本發(fā)明涉及靶向人源磷脂酶Cε(PhospholipaseC,PLCε)基因的RNA干擾重組慢病毒載體及其構建，屬于生物醫(yī)藥
技術領域：
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背景技術：
：腫瘤相關基因中，Ras基因最為常見，參與細胞增殖信號傳導，編碼鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)。Ras激活后，G蛋白只保留GTP結合活性而無水解活性，故持續(xù)激活，有絲分裂信號持續(xù)傳入，細胞過度增殖。在Ras信號通路眾多下游效應蛋白中，近年來磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)家族中一個新的亞型PLCε被發(fā)現，除與其他PLC同有典型結構域X、Y和C2，其羧基端還具有特異性的Ras結合結構域和氨基端鳥苷酸交換因子結構域。PLCε在化學致癌物誘導鼠皮膚腫瘤的過程中發(fā)揮促進作用，并與腫瘤增殖有關。隨后的研究表明，PLCε的促進作用可能歸因于其擴大了炎癥反應。PLCε通過增加炎癥反應和血管形成促進鼠腸道腫瘤的發(fā)生。PLCε作為Ras原癌基因的效應子，其在腫瘤發(fā)生和進展的作用至關重要。RNA干擾技術能特異性降解mRNA，沉默靶基因，在轉錄后水平抑制基因的表達，從而可用來進行基因功能的研究和藥物靶標的研究。目前通過siRNA誘導哺乳動物細胞內RNA干擾的操作方法有兩種，分別為化學合成的siRNA和細胞內表達的siRNA?；瘜W合成法人工制備siRNA，一般是分別合成21個堿基的正義鏈和反義鏈，體外適當的溫度下使互補鏈配對，形成siRNA。然后，采用傳統(tǒng)轉染的方法，如Lipofectamine轉染、磷酸鈣、電打孔等將siRNA導入細胞，誘導RNA干擾。此方法操作簡單、快速，但引起的RNA干擾效應往往是暫時的，難以持久。因此，目前更傾向于在哺乳動物細胞內表達siRNA，以維持長久的RNA干擾效應。細胞內表達法是將表達siRNA的載體轉染細胞，在細胞內表達siRNA。慢病毒載體作為常用的病毒載體之一，其特點是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相細胞，能自身攜帶片段整合入宿主細胞基因組，并在哺乳動物各類細胞穩(wěn)定表達siRNA，長期抑制基因表達。技術實現要素：本發(fā)明提供一種靶向PLCε基因的RNA干擾重組病毒載體構建、篩選及其用途。本發(fā)明以RNA干擾技術為主，針對PLCε基因的不同靶序列，構建了四個能在293T細胞中表達siRNA的慢病毒真核表達載體pLv-PLCεshRNA，該載體是自身失活的慢病毒載體，其示意圖譜見圖1，能特異性的抑制PLCε基因表達。本發(fā)明的技術方案如下：一種靶向PLCε基因的siRNA重組慢病毒表達載體，是用于腫瘤PLCε基因相關性治療性物質，慢病毒是由pLv-PLCεshRNA、pMD2.G和pSPAX2載體共轉染293T細胞培養(yǎng)獲得；其中，所述的pLv-PLCεshRNA重組載體是在plv-shRNA載體的多克隆位點中連接雙鏈DNA片段構建而得，酶切位點是BamHI和EcoRI，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種：(1)PLCε-homo-U1寡核苷酸序列1:正義鏈:5’GATCCCCACTTTGTTAGTCAGGAGATCTCGAGATCTCCTGACTAACAAAGTGGTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAACCACTTTGTTAGTCAGGAGATCTCGAGATCTCCTGACTAACAAAGTGGG3’(2)PLCε-homo-U2寡核苷酸序列2:正義鏈:5’GATCCGCGGATTATTGGAACTCACTACTCGAGTAGTGAGTTCCAATAATCCGCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGCGGATTATTGGAACTCACTACTCGAGTAGTGAGTTCCAATAATCCGCG3’(3)PLCε-homo-U3寡核苷酸序列3:正義鏈:5’GATCCCCATCATTTATCATGGACATACTCGAGTATGTCCATGATAAATGATGGTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAACCATCATTTATCATGGACATACTCGAGTATGTCCATGATAAATGATGGG3’(4)PLCε-homo-U4寡核苷酸序列4:正義鏈:5’GATCCGCTGCAATGTTTGAGGCAAATCTCGAGATTTGCCTCAAACATTGCAGCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGCTGCAATGTTTGAGGCAAATCTCGAGATTTGCCTCAAACATTGCAGCG3’根據本發(fā)明，所述的靶向PLCε基因的siRNA重組慢病毒表達載體的構建方法，包括步驟如下：a.根據PLCεmRNA序列，設計合成雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為所述的PLCε-homo-U1、PLCε-homo-U2、PLCε-homo-U3及PLCε-homo-U4核酸序列中的一種；b.然后將所述的雙鏈DNA片段連接到plv-shRNA載體的多克隆位點中構建成pLv-PLCεshRNA重組載體；c.再將所述的pLv-PLCεshRNA重組載體與pMD2.G和pSPAX2載體共轉染293T細胞培養(yǎng)，得靶向PLCε基因RNA干擾的重組慢病毒載體系統(tǒng)。為了對靶向PLCε基因RNA干擾的重組慢病毒載體對PLCεε基因的抑制效果進行鑒定，將pLv-PLCεεshRNA與包裝質粒共轉染293T細胞后進行熒光定量PCR檢測目的基因表達水平，篩選出有效干擾質粒。附圖說明圖1為實施例中慢病毒表達載體plv-shRNA結果示意圖。圖2PLCε干擾RNA慢病毒載體瞬轉293T細胞48h圖片(熒光、可見光)。其中(a)為普通光鏡(100×)；(b)為熒光光鏡(100×)。圖3不同干擾序列下的PLCε表達水平。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。主要材料：293T細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；慢病毒載體plv-shRNA購自Clontech公司，含有人U6啟動子，編碼綠色熒光蛋白報告基因；各種限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶及TaqDNA聚合酶均為美國NEB公司產品；SYBRGreenIqRT-PCRMixs購與上海生工生物工程技術服務公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibico公司。實施例1靶向PLCε基因的慢病毒載體構建1.寡聚核酸的設計與合成設計靶向PLCε基因（NM_016341.3）的4個干擾序列（表1），并合成相應的單鏈DNA表1靶向PLCε基因RNA干擾序列序列名稱序列信息起始位置U1CCACTTTGTTAGTCAGGAGAT965U2GCGGATTATTGGAACTCACTA2999U3CCATCATTTATCATGGACATA4343U4GCTGCAATGTTTGAGGCAAAT5479shRNA寡核苷酸的3’末端是TTTTT，作為RNA聚合酶Ⅲ型啟動子U6的終止信號，其5’和3’末端分別是BamHI和EcoRI的限制性酶切位點，plv-shRNA模板中的loop結構選用了CTCGAG。各自單鏈DNA合成片段如下：(1)PLCε-homo-U1寡核苷酸序列1:正義鏈:5’GATCCCCACTTTGTTAGTCAGGAGATCTCGAGATCTCCTGACTAACAAAGTGGTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAACCACTTTGTTAGTCAGGAGATCTCGAGATCTCCTGACTAACAAAGTGGG3’(2)PLCε-homo-U2寡核苷酸序列2:正義鏈:5’GATCCGCGGATTATTGGAACTCACTACTCGAGTAGTGAGTTCCAATAATCCGCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGCGGATTATTGGAACTCACTACTCGAGTAGTGAGTTCCAATAATCCGCG3’(3)PLCε-homo-U3寡核苷酸序列3:正義鏈:5’GATCCCCATCATTTATCATGGACATACTCGAGTATGTCCATGATAAATGATGGTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAACCATCATTTATCATGGACATACTCGAGTATGTCCATGATAAATGATGGG3’(4)PLCε-homo-U4寡核苷酸序列4:正義鏈:5’GATCCGCTGCAATGTTTGAGGCAAATCTCGAGATTTGCCTCAAACATTGCAGCTTTTTG3’反義鏈:5’AATTCAAAAAGCTGCAATGTTTGAGGCAAATCTCGAGATTTGCCTCAAACATTGCAGCG3’2.寡聚核酸退火將合成的寡聚核酸分別用無酶水溶解，濃度為20μM。取相應正義鏈和反義鏈溶液，按照如下配比配制退火反應體系組分體積（μL）退火緩沖液5正義鏈（20μM）5反義鏈（20μM）5水至終體積50在PCR儀上按照如下程序進行退火處理：95℃5min;85℃5min;75℃5min;70℃5min;4℃保存。3.pl-shRNA載體線性化取2μgplv-shRNA載體，按照如下體系進行酶切處理：組分體積（μL）10×緩沖液5BamHI1EcoRI1水至終體積5037℃酶切1小時，1.5%瓊脂糖電泳，使用DNA純化試劑盒回收，核酸蛋白濃度測定儀測定回收質量。4.plv-PLCε-shRNA載體的構建利用T4DNA連接酶，按照如下體系進行載體連接反應：組分體積（μL）10×T4連接緩沖液2載體回收2shDNA2T4DNA連接酶1水至終體積2020℃連接過夜，轉化質大抽桿菌感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆送去測序。本步驟得到的產物是plv-PLCε-shRNA。實施例2RNA干擾慢病毒質粒瞬轉293T細胞將4種干擾慢病毒質粒，采用瞬時轉染的方法轉染293T細胞。293T細胞采用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。轉染前1天消化293T細胞，計數，將細胞接種至35mm培養(yǎng)皿內，每個培養(yǎng)皿接種6×105個細胞；次日用不含FBS的DMEM培養(yǎng)基分別配制鈣轉試劑和RNA干擾質粒，每84μl培養(yǎng)基內加入16μl鈣轉試劑，每100μl培養(yǎng)基內加入4μg質粒，分別混勻后將鈣轉溶液和質粒溶液輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，逐滴加入培養(yǎng)皿內，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h，更換新鮮的含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞，提取細胞RNA。實施例31.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干擾效應的RT-PCR檢測分別取1μgRNA反轉錄cDNA，采用熒光定量PCR法檢測PLCε的表達水平，以beta-actin作為內參，熒光定量PCR所采用的引物序列見表2，采用2-△△CT相對定量方法計算不同RNA干擾序列樣品的PLCε表達水平。篩選出表達水平最低的RNA干擾序列。檢測結果（見圖3）表明U4序列的PLCε基因表達水平最低，說明U4序列的RNA干擾效果最好。2.PLCε和beta-actin引物探針設計引物名稱序列F-PLCεTCTTCGCACAATACCTACCTCACR-PLCεATCAATGGCTTCAACCACTTCCTF-actinbTATCGCCGCGCTCGTCGTCR-actinbTCTTGCTCTGGGCCTCGTCSEQUENCELISTING<110>同濟大學蘇州研究院<120>靶向PLCε基因RNA干擾重組慢病毒載體及其構建方法<130>2016<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>1gatccccactttgttagtcaggagatctcgagatctcctgactaacaaagtggtttttg59<210>2<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>2aattcaaaaaccactttgttagtcaggagatctcgagatctcctgactaacaaagtggg59<210>3<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>3gatccgcggattattggaactcactactcgagtagtgagttccaataatccgctttttg59<210>4<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>4aattcaaaaagcggattattggaactcactactcgagtagtgagttccaataatccgcg59<210>5<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>5gatccccatcatttatcatggacatactcgagtatgtccatgataaatgatggtttttg59<210>6<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>6aattcaaaaaccatcatttatcatggacatactcgagtatgtccatgataaatgatggg59<210>7<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>7gatccgctgcaatgtttgaggcaaatctcgagatttgcctcaaacattgcagctttttg59<210>8<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>8aattcaaaaagctgcaatgtttgaggcaaatctcgagatttgcctcaaacattgcagcg59當前第1頁1 2 3