專利名稱：一種加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，特別涉及一種加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
背景技術(shù)：
激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是最早被鑒定的轉(zhuǎn)錄因子，屬于堿性亮氨酸拉鏈類超家族(basic domain leucine zipper superfamily，bZIP)成員，是諸多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞核內(nèi)的交匯點(diǎn)。AP-1可以調(diào)控許多重要的細(xì)胞生命過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、存活、分化、癌變等。AP-1活性受到嚴(yán)謹(jǐn)、動(dòng)態(tài)的調(diào)控，多種生理刺激、環(huán)境因素和胞內(nèi)的調(diào)節(jié)蛋白都可以調(diào)控AP-1的活性。AP-1的調(diào)控是AP-1研究者關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。c-Jun是AP-1家族的核心組成成分，也是AP-1家族成員中功能最強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(transcriptional activator)。c-Jun蛋白由原癌基因c-jun編碼，全長331個(gè)氨基酸，分子量39kDa。已有的研究發(fā)現(xiàn)c-Jun有60多個(gè)相互作用蛋白，是AP-1家族成員中最多的。所有已知的c-Jun相互作用蛋白的一個(gè)共同特點(diǎn)是，以完整的分子形式發(fā)揮功能。
本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室在1998年啟動(dòng)了人22周孕齡胎肝的大規(guī)模cDNA測序，這一計(jì)劃的初衷是全面了解22周孕齡胎肝的基因表達(dá)特點(diǎn)、發(fā)掘新的細(xì)胞因子，為臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)尋找新的靶點(diǎn)。測序工作于2000年完成，共測定了15,000多個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，含有1660個(gè)已知基因，建立了迄今最為系統(tǒng)、最大規(guī)模的基因表達(dá)譜。完成了5000多個(gè)代表新基因的ESTs的生物信息學(xué)分析，確定了110條含有全長ORF的cDNA作為新功能基因研究的重點(diǎn)。在這1660個(gè)已知基因中轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子共計(jì)234個(gè)，約占14.1％，因此胎肝中尚未發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中很可能存在一些在重要疾病(如腫瘤)的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色的因子。
Jlip(c-Jun leucine zipper interacting protein)是上述110條基因中的一個(gè)有一定研究線索的分子。其cDNA全長1633bp，Genbank注冊(cè)號(hào)AF291105，編碼蛋白長409個(gè)氨基酸，N端含有一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain)，C端72個(gè)氨基酸(其中包含一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu))與小鼠JZA-20多肽同源性非常高(高達(dá)96％)，后者是1992年Chevray等以c-Jun亮氨酸拉鏈區(qū)為誘餌利用酵母雙雜交尋找c-Jun結(jié)合蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)片段，提示Jlip可能與c-Jun結(jié)合并調(diào)控AP-1活性，并據(jù)此命名為Jlip(c-Jun leucine zipper interacting protein)。但目前并沒有對(duì)人源的c-Jun亮氨酸拉鏈區(qū)結(jié)合蛋白進(jìn)行報(bào)道，而Chevray得到的是多肽片段，不是完整的蛋白，也沒有對(duì)得到的多肽作進(jìn)一步的驗(yàn)證和功能研究。
同一分子既含有PH結(jié)構(gòu)域，又含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的組成特點(diǎn)比較罕見。目前，只有少數(shù)幾個(gè)分子有功能報(bào)道，如AFAP-110、beta Pix、APPL和Vav(Baisden et al.，2001；Kim et al.，2001；Mitsuuchi et al.，1999；Romero & Fischer，1996)。其中只有原癌蛋白Vav與AP-1有功能關(guān)聯(lián)，它可以激活JNK/AP-1通路。但Vav對(duì)AP-1的調(diào)控是間接的，依賴于Rac和Vav分子內(nèi)DH結(jié)構(gòu)域的存在，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)并不參與調(diào)控。
對(duì)Jlip分子的結(jié)構(gòu)分析顯示，其亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的N端不存在DNA結(jié)合區(qū)，因而不是典型的bZIP分子；分子內(nèi)也不含其它DNA結(jié)合區(qū)，因而也不是DNA結(jié)合蛋白，因此排除了作為轉(zhuǎn)錄因子的可能。而具有磷脂結(jié)合特性的PH結(jié)構(gòu)域很可能將其錨定于質(zhì)膜，因此，既要Jlip錨定于質(zhì)膜上，又要參與結(jié)合核內(nèi)的c-Jun，從常理上講，是矛盾的，也暗示Jlip可能以尚未發(fā)現(xiàn)的新的調(diào)控方式參與AP-1的功能。
加拿大的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室也獲得了相同的基因，Bosc等以研究CK2為主要方向，以CK2α為誘餌蛋白篩選人B細(xì)胞文庫，得到此基因，命名為CKIP-1(casein kinase 2interacting protein-1)。Bosc等在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了CKIP-1與CK2α的相互作用，初步分析了CKIP-1的組織分布和細(xì)胞內(nèi)定位。他們?cè)噲D探討CKIP-1對(duì)CK2的激酶活性的影響或CKIP-1是否為CK2的底物，但得到的都是陰性結(jié)果。因此，他們只推測CKIP-1可能是CK2的一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白。所以，關(guān)于Jlip分子，既有一定的研究基礎(chǔ)，更有諸多問題沒有解決(1)雖然Jlip的C端可能與c-Jun結(jié)合，但尚未確證；(2)Jlip是否調(diào)控AP-1/c-Jun的活性，不清楚；(3)Jlip的生理功能沒有報(bào)道。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
本發(fā)明所提供的加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分是Jlip蛋白。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的藥物可加速乳腺癌細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞的凋亡。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Jlip蛋白可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子、放線菌酮等凋亡誘導(dǎo)因子的敏感性，是一個(gè)新的腫瘤細(xì)胞凋亡增效分子。本發(fā)明的藥物可以輔助用于臨床上治療腫瘤，具有重要的意義。


圖1為Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3細(xì)胞增殖曲線圖2為Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3受到TNF/CHX信號(hào)刺激后細(xì)胞的凋亡曲線圖3為Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3受到TNF/CHX信號(hào)刺激后細(xì)胞caspase-3的活性變化曲線圖4為具體實(shí)施方式
材料腫瘤壞死因子(TNF)購自Chemicon；放線菌酮(cycloheximide，CHX)購自Sigma；重組人源caspase-3購自Pharmingen；caspase抑制劑DEVD-CHO購自Clontech；pcDNA3.1-Myc質(zhì)粒購自Invitrogen；pcDNA3.1-Myc-Jlip質(zhì)粒構(gòu)建所用引物為P8181和P8183，插入片段長1.2kb，插入到載體的HindIII和KpnI位點(diǎn)之間，(引物序列為P8181caa gct tcg aat tct cgc ccg cgc ccg ctg gga atg；P8183cag agg tac ctt cat cag gct ctt)；胎牛血清(FBS)購自Hyclone；G418購自Gibco；FuGene 6轉(zhuǎn)染試劑購自Roche。
實(shí)施例1、Jlip加速腫瘤細(xì)胞的凋亡及其機(jī)理1、Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3細(xì)胞的增殖速度(1)Jlip/SK-BR-3穩(wěn)定株的篩選pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-Myc-Jlip質(zhì)粒(編碼C末端含Myc標(biāo)簽的Jlip蛋白)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，SK-BR-3細(xì)胞以RPMI 1640(15％FBS)培養(yǎng)。以FuGene 6轉(zhuǎn)染方法在6孔板內(nèi)進(jìn)行。3天后，換含有G418(800μg/ml)的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2周左右，每2天換液1次清除死亡細(xì)胞。待克隆長出之后，挑取克隆并轉(zhuǎn)移至24孔板內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，而后依次擴(kuò)大至12孔板、6孔板、培養(yǎng)瓶內(nèi)。通過Westernblot鑒定陽性克隆。經(jīng)過3周的篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)Jlip的單克隆20個(gè)左右，均經(jīng)Western blot鑒定為陽性，同時(shí)獲得了轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照克隆。
(2)Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3細(xì)胞的增殖速度Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3細(xì)胞穩(wěn)定株鋪24孔板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)，每天細(xì)胞計(jì)數(shù)(血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù))，每天計(jì)3孔，取平均值，共計(jì)7天，在第四天換1次培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取其中具代表性的1次數(shù)據(jù)作圖，得到細(xì)胞生長曲線。
結(jié)果如圖1所示，表明盡管兩組細(xì)胞的形態(tài)沒有差別，增殖速度也都比較快，但仍然可以看出差別，空載體組的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)一些。圖1中，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。
2、Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3細(xì)胞穩(wěn)定株受到TNF/CHX信號(hào)刺激后細(xì)胞的凋亡情況Jlip/SK-BR-3及pcDNA3.1/SK-BR-3細(xì)胞穩(wěn)定株生長至融合率90％左右時(shí)，撤血清饑餓過夜，加入20ng/ml的TNF和10μg/ml的CHX，誘導(dǎo)處理2-8hr。TNF以水配制，CHX以乙醇配制，-20℃保存。
經(jīng)TNF/CHX誘導(dǎo)的細(xì)胞以胰酶消化，離心，加入PBS(含15％FBS)+70％乙醇(二者體積比3∶7)，-20℃放置4hr以上，離心，加入RNaseA消化，以碘化丙啶(PI)染色，在流式細(xì)胞分析儀上分析檢測兩組SK-BR-3穩(wěn)定株對(duì)TNF/CHX信號(hào)刺激后凋亡細(xì)胞的比率，結(jié)果如圖2所示。
過表達(dá)Jlip本身并不能誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞受到TNF/CHX的刺激后，在所檢測的8hr內(nèi)細(xì)胞的凋亡率Jlip組要高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，2hr時(shí)差異顯著(P＜0.05)，4hr到8hr差異極其顯著(P＜0.01)，如TNF/CHX處理后6hr，大約27.0±2.5％的Jlip組細(xì)胞發(fā)生凋亡，此時(shí)空載體組只有11.8±1.9％發(fā)生凋亡。因此，Jlip表達(dá)可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子的敏感性，加速乳腺癌細(xì)胞的凋亡。
3、Jlip加速腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理為了闡明Jlip加速腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理，以DEVD-CHO-AFC為底物，按照ApoAlertcaspase-3測定試劑盒(購自Clontech)的說明進(jìn)行Caspase-3活性測定，熒光底物的不同光吸收值反映caspase-3活性。
結(jié)果如圖3所示，表明TNF/CHX刺激之后，Jlip組細(xì)胞的caspase-3活性在2hr就可以看到激活，而在對(duì)照組這一激活的發(fā)生出現(xiàn)在第4hr，在6hr以內(nèi)的時(shí)相范圍可以看到兩組的差別比較明顯。在較晚的時(shí)相，這種差別不再明顯，表明此時(shí)caspase-3的激活可能已經(jīng)接近平臺(tái)期。以前的研究曾發(fā)現(xiàn)caspase-3是CHX誘導(dǎo)凋亡所必需的，比如caspase-3打靶的小鼠骨髓嗜中性粒細(xì)胞可以拮抗CHX誘導(dǎo)的凋亡(Woo et al.，1998)。
為了確證caspase-3對(duì)于凋亡發(fā)生的重要性，在TNF/CHX加入前，預(yù)先加入caspase-3的特異性抑制劑DEVD-CHO，結(jié)果如圖2和圖3所示，表明DEVD-CHO可以阻斷TNF/CHX誘導(dǎo)的凋亡與caspase-3激活，表明了caspase-3的重要性。此外，還觀察到，Jlip的表達(dá)并未對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯的影響。
Caspase-3的抑制劑可以阻斷TNF/CHX誘導(dǎo)的凋亡以及Jlip促進(jìn)凋亡的效應(yīng)，表明caspase-3不僅是TNF/CHX誘導(dǎo)凋亡所必需的，也是Jlip介導(dǎo)的凋亡放大效應(yīng)所必需的。Jlip的這種作用有些類似于與Jlip具有完全不同結(jié)構(gòu)的其他caspase-3底物，如MEKK1、RET和Bcl-2(Widmann et al.，1998；Bordeaux et al.，2000；Chenget al.，1997)。
從本實(shí)施例可以看出，Jlip可抑制細(xì)胞生長，增加SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞對(duì)TNF/CHX的凋亡誘導(dǎo)敏感性；Jlip是一個(gè)凋亡的增效分子。
實(shí)施例2、Jlip降低肺腺癌細(xì)胞Glc-82在培養(yǎng)條件下的集落形成能力1、Jlip/Glc-82及pcDNA3.1/Glc-82細(xì)胞穩(wěn)定株的篩選pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-Myc-Jlip質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞Glc-82，Glc-82細(xì)胞以RPMI 1640(10％FBS)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定方法同實(shí)施例1中SK-BR-3細(xì)胞穩(wěn)定株的方法。
2、Jlip/Glc-82及pcDNA3.1/Glc-82細(xì)胞穩(wěn)定株的集落形成能力測定先制備軟瓊脂平板。配制2×RPMI 1640培養(yǎng)液、1.2％和0.7％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。將1.2％瓊脂糖膠和等體積2×RPMI 1640混勻，鋪于60mm直徑培養(yǎng)皿內(nèi)，作為底層膠。而后胰酶消化穩(wěn)定株細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，鋪板，每個(gè)培養(yǎng)皿接種600個(gè)細(xì)胞。消化細(xì)胞的同時(shí)將0.7％瓊脂糖膠和等體積2×RPMI 1640混勻，維持在40℃左右，作為頂層膠。將細(xì)胞迅速加入到頂層膠中，鋪于底層膠上面。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2周左右，計(jì)生長的細(xì)胞克隆數(shù)。
結(jié)果如圖4所示，表明空載體組得到267±84.01個(gè)集落，而Jlip表達(dá)組只得到135.25±21.19個(gè)集落，差異顯著(P＜0.05)。集落形成能力代表了腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力，因此，Jlip的表達(dá)可以顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
從本實(shí)施例可以看出，Jlip可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。
權(quán)利要求
1.一種加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分是Jlip蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所述藥物中還含有人體可接受的藥用載體。
4.Jlip蛋白在制備加速腫瘤細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為肺腺癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。本發(fā)明所提供的加速腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分是Jlip蛋白。該藥物中還含有人體可接受的藥用載體。本發(fā)明的藥物可加速乳腺癌細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞的凋亡，可以輔助用于臨床上治療腫瘤，具有重要的理論和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1602952SQ0313471
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者賀福初, 張令強(qiáng), 邢桂春, 唐穎, 李力, 魏漢東, 田春艷 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所