洗滌步驟時的流率為每分鐘0.05-0.30柱床體積，優(yōu)選地0.15-0.27，本實(shí)施例為每分鐘0.25倍柱床體積。所有其它步驟以0.04-0.30操作，優(yōu)選地0.1-0.25，本實(shí)施例為0.20柱床體積/分鐘。通過降低柱床高度所得的流率的上升因四個有利于大規(guī)模生產(chǎn)的因素之一而增加了產(chǎn)量并接近于DBA的最大工作能力。由于這種增加的流率對白蛋白的回收或白蛋白的純度未顯出不利影響，因此采用這種較高的流速是可取的。
層析柱用5倍柱體積的乙酸銨緩沖液(CS29)洗滌，白蛋白以強(qiáng)的鹽和磷酸鹽溶液(1.0-3.0M氯化鈉，如1.5-2.5M或2.0M氯化鈉和5-100mM，即在CS30中50mM磷酸鹽)洗脫。
在本變化的方法中洗脫液的pH值從9.2改變?yōu)?.0。緩沖液從50mM的乙酸銨改變?yōu)?0mM的磷酸鈉，優(yōu)選地因?yàn)槠渚彌_值為pH7.0，以及相對低廉的價格。低pH值的洗脫液導(dǎo)致增加DBA洗脫液中白蛋白單體的回收。低于7.0的pH增加片段的水平，而高于pH7.0，白蛋白單體的回收率下降。pH值，可在5.5-9.0的范圍，優(yōu)選地為pH7.0。層析柱以如上所述的氫氧化鈉(CS25，CS26)清洗和貯存。
DBA的洗脫液(可選擇用纖維素型濾膜(標(biāo)稱截流分子量30,000)超濾后得到80-110g/L的白蛋白)然后進(jìn)行凝膠滲透樹脂，如S-200(HR)處理。S-200所用的緩沖液改變?yōu)?0mM磷酸鈉pH7.0。這種緩沖液由于價格原因省略了辛酸鈉，而代替以將溶液在透濾(加至濃度1-20mM，優(yōu)選地為5mM)加入。磷酸鹽使使用的緩沖液具超高的電導(dǎo)率以增加純度?？刹捎酶啕}濃度增加電導(dǎo)率但優(yōu)選地還是使溶液具緩沖能力。優(yōu)選地是pH 7.0，這是由于這是制劑的理想pH值。
因此，在本實(shí)施例中，純化步驟的順序是陽離子交換(以一種與白蛋白特異結(jié)合的分子洗脫)，陰離子交換，親和層析和凝膠滲透。
如果開始時白蛋白是pH 7.0會對制劑之前的透濾步驟有幫助。白蛋白在最終的洗脫液中比實(shí)施例2的方法更濃縮，有助于制劑(實(shí)施例3)前的終末超濾步驟。
實(shí)施例5陽離子交換劑的高鹽洗滌在本方法的進(jìn)一步變化中，除了下述外，其余按照實(shí)施例2或4中的方法。白蛋白上樣至陽離子交換柱(例如SP-瓊脂糖凝膠FF，Pharmacia)后，柱子用CS21(50Mm乙酸鈉，pH 3.9-4.1，0.6-0.8mScm-1)洗滌，然后，進(jìn)一步在最終的CS20洗滌之前用乙酸鈉緩沖液(例如10-50mM乙酸鈉、優(yōu)選地為約27mM，pH 3.5-4.5優(yōu)選地為pH 4.0)中含1-3M，優(yōu)選地為2M的氯化鈉的高鹽緩沖液洗滌。這種更嚴(yán)格的洗滌方法導(dǎo)致洗脫液含有的非白蛋白的蛋白水平較低，這對于如果白蛋白來源于酵母發(fā)酵也許特別有用。白蛋白按實(shí)施例4所述洗脫。高鹽洗滌前降低pH值有助于在洗滌過程中保留柱中的白蛋白，且最后的洗滌也被白蛋白回收達(dá)到最大?？赡軟]有任何一個步驟對于回收的白蛋白的純度有主要的影響。
實(shí)施例6濃縮從陰離子交換劑獲得的硼酸鹽洗脫液本實(shí)施例中，實(shí)施例2或4的方法(經(jīng)或不經(jīng)實(shí)施例5的變化)作如下的變更。陽離子交換柱的洗脫液稀釋至電導(dǎo)率低于10mScm-1，優(yōu)選地低于5mScm-1，然后上樣于陰離子交換基質(zhì)(例如二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠FF，Pharmacia)，陰離子交換基質(zhì)然后用稀釋的四硼酸鹽緩沖液(如25mM的四硼酸鉀或四硼酸鈉)洗滌，這具有使pH上升至約9.2的作用，白蛋白用濃度更高的四硼酸鹽(如80-150mM四硼酸鉀，優(yōu)選地為110mM四硼酸鉀)洗脫。在實(shí)施例2和4中，白蛋白是用20mM四硼酸鹽，100mM氯化鈉洗脫；用80-150mM四硼酸鹽(如33.6g/L)導(dǎo)致洗脫液含碳水化合物雜質(zhì)如酵母蛋白的含量較低，這是因?yàn)樵谶@種條件下，這些物質(zhì)與陰離子交換基質(zhì)的親和力上升。使用四硼酸鉀比四硼酸鈉更優(yōu)選是因?yàn)槠湓谑覝叵掠休^高的溶解度。陰離子交換基質(zhì)的洗脫液同實(shí)施列2或4中一樣處理。例如，在實(shí)施例4的方法中，直接上樣至親和基質(zhì)，如Delta藍(lán)瓊脂糖(DBA)，如實(shí)施例4所述操作。
然后進(jìn)行如實(shí)施例2或4的凝膠滲透步驟。
實(shí)施例7固相化的氨基苯基硼酸鹽從DAB基質(zhì)所得的洗脫液可在凝膠滲透基質(zhì)上操作，如Sephacrgl S-200(HR)(Pharmacia)，其在一種乙酸銨緩沖液平衡(如10-100mM，優(yōu)選地約30mM，含有氯化鈉(20-2000mM，優(yōu)選地為100mM)和辛酸鹽(1-20mM在pH9.0-9.5優(yōu)選地為9.2時的5M辛酸鹽為優(yōu)選。)這種緩沖液在下文詳述的最后的層析步驟中有效地將白蛋白交換到合適的溶液中。
S-200步驟操作如下。S-200工作的最低床高是90.0±3cm(如一套3×3cm)。(a)中間體超濾的保留液上樣至柱子。循環(huán)并回收產(chǎn)物組分。這一步可重復(fù)直至所有原料上樣至柱子。(b)混合的循環(huán)組分用上述的超濾濃縮至80-110g重組人白蛋白/升。(c)循環(huán)超濾的保留液上樣至同樣的柱子，并收集每個峰的產(chǎn)物組分。重復(fù)這一步直至所有原料都上樣至柱子。(d)初級和次級凝膠滲透步驟(a)和(c)的產(chǎn)物組分混合作為S-200的洗脫液。
最后一步包括一去除糖綴合物，如糖蛋白和糖脂，和多聚、寡聚及單體糖。這一步用固相化的氨苯基硼酸(PBA)作為配體。美國專利第4562251號(以參考文獻(xiàn)形式并入本發(fā)明描述了制備二硼酸化或單硼酸化的瓊脂糖的適當(dāng)方法。(1)首先，三嗪以O(shè)基與瓊脂糖連接，然后在第二個反應(yīng)中與3-氨苯基硼酸(APBA)連接。如果三嗪上的X基團(tuán)被氯取代則形成二取代的樹脂。(2)首先，三嗪與APBA反應(yīng)產(chǎn)生單或二硼三嗪。其再通過三嗪上的自由氯基團(tuán)以O(shè)基連接到-ONa激活的瓊脂糖以產(chǎn)生單基團(tuán)或二基團(tuán)取代的瓊脂糖。本專利中所有的實(shí)施例和說明都采用能導(dǎo)致O-連接的ONa激活的瓊脂糖。
較早的專利US 4269605考慮用不同的基質(zhì)激活方法。包括3-氯-1，2-環(huán)氯丙烷活瓊脂糖，在這里更優(yōu)選。商品化的基質(zhì)包括Amicon的PBA 30和Sigma的丙烯珠化的氨基苯基硼酸鹽。
從S-200柱收集的白蛋白經(jīng)已用S-200作緩沖液(見上)預(yù)平衡的PBA基質(zhì)層析；在這種情況下，白蛋白并不明顯地與基質(zhì)結(jié)合，而基于碳水化合物的雜質(zhì)則在通過該柱時被阻滯于柱子足以有效地從白蛋白中分離。因此對于白蛋白來說層析處于消極狀態(tài)。詳述如下苯基硼酸鹽基質(zhì)的流經(jīng)高度為11.0±1.0cm，用含銨離子(10-50mM)，乙酸鹽(10-50mM)和1.0-10.0mM的辛酸鹽(中CS36-見下表)的緩沖液平衡。柱的上樣量為35±15g重組人白蛋白/升基質(zhì)。PBA是作為一負(fù)效應(yīng)步驟來進(jìn)行，因此，收集的產(chǎn)物是上樣期間和隨后以平衡緩沖液洗滌的流出液。所有層析步驟都可以范圍在0.005-0.4柱床體積/min的流率進(jìn)行。平衡和清洗柱子優(yōu)選地用較高的流率，如0.19柱床體積/min，而不似上樣和收集白蛋白溶液，其優(yōu)選地以0.01-0.05；優(yōu)選地為0.025柱床體積/min。然后，柱子以硼酸緩沖液(如CS37)、鹽(CS38)和苛性堿(CS25)清洗再貯存在硼酸緩沖液(CS37)。
收集的流出液和洗滌液用磷酸溶液(CS35)調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1。
所用的緩沖液如下表4實(shí)施例7的層析溶液

由于在PBA緩沖液中使用了銨離子，在最后的超濾步驟中使用鹽，如上述實(shí)施例3所解釋的那樣是有益。
在一個尤其優(yōu)選的方法中，各步驟的順序如下(1)如實(shí)施例1中的酵母發(fā)酵。
(2)如實(shí)施例2中調(diào)節(jié)濃縮液。
(3)如實(shí)施例5中，用高鹽洗滌陽離子交換劑(SP-FF)，再如實(shí)施例4所示用白蛋白特異的化合物洗脫白蛋白。
(4)稀釋并以實(shí)施例6中所述的用濃縮四硼酸鹽洗脫的陽離子交換。
(5)如實(shí)施例4中的親和層析(DBA)。
(6)中間體超濾然后凝膠滲透(S-200)，伴以如實(shí)施例7的循環(huán)(recycle)超濾。
(7)如實(shí)施例7，用固相化硼酸鹽進(jìn)行層析。
(8)如實(shí)施例3中的最終超濾和配制。
實(shí)施例8固相化苯基硼酸鹽的提前使用涉及固相化苯基硼酸鹽的步驟可在方法中提前使用，例如一種方法其步驟確定為陽離子交換劑-陰離子交換劑-親和材料-超濾/透濾-固相化苯基硼酸鹽-凝膠滲透。
每步的條件參見實(shí)施例4至7，以下除外。DBA洗脫液通過對實(shí)施例7中所用的那種乙酸銨的透濾(5倍體積)濃縮至80-110g/L白蛋白，pH調(diào)至9.2。濃縮的DBA洗脫液用PBA層析，收集流出液直接用于凝膠滲透(例如S200)柱。由于現(xiàn)在凝膠滲透是最后一步，可在一種適合于制劑步驟的緩沖液如20-130mM(優(yōu)選地為50-100mM)pH 7.0氯化鈉進(jìn)行。
實(shí)施例9根據(jù)本發(fā)明制備的白蛋白的特征本實(shí)施例說明根據(jù)本發(fā)明純化的白蛋白進(jìn)行純度檢測。除非另有說明，所有進(jìn)行測試是針對如實(shí)施例3所述制劑方法獲得的最終產(chǎn)品白蛋白。
重組人白蛋白的糖基化糖基化蛋白微量分析顯示根據(jù)本發(fā)明純化的重組人白蛋白不是通過非酶促的糖基化修飾的。微量分析是通過用高碘酸氯化C-1的羥基基團(tuán)來測定糖基化蛋白的穩(wěn)定的Amabori產(chǎn)物(AP)形式。高碘酸氧化釋放的甲醛通過在氨中與乙酰丙酮反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成生色基團(tuán)，二乙?；涠谆拎?DDL)來定量。DDL在405nm進(jìn)行比色檢測。
白蛋白批次 Mol己糖/mol蛋白A0.092B0.116C0.090D0.132E0.060G0.04H0.01I0.07J0.07K0.05L0.740M0.70
N 0.96O 0.78批次為A-K是按實(shí)施例2純化的重組人白蛋白。批次為L-O是不同來源的商品化的人血清白蛋白。8批按實(shí)施例7純化的重組人白蛋白與人血清白蛋白(0.387±0.012)相比其糖基化水平(0.042±0.018moles/mole)可忽略。
低分子量雜質(zhì)分析原理本分析的目的是使用酸性有機(jī)溶劑從重組人白蛋白和人血清白蛋白中去除非共價鍵結(jié)合的低分子量雜質(zhì)(LMC)。可得出一與樣品比較的高效液相色譜的指紋色譜圖。
方法-在100μl最終產(chǎn)品(20mg，重組人白蛋白或人血清白蛋白)中依次加入50μl甲酸(98％v/v)，100μl氯仿和50μl乙醇，每次加入后混勻器混勻。樣品在室溫常規(guī)混和5分鐘。再加入1ml丙酮(30分鐘，-20℃)使蛋白沉淀。離心使蛋白樣品沉聚，去除上清，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。干燥的樣品重懸于25％乙腈/0.1％三氟乙酸。然后低分子量雜質(zhì)在用10％-90％線性乙腈梯度的三氟乙酸(流率＝30μl/min)的ABI PTH C18反相色譜柱(220×2.1mm)中分離。樣品在214nm用Shimadzn紫外檢測儀檢測。結(jié)果-對一批商品化的人血清白蛋白和一批根據(jù)本發(fā)明純化的重組人白蛋白進(jìn)行比較。在本發(fā)明提供的樣品中可見兩個主要的明顯的A214nm峰(Rt分別為31.1和42.8分鐘-見圖2和表9)在2.15分的峰認(rèn)為是由通過柱的不溶或部分溶解的物質(zhì)形成，56.5分鐘的大的峰出現(xiàn)在微量的水空白中因而被認(rèn)為是假象。
表5吸收峰結(jié)果

另一方面，商品化的人血清白蛋白有更多的峰。
表6吸收峰結(jié)果


依據(jù)非共價結(jié)合的低分子量雜質(zhì)，本發(fā)明的白蛋白的質(zhì)量明顯高于臨床人血清白蛋白的質(zhì)量。用數(shù)量表示，本發(fā)明的白蛋白在10分鐘和55分鐘之間的所有峰的面積約為6.4V.sec，而商品化物質(zhì)在同樣兩個時間之間的所有峰面積約為39.7V.sec。
對在280nm檢測進(jìn)行相似的分析，在此情況下按本發(fā)明純化的白蛋白的峰面積為0.56Vsec，而人血清白蛋白為14.9Vsec。
低分子量雜質(zhì)的熒光分析(在280nm激活，在350nm檢測)再次表明用本發(fā)明純化的白蛋白的全部峰面積低于人血清白蛋白的10％。
重組人白蛋白和人血清白蛋白的毛細(xì)管區(qū)帶電泳。
毛細(xì)管電泳(CE)是標(biāo)準(zhǔn)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的一種替代方法，以便定性地比較本發(fā)明純的人重組白蛋白和商品化的人血清白蛋白。CE是一種高分辨的電泳技術(shù)，它能分離僅能發(fā)現(xiàn)少量差別的同樣蛋白的亞群。
方法-人血清白蛋白(Armour)和按本發(fā)明純化的重組人白蛋白在20mMPO4/B4O7緩沖液，pH 7.4，20Kev 30℃下分離，在ABI 270 CE電泳。本發(fā)明的重組人白蛋白在電泳圖上只有單一峰，表明其均一性。相比而言，在商品化的人血清白蛋白樣品中發(fā)現(xiàn)有其它的峰，相信這些峰是表明存在諸如含有斷裂的自由巰基或氨基末端降解的白蛋白分子。
C-末端分析重組蛋白質(zhì)量控制的一個重要方面是預(yù)定的一級結(jié)構(gòu)的確定和穩(wěn)定。
材料和方法胰酶消化人血清白蛋白(商業(yè)來源-一個樣品存于-20℃，另一個在30℃12小時)，按本發(fā)明純化的重組人白蛋白(存于4℃和30℃6個月)和去除亮氨酸重組人白蛋白(重組人白蛋白去掉C末端亮氨酸的截短型)(每種1mg)用5mM的二硫蘇糖醇(Calbiochem)在37℃下降解120分鐘，然后以存在于溶于0.5M三羥甲基氨基甲烷鹽酸pH 8.0中的6M鹽酸胍中的10mM碘乙酰胺(Sigma)在37℃下烷基化90分鐘。
然后，樣品按1份溶于3份水中并用胰酶37℃消化48小時(TPCK處理的胰酶，購自Sigma，加入3×10μl容量的1mg/ml的溶液過48小時)。肽圖胰酶消化產(chǎn)物用反相(RP)高效液相色譜作圖。高效液相色譜采用使用25cm Pharmacia Super Pac Pep-S色譜柱(5μmC2/C18)的Gilson高效液相色譜系統(tǒng)。所用的洗脫液是A0.1％(v/v)TFA(ABI)水溶液；B0.09％(v/v)TFA溶于70％(v/v)乙腈(Fisons Scientific)，線性梯度超過60分鐘，0.5μl/min。在214nm和280nm處進(jìn)行紫外檢測。
N-末端測序在ABI 477A蛋白測序儀上進(jìn)行。
快原子轟擊-質(zhì)譜快原子轟擊-質(zhì)譜用M-Scan Limited，Ascot，UK生產(chǎn)的一種VG Autospec進(jìn)行。
肽合成全長的C末端胰酶降解肽LVAASQAA LGL(分子量(mass)1012)由ABI，Warrington，UK合成；截短的LVAASQALG(分子量899)由Nottinghanm大學(xué)生物化學(xué)系，Nottingham美國，合成。
結(jié)果全長的C末端的胰酶酶解的肽(分子量1012)用合成肽作標(biāo)記顯示在反相高效液相色譜37.5分鐘時洗脫。從人血清白蛋和重組人白蛋白收集這一峰并用N末端測序和快原子轟擊-質(zhì)譜鑒定。
去除C末端的亮氨酸獲得用合成標(biāo)記肽確定的顯示在28.5分洗脫的截短的C末端肽(分子量899)。這一洗脫峰從胰酶消化的去亮氨酸的重組人白蛋白分離并用N-末端測序和快原子轟擊-質(zhì)譜鑒定。在這28.5分鐘的洗脫峰中顯示存在兩種其它的肽，AWAVAR(分子量673)和DLGEENFK(分子量950)。
28.5分鐘的洗脫峰從胰酶消化的，人血清白蛋白(HSA)的反相高效液相色譜中收集。HSA貯存在30℃下12周。去除亮氨酸rHA.rHA(本發(fā)明)貯存于4℃下6個月而本發(fā)明的rHA貯存于30℃6個月。
每種消化產(chǎn)物的洗脫峰隨后用N末端測序和快原子轟擊-質(zhì)譜(合成標(biāo)記肽)來分析。
表7用N-末端測序不自定的28.5分鐘峰中存在的肽

用快原子轟擊，存在于28.5分洗脫峰的主信號((M+H)+分子離)如表8所示。
表8在28.5分的吸收峰的離子(M+H)+

在1028和1104的信號可能是碎片的離子；它們不是可通過測序分析檢測的肽。
結(jié)論去除亮氨酸的C末端胰酶消化肽在商品化人血清白蛋白檢測到約5-10％(不定量)，但在本發(fā)明的重線人白蛋白中，即使30℃保存6個月也不能檢測到。去除亮氨酸的肽不能在30℃貯存12周的人血清白蛋白中檢測到，全長C末端肽在37.5分鐘的洗脫峰(盡管未分離)與其它樣品相比非常弱，顯示可能正處于進(jìn)一步的C末端降解。
這些結(jié)果顯示，按本發(fā)明純化的重組人白蛋白有穩(wěn)定和全長的羧基末端，而以前商業(yè)來源提供的人血清白蛋白相比則顯示出異質(zhì)性。
純化的人白蛋白中自由巰基的比色分析導(dǎo)言-Ellmani’s試劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸(DTNB)是一種檢測自由巰基如Cys-SH的特異的和靈敏的方法。反應(yīng)可用在412mm處的光吸收跟蹤監(jiān)測，其數(shù)值可用于計算自由Cys-SH，其可達(dá)到每分子重組人白蛋白少于1個殘基水平的。檢測中所用的溶液試劑如下5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸DTNB，Sigma產(chǎn)品，編號D8130TRIS預(yù)配的pH晶體pH 8.0，Sigma產(chǎn)品，編號T4753EDTA，二鈉，Sigma產(chǎn)品，編號ED2SS二水磷酸二氫鈉，分析級二水磷酸氫二鈉，分析級緩沖液10.1M(12.1g)Tris-HCl；0.01M(3.72g)EDTA Na2.2H2O，pH8.0、預(yù)配的pH晶體。溶于500ml水并定容至正好一升體積。室溫下穩(wěn)定1個月。
緩沖液2.05M磷酸鈉pH 7.0，二水磷酸氫三鈉(5.45g)3.04g二水磷酸二氫鈉。溶于500ml水，并定容至正好一升體積。室溫穩(wěn)定一個月。
試劑0.01M(39.4mg)DNTP在磷酸緩沖液中。在10ml緩沖液2中溶解。每日新鮮配制。
樣品白蛋白用緩沖液1稀釋至約10.3μmM(0.66g/ml)。
步驟1)將分光光度室的溫度設(shè)為25℃。2)分別在樣品和對照位置上放入加入1.25ml樣品的比色杯和另一加入緩沖液11.25ml的10mm的體積減小的比色杯。3)在412nm調(diào)零。設(shè)置吸收度至0.1AU滿值。4)在對照比色杯中加入50μl DTNB試劑，并用干凈的塑料攪棒輕微混和。5)在樣品杯中加入50μl DTNB試劑，如上混和。6)立即開始讀取數(shù)據(jù)(或打開繪圖記錄儀，隨后反應(yīng)持續(xù)10分鐘以上)。7)重復(fù)每一樣品，以得到三個重復(fù)的值。8)從穩(wěn)定的吸收衰減外推至零時，并在412nm讀出吸收值(δA412)(圖1)9)用分子消光系數(shù)∈412^＝13.9cm2mM-1計算巰基的含量。
結(jié)果大量的商品化的人血清蛋白樣品用于檢測自由巰基含量，結(jié)果歸納如下人血清白蛋白自由巰基(mole SH/mol HSA)10.2920.2230.3540.0550.0860.4670.36這些值比按前述實(shí)施例制備的，常規(guī)檢測為0.85-0.9mol SH/mol rHA的白蛋白的值明顯較低。
用石墨熔爐分光鏡(graphite furnace spectroscopy)檢測人白蛋白中的金屬離子雜質(zhì)。
標(biāo)準(zhǔn)品和樣品用高溫包被的石墨管中的原子霧化。用下列條件檢測樣品的原子吸收。

鋁的測定采用Perkin Elmel M2100原子吸收分光光度計，Perkin ElmerHGA-700石墨爐，有樣品杯和鋁管陽性燈Perkin Elmer AS-70自動進(jìn)樣器。試劑為分析純級的硝酸鎂，一種鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000ppm)和分析純級濃硝酸。1.00％w/v硝酸溶液用milli-Q水配制。在自動進(jìn)樣器中注入15μl鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液并以0.20％硝酸溶液稀釋至1500μl。用15μl得到的溶液，然后再用得到的150μl溶液重復(fù)該步驟，以得到10ppb(μg/l)鋁溶液。
白蛋白樣品以0.20％硝酸溶液稀釋使得到一在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的鋁濃度。通常1∶2稀釋是足夠的。
鎂的測定類似使用Perkin Elmer AS-51閃爍自動加樣器和鎂空心陽極燈。1000ppm的鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液用Milli-Q水稀釋得到0.1，0.2，0.5和1.0ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在28.5nm處檢測樣品的原子光吸收。
銅、鐵、錳和鋅用同鋁一樣的方法測定，除了鋅用1.0ppb(μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液代替10ppb的溶液。金屬離子的濃度以ng/L確定，并與白蛋白的濃度相關(guān)(ng金屬離子/g白蛋白)。這些資料列于表9。
表9按本發(fā)明制備的白蛋白的雜質(zhì)分布濃度(ng/g白蛋白)

所有結(jié)果以總金屬離子濃度表示。
表10顯示商品化人血清白蛋白中相應(yīng)的金屬離子水平。
表10以ng金屬/白蛋白克數(shù)計的濃度

可見本發(fā)明的產(chǎn)品中鋁的平均水平約為60ng/g而商品化的含155-3190ng/g。同樣，本發(fā)明的產(chǎn)品含有平均約948ng/g的鐵(比較現(xiàn)有技術(shù)的材料1850-41，200ng/g)，平均2，990ng/g的銅(比較現(xiàn)有技術(shù)的材料580-23，840ng/g)，平均1120ng/g的鎂(比較現(xiàn)有技術(shù)的材料500-54，000ng/g)，平均2390ng/g的鋅(比較現(xiàn)有技術(shù)的材料930-7230ng/g)和平均48ng/g的錳(比較現(xiàn)有技術(shù)的材料65至940ng/g)。
培養(yǎng)基和長鏈脂肪酸的分析。
根據(jù)本發(fā)明所得的白蛋白和商品化的人血清白蛋白的脂肪酸的特征通過用酸性溶劑提取和以C170為內(nèi)對照標(biāo)準(zhǔn)的游離脂肪酸的氣相色譜分析。裝置帶火焰離子檢測器的氣相色譜(如Shimadzu GC9A)；自動進(jìn)樣器(如Shimadzu AOC 14)；綜合儀/打印機(jī)(如Shimadzu(R4A)；HP-FFA 30×0.53mm，1.0μM相層析柱(Hewlett Packard Ltd)；帶有直接注射套筒的Megabore安裝工具盒(用于GcaA的J & W Scientigic 220-1150.)。
試劑水(Milli-Q)；二氯甲烷超純?nèi)芤?Romil Chemicals.Lougbborongh，Leics)；分析純的三水乙酸鈉(BDH Ltd.Poole)；分析純冰乙酸(BDH Ltd.Poole)；人血清白蛋白溶液(ZenalbTM20，Bio ProduceTs Laboratory，Elstree，Herts)；無水硫酸鈉(分析級)；Sigma的標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸。
溶液0.5M乙酸鈉緩沖液pH 4.5每100ml中乙酸鈉6.13g，乙酸3.30g。游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)混和物。在不同的玻璃試管中，分別稱取各種脂肪酸5mg。溶解每種脂肪酸于1ml二氯甲烷中，并分別按短鏈脂肪酸(C6-C14)，中等長度鏈脂肪酸(C16-C18)和長鏈脂肪酸(C20-C221)轉(zhuǎn)移至3個12ml的Pyrex培養(yǎng)管中。在氮?dú)饬髦懈稍锘旌臀锊⒂?ml二氯甲烷溶解。將50μl量的混和物轉(zhuǎn)入標(biāo)記的玻璃管，氮?dú)庵懈稍铮饪诓①A存在-20℃。
內(nèi)對照標(biāo)準(zhǔn)溶液1mg/ml十七酸(25.0mg十七酸/25ml二氯甲烷)。
步驟1.加50μl內(nèi)對照標(biāo)準(zhǔn)溶液于標(biāo)為6的40ml的Pyrex管。
2. 5％的重組人白蛋白加5ml樣品。25％重組人白蛋白用1ml樣品和4ml水。包括一個空白(5ml水)和血清白蛋白樣(1.25ml Zenalb TM20和3.75ml水)。所有的樣準(zhǔn)備兩份。
3.所有管中加入2.5ml乙酸鈉緩沖液，然后10ml二氯甲烷。
4.蓋好蓋的管置于機(jī)械轉(zhuǎn)床上室溫2小時。
5. 20℃，Sorvall RT 6000B離心機(jī)中以3000rpm將所有管離心5分鐘。
6.棄去上層水相，從管底小心轉(zhuǎn)移下層二氯甲烷相至標(biāo)記的12ml.Pyrex管。蛋白?？赡軙恋K二氯甲烷相的轉(zhuǎn)移。若出現(xiàn)這種情況加入一滿匙的無水硫酸鈉，蓋上蓋并震蕩。
7.在氮?dú)饬髦懈稍锒燃淄橄?，并存?20℃的氮?dú)庵兄钡椒治觥?br> 8.安裝毛細(xì)管柱，按操作指南設(shè)置氣相色譜的下列條件檢測器火焰離子分光光度計；負(fù)載氣體30ml min-1的氮?dú)?；注射體積0.5μl；柱起始溫度70℃；維持時間1.5分鐘；梯度120℃min-1至150℃；梯度24℃min-1至240℃；維持7分鐘；檢測器溫度280℃；Shimadzu GC9A的特殊設(shè)置為檢測器范圍10℃；水壓0.5kg/cm2；氣壓0.5kg/cm2；中心時間50分鐘。
9.打開綜合儀(integrator)按操作指南從氣相色譜中記錄數(shù)據(jù)。
10.使烤箱升溫至245℃，直至獲得穩(wěn)定的基線。
11.降低烤箱溫度至70℃并讓其平衡。
12.熔化一定量的長鏈、中等長鏈和短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品。將長鏈脂肪酸溶于1ml二氯甲烷中。將溶液轉(zhuǎn)入中等長鏈脂肪酸使之溶解。重復(fù)操作處理短鏈脂肪酸。
13.注入標(biāo)準(zhǔn)品混和物以確定脂肪酸存留時間。得到的色譜圖應(yīng)幾乎沒有峰拖尾現(xiàn)象，而存在平滑地緩慢上升的基線伴以適當(dāng)數(shù)量明顯的峰。己酸(C60)應(yīng)在滯留約6分鐘后洗脫，而順芥子酸(C221)的滯留時間約33分鐘。通過比較標(biāo)準(zhǔn)品樣的色譜圖可確定所有的峰。
14.注入樣品并記錄數(shù)據(jù)。
計算1.從空白樣品確定內(nèi)對照標(biāo)準(zhǔn)的峰。這將是滯留時間約23.5分鐘的主要的峰。
2.用下列公式計算所有樣品的所有整合峰的峰面積比率。
3.通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較確定基于滯留時間的重組人白蛋白和人血清白蛋白樣品中的脂肪酸吸收峰。
4.使用下列用于將重組人白蛋白和人血清白蛋白樣品所有峰面積率轉(zhuǎn)換成大致的濃度(μg/g白蛋白)。
濃度(μg/g)＝峰面積率×2005.用脂肪酸分子量和下列公式將確定為脂肪酸的峰從μg/g白蛋白的濃度轉(zhuǎn)換成mole/mole白蛋白。
實(shí)施例的結(jié)果顯示一批按實(shí)施例2制備的白蛋白(圖4)和商品化的人血清白蛋白(圖5)。盡管兩批蛋白的特征顯示明顯的區(qū)別，但無異常的脂肪酸在前者中被檢測到。正如預(yù)料的，二者都顯示大量加入的穩(wěn)定劑，辛酸鹽(C80)。除此之外，商品化的人血清白蛋白明顯特異含有C160，C161，C180，C181和C182而本發(fā)明的白蛋白主要含有C100，C120，C161并偶爾有C140。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，重組人白蛋白最后產(chǎn)品中的C100和C120的水平與用于純化過程后期的辛酸鹽中的這些雜質(zhì)的水平是一致的。
按實(shí)施例7生產(chǎn)的重組人白蛋白的數(shù)據(jù)如下表11按本發(fā)明方法純化的重組人白蛋白手商品化人血清白蛋白脂肪酸組成的比較

ND＝未檢測優(yōu)選地，總的C18脂肪酸的水平不超過辛酸基水平的1.0％(mole/mole)，優(yōu)選為不超過0.5％。而且，在本發(fā)明的白蛋白中，C182，C183和C20脂肪酸的水平通常檢測不到。在商品化的人血清白蛋白中，通常每摩爾白蛋白中有0.4摩爾C10和C20脂肪酸。在本發(fā)明的產(chǎn)品中，通常沒有可檢測到的C20脂肪酸且每摩爾白蛋白中只有約0.01和0.02摩爾的C18脂肪酸。顯色分析-5％(w/v)的最終產(chǎn)品的溶液在1cm的比色杯中，測定在350nm，403nm和500nm的光吸收并按每克白蛋白吸收值/升每厘米光程(即AL.·g-1·cm-1)計算。本發(fā)明的白蛋白的值如下波長平均吸收值(n＝10批)(nm) (L·g-1·cm-1)350 4.74×10-1403 2.12×10-1500 0.58×10-1總的說來，本發(fā)明的白蛋白在所說的三個波長下各自的吸收值不會超過6.0×10-3，2.5×103和0.75×10-3。
分析大量的商品化的人血清白蛋白制劑顯示在這些波長下有較高的吸收值(見表12)。
表12現(xiàn)有技術(shù)人血清白蛋白制劑的吸收值

SDS還原的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行這種分析是顯示重組人白蛋白是由當(dāng)用一種還原劑(β-巰基乙醇)處理時在SDS還原的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上以一條帶(單體)遷移的單一多肽鏈組成。
白蛋白樣品在SDS還原緩沖液(含有2mM乙二銨四乙酸，5％(w/v)SDS和10(v/v)β巰基乙醇的20mMTris-HCl，pH 8.0)中達(dá)1mg/ml，煮沸，然后上樣1μl的溶液用SDS均勻的(12.5％)快速膠(Phastgels)(Pharmacia)分離。蛋白帶用考馬斯亮藍(lán)R250染色，在Shimadzu CS9000光密度儀中掃描檢測。白蛋白的分離顯示一單一的考馬斯染色帶表明以單體存在的白蛋白組分至少99.9％。
凝膠滲透高壓液相色譜本發(fā)明方法中主要的實(shí)施方案(即陰離子交換步驟是超濾和制劑之前的最后步驟)中，將從陰離交換基質(zhì)洗脫的濃度為10mg/ml的白蛋白溶液25μl注入Shimadzu LC6A高效液相色譜的TSK3000SWXL柱中。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品為至少99.9％的單體。
已配制成25％w/v的根據(jù)本發(fā)明純化的第二個10mg/ml的白蛋白25μl以同樣的方式分析，發(fā)現(xiàn)含有的多聚白蛋白低于0.1％。這一結(jié)果表明這里所述的制劑對純化的白蛋白的多聚體/聚合體含量無影響。
雙向凝膠電泳將2μg用本發(fā)明的方法制備的重組人白蛋白用Millipore研究系統(tǒng)進(jìn)行雙向凝膠電泳。第一向分離是PH3-10的等電聚焦凝膠，然后，用10％聚丙烯酰胺/SDS進(jìn)行第二向電泳。在考馬斯亮染色的凝膠中，只可見一個點(diǎn)，表明只存在一種蛋白。
電子發(fā)射質(zhì)譜電子發(fā)射質(zhì)譜是用VG Quatto電子發(fā)射質(zhì)譜儀完成的，用馬心肌球蛋白(16951Da，購自Sigma)校準(zhǔn)m/2范圍超過950-1750Da/e。商品化的人血清白蛋白樣品和按本發(fā)明純化的重組人白蛋白樣品在分析之前通過采用含梯度三氟乙酸的乙腈的反相高效液相色譜脫鹽。圖6a和b分別顯示本發(fā)明的白蛋白和現(xiàn)有技術(shù)的人血清白蛋白的質(zhì)譜圖。后者顯示存在斷裂的自由巰基和N末端降解。
本發(fā)明的白蛋白在本測試中可見是完全均一的，換句話說它只顯示單一明顯的峰，出現(xiàn)在質(zhì)量約為66441Da處。
長期穩(wěn)定性用電泳方法檢測發(fā)現(xiàn)在兩年內(nèi)沒有白蛋白的降解，顯示不存在蛋白酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種純化白蛋白溶液的方法，包括將該溶液與一種相反離子溶液接觸以從白蛋白中將銨離子置換出并能從溶液中去除的步驟。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其將相反離子溶液加入到白蛋白溶液并通過透析去除銨離子。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中相反離子溶液通過半透膜從白蛋白溶液中分離，并通過透濾去除銨離子。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中銨離子通過凝膠滲透層析從溶液中去除。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一條所述的方法，其中的相反離子溶液是含有鈉離子的溶液。
6.一種純化白蛋白溶液的方法，該方法包含在一種含有銨離子的緩沖液中將該溶液與層析材料接觸，通過根據(jù)權(quán)利要求32與36中任一條所述的方法隨后去除銨離子以獲得純化的白蛋白產(chǎn)品，這也可任選在進(jìn)一步純化或制劑步驟之后。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中層析材料包含固相化的硼酸根離子。
8.一種純化含有由特定分泌白蛋白的微生物產(chǎn)生的約45KD的白蛋白片段(1-403至1-409)的白蛋白溶液的方法，該方法包含將白蛋白溶液與對白蛋白有特異親和性的固相化染料接觸，并在洗脫白蛋白時將45KD的片段留在染料上的步驟。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中的染料是固相化的、白蛋白特異的染料。
全文摘要
提供一種制備含極低水平或基本去除色素金屬離子，人源蛋白，宿主蛋白，白蛋白片斷，白蛋白多聚體或聚合體和病毒，而且基本無糖基化，較高程度的巰基并帶有一完整的羧基末端的白蛋白的技術(shù)。該技術(shù)包括將白蛋白(優(yōu)選地是轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)和分泌的)通過陽型陽離子交換層析然后再通過陽型陰離子交換層析。也可能采用其它的步驟，如超濾，凝膠滲透層析，結(jié)合白蛋白的親和層析(如使用藍(lán)染料)和結(jié)合雜質(zhì)的親和層析(如使用一種氨基苯基硼酸樹脂)。還公開了采用一種與白蛋白有親和力的化合物，從一種與白蛋白有非特異親和力的物質(zhì)上洗脫白蛋白，如同用相反的離子去除銨離子的方法。
文檔編號A61P17/02GK1550504SQ0312774
公開日2004年12月1日 申請日期1996年2月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月25日
發(fā)明者安德魯·R·古迪, 達(dá)雷爾·斯利普, 亨德里克·范厄克, 斯蒂芬·貝雷曾科, 約翰·R·伍德羅, 理查德·A·約翰遜, 帕特里夏·C·伍德, 斯蒂芬·J·伯頓, 艾倫·V·夸克, A 約翰遜, J 伯頓, 斯利普, 貝雷曾科, R 伍德羅, V 夸克, 克 范厄克, 夏 C 伍德, 安德魯 R 古迪 申請人:達(dá)爾塔生物技術(shù)有限公司