專利名稱：通過基因治療的骨生成的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種將至少一種編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族一員的基因?qū)胫辽僖环N哺乳動(dòng)物結(jié)締組織細(xì)胞，用來生成或再生骨，特別是用來修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨折或融合哺乳動(dòng)物宿主的脊柱。
相關(guān)領(lǐng)域簡(jiǎn)述活骨組織的動(dòng)態(tài)平衡是一個(gè)由調(diào)控信號(hào)調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過程，例如激素，生長(zhǎng)和分化因子。已知刺激骨細(xì)胞繁殖的生長(zhǎng)因子是骨形成蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β蛋白質(zhì)(TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。
骨質(zhì)疏松癥，其特點(diǎn)是低骨量和骨微結(jié)構(gòu)的退化，會(huì)導(dǎo)致骨折，它是老年人中數(shù)量增加的一個(gè)普通健康問題。骨質(zhì)疏松癥可由許多因素引起，例如但不局限于絕經(jīng)、鈣缺乏性飲食、卵巢切除后、糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥，甲狀腺功能亢進(jìn)、制動(dòng)、肝素誘導(dǎo)的或免疫抑制誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。
骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，并仍不是很清楚。通過刺激患者骨質(zhì)疏松的卵巢切除和低鈣飲食制造大鼠模型，骨折的骨頭沒有很好的愈合(Kubo等，SteroidBiochemistry & Molecular Biology，68197-202，1999；Namkung-Matthai等，Bone，2880-86，2001)。因此，包括骨再生的治療也大大改善了骨質(zhì)疏松性骨折的治療。
在骨科領(lǐng)域，一些細(xì)胞因子已經(jīng)被認(rèn)為是治療骨科疾病的候選。骨形成蛋白已經(jīng)被認(rèn)為是一種有效的骨形成刺激劑(Ozkaynak等，EMBO J，92085-2093，1990；Sampath和Rueger，Complication in Ortho，101-107，1994)，TGF-β已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)是一種骨生成和軟骨形成的刺激劑(Joyce等，J Cell Biology，1102195-2207，1990)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)被認(rèn)為是一種多功能的細(xì)胞因子(Sporn和Roberts，Nature(London)，322217-219，1988)，并在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞外矩陣蛋白合成中起了調(diào)節(jié)作用(Madri等，J Cell Biology，1061375-1384，1988)。TGF-β抑制體外上皮細(xì)胞和破骨樣細(xì)胞的生長(zhǎng)(Chenu等，Proc Natl Acad Sci，855683-5687，1988)，但它刺激了軟骨內(nèi)骨化，并最終在體內(nèi)形成骨(Critchlow等，Bone，521-527，1995；Lind等，A Orthop Scand，64(5)553-556，1993；和Matsumoto等，In vivo，8215-220，1994)。TGF-β誘導(dǎo)的骨形成是通過刺激骨膜下多能性細(xì)胞而調(diào)節(jié)的，所述多能細(xì)胞最終分化為軟骨-形成細(xì)胞(Joyce等，J Cell Biology，1102195-2207，1990；和Miettinen等，J Cell Biology，127-62021-2036，1994)。
骨科學(xué)中TGF-β的生物作用已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了(Andrew等，Calcif Tissue In.5274-78，1993；Borque等，Int J Dev Biol.，37573-579，1993；Carrington等，J Cell Biology，1071969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand.64(5)553-556，1993；Matsumoto等，In vivo，8215-220，1994)。在小鼠胚胎中，染色顯示TGF-β和來自間充質(zhì)的組織緊密相關(guān)，例如結(jié)締組織、軟骨和骨。除了胚胎學(xué)的發(fā)現(xiàn)，TGF-β存在于骨形成和軟骨形成的部位。它還能增加兔脛骨的骨折愈合。近來，TGF-β的治療值已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)(Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A Orthop Scand，64(5)553-556，1993)，但是短期的作用和高花費(fèi)已限制了廣泛的臨床應(yīng)用。
許多過度損傷的骨缺陷不會(huì)完全恢復(fù)并需要治療性的干預(yù)，例如自體移植或從存儲(chǔ)骨移植。高失敗率和這些傳統(tǒng)的治療相關(guān)。近來大多數(shù)可供選擇的方法利用注入骨誘導(dǎo)性蛋白的生物降解載體移植到損傷部位。見例如，美國(guó)專利第5,656,598號(hào)。其他方法包括應(yīng)用機(jī)械裝置使得骨再生，例如美國(guó)專利第6,077,076和第6,022,349號(hào)中所揭示的。這些方法一個(gè)主要的不利之處就是需要大量重組蛋白來獲得治療作用，因?yàn)樵隗w內(nèi)治療性蛋白的作用持續(xù)時(shí)間短。
脊柱椎體中骨退變是另外一個(gè)領(lǐng)域，其中融合椎體的骨形成會(huì)使飽受椎體塌陷導(dǎo)致后背疼痛之苦的患者獲得緩解。所以，文中治療性申請(qǐng)需要改善骨形成蛋白釋放的時(shí)間長(zhǎng)度。正如本申請(qǐng)中所描述的，本發(fā)明提供了一種在骨缺陷部位持續(xù)表達(dá)這種骨形成治療性蛋白的方法，從而導(dǎo)致有效的骨再生。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明已滿足了上文中的需要。本發(fā)明提供了一種將至少一種編碼產(chǎn)物的基因?qū)胫辽僖环N哺乳動(dòng)物結(jié)締組織細(xì)胞的方法，用來治療哺乳動(dòng)物宿主。這種方法包括運(yùn)用重組技術(shù)制造包含編碼產(chǎn)物基因的DNA載體分子，并將包含編碼產(chǎn)物基因的DNA載體分子導(dǎo)入結(jié)締組織細(xì)胞。所述DNA載體分子可以是任何能被輸入和保留在靶細(xì)胞或組織中的DNA分子，這樣所述編碼有意義產(chǎn)物的基因可被穩(wěn)定表達(dá)。在本發(fā)明中優(yōu)選應(yīng)用的DNA載體分子是病毒或質(zhì)粒DNA載體。這種方法優(yōu)選的包括將編碼產(chǎn)物的基因?qū)氩溉閯?dòng)物結(jié)締組織細(xì)胞用作治療。
本發(fā)明提供了一種在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括a)將編碼具有骨再生功能的蛋白質(zhì)的基因插入載體，并操作性連接于啟動(dòng)子，和b)用所述重組載體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一群結(jié)締組織細(xì)胞；和c)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞移植到骨缺陷部位，并使骨缺陷部位形成骨。
在這種方法中，所述載體可以無限制的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或質(zhì)粒載體。所述基因可以是TGF-β超家族的一員，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以是BMP-2。此外，所述結(jié)締組織細(xì)胞可以是成纖維或骨祖細(xì)胞。
在以上的方法中，骨在早期或晚期產(chǎn)生。
本發(fā)明還旨在提供一種融合脊柱的方法，包括a)將編碼具有骨形成功能的蛋白質(zhì)的基因插入載體；b)用所述重組載體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一群結(jié)締組織細(xì)胞；和c)使成骨有效量的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)締組織細(xì)胞群以及藥學(xué)上可接受的載體和脊柱接觸，這樣編碼基因的DNA序列在脊柱表達(dá)導(dǎo)致了骨生成，由此脊柱融合了。
在這種方法中，所述載體可無限制的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或質(zhì)粒載體。所述基因可以是TGF-β超家族的一員，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以是BMP-2。此外，所述結(jié)締組織細(xì)胞可以是成纖維或骨祖細(xì)胞。
在以上的方法中，骨在早期或晚期產(chǎn)生。
此外，本發(fā)明旨在提供一種愈合骨質(zhì)疏松性骨折的方法，包括a)將編碼具有骨再生功能的蛋白質(zhì)的基因插入載體，并操作性連接于啟動(dòng)子，b)用所述重組載體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一群結(jié)締組織細(xì)胞；和將結(jié)締組織細(xì)胞導(dǎo)入骨折部位，并使骨折愈合。
在這個(gè)方法中，所述載體可無限制的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或質(zhì)粒載體。所述基因可以是TGF-β超家族的一員，特殊的是骨形成蛋白(BMP)。更特殊的，所述BMP可以是BMP-2。此外，所述結(jié)締組織細(xì)胞可以是成纖維或骨祖細(xì)胞。
在以上的方法中，骨在早期或晚期產(chǎn)生。
本發(fā)明的這些和其他對(duì)象通過以下本發(fā)明的詳述、附帶的參考圖和所附的權(quán)利要求被更好理解。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將通過以下給出的詳細(xì)描述和附帶的圖被更好理解，后者的給出僅僅是為了闡明，而不是限制本發(fā)明，其中；


圖1A和1B顯示了包含人類BMP2基因pMT-BMP2的結(jié)構(gòu)。
圖2A-2F顯示了利用NIH3T3-BMP-2成纖維細(xì)胞的骨再生。圖2A和2B顯示了在注射對(duì)照NIH3T3成纖維細(xì)胞(A)和NIH3T3-BMP-2(B)8周后的腿骨圖。圖2C-2F顯示了在處死動(dòng)物之前對(duì)照(C&D)和實(shí)驗(yàn)(E&F)腿骨的X線檢查。用表達(dá)BMP-2蛋白細(xì)胞處理過的骨缺陷在注射8周后愈合。
圖3A-3D顯示了再生骨組織的組織學(xué)檢查。制作再生骨組織的石蠟切片并用Mason′s三色染色。結(jié)果顯示再生骨組織(RB)的結(jié)構(gòu)幾乎和正常骨組織(NB)的相同。圖3A和3B顯示了低放大率(40x)，圖3C和3D顯示了高放大率(100x)。點(diǎn)線表示再生和正常骨組織之間的界限。
圖4A-4I顯示了用NIH3T3-BMP-2成纖維細(xì)胞的骨再生。將NIH3T3-BMP-2細(xì)胞(2ml2×106細(xì)胞/ml)在縫合后注射入脛骨的缺損區(qū)域。(A-G)在細(xì)胞注射1、2、3、4、5、6、7周后實(shí)施X線分析。(H)在注射后7周收獲樣本，并繪圖。(I)在收獲后進(jìn)行組織學(xué)檢查。顯示Mason’s三色染色的結(jié)果。
圖5A-5I顯示了用對(duì)照DMEM培養(yǎng)基的骨再生。將DMEM培養(yǎng)基(2ml)縫合后注射入脛骨的缺損區(qū)域。(A-G)在注射培養(yǎng)基1、2、3、4、5、6周后實(shí)施X線分析。(H)在注射后6周收獲樣本，并繪圖。(I)在收獲后進(jìn)行組織學(xué)檢查。顯示Mason’s三色染色的結(jié)果。
圖6A和6B顯示了大鼠TG001應(yīng)用可吸收膠原海綿(ACS)載體在后外側(cè)橫突間處理融合植入細(xì)胞4和6周后的X線圖。在利用用于BMP-2后外側(cè)橫突間處理融合研究的cDNA轉(zhuǎn)染5×106成纖維細(xì)胞(小鼠)后，X線上左側(cè)富集了橋骨。注意右側(cè)如果有的話，可能細(xì)胞較少，骨形成較少。
發(fā)明詳述在本申請(qǐng)中，“一種”和“一個(gè)”用來指對(duì)象的單數(shù)和復(fù)數(shù)。
正如這里所應(yīng)用的，“聯(lián)合”一種或多種治療藥物給藥包括同時(shí)(一起)和以任何順序連續(xù)給藥。
正如這里所應(yīng)用的，關(guān)于核酸、蛋白質(zhì)和蛋白片段或其衍生物的名詞“生物活性”定義為核酸或氨基酸序列模仿野生型核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)生的已知生物功能的能力。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“骨生長(zhǎng)”涉及骨質(zhì)量。TGF-β蛋白被認(rèn)為系統(tǒng)的增加骨量。這表現(xiàn)為在系統(tǒng)給藥后，成骨細(xì)胞的數(shù)量和大小增加，骨化加襯骨表面沉積的增加。
正如這里所應(yīng)用的，“載體”包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們?cè)谶\(yùn)用所述劑量和濃度時(shí)，對(duì)于暴露于其的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是沒有毒性的。通常，藥學(xué)上可接受的載體是含水的pH緩沖溶液。藥學(xué)上可接受載體的實(shí)施例包括，不限于例如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(大約低于10個(gè)殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如TWEEN，聚乙二醇(PEG)，和PLURONICS。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“結(jié)締組織”是指任何連接和支持其他組織或器官的組織，并包括但不局限于哺乳動(dòng)物的韌帶、軟骨、腱、骨或滑膜。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“結(jié)締組織細(xì)胞”包括在結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)和骨細(xì)胞(成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞)，還有脂肪細(xì)胞(脂細(xì)胞)和平滑肌細(xì)胞。優(yōu)選的，所述結(jié)締組織細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。更優(yōu)選的，所述結(jié)締組織細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。作為選擇，所述結(jié)締組織細(xì)胞是成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞。可以認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可用結(jié)締組織細(xì)胞的混合培養(yǎng)基實(shí)施，也可以用單一類型的細(xì)胞。也可認(rèn)識(shí)到組織細(xì)胞可用例如化學(xué)或放射處理，這樣所述細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)有意義的基因。優(yōu)選的，所述結(jié)締組織細(xì)胞當(dāng)注射入宿主有機(jī)體時(shí)不會(huì)引起負(fù)性免疫反應(yīng)。可以明白同種異體細(xì)胞可用于此，同樣自體同源細(xì)胞可用于細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療或體細(xì)胞治療。
正如這里所應(yīng)用的，“結(jié)締組織細(xì)胞”包括大量來源于普通親本細(xì)胞的結(jié)締組織細(xì)胞。
正如這里所應(yīng)用的，“宿主細(xì)胞”包括可或已經(jīng)作為本發(fā)明載體受體的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基。宿主細(xì)胞包括單一宿主細(xì)胞的后代，所述后代和原始親本細(xì)胞不一定是完全相同的(在形態(tài)學(xué)或完整DNA受體上)，這是因?yàn)樽匀弧⒁馔饣蛘T導(dǎo)的突變和/或變化。宿主細(xì)胞包括在體內(nèi)用包含編碼TGF-β超家族一員聚核苷酸的載體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“低骨量”指一種骨量低于年齡特異正常水平的疾病，由世界衛(wèi)生組織“骨折風(fēng)險(xiǎn)以及將其用于篩選絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)測(cè)(Assessment ofFracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis)(1994).世界衛(wèi)生組織研究組的報(bào)告，世界衛(wèi)生組織技術(shù)組843”的標(biāo)準(zhǔn)定義，這里包含進(jìn)來作為骨量正常和骨質(zhì)疏松水平的參考。而且，名詞“骨量”指骨質(zhì)量/單位面積，它有時(shí)候指骨礦物密度。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“保留”，當(dāng)應(yīng)用于脂質(zhì)體輸入的上下文中，表示導(dǎo)入DNA保留在細(xì)胞中的能力。當(dāng)在其他文中應(yīng)用時(shí)，它表示靶DNA保留在靶細(xì)胞或組織中的能力，從而產(chǎn)生治療作用。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“哺乳動(dòng)物宿主”包括動(dòng)物王國(guó)的成員，包括但不局限于人類。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“成熟骨”涉及礦化骨，和非-礦化骨，例如類骨質(zhì)形成對(duì)比。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“成骨有效”指的是能影響成熟骨形成和發(fā)展的量。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“骨祖細(xì)胞”或“骨祖細(xì)胞”是有變成骨細(xì)胞潛力的細(xì)胞，并存在于骨膜和骨髓中。骨祖細(xì)胞來源于也存在于周圍組織(肌肉)的結(jié)締組織祖細(xì)胞。
正如這里所應(yīng)用的，名詞“患者”包括動(dòng)物王國(guó)的成員，包括但不局限于人類。
正如這里所應(yīng)用的，一種組合物是“藥學(xué)上或生理上可接受的”，如果接受的動(dòng)物可容忍給藥或適合對(duì)那種動(dòng)物給藥。如果所述給藥的量是生理有效的，那這種試劑以“治療有效的量”施用。如果一種試劑的存在可導(dǎo)致受試患者生理上可察覺的變化，那么它就是生理有效的。
正如這里所應(yīng)用的，“藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等等。應(yīng)用這種藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑在文中是熟知的。除非任何傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑和所述活性成分不相容，可將它們應(yīng)用于治療性組合物中。輔助活性成分也可被包含進(jìn)所述組合物。
正如這里所應(yīng)用的，“啟動(dòng)子”可以是任何活性DNA序列，并控制真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子在真核細(xì)胞和/或原核中是有活性的。優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是有活性的。所述啟動(dòng)子可在結(jié)構(gòu)上表達(dá)或誘導(dǎo)。優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的。優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子可由外部刺激誘導(dǎo)。更優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子可由激素或金屬誘導(dǎo)。同樣，“增強(qiáng)子元件”也控制轉(zhuǎn)錄，它可被插入DNA載體結(jié)構(gòu)，并和本發(fā)明的結(jié)構(gòu)一起應(yīng)用而增強(qiáng)有意義基因的表達(dá)。
正如這里所應(yīng)用的，“可選擇標(biāo)記”包括由穩(wěn)定保存導(dǎo)入DNA細(xì)胞表達(dá)的基因產(chǎn)物，并導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)改變的表型，例如形態(tài)的變化或酶活性。表達(dá)轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞的分離通過將編碼可選擇標(biāo)記的第二種基因?qū)胂嗤募?xì)胞而實(shí)現(xiàn)，例如有酶活性的，可對(duì)抗生素或其他藥物產(chǎn)生抵抗。可選擇標(biāo)記的實(shí)施例包括，但不局限于胸苷激酶、二氫葉酸還原酶、氨基糖甙磷酸轉(zhuǎn)移酶，它會(huì)對(duì)氨基糖甙抗生素產(chǎn)生抵抗，例如卡那霉素、新霉素和遺傳霉素、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、CAD(一種具有從頭生物合成尿苷三種酶活性的單一蛋白質(zhì)--氨甲酰磷酸酯合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和二氫乳清酸酶)，腺苷脫氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等，Molecular Cloning，Chapter 16.1989)，這里完整包含進(jìn)來作參考。
正如這里所應(yīng)用的，“受試者”是一種脊柱動(dòng)物，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選的是人類。
正如這里所應(yīng)用的，“治療”是指一種獲得有益或理想臨床結(jié)果的方法。對(duì)于本發(fā)明來說，有益或理想的臨床結(jié)果包括，但不局限于，癥狀的緩解，疾病程度的減輕，疾病的穩(wěn)定狀態(tài)(例如沒有惡化)，疾病進(jìn)展的延遲或變慢，疾病狀態(tài)的改善或減輕，減輕(部分或全部)，可察覺或未察覺。“治療”也指和如果沒有接受治療獲得的理想生存相比生存延長(zhǎng)。“治療”也指治療性處理和預(yù)防性的措施。需要治療的包括那些已經(jīng)患有疾病的以及預(yù)防疾病的?！皽p輕”一種疾病指疾病狀態(tài)的程度和/或不理想的臨床表現(xiàn)減輕和/或進(jìn)展的時(shí)間減慢或延長(zhǎng)，這些都是和未治療的情況相比。
正如這里所應(yīng)用的，“TGF-β蛋白質(zhì)”指的是蛋白質(zhì)TGF-β超家族中的一員。
正如這里所應(yīng)用的，“載體”、“聚核苷酸載體”、“結(jié)構(gòu)”和“聚核苷酸結(jié)構(gòu)”這里互換應(yīng)用。本發(fā)明的聚核苷酸載體可以是任何形式，包括但不局限于，RNA、DNA、裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒衣膠囊中的RNA，裝在腺病毒衣膠囊中的DNA，以其他病毒或病毒樣形式打包的DNA(例如單純皰疹病毒以及腺相關(guān)病毒(AAV))，裝在脂質(zhì)體膠囊中的DNA，和賴氨酸結(jié)合的DNA，和合成的聚陽(yáng)離子分子結(jié)合的DNA，與化合物例如聚乙烯二醇(PEG)結(jié)合的DNA，從而免疫“掩蓋”分子和/或增加半衰期，或與非-病毒蛋白質(zhì)軛合。優(yōu)選的，所述聚核苷酸是DNA。正如這里所應(yīng)用的，“DNA”不僅包括堿基A、T、C和G，還包括任何它們的類似物或這些堿基修飾后的形式，例如甲基化核苷、核苷內(nèi)部的改變，例如不帶電荷的連接和thioate，糖類似物的應(yīng)用，以及被修飾和/或可供選擇的脊柱結(jié)構(gòu)，例如聚酰胺。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族包括一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們?cè)谂咛グl(fā)育期間影響許多分化過程。這以初級(jí)氨基酸序列同型為基礎(chǔ)，包括完全保存7個(gè)半胱氨酸殘基。所述家族包括，Mullerian抑制物質(zhì)(MIS)，它對(duì)于正常雄性發(fā)育是所需的(Behringer等，Nature，345167，1990)，Drosophila decapentaplegic(DPP)基因產(chǎn)物，它對(duì)于背腹軸的形成和成蟲盤的形態(tài)形成來說是所需的(Padgett等，Nature，32581-84，1987)，激活素(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135957-964，1986)，它能誘導(dǎo)Xenopus胚胎中胚葉和前結(jié)構(gòu)的形成(Thomsen等，Cell，63485，1990)，骨形成蛋白(BMP’s，例如BMP-2至BMP-15)，它能再次誘導(dǎo)軟骨和骨的形成(Sampath等，J.Biol.Chem.，26513198，1990)。TGF-β基因產(chǎn)物可影響許多分化過程，包括脂肪生成、肌形成、軟骨形成、造血作用和上皮細(xì)胞分化(回顧，見Massague，Cell 49437，1987)，這里完整包含進(jìn)來作參考。
TGF-β家族的蛋白質(zhì)一開始合成為大的前體蛋白質(zhì)，接著在從C-末端大約110-140個(gè)氨基酸堿基簇處蛋白水解。所述蛋白質(zhì)的C-末端區(qū)域都是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的，不同的家族成員可根據(jù)它們同源的程度分為不同的亞群。雖然特殊亞群中的同源性范圍是70％-90％個(gè)氨基酸序列相同，但亞群之間的同源性明顯較低，通常僅有20％-50％。在各種情況下，活性種類似乎是C-末端片段的連有二硫化物的二聚體。對(duì)于已經(jīng)研究過的該家族大多數(shù)成員，已發(fā)現(xiàn)同二聚體種類具有生物活性，但還檢測(cè)了該家族的其它成員，如抑制素(Ung等，Nature，321779，1986)和TGF-β(Cheifetz等，Cell，48409，1987)的異二聚體，但它們似乎具有與同二聚體不同的生物特性。
TGF-β基因超家族的成員包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(雞)、TGF-β1、TGF-β5(非洲蟾蜍)、BMP-2、BMP-4、果蠅DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蠅60A、GDF-1、非洲蟾蜍Vgf、BMP-3、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。這些基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998中有討論，在此將其全文并入以供參考。
優(yōu)選地，TGF-β基因超家族的成員是BMP。更優(yōu)選的，該成員是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。再優(yōu)選的一個(gè)是人BMP。最優(yōu)選的成員是人BMP-2。
BMPBMP是在骨骼開始形成前誘導(dǎo)間充質(zhì)類型細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的蛋白質(zhì)。它們促進(jìn)軟骨和骨骼形成細(xì)胞在骨折位置周圍分化，同時(shí)也在其它異位(ectopic)部位分化。這些蛋白質(zhì)中的一些誘導(dǎo)堿性磷酸酶和膠原在成骨細(xì)胞內(nèi)合成。一些BMP直接作用于成骨細(xì)胞并促進(jìn)它們的成熟，同時(shí)抑制肌細(xì)胞分化。其它BMP促進(jìn)典型的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞，同時(shí)能夠誘導(dǎo)非成骨細(xì)胞類型表達(dá)成骨細(xì)胞表型。屬于TGF-β超家族的BMP家族包括BMP-2A或BMP-2-a(114個(gè)氨基酸)，也稱為BMP-2。人、小鼠和大鼠蛋白質(zhì)的氨基酸序列是相同的。該蛋白質(zhì)與果蠅有68％的同源性。
BMP-2B或BMP-2-β(116個(gè)氨基酸)，也稱為BMP-4。小鼠和大鼠蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列相同。
BMP-3(110個(gè)氨基酸)是一種糖蛋白，且與骨生成蛋白相同。人和大鼠的成熟蛋白質(zhì)有98％的同一性。
BMP-3b(110個(gè)氨基酸)與BMP-3(同一性82％)相關(guān)。人和小鼠的蛋白質(zhì)顯示有97％的同一性(3個(gè)不同的氨基酸)。人和大鼠的蛋白質(zhì)序列有兩個(gè)氨基酸不相同。該因子與GDF-10相同。
BMP-4與BMP-2B和DVR-4相同。該蛋白質(zhì)與果蠅有72％的同源性。
BMP-5(138個(gè)氨基酸)。在氨基酸水平上，人和小鼠的蛋白質(zhì)有96％的同一性。
BMP-6(139個(gè)氨基酸)與DVR-6和植物-特異性-相關(guān)蛋白-1相同。
BMP-7(139個(gè)氨基酸)與OP-1(成骨蛋白-1)相同。小鼠和人的蛋白質(zhì)有98％的同一性。BMP-5、BMP-6和BMP-7的成熟形式顯示出75％的同一性。
BMP-8(139個(gè)氨基酸)與OP-2相同。該因子也被稱為BMP-8a。
BMP-8b(139個(gè)氨基酸)與OP-3相同，且僅在小鼠中發(fā)現(xiàn)。該因子也被稱為OP-3。
BMP-9(110個(gè)氨基酸)也被稱為GDF-5。
BMP-10(108個(gè)氨基酸)已從牛來源被分離。牛和人的蛋白質(zhì)是相同的。
BMP-11(109個(gè)氨基酸)已從牛來源被分離。人和牛的序列是相同的。該蛋白質(zhì)也被稱為GDF-11。
BMP-12(104個(gè)氨基酸)也被稱為GDF-7或CDMP-3。
BMP-13(120個(gè)氨基酸)與GDF-6和CDMP-2相同。
BMP-14(120個(gè)氨基酸)與GDF-5和CDMP-1相同。
BMP-15(125個(gè)氨基酸)在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)。鼠類的這種蛋白質(zhì)與鼠GDF-9最相關(guān)。
這些蛋白質(zhì)中的一些以異二聚體的形式存在。例如，OP-1與BMP-2A相結(jié)合。
由于氨基酸序列同源性程度高(約90％)，BMP-5、BMP-6和BMP-7被認(rèn)為是BMP一個(gè)不同的亞家族。編碼BMP-5和BMP-6的基因位于人染色體6上。編碼BMP-7的基因位于人染色體20上。可從脫礦物質(zhì)的骨骼和骨肉瘤細(xì)胞分離BMP。已知它們?cè)谂咛ジ鞣N上皮組織和間充質(zhì)組織中表達(dá)。已知一些BMP(例如BMP-2和BMP-4)將引發(fā)性質(zhì)上完全相同的結(jié)果(形成軟骨和骨骼)并有相互取代的能力。
骨生成蛋白和相關(guān)的BMP通過作為使單核細(xì)胞循環(huán)的有效化學(xué)引誘物，此外還通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞合成和分泌TGF-β1，也促進(jìn)軟骨成骨級(jí)聯(lián)中的額外連續(xù)步驟。TFG-β刺激下的單核細(xì)胞分泌許多趨化因子和促有絲分裂細(xì)胞因子到條件培養(yǎng)基，這可聚集內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)膠原和相關(guān)基質(zhì)組分的合成。
骨骼再生療法本發(fā)明揭示了將感興趣的DNA序列輸送到哺乳動(dòng)物宿主結(jié)締組織的體外和體內(nèi)技術(shù)。所述體外技術(shù)包括靶結(jié)締組織細(xì)胞培養(yǎng)基，在體外將DNA序列、DNA載體或其他有意義的傳輸載體轉(zhuǎn)染入結(jié)締組織細(xì)胞，接著將修飾過的結(jié)締組織細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物宿主的目標(biāo)骨缺損部位，這樣在體內(nèi)影響有意義基因產(chǎn)物的表達(dá)。
應(yīng)該明白可能的是，將所述物質(zhì)例如框架結(jié)構(gòu)、矩陣或生物粘附例如棕黃層或其他化學(xué)粘附，還有各種外來組織和生物可容性載體，以及其他輔助材料可與本發(fā)明的遺傳修飾細(xì)胞一起植入。一方面，本發(fā)明包括治療組合物中的生物粘附劑，從而有利于遺傳修飾的結(jié)締組織細(xì)胞和骨缺損部位或鄰近部位接觸。作為選擇，可能將這種物質(zhì)排除在本發(fā)明給藥系統(tǒng)中的組合物之外。
普通的技工將會(huì)明白治療人類患者優(yōu)選的細(xì)胞來源是患者自己的結(jié)締組織細(xì)胞，例如自體成纖維細(xì)胞或骨祖細(xì)胞(骨祖細(xì)胞)、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞，也可以應(yīng)用同種異體細(xì)胞。
更特殊的，這種方法包括運(yùn)用一種屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族一員的基因產(chǎn)物，或具有生物活性的衍生物或其片段。
在本發(fā)明另外一種實(shí)施方案中，所提供的以治療有效量胃腸外對(duì)患者施用包含TGF-β超家族蛋白質(zhì)和合適藥物載體的化合物。
本發(fā)明另外一種實(shí)施方案提供了以預(yù)防有效量胃腸外對(duì)患者施用包含TGF-β超家族蛋白質(zhì)和合適藥物載體的化合物。
在本申請(qǐng)中，提供了一種通過注射一種合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生或再生骨的方法，這種細(xì)胞用編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族一員的基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括但不局限于BMP-2和TGF-β1、2和3，BMP-2是典型的實(shí)施例。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，明白了可以將細(xì)胞注入骨產(chǎn)生或再生的部位，而需要或不需要腳手架材料或任何其他輔助材料，例如外來細(xì)胞或其他生物相容的載體。即被修飾過的細(xì)胞可被注入骨再生的部位，而沒有任何其他結(jié)構(gòu)或框架的幫助。在本發(fā)明一種實(shí)施方案中，這樣的附加物質(zhì)揭示于，例如美國(guó)專利第5,842,477號(hào)中，并排除在本發(fā)明的組合物之外。
本發(fā)明的方法可應(yīng)用于身體中所有類型的骨，包括但不局限于，非-連接的骨折(不能愈合的骨折)，顱面重建、由于腫瘤切除的部分缺損，在髖移植矯正周圍的骨增加(例如25％髖移植物被現(xiàn)存移植物代替，因?yàn)轶y移植物的壽命僅僅＜10年)，為了牙齒的原因頜骨的骨重建。而且，其他靶骨包括用作脊柱融合的椎骨，大骨等等。
被修飾的細(xì)胞包括任何合適的哺乳動(dòng)物結(jié)締組織細(xì)胞，它會(huì)有助于骨的形成，包括但不局限于成纖維細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，還包括軟骨細(xì)胞。然而，可以明白其他非-遺傳修飾的細(xì)胞也可被包括在用來接觸骨缺損部位的組合物中，例如成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等等。
作為體外處理宿主細(xì)胞的一種選擇，可將編碼有意義產(chǎn)物的基因?qū)胫|(zhì)體，并直接注射入骨折或骨缺陷部位或鄰近部位，其中脂質(zhì)體與結(jié)締組織細(xì)胞融合，導(dǎo)致在體內(nèi)表達(dá)屬于TGF-β超家族的基因產(chǎn)物。
如果提及“骨缺陷”或“缺陷骨”，應(yīng)該明白這種缺陷可包括骨折、斷裂和/或骨的退變，包括由損傷或疾病導(dǎo)致的這些情況，進(jìn)一步還包括脊柱椎骨的缺損，椎體間椎間盤部分的退變。在本發(fā)明的一個(gè)方面，由于椎體間椎間盤退變導(dǎo)致的疼痛可通過融合退變椎間盤周圍的椎體而治療。
作為體外處理宿主細(xì)胞的一種選擇，，將編碼有意義產(chǎn)物的基因?qū)肴睋p骨部位，作為裸露的DNA。所述裸露DNA進(jìn)入結(jié)締組織細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)表達(dá)屬于TGF-β超家族的基因產(chǎn)物。
整個(gè)說明書中揭示的體外治療骨折或骨缺損的方法起初包括制造一種重組病毒或質(zhì)粒載體，它們包含編碼蛋白質(zhì)或其生物活性片段的DNA。接著將這種重組載體用來感染或轉(zhuǎn)染一群體外培養(yǎng)的結(jié)締組織細(xì)胞，從而產(chǎn)生一群包含載體的結(jié)締組織細(xì)胞。接著將這些結(jié)締組織細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物宿主的目標(biāo)骨缺損部位，從而影響接下來缺損部位中蛋白或蛋白片段的表達(dá)。這種有意義DNA序列的表達(dá)對(duì)于完全修復(fù)骨折或缺損是有益的。
更特殊的，這種方法包括運(yùn)用一種能編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族一員的基因或編碼生物活性的衍生物或其片段和一種可選擇的標(biāo)記的基因，或一種生物活性的衍生物或其片段的基因。
本發(fā)明另外一種實(shí)施方案包括運(yùn)用一種能編碼至少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族一員的基因或編碼一種生物活性的衍生物或其片段的基因，以及運(yùn)用任何對(duì)于文中技術(shù)人員來說是所知的DNA質(zhì)粒載體，它們能夠通過輸入穩(wěn)定的保留在靶細(xì)胞或組織中，不管所應(yīng)用的傳輸方法是什么。
本發(fā)明另外一種實(shí)施方案提供了一種將編碼產(chǎn)物的至少一個(gè)基因?qū)虢Y(jié)締組織至少一個(gè)細(xì)胞中的方法，用來治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種方法包括運(yùn)用非-病毒方法將編碼產(chǎn)物的基因?qū)虢Y(jié)締組織細(xì)胞。更特殊的，這種方法包括脂質(zhì)體膠囊化、磷酸鈣共沉淀、電穿孔術(shù)或DEAE-右旋糖苷間介作用，還包括運(yùn)用能夠編碼轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族的一員或其生物活性衍生物或片段，以及一種可選擇標(biāo)記，或生物活性的衍生物或其片段的基因。
本發(fā)明的另外一種實(shí)施方案提供了另外一種將編碼產(chǎn)物的至少一個(gè)基因?qū)虢Y(jié)締組織至少一個(gè)細(xì)胞中的方法，用來治療哺乳動(dòng)物宿主。這種其他方法包括運(yùn)用利用病毒的生物學(xué)方法，將DNA載體分子輸入到靶細(xì)胞或組織。優(yōu)選的，所述病毒是偽-病毒，它的基因組已經(jīng)被改變，這樣偽病毒僅能被傳輸并穩(wěn)定的保留在靶細(xì)胞中，卻沒有保留在靶細(xì)胞或組織中復(fù)制的能力。所述已改變的基因組進(jìn)一步通過重組DNA技術(shù)處理，這樣所述病毒基因組起到了DNA載體分子的作用，它包含在靶細(xì)胞或組織中表達(dá)的有意義的異種基因。
本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案是，通過將TGF-β基因傳輸?shù)讲溉閯?dòng)物宿主結(jié)締組織中而將TGF-β蛋白質(zhì)輸入到目標(biāo)缺損部位，通過應(yīng)用所述說明書中揭示的體外技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。換而言之，編碼功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的有意DNA序列并亞克隆入精選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，接著所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生長(zhǎng)到足夠的效價(jià)，并用它在體外感染培養(yǎng)的結(jié)締組織細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)締組織細(xì)胞，優(yōu)選自體移植的細(xì)胞移植入骨缺損部位或治療有效的鄰近部位。
本發(fā)明另外一種優(yōu)選的方法包括在體內(nèi)應(yīng)用腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體或單純皰疹病毒(HSV)載體直接將TGF-β超家族基因傳輸?shù)讲溉閯?dòng)物宿主的結(jié)締組織中。換而言之，將編碼功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的有意DNA序列亞克隆入各自的病毒載體中。所述包含病毒載體的TGF-β接著生長(zhǎng)到足夠效價(jià)并移植入骨缺損部位或有效成骨的鄰近部位。
將DNA分子呈遞至目標(biāo)關(guān)節(jié)結(jié)締組織的方法包括，但不局限于將DNA分子以膠囊裝入陽(yáng)離子脂質(zhì)體，將有意DNA序列亞克隆在逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒載體中，或?qū)NA分子本身直接注射入骨缺損部位或有效成骨的鄰近部位。所述DNA分子優(yōu)選的作為DNA載體分子出現(xiàn)，或是重組病毒DNA載體分子或重組DNA質(zhì)粒載體分子。有意異種基因表達(dá)的確保是通過將在真核細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子片段直接插入到異種基因編碼區(qū)域的上游。所述文中一個(gè)普通的技術(shù)人員會(huì)利用已知的載體構(gòu)建策略和技術(shù)來保證DNA分子進(jìn)入結(jié)締組織后有合適的表達(dá)水平。
文中的那些技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，所述運(yùn)用脂質(zhì)體的病毒載體不會(huì)被細(xì)胞分裂所限制，后者是逆轉(zhuǎn)錄病毒影響結(jié)締組織細(xì)胞感染和整合所需的。這種先前所述的運(yùn)用非病毒途徑的方法包括運(yùn)用一種能夠編碼屬于TGF-β超家族一員的基因和可選擇性的標(biāo)記基因，例如抗生素抵抗基因。
本發(fā)明另外一種實(shí)施方案包括在轉(zhuǎn)移細(xì)胞之前保存結(jié)締組織細(xì)胞。文中那些技術(shù)人員意識(shí)到所述結(jié)締組織細(xì)胞可冷凍保存在10％的DMSO液態(tài)氮中。
本發(fā)明者通過轉(zhuǎn)染BMP-2表達(dá)結(jié)構(gòu)制造穩(wěn)定的成纖維細(xì)胞系。這些BMP-2制造的細(xì)胞將活性BMP-2的高濃度在體內(nèi)維持較長(zhǎng)時(shí)間。
使骨質(zhì)疏松性骨折愈合的治療骨質(zhì)疏松是一種由于骨質(zhì)丟失而導(dǎo)致的骨骼結(jié)構(gòu)性退變，產(chǎn)生的原因有骨形成的不平衡、骨再吸收或兩者都有，這樣再吸收支配了骨形成階段，因此減少了所作用骨的承重能力。對(duì)于一個(gè)健康的成年人來說，骨的形成和再吸收率是緊密協(xié)調(diào)的，這樣就維持了骨骼的更新。然而，在骨質(zhì)疏松的個(gè)體中，這些骨重塑循環(huán)中產(chǎn)生了不平衡，這導(dǎo)致了骨量的丟失以及骨連續(xù)性中微結(jié)構(gòu)缺陷的形成。這些由于重塑順序混亂產(chǎn)生的骨骼缺損累積起來并最終達(dá)到一個(gè)點(diǎn)，骨骼的結(jié)構(gòu)完整性嚴(yán)重?fù)p害，就可能發(fā)生骨折。雖然這種不平衡在大多數(shù)個(gè)體中是隨著他們的衰老(“老年性骨質(zhì)疏松”)而逐漸形成的，但它在絕經(jīng)后的婦女中嚴(yán)重的多，并以較快的率發(fā)展。此外，骨質(zhì)疏松也會(huì)來源于營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)分泌的不平衡，遺傳性疾病和許多惡性轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是發(fā)明在受骨折之苦患者中產(chǎn)生骨的方法和組合物，這種患者，例如受骨量減少疾病的痛苦，特別的所述疾病導(dǎo)致了骨重塑的不平衡。另外一個(gè)目標(biāo)是增加骨的生長(zhǎng)，從而修復(fù)受骨疾病之苦兒童的骨折，包括代謝性骨疾病。還有一個(gè)目標(biāo)是修復(fù)有骨量丟失風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的骨折，包括絕經(jīng)后的婦女、衰老的個(gè)體和血液透析的患者。另外一個(gè)目標(biāo)是提供修復(fù)結(jié)構(gòu)損害骨微結(jié)構(gòu)缺陷的方法和組合物，包括修復(fù)骨折。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是刺激骨形成和增加骨量，任選的通過延長(zhǎng)的時(shí)間，特別是為了降低由于骨骼結(jié)構(gòu)性退變而產(chǎn)生的新骨折發(fā)生率。
Namkung-Matthai等，Bone，2880-86(2001)揭示了一種大鼠骨質(zhì)疏松模型，其中對(duì)骨折后早期的骨修復(fù)進(jìn)行了研究。早期表示骨折后3-6周。Kubo等，SteroidBiochemistry&Molecular Biology，68197-202(1999)也揭示了一種大鼠骨質(zhì)疏松模型，其中對(duì)骨折后晚期的骨修復(fù)進(jìn)行了研究。晚期表示骨折后大約12周。這些參考條目對(duì)于大鼠骨質(zhì)疏松模型的揭示以及涉及骨質(zhì)疏松的數(shù)據(jù)這里都完整包含進(jìn)來作參考。
另一方面，本發(fā)明旨在發(fā)明加強(qiáng)脊柱動(dòng)物骨移植的方法，例如哺乳動(dòng)物，通過根據(jù)本發(fā)明在或鄰近骨折或斷裂部位施用遺傳修飾的細(xì)胞。
骨折愈合測(cè)定在文中是已知的，包括骨折技術(shù)、組織學(xué)分析和生物機(jī)械分析，描述于例如，美國(guó)專利第6,521,750號(hào)，完整的將它們對(duì)于導(dǎo)致骨折和測(cè)定骨折程度的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則和修復(fù)過程，特別是骨質(zhì)疏松受試者的揭示包含進(jìn)來作參考。
在治療性的申請(qǐng)中，如果一種治療有效的組合物和所述結(jié)締組織細(xì)胞聯(lián)合施用時(shí)，TGF-β蛋白配制用作局部施用。技術(shù)和制劑通常見于Remington’s PharmaceuticalScience，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，latest edition。所述活性成分TGF-β蛋白通常和一種載體結(jié)合，例如賦形劑稀釋液，包括填充劑、混合劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、表面活性劑、腐蝕聚合物或潤(rùn)滑劑，這依賴于給藥方式和劑量形式的特點(diǎn)。典型的劑量形式包括粉末、液體制劑，包括懸浮液、乳劑和溶液，顆粒和膠囊。
其他合適的藥物載體的實(shí)施例是各種陽(yáng)離子脂類，包括但不局限于N-(1-2，3-二油基氧)丙基)-n，n，n-三甲基氯化銨(DOTMA)和二油基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphophotidylethanolamine)(DOPE)。脂質(zhì)體也是本發(fā)明TGF蛋白分子合適的載體。其他合適的載體是緩慢-釋放的凝膠或包含TGF蛋白分子的聚合物。
所述TGF-β蛋白可與一定量生理上可接受的載體或稀釋劑混合，例如鹽溶液或其他合適液體。所述TGF-β蛋白分子也可與其他載體裝置結(jié)合而保護(hù)TGF-β蛋白和其生物活性形式免受降解，直至到達(dá)他們的目標(biāo)和/或促進(jìn)TGF-β蛋白或其生物活性形式移動(dòng)穿過組織屏障。
脊柱融合的基因治療本發(fā)明旨在發(fā)明一種融合脊柱靶椎體的方法，通過在需要融合椎體的脊柱部位施用本發(fā)明的組合物。成骨有效量的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染結(jié)締組織細(xì)胞，這種成纖維細(xì)胞或骨祖細(xì)胞和缺損部位或其成骨有效部位接觸，由醫(yī)生選擇單次注射或多次注射，使之最佳，從而導(dǎo)致了靶椎體的融合。
脊柱是一個(gè)頂部互相堆疊在一起的骨(椎骨)柱，在它們之間有緩沖的盤(椎間盤)。在脊柱的中央是脊髓。脊神經(jīng)來自于脊髓，并從椎體之間的空隙離開脊柱。凸出或脫出的椎間盤會(huì)壓迫存在的神經(jīng)根。不穩(wěn)定的脊柱使得骨之間相互滑動(dòng)和摩擦，導(dǎo)致后背疼痛，有時(shí)候會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)損害。
開展脊柱融合手術(shù)的對(duì)象通常是脊柱大體不穩(wěn)(不正常運(yùn)動(dòng))，過度活動(dòng)引起的嚴(yán)重椎間盤退變性疾病，脊椎前移(一個(gè)椎體滑移超過另外一個(gè))，對(duì)于其他治療無反應(yīng)的面(關(guān)節(jié))疾病，以及骨折或腫瘤。脊柱融合治療最佳的候選者是那些椎間盤非常不正常，以致椎體間的空間坍塌了50％或更多，或已經(jīng)坍塌這樣周圍骨變成了刺激。
骨移植，通常移植物用來在脊柱融合手術(shù)期間增加穩(wěn)定性。在部分椎間盤被去除后，椎骨變粗糙，將其塑形接受移植物。過了一段時(shí)間后，所述移植物將鄰近節(jié)段的椎體融合在一起。當(dāng)骨融合后，椎體不再單獨(dú)移動(dòng)。這就使得脊柱更加穩(wěn)定。典型的，釘、板、籠、金屬棒和其他移植物可應(yīng)用于脊柱融合手術(shù)中來增加穩(wěn)定性。
治療性組合物在本發(fā)明另外一種實(shí)施方案中，提供了一種以預(yù)防或治療有效劑量經(jīng)胃腸外施用給患者的化合物，它包含編碼結(jié)締組織細(xì)胞的TGF-β超家族基因和一種合適的藥物載體。
在治療的申請(qǐng)中，所述結(jié)締組織細(xì)胞含有一種編碼TGF-β超家族一員的基因，這種細(xì)胞可配制用作局部給藥。在本發(fā)明中，所述結(jié)締組織細(xì)胞通常和一種載體結(jié)合起來，例如賦形劑的稀釋液，可包含填充劑、混合劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、表面活性劑、腐蝕聚合物或潤(rùn)滑劑，這依賴于給藥方式和劑量形式的特點(diǎn)。
適合注射應(yīng)用的藥物形式包括無菌水溶液(其中是水可溶的)或懸浮液，以及用作臨時(shí)配制無菌可注射溶液或懸浮液的無菌粉末。在所有情況下，所述劑量形式必須是無菌的，它的流動(dòng)性要到簡(jiǎn)單可注射的程度。它在制造和保存的條件必須穩(wěn)定，并且必須防止微生物的污染，例如細(xì)菌和真菌。所述載體必須是溶劑或分散型介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙烯二醇等等)，它們合適的混合物或植物油。維持合適的流動(dòng)性可通過，例如應(yīng)用涂層，如卵磷脂，在分散體的情況下維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑。預(yù)防微生物的作用可通過各種抗菌和抗真菌劑獲得，例如三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、theomersal等。在許多情況下，優(yōu)選的包括等滲劑，例如糖或氯化鈉?？赏ㄟ^延遲吸收所述試劑組合物而獲得所述可注射組合物的延長(zhǎng)吸收，例如利用單硬脂酸鋁和白明膠。
尤其有利的是將胃腸外的組合物配制在劑量單位形式中，從而方便給藥及劑量的統(tǒng)一。這里應(yīng)用的劑量單位形式是指實(shí)體上分離的單位，是治療哺乳動(dòng)物受試者合適的單一劑量；每個(gè)單位都包含預(yù)先決定量的活性材料，計(jì)算這些量聯(lián)合所需載體可以產(chǎn)生理想的治療作用。對(duì)于本發(fā)明劑量單位形式的詳述，受規(guī)定為并直接依賴于(a)所述活性材料的獨(dú)特特點(diǎn)以及獲得的特殊治療作用，以及(b)文中對(duì)化合物的限制，例如它是用來治療身體健康損害的活受試者疾病的活性材料。
所述主要的活性成分以有效量配制為方便和有效的給藥，并與合適的藥物可接受載體一起配制在劑量單位形式中。在包含輔助活性成分的組合物中，所述劑量參考常規(guī)劑量以及所述成分的給藥方式?jīng)Q定。
傳輸系統(tǒng)各種傳輸系統(tǒng)是已知的，并可用來施用本發(fā)明的組合物，例如脂質(zhì)體中的膠囊，微顆粒、微膠囊，能夠表達(dá)所述化合物的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，構(gòu)建一種核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體的一部分等等，也可與其他生物活性劑一起施用?？梢韵到y(tǒng)或局部給藥。
在特殊的實(shí)施方案中，理想是將本發(fā)明的化合物或組合物局部施用到需要治療的部位；這可以通過，但不是為了限制，例如在手術(shù)中局部輸注，利用栓劑或移植物，所述移植物是多孔、非多孔或明膠材料，包括細(xì)胞膜，例如sialastic膜或纖維。
本發(fā)明不局限于這里描述的特殊實(shí)施方案的限制。實(shí)際上，除了這里的描述外，根據(jù)先前的描述和附圖，本發(fā)明的各種修改對(duì)于那些文中的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改確定在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。為了闡明本發(fā)明給出了以下的實(shí)施例，而不是為了限制。
實(shí)施例實(shí)施例1-骨再生的實(shí)驗(yàn)步驟用人類胎腦cDNA和兩種引物通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))克隆人類BMP2基因。5’引物是5’-TCCCAGCGTGAAAAGAGAGACTGC-3’(SEQ ID NO1)，3’引物是5’-TTTTGCTGTACTAGCGACACCCACAACC-3’(SEQ ID NO2)。在利用富含GC的PCR系統(tǒng)(Roche)后，應(yīng)用TOPO TA克隆成套工具(Invitrogen)克隆入pCRII-TOPO載體(圖1A)。為了克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，用SalI剪切pCRIIbmp2 DNA，并用SalI和NotI懸突將人類BMP2 cDNA插入物綁入pMTMLV中(圖1B)。在轉(zhuǎn)染前一天培養(yǎng)打包細(xì)胞系GP-293細(xì)胞(5×105細(xì)胞/p60培養(yǎng)皿)。應(yīng)用Fugene(Roche)將pMTMLV或pMT-BMP2轉(zhuǎn)染至GP-293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將新霉素加入培養(yǎng)基中，用來篩選抗新霉素細(xì)胞。篩選持續(xù)10天。培養(yǎng)選出293MT和293MTBMP2細(xì)胞(5×105細(xì)胞/p60培養(yǎng)皿)用作第二天的編碼質(zhì)粒pVSVG包膜的轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，為了感染鍍靶細(xì)胞NIH3T3(5×105細(xì)胞/p60培養(yǎng)皿)。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清過濾通過低蛋白粘合過濾器(0.45μm)，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用相同體積的DMEM稀釋。去除NIH3T3培養(yǎng)基，并用過濾所得的上清替代。加入polybrene使得最終濃度為8μg/ml。在感染兩天后，開始新霉素篩選以獲得NIH3T3-neo和NIH3T3-BMP-2細(xì)胞穩(wěn)定的細(xì)胞系。篩選持續(xù)10天。在24小時(shí)后測(cè)定產(chǎn)生的BMP2的量大約是150ng/105細(xì)胞。
實(shí)施例2-將NIH3T3-BMP-2細(xì)胞注射入兔選擇體重2.0-2.5kg的新西蘭白兔用作動(dòng)物研究。暴露脛骨，并用骨科器械制造一個(gè)缺損(2cm長(zhǎng)、0.5cm深)。在縫合后，將對(duì)照的NIH3T3-neo或NIH3T3-BMP-2細(xì)胞(2ml 2×106細(xì)胞/ml)注射入缺損部位。在注射所述細(xì)胞8周后，進(jìn)行放射分析和組織學(xué)檢查。
實(shí)施例3-每周X線檢查選擇體重2.0-2.5kg的新西蘭白兔用作動(dòng)物研究。暴露脛骨，并用骨科器械制造一個(gè)缺損(2cm長(zhǎng)、0.5cm深)。在縫合后，將NIH3T3-BMP-2細(xì)胞(2ml 2×106細(xì)胞/ml)注射入脛骨的缺損部位。接著在注射細(xì)胞后1、2、3、4、5、6和7周進(jìn)行X線放射分析。在注射后7周收獲樣本，并繪圖。在收獲后進(jìn)行組織學(xué)檢查。
圖2A-2F顯示用NIH3T3-BMP-2成纖維細(xì)胞的骨再生。圖1A和1B顯示了注射對(duì)照NIH3T3成纖維細(xì)胞(A)和NIH3T3-BMP-2細(xì)胞(B)8周后的腿骨圖。圖2C-2F顯示了在處死動(dòng)物之前對(duì)照(C&D)和實(shí)驗(yàn)(E&F)腿骨的X線檢查。用表達(dá)BMP-2蛋白細(xì)胞治療的骨缺損在注射8周后愈合，而在用對(duì)照成纖維細(xì)胞處理的缺損中不產(chǎn)生骨再生。
圖3A-3D顯示了再生骨組織的組織學(xué)檢查。制造再生骨組織的石蠟切片并用Mason’s三色染色。結(jié)果顯示，再生骨組織(RB)的結(jié)構(gòu)幾乎和正常骨組織(NB)的相同。圖3A和3B顯示了低倍放大(40x)，圖3C和3D顯示了高倍放大(100x)。點(diǎn)線表示再生和正常骨組織之間的邊界。這些結(jié)果表明再生骨組織的量和正常骨組織的相似。
圖4A-4I顯示了用NIH3T3-hBMP2成纖維細(xì)胞的骨再生。在縫合后將NIH3T3-BMP-2細(xì)胞(2ml 2×106細(xì)胞/ml)注入脛骨的缺損部位。在注射所述細(xì)胞后的1、2、3、4、5、6和7周進(jìn)行(A到G)X線分析。結(jié)果顯示在注射所述細(xì)胞后3周，缺損已經(jīng)開始被新產(chǎn)生的骨組織填充，并在注射后6周完成。(H)在注射后7周收集樣本并繪圖。這張圖也顯示了再生骨組織完全填充了缺損。(I)在收獲后進(jìn)行組織學(xué)檢查。顯示Mason’s三色染色的結(jié)果。染色的結(jié)果表明被修復(fù)的骨組織和正常骨組織有相似的特點(diǎn)。
圖5A-5I顯示了用對(duì)照DMEM培養(yǎng)基的骨再生。在縫合后將對(duì)照DMEM培養(yǎng)基(2ml)注入脛骨的缺損部位。在注射所述培養(yǎng)基1、2、3、4、5、6周后進(jìn)行(A到G)X線分析。所得結(jié)果，和NIH3T3-hBMP2成纖維細(xì)胞的數(shù)據(jù)相比，顯示所述缺損即使在注射細(xì)胞6周后也沒有被完全填充。(H)在注射后6周收集樣本并繪圖。這張圖也顯示了不完全填充的缺損。(I)在收獲后進(jìn)行組織學(xué)檢查。顯示Mason’s三色染色的結(jié)果。
實(shí)施例4-用NIH3T3-BMP2注射骨質(zhì)疏松大鼠所述骨質(zhì)疏松大鼠模型，例如揭示于Kubo等，Steroid Bioche-mistry & MolecularBiology，68197-202，1999；和Namkung-Matthai等，Bone，2880-86，2001。暴露脛骨，并用骨科器械制造一個(gè)缺損(2cm長(zhǎng)、0.5cm深)。在縫合后，將對(duì)照的NIH3T3-neo或NIH3T3-BMP-2細(xì)胞(2ml 2×106細(xì)胞/ml)注射入缺損部位。以數(shù)周間隔，尤其在注射所述細(xì)胞8周后，進(jìn)行放射分析和組織學(xué)檢查。
實(shí)施例5-脊柱融合的實(shí)驗(yàn)步驟克隆人類BMP2并轉(zhuǎn)染至NIH3T3，正如上面的實(shí)施例1所述。分別培養(yǎng)來自人類(包皮成纖維衍化細(xì)胞系，I型(Phase I))，小鼠(NIH-3T3，I型(Phase I))，大鼠(Lewis大鼠假關(guān)節(jié)纖維組織衍化細(xì)胞，II型(Phase II))以及人類(假關(guān)節(jié)纖維/疤痕組織衍化成纖維細(xì)胞，II型(Phase II))的粘附成纖維細(xì)胞并用BMP-2 cDNA通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。應(yīng)用Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Cellgro，Herndon，Vir-gina)，10％熱失活的胎牛血清(Gibco BRL，Grand Island，New York)和青霉素及鏈霉素(Cellgro，Herndon，Virgina)使細(xì)胞在60mm的皿中生長(zhǎng)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒-BMP-2或-lacZ(陰性對(duì)照)感染成纖維細(xì)胞4小時(shí)/天持續(xù)2天。完成ELISA來測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度(ng/ml)。對(duì)于每個(gè)樣本，將量為5×106，10×106，20×106BMP-2產(chǎn)生的細(xì)胞吸收到1×0.5cm的膠原止血海綿上(ACS，Helistat，Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)。將0.16-0.18mg/ml rhBMP-2(Genetics Institute，Cambridge，MA)吸到1×0.5cm ACS(陽(yáng)性對(duì)照)上。將Morselized髂嵴骨放在融合部位。
例6-將細(xì)胞注射入大鼠的脊柱應(yīng)用總共48只雌性成年(3-4個(gè)月)無胸腺rnu/rnu大鼠(I型24只；II型24只)。麻醉大鼠。應(yīng)用后正中線途徑暴露L4和L5的橫突。應(yīng)用一種高速鉆僅剝離橫禿。沖洗部位(抗生素-ringers溶液)。在L4和L5橫突床之間植入細(xì)胞/ACS。每?jī)芍苓M(jìn)行一次X線檢查，直至處死。手觸L4-L5節(jié)段。在橫突間發(fā)現(xiàn)有移動(dòng)就認(rèn)為是融合失敗。進(jìn)行非-脫鈣組織學(xué)檢查。
圖6A和6B顯示了大鼠TG001應(yīng)用可吸收膠原海綿(ACS)載體在后外側(cè)橫突間處理融合植入細(xì)胞4和6周后的X線圖。在利用用于BMP-2后外側(cè)橫突間處理融合研究的cDNA轉(zhuǎn)染5×106成纖維細(xì)胞(小鼠)后，X線上左側(cè)富集了橋骨。注意右側(cè)如果有的話，可能細(xì)胞較少，骨形成較少。正如所示，骨再生并且脊柱融合了。
這里所有引用的參考數(shù)目都完整的包含進(jìn)來做參考。
雖然為了闡明本發(fā)明特殊的實(shí)施方案，已經(jīng)在上面進(jìn)行了描述，但對(duì)于那些文中的技術(shù)員來說，顯而易見的是本發(fā)明細(xì)節(jié)的可發(fā)生各種變化但不背離本發(fā)明，正如所附權(quán)利要求所限定的。
序列表<110>組織基因股份有限公司(TissueGene，Inc.)S.U.宋(Song，Sun，Uk)Y.伊(Yi，Youngsuk)K.H.李(Lee，Kwan，Hee)M.J.諾(Noh，Moon，Jong)H.白(Bae，Hyun)<120>通過基因治療的骨生成<130>55293-32USA<150>us 60/369,100<151>2002-03-28<150>us 60/405,413<151>2002-08-22<160>2<170>PatentIn Version.3.2<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1tcccagcgtg aaaagagaga ctgc24<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ttttgctgta ctagcgacac ccacaacc28
權(quán)利要求
1.一種在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，其特征在于，所述方法包括a)將編碼具有骨再生功能的蛋白質(zhì)的基因插入載體，并操作性連接于啟動(dòng)子，和b)用所述重組載體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一群結(jié)締組織細(xì)胞；和c)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞移植到骨缺陷部位，并使骨缺陷部位形成骨。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體是質(zhì)粒載體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基因?qū)儆赥GF-β超家族。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述基因編碼BMP。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述基因編碼BMP-2。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述結(jié)締組織是成纖維細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述結(jié)締組織細(xì)胞是骨祖細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述骨在早期產(chǎn)生。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述骨在晚期產(chǎn)生。
11.一種融合脊柱的方法，其特征在于，所述方包括a)將編碼具有骨形成功能的蛋白質(zhì)的基因插入載體；b)用所述重組載體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一群結(jié)締組織細(xì)胞；和c)使成骨有效量的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)締組織細(xì)胞群及其藥學(xué)上可接受的載體和脊柱接觸，這樣編碼基因的DNA序列在脊柱表達(dá)導(dǎo)致了骨生成，由此脊柱融合了。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述載體是質(zhì)粒載體。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述結(jié)締組織是成纖維細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述結(jié)締組織細(xì)胞是骨祖細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述基因?qū)儆赥GF-β超家族。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述基因編碼BMP。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述基因編碼BMP-2。
19.一種愈合骨質(zhì)疏松性骨折的方法，包括a)將編碼具有骨再生功能的蛋白質(zhì)的基因插入載體，b)用所述重組載體在體外轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)一群結(jié)締組織細(xì)胞；和c)將結(jié)締組織細(xì)胞導(dǎo)入骨折部位，并使骨折愈合。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述載體是質(zhì)粒載體。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述基因?qū)儆赥GF-β超家族。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述基因編碼BMP。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述基因編碼BMP-2。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述骨在早期產(chǎn)生。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述骨在晚期產(chǎn)生。
全文摘要
本申請(qǐng)揭示了一種在受低骨量折磨的患者骨缺陷部位形成骨的方法，包括將編碼具有骨再生功能蛋白質(zhì)的基因插入結(jié)締組織細(xì)胞，操作性連接于啟動(dòng)子，并將哺乳動(dòng)物細(xì)胞移植入骨缺陷部位，從而使骨缺陷部位形成骨。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1656223SQ03812002
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月28日
發(fā)明者S·U·宋, 李泳錫, 李寬熙, 盧文鐘, H·裴 申請(qǐng)人:組織基因股份公司