專利名稱：用于腎移植排斥反應(yīng)血清多肽檢測(cè)方法
用于腎移植排斥反應(yīng)血清多肽檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
同種異體腎移植術(shù)是大多數(shù)終末期腎臟病人的首選治療方案。隨著外科手術(shù)和免 疫抑制療法的發(fā)展進(jìn)步，接受移植手術(shù)后存活超過(guò)一年的病人存活率已大于90%，但在移 植后早期發(fā)生的移植物功能障礙仍是臨床上亟待解決的難題之一，需要與當(dāng)前的處置排斥 反應(yīng)的治療手段相結(jié)合進(jìn)行有效的早期監(jiān)測(cè)。目前，國(guó)際唯一公認(rèn)的確診腎移植排斥反應(yīng) 的方法是移植腎活組織檢查，該方法花費(fèi)較高、操作不便，會(huì)給病人造成創(chuàng)傷、引起疼痛，同 時(shí)還會(huì)引發(fā)如出血、感染、移植物失功等一系列并發(fā)癥。一些報(bào)道還指出該監(jiān)測(cè)手段并不能 反映移植腎早期的變化，原因是腎功能并不總是與組織學(xué)的好轉(zhuǎn)相關(guān)聯(lián)。因此，急需開發(fā)一 種能夠替代腎活檢的非侵襲性的檢測(cè)方法，以降低因腎活檢引起的并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此 夕卜，應(yīng)用非侵襲性的手段來(lái)評(píng)價(jià)移植腎功能，尋找到一系列新的具有高度敏感性和特異性 的生物標(biāo)記物，可以使更多的移植病人能及早監(jiān)測(cè)到排斥反應(yīng)發(fā)生，便于醫(yī)生采取及時(shí)有 效的治療方案。血清是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域理想的生物學(xué)樣品，因?yàn)樗钜资苋梭w內(nèi)環(huán)境的各種因 素影響，它的獲得是非侵襲性的，能夠進(jìn)行廣泛收集。生物體的血清中約含有超過(guò)10，000 種的差異蛋白和多肽，這些蛋白和多肽來(lái)自機(jī)體各部的組織和細(xì)胞，它們?cè)跀?shù)量和質(zhì)量上 的變化都是特異的，不僅受到疾病對(duì)組織的影響，還受到整個(gè)疾病過(guò)程的影響。血清蛋白主 要由白蛋白、免疫球蛋白、抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白和低豐度蛋白在內(nèi)的總蛋白量構(gòu)成，能指 示人體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜變化情況。在疾病診斷和藥物監(jiān)測(cè)的研究領(lǐng)域，研究者們對(duì)人類和實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物血清蛋白質(zhì)圖譜的研究產(chǎn)生了極大的興趣，各種血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用使 得疾病生物標(biāo)記物的鑒定和藥品安全和治療監(jiān)測(cè)成為現(xiàn)實(shí)。血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)不僅 在疾病診斷和治療監(jiān)測(cè)方面較其他生物分析技術(shù)更具有優(yōu)勢(shì)，而且新的分析技術(shù)應(yīng)用于蛋 白質(zhì)組學(xué)研究為從復(fù)雜的樣品中同步鑒定分析物提供了可能。譬如蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù) 之一質(zhì)譜技術(shù)，就可以讓我們僅用數(shù)微升的血清便可獲得數(shù)以百計(jì)的小型或中等大小的多 肽?；|(zhì)輔助激光角軍吸電離法(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)是一種廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的質(zhì)譜技術(shù)，是公認(rèn)的用來(lái)分析蛋白質(zhì)和多肽的 一種最強(qiáng)大的工具。該技術(shù)引領(lǐng)了蛋白功能研究的革命，改進(jìn)了質(zhì)譜分析的精確度和靈敏 度，使得對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定達(dá)到了前所未有的水平。該技術(shù)已被成功地用來(lái)從生物液 體中發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物，研究蛋白間的相互作用，同時(shí)，MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔 助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)檢測(cè)法在免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景也不容忽 視。通過(guò)采用MALDI-TOF MS法聯(lián)合磁珠純化技術(shù)分離血清樣本，并分析血清多肽的生物學(xué) 信息，獲得移植排斥反應(yīng)患者血清多肽的質(zhì)譜圖，從而評(píng)估從小樣本量中得到的差異性多肽作為檢測(cè)腎移植排斥反應(yīng)的潛在生物標(biāo)記物的價(jià)值，將會(huì)為腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制 及早期診斷提供新的思路和新的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法，以評(píng)估從血 清樣本中得到的差異性多肽作為檢測(cè)腎移植排斥反應(yīng)的潛在生物標(biāo)記物的價(jià)值。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提出以下的技術(shù)方案—種用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法，包含以下步驟Sl將事先收集的血清樣本按病患志愿者腎活組織檢查病理分級(jí)進(jìn)行分類，分為急 性移植腎排斥患者血清組、慢性移植腎排斥患者血清組、穩(wěn)定移植腎功能對(duì)照血清組和健 康對(duì)照血清組；S2采用MB-WCX (弱陽(yáng)離子交換磁珠)從上述血清樣本組中的血清中分別捕獲多肽 并濃縮在磁珠上形成結(jié)合分子；S3從磁珠上洗脫結(jié)合分子并進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜分析，將各個(gè)組別的樣本測(cè)量出 的差異多肽峰進(jìn)行分類，建立分類預(yù)測(cè)模型，獲得差異多肽表達(dá)圖譜；S4將待檢測(cè)的腎移植排斥反應(yīng)患者的血清樣本采用MB-WCX結(jié)合后，進(jìn)行 MALDI-T0F質(zhì)譜分析，并將分析結(jié)果與S3中獲得的圖譜進(jìn)行比較，標(biāo)定該血清樣本的多肽。本發(fā)明所提供的用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法中，所述步驟S2中 MB-WCX結(jié)合的方法是S2-1渦旋混勻磁珠，獲得均勻的磁珠混懸液；S2-2將WCX磁珠混懸液轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)EP管中，吸打混勻；S2-3向EP管加入樣本血清，吸打混勻； S2-4將EP管放置在磁珠分離器中，反復(fù)分離三次，收集貼在管壁的磁珠，并用移液管移去上清液，待用。本發(fā)明所提供的用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法中，所述步驟S3中從 磁珠上洗脫結(jié)合分子的步驟包括1)向EP管加入磁珠洗液，在磁珠分離器中反復(fù)分離，收集管壁上的磁珠，并移去 上清液；2)向EP管加入WCX磁珠洗脫液，并用反復(fù)吸打，洗滌管壁上的磁珠；3)收集管壁上的磁珠和上清液，轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，并加入WCX磁珠固定液，吸打 混勻，待用。本發(fā)明所提供的用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法中，所述步驟S3中 MALDI-T0F質(zhì)譜分析的參數(shù)為m/z :1，000-10, 000，每一個(gè)質(zhì)譜設(shè)置800個(gè)激光點(diǎn)，在50Hz 頻率下將每50個(gè)激光點(diǎn)作為一個(gè)組合，并定位在不同的位點(diǎn)表面。本發(fā)明所提供的用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法中，所述步驟S3中對(duì) 差異多肽峰進(jìn)行分類前，還需要先對(duì)各組別樣品的原始譜圖進(jìn)行處理，包括基線消減，并進(jìn) 行校正和歸一化，再對(duì)多肽峰數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。從以上技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所提供的用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè) 方法檢測(cè)出了有價(jià)值的差異性多肽，獲得了可作為診斷腎移植排斥反應(yīng)的潛在生物標(biāo)記物，建立了有效區(qū)分移植排斥反應(yīng)的診斷預(yù)測(cè)模型，有助于從蛋白質(zhì)組學(xué)的層面更好地理解腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)理，為對(duì)腎移植排斥反應(yīng)做出早期診斷提供了可能。

圖1所示是本發(fā)明實(shí)施例中MB-WCX純化后各實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)譜圖；圖2所示是本發(fā)明實(shí)施例中四個(gè)組別的單個(gè)樣本重復(fù)四次的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施方式1、材料和方法1. 1樣本資料樣本血清的收集都來(lái)自空腹抽取志愿者，22位腎移植志愿者為經(jīng)腎活檢證明發(fā)生 了排斥反應(yīng)的患病志愿者、12例移植術(shù)后腎功能穩(wěn)定患病志愿者、13例門診體檢正常的志 愿者全血3ml置于生化管，4°C靜置Ih后，3000r/min離心5min，取上清冰浴，每20 μ 1裝一 份，-80°C保存。排斥患者腎活檢樣本按照BanfT97分類法進(jìn)行分類，其中有10例確診為急性排斥 反應(yīng)，12例確診為慢性排斥反應(yīng)。12例慢性移植性腎病約在移植術(shù)后1. 0 5. 5年內(nèi)發(fā) 生，10例急性排斥約在移植術(shù)后1. 0 90. 0天內(nèi)發(fā)生，并且都在用免疫抑制劑之前進(jìn)行腎 活檢。另有12例年齡匹配的移植功能穩(wěn)定患病志愿者設(shè)置為對(duì)照組，13例健康人設(shè)置為健 康對(duì)照組。1. 2移植腎活組織檢杳樣本腎活檢樣本嚴(yán)格按照BanfT97分類法進(jìn)行分類，10例急排和12例慢排病人的組織 標(biāo)本經(jīng)免疫組化顯微鏡檢查法進(jìn)行檢測(cè)和確認(rèn)。1. 3運(yùn)用弱陽(yáng)離子磁珠結(jié)合血清蛋白采用弱陽(yáng)離子交換磁珠MB-WCX (Bruker Daltonics, Ettlingen, Germany)結(jié)合樣 本的血清蛋白。①渦旋混勻磁珠lmin，獲得均一的磁珠混懸液；②將10 μ IWCX磁珠混懸液 轉(zhuǎn)移到0. 5ml的標(biāo)準(zhǔn)EP管中，用吸液槍吸打混勻；③向EP管加入每例樣本的血清各5 μ 1， 吸打混勻；④將EP管放置在磁珠分離器中，反復(fù)分離三次，Imin后收集貼管壁的磁珠；⑤用 移液管小心地移去上清液；⑥向EP管加入100 μ 1的磁珠洗液，在磁珠分離器中反復(fù)分離十 次，收集管壁上的磁珠，用吸液槍小心移去上清液，重復(fù)步驟六兩次；⑦向EP管加入5μ 1的 WCX磁珠洗脫液，并用移液槍反復(fù)吸打，洗滌管壁上的磁珠；⑧2min后收集管壁上的磁珠和 上清液，轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，并加入4 μ IffCX磁珠固定液，吸打混勻，預(yù)備在MALDI-TOF MS 上點(diǎn)樣并進(jìn)行質(zhì)譜分析。1. 4MALDI-T0F 質(zhì)譜分析質(zhì)譜在ClinProt系統(tǒng)下執(zhí)行，血清多肽的數(shù)據(jù)分析由Autofiex MALDI-T0F/T0F 質(zhì)譜(Bruker Daltonik, Bremen, Germany)完成。設(shè)備包括 355-nm Nd-YAG 激光、網(wǎng)格離 子源、延遲提取電子設(shè)備(DE)、高分辨率的同步離子選擇器(TIS)、2-GHz數(shù)字轉(zhuǎn)換器。質(zhì) 譜設(shè)置在m/z 1，000-10, 000的最佳化狀態(tài)，每一個(gè)質(zhì)譜有800個(gè)激光點(diǎn)，在50_Hz頻率下 把每50個(gè)激光點(diǎn)作為一個(gè)組合，可得到16個(gè)組合，并定位在不同的位點(diǎn)表面。所得譜圖均 由flexAnalysis軟件(Bruker Daltonik)自動(dòng)獲得，設(shè)置關(guān)鍵儀器模糊調(diào)節(jié)控制程序，以產(chǎn)生最佳品質(zhì)的原始數(shù)據(jù)。1. 5統(tǒng)斤腎移棺的差異蛋白表汰譜應(yīng)用ClinProTools 2. 2軟件(Bruker，Daltonik)分析所有從血清樣本中得到的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的數(shù)據(jù)之前，應(yīng)對(duì)樣品原始譜圖進(jìn)行處理，包括基線消減，并進(jìn)行校正 和歸一化。隨后，選擇軟件內(nèi)嵌的統(tǒng)計(jì)算法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得移植排斥組的差異表達(dá)蛋 白質(zhì)。顯著的差異多肽峰由軟件中的Welch' s T檢驗(yàn)確定，分類預(yù)測(cè)模型由快速分類算 法(Quick Classifier Algorithm, QC)建立。為了解分類預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用分類預(yù)測(cè)算 法隨機(jī)挑選一個(gè)樣本作為實(shí)驗(yàn)樣本，其余樣本作為驗(yàn)證樣本對(duì)建立的模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證。2、結(jié)果為了分析全部樣本的血清蛋白生物學(xué)信息，本實(shí)施例成功地使用MB-WCX試劑盒 對(duì)血清蛋白進(jìn)行富集和純化(結(jié)果如圖1所示，圖1所示的A到C是47例樣本經(jīng)WCX磁 珠純化后的分析圖譜；A中是13例正常人、12例移植功能穩(wěn)定患者、10例急排反應(yīng)患者的 聯(lián)合分析圖譜；B中是13例正常人、12例移植功能穩(wěn)定患者、12例慢排反應(yīng)患者的聯(lián)合分 析圖譜；C中是12例慢排反應(yīng)患者、10例急排反應(yīng)患者的聯(lián)合分析圖譜。純化后的樣品經(jīng) MALDI-T0F質(zhì)譜上樣后由ClinProTools軟件分析生物學(xué)信息。圖中的(N)代表健康對(duì)照組， (S)代表移植功能穩(wěn)定組，(A)代表急排組，(C)代表慢排組，每個(gè)血清樣本的生物學(xué)信息由 密度曲線表示。X軸，分子質(zhì)量(m/z) ；y軸，特定的樣本；水平線表示將健康對(duì)照組、移植功 能穩(wěn)定組、急排組、慢排組的樣本區(qū)分開來(lái)。4組沿X軸所展示的密度差異代表將樣本顯著 區(qū)分開的特異性多肽。樣本經(jīng)MALDI-T0F MS獲得高分辨率的圖譜，并經(jīng)ClinPro Tools軟 件2. 2分析，經(jīng)由組間的密度差異顯著區(qū)分各個(gè)樣本的差異性多肽。通過(guò)比較急排組和健康對(duì)照組的質(zhì)譜圖，篩選出18個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰作為 鑒別急排反應(yīng)的潛在生物標(biāo)記，各個(gè)峰m/z分別為2102. 53，2756. 02，2919. 75,2991.01, 3095. 5, 3884. 65,4056. 31,4093. 64,4212. 62,4251. 74,4647. 07,4894. 62,4919. 21, 5739. 17，5799. 75，5812. 07，5826. 5，7968. 44 ；其中 8 個(gè)在急排組高表達(dá)，分別是 m/z 2756. 02,2919. 75,4894. 62,4919. 21,5739. 17,5799. 75,5812. 07,5826. 5。在急排組和移植 功能穩(wěn)定組的比較中，篩選出m/z為2079. 24，2090. 9，3229. 03，5344. 85共4個(gè)有表達(dá)差異 的多肽峰，這4個(gè)多肽峰在急排組低表達(dá)，可作為鑒別急排反應(yīng)的潛在生物標(biāo)記。(見(jiàn)下表 1)表1排斥組和對(duì)照組有顯著差異的多肽峰 Mass 質(zhì)荷比；Dave 組間最大和最小的峰平均值之間的差；PTTA =Wilcoxon或 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)的P值；PAD Anderson-darling正態(tài)檢驗(yàn)的P值；Ave，組間峰差的算 術(shù)平均值。在慢排組和健康對(duì)照組的比較中，篩選6個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰，分別是m/z 2023.77,2043.16,2756. 71,2869. 99,3180. 95,5900. 5，其中 m/z 為 2023.77 和 2043.16 的多肽峰在慢排組低表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)比較慢排組和移植功能穩(wěn)定組多肽差異，發(fā)現(xiàn)有 16 個(gè)存在表達(dá)差異的多肽峰，分別是 m/z 2079. 01,2090. 81,2540. 69,2850. 09,2919. 88， 2939. 63,2946. 84,5329. 97,5383. 73,5951. 77,5992. 85,6043. 93,6382. 12,7835. 65， 7876. 8，9291. 89，其中 m/z 為 6382. 12，7835. 65，7876. 8 和 9291. 89 的多肽峰在慢排組高表 達(dá)。(見(jiàn)表1)比較分析急排組和慢排組的多肽差異，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)存在表達(dá)差異的多肽峰，分 別是 m/z 1433. 88，1676. 36，3180. 75,4255. 83,4359. 83,4806. 47，其中 m/z 為 1433. 88， 1676. 36，4359. 83,4806. 47的4個(gè)多肽峰在急排組高表達(dá)，將急排組與慢排組顯著區(qū)分開 來(lái)，結(jié)果如表1所示。急排組、移植功能穩(wěn)定組和健康組的比較中，篩選了 m/z為2043. 35,2647. 74， 2919. 88，2939. 82，3228. 91,8690. 67共6個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰；慢排組、移植功能穩(wěn)定 組和健康組的比較中，篩選了 m/z 為 2043. 05,2647. 56，2850，2868. 63,2919. 98,2939. 72， 3083. 95，3180. 71，3228. 98共9個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰。另外，通過(guò)比較移植功能穩(wěn)定組和 健康組的多肽差異，也篩選出了 7個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰，分別是m/z 2043. 58,2647. 37, 2917. 8，2939. 68，3180. 59，3228. 96，5899. 34，結(jié)果如表 1 所示。本實(shí)施例采用ClinPro Tools 2. 2軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用QC算 法對(duì)樣本進(jìn)行分類以及建立診斷預(yù)測(cè)模型。該模型對(duì)于區(qū)分急排組和移植功能穩(wěn)定組的 識(shí)別率為90. 28%，交叉驗(yàn)證能力為83. 83% ；對(duì)區(qū)分急排組和健康組的識(shí)別率為82. 64%, 交叉驗(yàn)證能力為77. 03%。建立的診斷模型對(duì)區(qū)分慢排組和移植功能穩(wěn)定組的識(shí)別率為87. 85%，交叉驗(yàn)證能力為86. 50% ；對(duì)區(qū)分慢排組和健康組的識(shí)別率為98. 96%，交叉 驗(yàn)證能力為97. 58% ；模型對(duì)區(qū)分急排組和慢排組的識(shí)別率為88. 69%，交叉驗(yàn)證能力為 84. 00%。3、結(jié)論 本發(fā)明采用了一種簡(jiǎn)便、高效的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)MB-WCX純化聯(lián)合MALDI-T0F質(zhì)譜 分析作為鑒定新的生物標(biāo)記物的方法。經(jīng)過(guò)MB-WCX純化，組間峰值差異顯著，組內(nèi)多肽峰 則保持一致(見(jiàn)圖2，A(急排組)、C(慢排組)、S(移植功能穩(wěn)定組)、N(健康對(duì)照組)四 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的單個(gè)樣本重復(fù)四次的質(zhì)譜圖，表明經(jīng)WCX磁珠純化后樣品重復(fù)性好。)。在本實(shí)施例中，把血清樣本分為4組，包括急排組10例、慢排組12例、移植功能穩(wěn) 定組12例、健康組13例，并比較了各組間的多肽差異。移植排斥反應(yīng)是移植術(shù)后發(fā)生的一種復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，臨床上的腎移植排斥反 應(yīng)是各種免疫因素共同作用的結(jié)果，而特異性的免疫反應(yīng)又是排斥發(fā)生的關(guān)鍵。另外，各種 并發(fā)癥如糖尿病、高血壓、心血管疾病、感染及惡性腫瘤等危險(xiǎn)因子也是直接或間接影響移 植病人移植腎排斥反應(yīng)、移植腎失功以及存活的主要原因。通過(guò)健康對(duì)照組和移植各組的比較，篩選出18個(gè)有表達(dá)差異的可用于鑒別急排 組和健康組的多肽峰，其中的8個(gè)在急排組高表達(dá)；篩選出的6個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰可用 于鑒別慢排組和健康組，其中有2個(gè)在慢排組低表達(dá)；7個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰可用于鑒別 移植功能穩(wěn)定組和健康組。上述結(jié)果表明，移植病人的血清多肽生物學(xué)信息與健康人相比 存在顯著差異。在急排組與慢排組的比較中，篩選6個(gè)有表達(dá)差異的多肽峰，4個(gè)在急排組 高表達(dá)。另外，在多個(gè)組的比較中，也獲得了有顯著差異的多肽峰，表明本實(shí)施例的4組血 清樣本的生物學(xué)信息存在顯著差異。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法，其特征在于，包含以下步驟S1將事先收集的血清樣本按病患志愿者腎活組織檢查病理分級(jí)進(jìn)行分類，分為急性移植腎排斥患者血清組、慢性移植腎排斥患者血清組、穩(wěn)定移植腎功能對(duì)照血清組和健康對(duì)照血清組；S2采用MB-WCX從上述血清樣本組中的血清中分別捕獲多肽并濃縮在磁珠上形成結(jié)合分子；S3從磁珠上洗脫結(jié)合分子并進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，將各個(gè)組別的樣本測(cè)量出的差異多肽峰進(jìn)行分類，建立分類預(yù)測(cè)模型，獲得差異多肽表達(dá)圖譜；S4將待檢測(cè)的腎移植排斥反應(yīng)患者的血清樣本采用MB-WCX結(jié)合后，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，并將分析結(jié)果與S3中獲得的圖譜進(jìn)行比較，標(biāo)定該血清樣本的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S2中MB-WCX結(jié)合的方法是S2-1渦旋混勻磁珠，獲得均勻的磁珠混懸液；S2-2將WCX磁珠混懸液轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)EP管中，吸打混勻；S2-3向EP管加入樣本血清，吸打混勻；S2-4將EP管放置在磁珠分離器中，反復(fù)分離三次，收集貼在管壁的磁珠，并用移液管 移去上清液，待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S3中從磁珠上洗脫結(jié)合分 子的步驟包括1)向EP管加入磁珠洗液，在磁珠分離器中反復(fù)分離，收集管壁上的磁珠，并移去上清液；2)向EP管加入WCX磁珠洗脫液，并用反復(fù)吸打，洗滌管壁上的磁珠；3)收集管壁上的磁珠和上清液，轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，并加入WCX磁珠固定液，吸打混 勻，待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S3中MALDI-TOF質(zhì)譜 分析的參數(shù)為m/z 1, 000-10，000，每一個(gè)質(zhì)譜設(shè)置800個(gè)激光點(diǎn)，在50Hz頻率下將每50 個(gè)激光點(diǎn)作為一個(gè)組合，并定位在不同的位點(diǎn)表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S3中對(duì)差異多肽峰進(jìn)行分 類前，還需要先對(duì)各組別樣品的原始譜圖進(jìn)行處理，包括基線消減，并進(jìn)行校正和歸一化， 再對(duì)多肽峰數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
全文摘要
一種用于腎移植排斥反應(yīng)的血清多肽檢測(cè)方法，包含步驟S1、將事先收集的血清樣本按供體病患程度進(jìn)行分類；S2、采用MB-WCX從血清樣本組中的血清中分別捕獲多肽并濃縮在磁珠上形成結(jié)合分子；S3、從磁珠上洗脫結(jié)合分子并進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，將各個(gè)組別的樣本測(cè)量出的差異多肽峰進(jìn)行分類，建立分類預(yù)測(cè)模型，獲得差異多肽表達(dá)圖譜；S4、將待檢測(cè)的腎移植排斥反應(yīng)患者的血清樣本采用MB-WCX結(jié)合后，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，并將分析結(jié)果與S3中獲得的圖譜進(jìn)行比較，標(biāo)定該血清樣本的多肽。該方法有助于從蛋白質(zhì)組學(xué)的層面更好地理解腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)理，為對(duì)腎移植排斥反應(yīng)做出早期診斷提供了可能。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101839890SQ200910106218
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者戴勇, 晏強(qiáng), 眭維國(guó), 陳潔精, 黃禮玲 申請(qǐng)人:眭維國(guó)