專利名稱：抗微生物聚合物軛合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗微生物劑與水溶性聚合物的軛合從而在它們的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和降低的免疫原性方面改善它們的臨床性質(zhì)。更具體地，本發(fā)明涉及抗微生物劑例如溶葡萄球菌素與聚(烯化氧)例如聚(乙二醇)(PEG)的軛合。
背景技術(shù)：
A.溶葡萄球菌素溶葡萄球菌素是有效的抗微生物劑，首先在模仿葡萄球菌(從前稱作S.staphylolyticus)中被識(shí)別。溶葡萄球菌素是細(xì)菌的肽鏈內(nèi)切酶，能夠斷裂葡萄球菌細(xì)胞壁中特定的交聯(lián)多聚甘氨酸橋，因此對(duì)葡萄球菌是高度致命的。溶葡萄球菌素以單一多肽鏈表達(dá)，其分子量大約為27kDa。
金黃色葡萄球菌(一種凝固酶陽性的葡萄球菌)的細(xì)胞壁橋中包含高比例的甘氨酸，因此溶葡萄球菌素對(duì)于溶解金黃色葡萄球菌是尤其有效的。業(yè)已證明溶葡萄球菌酶具有溶解表皮葡萄球菌的能力。
金黃色葡萄球菌是高度有毒的人類病原體。它是從局部皮膚感染到危及生命的菌血癥和重要器官感染的多種人類疾病的誘因。如果沒有被迅速地控制，金黃色葡萄球菌感染能夠快速地從感染的最初部位擴(kuò)散至其它器官。雖然感染的病灶可能不是明顯的，但是對(duì)感染尤其易感的器官包括心臟瓣膜、腎、肺、骨、腦膜和燒傷患者的皮膚。
葡萄球菌感染，例如由金黃色葡萄球菌引起的那些，是發(fā)病率和死亡率的重要原因，尤其是在例如醫(yī)院、學(xué)校和醫(yī)務(wù)室的環(huán)境中。尤其危險(xiǎn)的患者包括嬰兒、老年人、免疫受損者、免疫抑制者和那些患有慢性病需要頻繁住院者。
處于受葡萄球菌感染的危險(xiǎn)最大的患者是那些正在進(jìn)行住院或門診手術(shù)的、在重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中的、在連續(xù)血液透析的、有HIV感染的、有AIDS的、燒傷受害者、由于治療或疾病而使天然免疫性減小的人、慢性病或疲勞過度的患者、老年人群、具有未成熟的免疫系統(tǒng)的嬰兒和帶有血管內(nèi)裝置的人。
Climo等的美國(guó)專利6,028,051公開了治療葡萄球菌疾病的方法。相對(duì)高劑量的溶葡萄球菌素，每千克體重至少50且優(yōu)選100毫克溶葡萄球菌素，被用于治療。相對(duì)高劑量的溶葡萄球菌素可以用于單劑量治療或多劑量治療。溶葡萄球菌素類似物可以單獨(dú)地應(yīng)用或與另外的抗菌素制劑結(jié)合使用?！?51專利也公開了溶葡萄球菌素基因的克隆和測(cè)序使得可能分離具有與那些野生型的溶葡萄球菌素相同或不同性質(zhì)的溶葡萄球菌素的變異體形式。
O′Callaghan的美國(guó)專利6,315,996公開了利用溶葡萄球菌素作為用于局部治療葡萄球菌角膜感染的有效抗生素的方法。Blackburn等的美國(guó)專利5,760,026公開了應(yīng)用溶葡萄球菌素根除和治愈葡萄球菌感染的方法，包括通過乳房?jī)?nèi)注入治愈乳腺炎。此方法直接應(yīng)用于奶牛。
然而，小蛋白(低于大約70kDa)，例如溶葡萄球菌素，在靜脈注射后在血液中具有相對(duì)短的半衰期。溶葡萄球菌素從循環(huán)中的快速清除會(huì)減少其功效。同時(shí)，因?yàn)槿芷咸亚蚓貋碓从诩?xì)菌類并且因此對(duì)任何哺乳動(dòng)物種類都是異質(zhì)，其也是非常免疫原性的分子，這進(jìn)一步刺激了它從血液中的清除，特別是在與葡萄球菌有過先前接觸的患者中。因此，葡萄球菌的短暫的循環(huán)半衰期不能通過增加劑量或給藥頻率來被有效地對(duì)抗。存在增加溶葡萄球菌素的循環(huán)半衰期而不增加給藥的量或頻率的方法的需求。甚至更加希望的是增加溶葡萄球菌素的循環(huán)半衰期，與此同時(shí)減少給藥的量或頻率。
B.聚合物軛合生物活性的多肽與水溶性聚合物例如PEG的軛合是眾所周知的。PEG化作用(PEGylation)是一種方法，其中治療性多肽例如酶和激素與聚乙二醇的一個(gè)或多個(gè)鏈相結(jié)合以在藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和免疫原性方面提供改善的臨床性質(zhì)。
PEG化作用可以改變多肽的性質(zhì)而不影響母體分子作用的能力，從而產(chǎn)生有生理活性的、免疫原性降低的或無免疫原性的、水溶性多肽組合物。此聚合物通過減少多肽的清除和對(duì)酶降解的敏感性來保護(hù)其防止活性喪失，并且此組合物可以被注射入哺乳動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)而基本上無免疫源應(yīng)答。酶和其它多肽的PEG化作用在Davis等的美國(guó)專利4179337和Zalipsky的“Functionalized Poly(ethylene glycol)for Preparation of Biologically Relevant Conjugates”，Bioconiugate Chem.，6，150-165(1995)中有詳細(xì)描述，這兩篇文獻(xiàn)在此被全文引入作為參考。
Davis等公開了用PEG修飾的多肽具有顯著降低的免疫原性和抗原性。PEG軛合物顯示寬范圍的溶解度和低毒性，并且已經(jīng)顯示在血流中的停留相當(dāng)大地長(zhǎng)于相應(yīng)的天然化合物，還能容易地被排泄。已經(jīng)顯示軛合物不干擾血流中其它酶的活性或者與它們軛合的多肽的構(gòu)象。
通過兩種通常應(yīng)用的連接類型能典型地完成PEG軛合。一種類型的軛合是使多肽氨基基團(tuán)與具有活性碳酸鹽、酯、醛或tresylate基團(tuán)的PEG分子反應(yīng)。另一種類型的軛合是使多肽硫醇基與具有活性乙烯基砜、馬來酰亞胺、鹵代?；騮hiorthopyridyl基團(tuán)或其它合適的親電體的PEG分子反應(yīng)。例如見Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，San Diego 1966)。當(dāng)分子間的交聯(lián)不合需要時(shí)，PEG的兩個(gè)末端羥基中的一個(gè)羥基通過轉(zhuǎn)變成烷氧基進(jìn)行封閉。具有一個(gè)末端甲氧基基團(tuán)的PEG分子被稱作mPEG。
PEG分子可以是直鏈或支鏈的，由此PEG軛合物的建立可以是通過軛合單個(gè)大PEG部分至單個(gè)軛合位點(diǎn)、軛合單個(gè)支鏈(但是較小)PEG部分至單個(gè)軛合位點(diǎn)，或者軛合若干小PEG部分至多個(gè)軛合位點(diǎn)。當(dāng)使用多個(gè)軛合位點(diǎn)時(shí)，這會(huì)導(dǎo)致生物活性喪失。除PEG均聚物外，聚合物分子能夠與其它烯基氧化物部分共聚，或者它可以是另一種聚(烯基氧化物)均聚物或共聚物。
已經(jīng)研發(fā)了多種治療蛋白的PEG-軛合物，它們顯示降低的免疫原性和抗原性以及較長(zhǎng)的清除時(shí)間，而保留蛋白生理活性的重要部分。美國(guó)專利4261973描述了降低過敏原的免疫原性的致免疫的過敏原分子的PEG軛合物。美國(guó)專利4301144公開了PEG與血紅蛋白的軛合增加了分子的氧運(yùn)輸能力。美國(guó)專利4732863公開了PEG與抗體的軛合可減少與Fc受體的結(jié)合。EP154316和Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.，84，1487(1987)公開了PEG軛合的淋巴因子例如IL-2。美國(guó)專利4847325公開了PEG與集落刺激因子(CSF-1)的選擇性軛合。
干擾素-2(INF-2)已經(jīng)與單個(gè)、支鏈的PEG分子的琥珀酰亞胺酯軛合而無生物活性喪失，此PEG分子的琥珀酰亞胺酯由兩個(gè)20kDa的單甲氧基PEG鏈通過賴氨酸分子經(jīng)由氨基甲酸乙酯鍵連接而構(gòu)成。這一PEG軛合物通過影響宿主免疫性和增強(qiáng)病毒的免疫清除靶向治療丙型肝炎。INF-2的給藥可以從一周三至七次降低至每周一次，簡(jiǎn)化并改善患者的順應(yīng)性。此外，血清水平維持在最小的峰-谷變化，毒性降低而功效增加。
FDA批準(zhǔn)臨床使用的PEG化的治療多肽包括INF-2、腺苷脫氨酶和門冬酰胺酶的PEG軛合物。等待FDA批準(zhǔn)的PEG化的治療多肽包括IL-2、IL-6和腫瘤壞死因子的PEG軛合物。這些PEG化的產(chǎn)品中的每一個(gè)都包含靶向宿主細(xì)胞活動(dòng)或癌性宿主細(xì)胞但是不靶向微生物的多肽。已經(jīng)公開的蛋白的EG軛合物例如α-1-蛋白酶抑制劑、尿酸酶、超氧化物歧化酶、鏈激酶、血纖維蛋白溶酶原活化因子、IgG、白蛋白、INF-、脂蛋白脂肪酶、辣根過氧化物酶、過氧化氫酶和精氨酸酶。這些蛋白質(zhì)也不靶向微生物。據(jù)報(bào)道PEG軛合改善循環(huán)半衰期、減少免疫原性、增加溶解度和通常增加功效，從而允許較低頻率的給藥。在大多數(shù)情況下，通過這種修飾，每分子需要多個(gè)PEG軛合的蛋白質(zhì)改善體內(nèi)作用并且顯著地降低了體外活性。
公開于2002年1月18日的WO 01/04287公開了通常應(yīng)用誘變的方法修飾多肽，并且尤其是鏈激酶，以改變它們的PEG軛合物的性能。
另外，還沒有公開抗微生物劑的PEG軛合來最優(yōu)化藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。沒有參考文獻(xiàn)公開了抗微生物劑或其突變修飾物與PEG的軛合以便保持其生物活性，同時(shí)也增加其循環(huán)半衰期和功效，并且降低它的抗體結(jié)合和毒性。
發(fā)明概述本發(fā)明克服了前述限制。本發(fā)明提供了抗微生物劑的聚合物軛合以增加體內(nèi)循環(huán)半衰期同時(shí)保留抗微生物活性。這樣修飾的抗微生物劑因此可以被用來以與未修飾的藥劑相比更加降低的和/或更低頻率的劑量治療或預(yù)防感染。
除了在保留抗微生物活性的同時(shí)增加循環(huán)半衰期，通過聚合物軛合獲得的其它優(yōu)點(diǎn)包括降低的抗體結(jié)合和增加的殺傷、減少的免疫原性和與循環(huán)系統(tǒng)表面包括人造移植裝置表面的結(jié)合，它們兩者也可以增加循環(huán)半衰期，不依賴于通過聚合物軛合而增加的分子量獲得的循環(huán)半衰期的增加。
更具體地，本發(fā)明提供與抗微生物劑軛合的水溶性聚合物，這樣至少保留藥物的部分抗微生物活性。適用于本發(fā)明的抗微生物劑包括藥物例如化學(xué)藥品、肽、蛋白質(zhì)和脂肽，這些藥物一旦接觸宿主中的微生物，就通過任意的多種技術(shù)殺死微生物或者抑制微生物的新陳代謝，而不毀壞宿主細(xì)胞或組織或引發(fā)有害的宿主響應(yīng)。可以使用肽和蛋白質(zhì)中的抗微生物酶。
雖然微生物被定義為包括細(xì)菌和真菌，但是由于葡萄球菌感染引起的前面提及的風(fēng)險(xiǎn)，溶解葡萄球菌(staphylolytically)活性抗微生物劑是合乎需要的。在溶解葡萄球菌的活性抗微生物劑中起溶解葡萄球菌的活性酶作用的蛋白質(zhì)和肽包括能夠斷裂葡萄球菌細(xì)胞壁粘肽中的交聯(lián)多聚甘氨酸橋中的蛋白質(zhì)，例如溶葡萄球菌素和溶葡萄球菌素類似物。
水溶性聚合物包括聚(烯基氧化物)、聚氧乙基化的多元醇和聚(乙烯醇)。聚(烯基氧化物)包括PEG類、泊洛沙姆類和poloxamines。聚(烯基氧化物)典型地通過從活性酯形成的酰胺鍵與游離氨基基團(tuán)軛合，例如聚(烯基氧化物)的N-羥基琥珀酰亞胺酯。此聚(烯基氧化物)可以是mPEG，是直鏈的或支鏈的，具有約5-約100kDa的分子量。
在另一方面，本發(fā)明涉及通過給予哺乳動(dòng)物有效量的藥物制劑預(yù)防性或治療性處理哺乳動(dòng)物微生物感染的方法，此藥物制劑包含在可藥用載體中的本發(fā)明的抗微生物軛合物。當(dāng)由具有足夠細(xì)胞壁多聚甘氨酸交聯(lián)的葡萄球菌類引起微生物感染時(shí)，當(dāng)與溶葡萄球菌素接觸時(shí)，此物種的細(xì)胞壁被溶解，可以使用本發(fā)明的溶葡萄球菌素或溶葡萄球菌素類似物軛合物。本發(fā)明方法的這一實(shí)施方案用于治療金黃色葡萄球菌感染是尤其有效的。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供藥物組合物用于發(fā)明的治療方法，其包括在可藥用載體中的本發(fā)明的抗微生物軛合物。
本發(fā)明的前述的和其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)在與附圖結(jié)合的下面陳述的詳細(xì)說明中更容易明白。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.描繪了按照本發(fā)明的溶葡萄球菌素軛合物的細(xì)胞溶解活性，以熱滅活的5型金黃色葡萄球菌為例；圖2.描繪了按照本發(fā)明的溶葡萄球菌素軛合物對(duì)高度無毒的活5型金黃色葡萄球菌的殺滅活性；圖3.是描述PEG保護(hù)溶葡萄球菌素避免結(jié)合抗體的能力的溶葡萄球菌素捕獲的免疫分析；圖4.描繪了與未軛合的溶葡萄球菌素比較，按照本發(fā)明的在兩種不同濃度的一種溶葡萄球菌素軛合物的血清濃度和半衰期；圖5.描繪了按照本發(fā)明的溶葡萄球菌素軛合物對(duì)在生理鹽水中的5型金黃色葡萄球菌的殺滅能力；圖6.描繪了按照本發(fā)明的溶葡萄球菌素軛合物對(duì)在血液中的5型金黃色葡萄球菌的殺滅能力；圖7.是描繪抗葡球菌酶抗體對(duì)按照本發(fā)明的溶葡萄球菌素軛合物的反應(yīng)性的ELISA；圖8.描繪了按照本發(fā)明另一方面的溶葡萄球菌素軛合物在熱滅活的5型金黃色葡萄球菌中的細(xì)胞溶解活性；圖9.描繪了按照本發(fā)明再另一方面的溶葡萄球菌素軛合物在熱滅活的5型金黃色葡萄球菌中的細(xì)胞溶解活性；圖10.描繪了按照本發(fā)明另一方面的溶葡萄球菌素軛合物對(duì)在生理鹽水中的5型金黃色葡萄球菌的殺滅能力；圖11.是描繪抗葡球菌酶抗體對(duì)按照本發(fā)明另一方面的溶葡萄球菌素軛合物的反應(yīng)性的ELISA；圖12.描繪了按照本發(fā)明另一方面的溶葡萄球菌素軛合物的血清濃度和半衰期；圖13.比較按照本發(fā)明的兩種不同分子量的溶葡萄球菌素軛合物對(duì)在生理鹽水中的5型金黃色葡萄球菌的殺滅活性；圖14.描繪了按照本發(fā)明的再另一個(gè)方面的溶葡萄球菌素軛合物對(duì)在生理鹽水中的5型金黃色葡萄球菌的殺滅活性。
詳細(xì)說明對(duì)于本發(fā)明來說，術(shù)語“抗微生物劑”被定義為包括任何物質(zhì)(化學(xué)藥品、蛋白質(zhì)、肽或脂肽，包括酶)，此物質(zhì)一旦例如在宿主中接觸時(shí)，殺滅微生物或抑制微生物新陳代謝，而不損害周圍環(huán)境例如宿主細(xì)胞或組織，或者不會(huì)在與宿主接觸時(shí)引發(fā)有害的宿主響應(yīng)。這包括無聚合物軛合另外損害宿主細(xì)胞或組織或引發(fā)有害的響應(yīng)的物質(zhì)。術(shù)語“微生物”被定義為原生生物，其包括細(xì)菌和真菌。
術(shù)語“溶葡萄球菌素”被定義為包括任何酶，包括溶葡萄球菌素(野生型)、任何溶葡萄球菌素突變體或變異體、任何重組體，或相關(guān)的酶，或任何保留蛋白水解能力的溶葡萄球菌素的合成型或片斷，在體內(nèi)和體外，斷裂葡萄球菌細(xì)胞壁粘肽中的交聯(lián)多聚甘氨酸橋。變異體可以通過蛋白的翻譯后加工(通過在生產(chǎn)菌種中存在的酶或依靠在加工的任意階段引入的酶或試劑)或通過結(jié)構(gòu)基因的變異產(chǎn)生。變異可以包括位點(diǎn)刪除、插入、區(qū)域除去和置換變異。
術(shù)語“溶葡萄球菌素類似物”被定義為包括不是野生型的任何型的溶葡萄球菌素。在本發(fā)明中預(yù)期的溶葡萄球菌素和溶葡萄球菌素類似物可以是從細(xì)胞培養(yǎng)物或較高等的重組體物種例如小鼠或其它中重組地表達(dá)，表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主、昆蟲、細(xì)菌、酵母、爬行動(dòng)物、真菌等，或合成構(gòu)建。這包括保留活性的合成結(jié)構(gòu)，其包括合成肽和多肽或?qū)λ膯为?dú)抗葡萄球菌的活性的溶葡萄球菌素多肽負(fù)責(zé)的溶葡萄球菌素多肽的部分的重組表達(dá)，或作為較大的蛋白或多肽的部分，包括嵌合蛋白質(zhì)，包含一種或多種其它抗微生物蛋白質(zhì)或肽的活性位點(diǎn)，此蛋白質(zhì)或肽是抗葡萄球菌或抗一種或多種其它微生物或細(xì)菌種類有活性的，以提供更寬的活性譜。
溶葡萄球菌素是細(xì)菌以原酶形式天然地產(chǎn)生的，原酶被斷裂以產(chǎn)生全長(zhǎng)型的溶葡萄球菌素?？梢允褂弥亟M的或合成地產(chǎn)生的溶葡萄球菌素制劑，其僅包含完全活性型的溶葡萄球菌素。
同族溶葡萄球菌素的重組表達(dá)和含同族完全活性的溶葡萄球菌素的從表達(dá)的蛋白制備的組合物公開于在2002年12月21日公開的、Jeffery Richard Stinson，Lioubov Grinberg，John Kokai-Kun，AndrewLees和James Jacob Mond申請(qǐng)的、題目為“Truncated LysostaphinMolecule with Enhanced Staphylolytic Activity”的美國(guó)專利申請(qǐng)，此公開文獻(xiàn)在此被全文引入作為參考。此申請(qǐng)要求2001年12月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/341,804的優(yōu)先權(quán)。
上述抗微生物劑例如溶葡萄球菌素和溶葡萄球菌素類似物蛋白質(zhì)經(jīng)由游離氨基與水溶性聚合物軛合，在賴氨酸和精氨酸殘基或在游離氨基基團(tuán)，如果任意，在N-末端。其它合適的抗微生物劑包括乳酸鏈球菌肽、兩性霉素-β等。從最小量一個(gè)高至大約十二個(gè)水溶性聚合物分子能被連接至抗微生物劑的每個(gè)分子。因?yàn)樾揎椀囊粋€(gè)目標(biāo)是比未軛合抗微生物劑增加體內(nèi)半衰期，且減少免疫原性，應(yīng)該選擇軛合的聚合物的數(shù)目和這些分子的重量平均分子量來提供抗微生物劑與表觀重量平均分子量為大約5-40kDa高至大約200kDa的抗微生物劑的聚合物軛合物。
聚(烯基氧化物)，當(dāng)使用時(shí)，典型地具有約1-約100kDa的分子量，更典型地在約2、3或4至約50kDa之間，并且也在約5或10至約40kDa之間，取決于每個(gè)溶葡萄球菌素分子軛合物的數(shù)目。當(dāng)與溶葡萄球菌素軛合時(shí)，每個(gè)溶葡萄球菌素分子可以使用一個(gè)至大約十個(gè)聚(烯基氧化物)分子，典型地使用一個(gè)至約三或四個(gè)，并且更典型的是一個(gè)或兩個(gè)。也可以使用具有混合程度的軛合的溶葡萄球菌素組合物，或者溶葡萄球菌素軛合物可以被分級(jí)，這樣獲得基本上由溶葡萄球菌素的部分與基本上相同數(shù)目的聚合物構(gòu)成的溶葡萄球菌素軛合物。即基本上在分級(jí)樣本中的所有溶葡萄球菌素與一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多聚合物軛合，但不是它們的混合物。
當(dāng)使用聚(烯基氧化物)時(shí)，它們可以是直鏈或支鏈的。支鏈的聚(烯基氧化物)，例如支鏈的PEG，因?yàn)樗鼈兊妮^大的空間體積，被認(rèn)為不太可能穿透蛋白質(zhì)裂縫，這些裂縫往往是酶的結(jié)合區(qū)和活性位點(diǎn)。典型的聚(烯基氧化物)由C2-C4烯基氧化物基團(tuán)組成，單獨(dú)地作為均聚物或是結(jié)合使用。這包括PEG類、泊洛沙姆類和poloxamines。此聚(烯基氧化物)可以在一個(gè)末端被烷基基團(tuán)取代，或它可以是未取代的。此烷基基團(tuán)，當(dāng)存在時(shí)，可以是C1-C4烷基基團(tuán)，且典型地是甲基基團(tuán)。
合適的共價(jià)鍵修飾反應(yīng)是公知的并且基本上是常規(guī)的。通常此過程包括制備活性聚合物，其后使抗微生物劑與此活性聚合物反應(yīng)?？梢允褂肈avis等描述的利用N-羥基琥珀酰亞胺酯活化mPEG(mPEG-NHS)的反應(yīng)。mPEG-NHS商購自Huntsville，AL的Sheatwater Corp.，現(xiàn)在稱作Nektar Therapeutics，AL。
典型地，在pH約7-8的緩沖液中，經(jīng)常地在pH7.5的約10mM的Hepes，及100mM NaCl中進(jìn)行反應(yīng)。通常在0℃-約25℃進(jìn)行反應(yīng)約20分鐘-約12小時(shí)，例如在約20℃ 25-35分鐘或在4℃ 3小時(shí)。在軛合后，回收預(yù)期的產(chǎn)品并通過柱色譜純化等。
為了重組將如此修飾的抗微生物劑制成含水溶液、半固體制劑或干燥制劑(例如凍干的、晶體的或無定形的，有或沒有另外的為滲透平衡的溶質(zhì))。制劑可以存在于或重組于無毒性、穩(wěn)定的、藥用可接受的含水載體介質(zhì)中，pH為約3-8典型地為5-8，用于通過常規(guī)的方案和方式給藥或在半固體制劑例如膏霜中給藥。給藥可以是通過眼給藥、靜脈內(nèi)(iv)、肌內(nèi)、皮下或腹腔途徑或鞘內(nèi)途徑，或通過吸入或用于覆蓋醫(yī)療用具、導(dǎo)管和植入裝置，或通過直接裝入感染的位點(diǎn)以便使得在血液和組織濃度中達(dá)到超過活性劑的最小抑制濃度(MIC)，并因此實(shí)現(xiàn)微生物滴定度的減少以便治愈或減輕感染。此外，抗微生物劑可以被制成半固體制劑，例如膏霜，其可以被用于局部或鼻內(nèi)制劑。
此外，抗微生物軛合物可以與其它抗微生物劑同時(shí)地或交替地共同給藥，以便更有效地治療感染性疾病。制劑可以是，或被重組為，用于局部、眼或鼻內(nèi)應(yīng)用的半固體制劑、適用于眼給藥的液體、丸劑、靜脈或外周注射或通過增至較大量的靜脈滴注溶液，或可以是，或被重組為通過緩慢靜脈輸注的較大的量。例如，溶葡萄球菌素軛合物可以與抗生素結(jié)合給藥，此抗生素干涉或抑制細(xì)胞壁合成，例如青霉素類如萘夫西林和其它β-內(nèi)酰胺抗生素、頭孢菌素類例如頭孢噻吩、氨基糖苷類、磺胺類、抗葉酸劑、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、糖肽類例如萬古霉素和多肽類?；蛘?，溶葡萄球菌素軛合物可以與抗生素結(jié)合給藥，此抗生素抑制蛋白質(zhì)合成，例如氨基糖苷類如鏈霉素、四環(huán)素類和鏈陽菌素。溶葡萄球菌素軛合物也可以與下列物質(zhì)一起給藥單克隆抗體；其它非軛合的抗菌酶例如溶葡萄球菌素、溶菌酶、變?nèi)芫?、和cellozyl溶菌酶；肽例如防衛(wèi)素；和羊毛硫抗生素例如乳酸鏈球菌肽；或任何其它包含lanthione的分子例如枯草菌素。
與溶葡萄球菌素軛合物共同給藥的藥劑可以與溶葡萄球菌素軛合物一起制成固定的組合，或者可以無準(zhǔn)備地使用，以無論何種可得和實(shí)用的制劑并且通過無論何種已知能在感染部位提供這些藥劑的足夠濃度的給藥途徑。
按照本發(fā)明的軛合物擁有至少部分相應(yīng)于非軛合的抗微生物劑的抗微生物活性。保留完全(或者全部)活性是不必要的，因?yàn)橛捎赑EG化作用產(chǎn)生的降低的免疫原性和增加的循環(huán)半衰期可以在頻率降低的間隔給予增加的劑量。保留至少10％非軛合的抗微生物劑活性的軛合物是優(yōu)選的，保留至少15％、20％、25％、30％、40％等的非軛合抗微生物劑活性的軛合物是更漸進(jìn)地優(yōu)選的。
溶葡萄球菌素軛合物的合適的劑量和方式可以隨感染的嚴(yán)重性和感染微生物的敏感性變化，就組合療法來說，可以依賴于在組合中使用的特定的抗葡萄球菌藥劑。劑量可以在約0.05至約100mg/kg/天之間變化，優(yōu)選在約1至約40mg/kg/天之間變化，以單或分割劑量給予，或通過連續(xù)輸注給予。
通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，它們教導(dǎo)了那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員如何實(shí)施本發(fā)明。下述實(shí)施例僅是用作本發(fā)明的說明，并且公開了本發(fā)明特定實(shí)施方案的各種有益的性質(zhì)。下述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為如要求的限制本發(fā)明。
實(shí)施例材料作為抗微生物劑的例子，溶葡萄球菌素被用于這些研究，它們基本上可以用任何抗微生物劑來重復(fù)，通過本說明書定義了此術(shù)語。溶葡萄球菌素(Ambicin L)從AMBI，Inc.(現(xiàn)稱Nutrition 21)處獲得。mPEG2-NHS酯，10和40kDa購自Shearwater公司(Huntsville，AL)(現(xiàn)稱Nektar Therapeutics，AL)。硼酸鈉、DMSO、牛血清蛋白和extravidin-HRP購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。甘氨酸購自EM Science(Gibbstown，NJ)。NuPage電泳系統(tǒng)和膠體藍(lán)染料購自Invitrogen(Carlsbad，CA)。Sephacryl S-100HR和HiTrapSP FF購自Amersham-Pharmacia(Piscataway，NJ)。胰蛋白酶的大豆培養(yǎng)基、TSB和陽離子校正的Mueller Hinton培養(yǎng)基、CAMHB購自Becton Dickinson(Sparks，MD)。TMB微孔和450 STOP試劑購自BioFX(Owings Mills，MD)。
實(shí)施例1-研究PEG化的溶葡萄球菌素溶葡萄球菌素PEG化作用將0.27、1或5mg/mL的溶葡萄球菌素溶解在0.2M的硼酸鹽緩沖液(pH8.5)或DMSO中。在DMSO中制備mPEG2-NHS酯，并將其以在40、20、10、5或2.5∶1比例的摩爾過量加入到溶葡萄球菌素溶液中。用三種不同的緩沖環(huán)境進(jìn)行PEG化作用，都在室溫下進(jìn)行1、2或3小時(shí)硼酸鹽緩沖液(有通過加入PEG所得的＜10％DMSO)、50％硼酸鹽/50％DMSO和100％DMSO。通過加入甘氨酸至25ml并渦流來終止所有反應(yīng)。
通過SDS-PAGE用NuPage電泳系統(tǒng)來評(píng)價(jià)與溶葡萄球菌素的PEG軛合。使非還原的樣本(300ng)在115V過Novex4-12％Bis-Tris凝膠并用膠體藍(lán)染色。通過使反應(yīng)混合物過Sephacryl S-100HRTM柱，將PEG化作用的溶葡萄球菌素與未到達(dá)的溶葡萄球菌素分離開。濃縮純化的PEG-溶葡萄球菌素并保存用于活性測(cè)定。
或者，將未軛合的溶葡萄球菌素通過離子交換色譜從樣本中移除。將溶葡萄球菌素，但不是PEG-溶葡萄球菌素，結(jié)合在pH7.0的在50mM磷酸鈉緩沖液中的HiTrap SP FF柱上。用相同的緩沖液洗滌此柱，直到洗出液的OD280降至本底水平。然后除去結(jié)合的溶葡萄球菌素，并通過用pH7.0的50mM磷酸鈉加pH7.0，1M NaCl洗滌來再生柱。重復(fù)此過程數(shù)次，直到PEG-溶葡萄球菌素級(jí)分(未結(jié)合)為至少99％純的未軛合的溶葡萄球菌素。
PEG-溶葡萄球菌素的體外活性通過在650nm測(cè)量包含熱滅活的SA5(HKSA5)的溶液的液滴的吸光度來測(cè)定溶葡萄球菌素溶解5型金黃色葡萄球菌(SA5)的能力。通過在62℃孵化活細(xì)菌2小時(shí)來制備HKSA5，然后稀釋，使最初的吸光度約為1。然后以32μg/mL的濃度加入溶葡萄球菌素，并且每60秒讀取吸光度讀數(shù)共20分鐘。通過向在PBS中的SA5混懸液(％T＝40)中添加從0至10μg/mL的溶葡萄球菌素來測(cè)量活SA5培養(yǎng)物的清除率。將樣本在37℃孵育1小時(shí)，然后將其在血瓊脂平板上展開。在37℃過夜培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)菌落并與未處理的樣本比較。
測(cè)定軛合的溶葡萄球菌素抗SA5的最小抑制濃度(MIC)。在TSB中過夜孵育SA5后，將細(xì)菌稀釋至％T＝80。在96-孔培養(yǎng)平板的每個(gè)孔中加入100μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CAMHB+1％BSA+0-32μg溶葡萄球菌素)。向每個(gè)孔中加入5μ1 SA5，并將平板在37℃和200rpm溫育24小時(shí)。在650nm讀吸光度，并將MIC定義為最后的孔中無SA5生長(zhǎng)。
抗-溶葡萄球菌素結(jié)合活性進(jìn)行溶葡萄球菌素捕獲ELISA來測(cè)定是否PEG化的溶葡萄球菌素保護(hù)蛋白避免結(jié)合抗體。用多克隆兔抗-溶葡萄球菌素抗體覆蓋96-孔微孔板過夜。用1％BSA封閉孔，隨后用在PBS/0.5％吐溫20加0.1％BSA的溶葡萄球菌素樣本孵育。用生物素標(biāo)記的、多克隆抗體兔抗溶葡萄球菌素檢測(cè)溶葡萄球菌素結(jié)合，隨后是extravidin-HRP孵育和TMB色度法檢測(cè)。在SpectraMAX Plus平板讀數(shù)器(Molecular Devices；Sunnyvale，CA)中在450nm的吸光度測(cè)量平板。
PEG-溶葡萄球菌素的血清藥代動(dòng)力學(xué)在CF1小鼠尾靜脈以0.8或0.2mg(在0.2mL PBS中4或1mg/mL)的劑量注射S-100HR純化的PEG-溶葡萄球菌素。給對(duì)照小鼠注射0.8mg未軛合的溶葡萄球菌素。在給藥后1、4、7和24小時(shí)通過眼窩流血收集血液。在37℃溫育此血液30分鐘，隨后在4℃30分鐘。然后通過在1000g離心分離血清10分鐘。如上所述通過ELISA測(cè)定溶葡萄球菌素的血清濃度。
結(jié)果由于大量的賴氨酸(16)和精氨酸(6)殘基，溶葡萄球菌素在pH7有+10.53的高凈量的電荷。這些賴氨酸的側(cè)鏈的伯胺基團(tuán)是共價(jià)地連接且已經(jīng)用N-羥基琥珀酰亞胺激活的PEG的理想的靶。選擇支鏈的PEG是因?yàn)樗鼈兊妮^大的空間體積使得它們不太可能會(huì)穿過蛋白質(zhì)裂縫，其經(jīng)常是結(jié)合基序和酶的活性位點(diǎn)。
可以操縱反應(yīng)條件來產(chǎn)生PEG化的溶葡萄球菌素分子，此分子在酶活性和提高的性質(zhì)例如降低的免疫原性、降低的抗體結(jié)合和毒性和增加的血清半衰期和功效之間具有最佳的平衡。特有的反應(yīng)基團(tuán)可以被加入溶葡萄球菌素以便以數(shù)目控制的和位點(diǎn)特異的方式軛合PEG。建立巰基基團(tuán)可能是達(dá)到這一目標(biāo)的一條途徑，因?yàn)槿芷咸亚蚓夭话魏伟腚装彼釟埢?。達(dá)到這一目標(biāo)的另一個(gè)途徑可以是將硫醇基基團(tuán)引入蛋白，通過將包含硫醇基的氨基酸半胱氨酸通過基因工程引入蛋白的氨基酸序列。
酶對(duì)SA5的殺滅活性通過測(cè)量熱滅活的SA5的細(xì)胞溶解(圖1)和活SA5的殺滅活性(圖2)來試驗(yàn)五種PEG化的(PEGlyated)溶葡萄球菌素的體外殺滅活性。在圖1中，與10kDa PEG軛合的溶葡萄球菌素表示在線3133A-B pH和3133A-DMSO中。此pH指示表明發(fā)生在水溶液中的PEG化反應(yīng)。此DMSO指示指出在100％DMSO中進(jìn)行的PEG化(PEGlyation)反應(yīng)。所有樣本對(duì)于酶活性都是陽性的。隨PEG化作用程度增加而活性減少暗示了此10kDa PEG是足夠小的以能夠進(jìn)入溶葡萄球菌素的活性位點(diǎn)或它的粘肽結(jié)合區(qū)域，因此減少它的酶活性。相反，用40kDa的PEG樣本沒有觀察到酶活性的降低，盡管事實(shí)是在這些樣本上沒有進(jìn)行大小分離。這意味著高度PEG化的形式保留了與輕微軛合的形式的相似的活性，并且指示40kDa的PEG不能容易地進(jìn)入對(duì)于酶功能重要的位點(diǎn)。
用PEG化的溶葡萄球菌素的降低的濃度來試驗(yàn)體外殺滅活SA5的能力(圖2)。對(duì)于熱滅活測(cè)定觀察到了這一點(diǎn)，較高程度的PEG軛合減少了溶葡萄球菌素的活性，且與10kDa的形式相比，40kDa的軛合物保留了更大的活性。然而，出現(xiàn)的PEG-溶葡萄球菌素的新的性質(zhì)在熱滅活測(cè)定中是不明顯的。未軛合的溶葡萄球菌素的殺滅曲線顯示了響應(yīng)減少的酶濃度的相應(yīng)的滴定度，但是在最終滴定上揚(yáng)前，所有PEG化的酶的最初四個(gè)稀釋液似乎都具有平坦響應(yīng)。特別是，與未軛合的溶葡萄球菌素相比，在2∶1比例的40kDa的PEG維持超過最低三個(gè)濃度的更大的殺滅，但是與三個(gè)最高的濃度具有相比較低的活性。這一發(fā)現(xiàn)指示PEG化的溶葡萄球菌素具有改良的活性或新陳代謝。PEG會(huì)保護(hù)酶免受當(dāng)細(xì)菌被殺滅時(shí)從細(xì)菌釋放的降解的蛋白酶的水解，因此使得溶葡萄球菌素在較低的濃度保持較長(zhǎng)時(shí)間段的活性。另一種可能性是PEG與溶葡萄球菌素軛合會(huì)改變酶與細(xì)菌細(xì)胞壁的相互反應(yīng)。降低與它的細(xì)胞壁的對(duì)接位點(diǎn)的結(jié)合親和性，同時(shí)仍然促使粘肽裂開，會(huì)導(dǎo)致更快的酶釋放和加速溶葡萄球菌素下一個(gè)分裂周期的再循環(huán)。這些解釋中的任一個(gè)和其它還未被發(fā)現(xiàn)的，能解釋觀察到的響應(yīng)，并且每一個(gè)都同樣激勵(lì)著創(chuàng)建優(yōu)于天然藥物的PEG化形式的溶葡萄球菌素的前景。
SA5生長(zhǎng)的抑制最小抑制濃度(MIC)是藥物活性的定量量度，其典型地被用來檢測(cè)不同細(xì)菌菌株抗性的程度。使用抗SA5單個(gè)菌株的這一測(cè)定來測(cè)量在溶葡萄球菌素PEG化作用上的藥物活性喪失，如表1中所示。一些制劑保留了高濃度的活性，雖然沒有制劑的濃度如未軛合的溶葡萄球菌素一樣高。用不同PEG-溶葡萄球菌素種類觀察到的活性模式與在先前的殺滅測(cè)定中觀察到的一致。與高度軛合的形式相比，較輕微PEG化的溶葡萄球菌素保留了較高的活性，40kDa PEG軛合物的活性是10kDa PEG軛合物活性的八倍之多。
表1PEG化的溶葡萄球菌素抗SA5的MIC

這些發(fā)現(xiàn)都支持此結(jié)論，即低程度的PEG化作用產(chǎn)生活性酶而較龐大的40kDa PEG溶葡萄球菌素聚合物與10kDa的聚合物相比是更有活性的。用2∶1 PEG比例觀察到的小量活性喪失是對(duì)于這一軛合物的增加的血清半衰期和它的降低的免疫原性的可接受的選擇。這些軛合物的潛在的益處包括減少的給藥頻率、降低誘導(dǎo)抗體的能力、在具有抗溶葡萄球菌素抗體的患者中活性的保留和降低與免疫原性反應(yīng)相關(guān)的毒性。
對(duì)于PEG化的溶葡萄球菌素的抗-溶葡萄球菌素抗體活性用溶葡萄球菌素-捕獲免疫測(cè)定法體外試驗(yàn)PEG保護(hù)溶葡萄球菌素避免結(jié)合抗體的能力(圖3)。未軛合的溶葡萄球菌素顯示0.3ng/mL-20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)。可見PEG-溶葡萄球菌素與抗-溶葡萄球菌素抗體的異源的響應(yīng)，但是與未軛合的溶葡萄球菌素相比，所有結(jié)合都不太有效。觀察到最好防御結(jié)果是PEG化的溶葡萄球菌素與抗體親和性降低超過10倍。這一測(cè)定環(huán)境不同于在粘膜表面或流動(dòng)的血清中的結(jié)合，但是其確實(shí)證明了在溶葡萄球菌素表面上的PEG軛合能夠至少部分地保護(hù)酶免受抗體結(jié)合。在酶活性和降低的抗體結(jié)合之間似乎沒有任何關(guān)聯(lián)，但是與40kDa和10kDa軛合物結(jié)合的抗體的差異可以通過PEG化作用的不同的程度來解釋。通常，對(duì)于40kDa PEG更少的PEG分子附著于溶葡萄球菌素，所以它可以具有更開放的不排除抗體和10kDa形式的結(jié)構(gòu)，這也可以解釋為什么40kDa的軛合物具有更好的活性。盡管如此，與未軛合的溶葡萄球菌素相比，40kDa軛合物的抗體活性降低。
PEG化的溶葡萄球菌素的延長(zhǎng)的血清半衰期PEG在蛋白藥物上的軛合使得它們避免了機(jī)體正常的清除機(jī)制，并且因此導(dǎo)致藥物的增加的血清半衰期。在小鼠中測(cè)定低程度的PEG修飾的溶葡萄球菌素的藥代動(dòng)力學(xué)曲線(每個(gè)溶葡萄球菌素帶1-4個(gè)PEG)并與未軛合的溶葡球菌的清除做比較(圖4)。由于PEG化作用兩種增強(qiáng)作用從圖中看是明顯的(1)溶葡萄球菌素的半衰期顯著地增加，和(2)獲得的總血清濃度遠(yuǎn)高于未軛合的溶葡萄球菌素的總血清濃度。經(jīng)24小時(shí)，PEG-溶葡萄球菌素軛合物的血清濃度僅下降了兩至十倍，而經(jīng)相同的時(shí)間段，未軛合的溶葡萄球菌素下降了近500倍。這樣的溶葡萄球菌素的延長(zhǎng)的保留會(huì)減少必需用來保留上述藥物的治療有效濃度的給藥頻率。
維持溶葡萄球菌素的這些濃度較長(zhǎng)時(shí)間段也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌感染的更快清除，并且減少溶葡萄球菌素抗性出現(xiàn)的可能性。PEG-溶葡萄球菌素軛合物的總血清濃度也更高。在給藥后24小時(shí)，PEG-溶葡萄球菌素的血清濃度超過了天然溶葡萄球菌素給藥僅1小時(shí)后濃度的10倍，甚至當(dāng)最初PEG-溶葡萄球菌素的劑量是未軛合的溶葡萄球菌素的劑量的1/4時(shí)。這一結(jié)果暗示可以使用低得多劑量的PEG-溶葡萄球菌素來獲得與軛合的溶葡萄球菌素的相同的或更好的臨床益處，其會(huì)導(dǎo)致較低的治療花費(fèi)和最小化的潛在毒性或?qū)λ幬锏倪^敏反應(yīng)。前面的實(shí)施例因此說明了本發(fā)明的溶葡萄球菌素軛合物的增加的活性和延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。
實(shí)施例2-40kD PEG溶葡萄球菌素軛合物的分級(jí)分離通過離子交換色譜來進(jìn)行實(shí)施例1的各種40kD PEG-溶葡萄球菌素軛合物種類的分級(jí)分離，作為試驗(yàn)酶活性的方法，作為PEG軛合數(shù)目函數(shù)。雖然沒有獲得完美的分辨率，但是級(jí)分趨于僅富集在一個(gè)特定的帶中。將單-PEG化的形式純化至高于99％1-mer、同時(shí)將二-PEG化的形式純化至93％2-mer，剩余部分大都是1-mer，這一點(diǎn)通過分子排阻色譜HPLC來測(cè)定。
殺滅活性分析用不同濃度的酶來試驗(yàn)溶葡萄球菌素殺滅在生理鹽水中的SA的能力。在接種溶葡萄球菌素1-2小時(shí)后，將細(xì)菌劃在血液瓊脂平板上，并在第二天計(jì)數(shù)存活的菌落。此數(shù)據(jù)在圖5中作為SA的存活菌落被報(bào)告，圖上的值越低，溶葡萄球菌素對(duì)SA的殺滅越有效。與2-mer相比，1-mer具有更大的活性，但是與未軛合的溶葡萄球菌素相比，它們兩者都具有顯著降低的活性。
在血液中的殺滅活性用不同濃度的酶試驗(yàn)溶葡萄球菌素在完整、肝素化的人血液中殺滅SA的能力。在接種溶葡萄球菌素1-2小時(shí)后，將細(xì)菌劃在血液瓊脂平板上，并在第二天計(jì)數(shù)存活的菌落。此數(shù)據(jù)在圖6中作為SA的存活菌落被報(bào)告，圖上的值越低，溶葡萄球菌素對(duì)SA的殺滅越有效。此40k 1-mer BS是由50％的DMSO制成的實(shí)施例1的軛合物。如同在在生理鹽水中進(jìn)行的殺滅分析觀察的，40k1-mer的活性降低，但是在血液中活性的降低似乎比在生理鹽水中的降低更大。
對(duì)于2-mer活性的喪失，有兩種可能的解釋。雖然可能為PEG與溶葡萄球菌素的軛合提供有多達(dá)10種賴氨酸殘基，但是每一個(gè)具有不同的反應(yīng)性，并且可能只有一種或兩種賴氨酸殘基對(duì)于給定的反應(yīng)條件是優(yōu)先地PEG化的。對(duì)于第一個(gè)PEG鏈軛合的優(yōu)選的位點(diǎn)可能位于對(duì)于酶功能不關(guān)鍵的區(qū)域，并且可以解釋為什么對(duì)于1-mer活動(dòng)性有很少的喪失。然而，對(duì)于PEG化作用的下一個(gè)最優(yōu)選的賴氨酸可能位于或臨近溶葡萄球菌素的活性或細(xì)胞壁結(jié)合位點(diǎn)，并且PEG與這些區(qū)域的連接會(huì)嚴(yán)重地影響酶功能。
對(duì)于2-mer活性喪失的另一個(gè)可能的解釋與由于PEG化作用溶葡萄球菌素的增加空間體積有關(guān)。溶葡萄球菌素不作用于可溶的、可擴(kuò)散的基質(zhì)，但是必須能夠穿透細(xì)菌細(xì)胞壁的厚的、固態(tài)的粘肽支架。PEG每一個(gè)連續(xù)地加入增加了溶葡萄球菌素的分子量，并且從1-mer到2-mer空間體積的增加會(huì)妨礙酶通過細(xì)胞壁中的五甘氨酸橫橋，因此消除了其殺滅活性。
抗體反應(yīng)性用ELISA測(cè)量抗-溶葡萄球菌素抗體對(duì)PEG化的溶葡萄球菌素的反應(yīng)性(圖7)用多克隆抗溶葡萄球菌素抗體(Ab)覆蓋96-孔板，然后與溶葡萄球菌素一起溫孵。然后用多克隆、HRP-標(biāo)記的、抗-溶葡萄球菌素Ab檢測(cè)結(jié)合的溶葡萄球菌素。測(cè)定溶葡萄球菌素對(duì)這些抗體的結(jié)合水平(在圖中y軸上的平均值)作為酶濃度的函數(shù)。與未軛合的溶葡萄球菌素相比，兩種PEG軛合物都降低了Ab結(jié)合活性，但是2-mer的反應(yīng)性遠(yuǎn)低于1-mer。
實(shí)施例3-30kD PEG-溶葡萄球菌素軛合物的分級(jí)分離用30kD的PEG代替40kD的PEG重復(fù)實(shí)施例2，并且將mPEG溶葡萄球菌素軛合物的1-mers和2-mers分離成具有下述性質(zhì)的單獨(dú)部分OD液滴分析隨時(shí)間監(jiān)測(cè)鹽水中高度無毒的金黃色葡萄球菌(SA，約109/mL)在280hm處的OD。當(dāng)細(xì)菌被溶解時(shí)，OD下降，因此其是溶葡萄球菌素活性的量度。OD下降越快，酶活性越大。典型的標(biāo)準(zhǔn)花費(fèi)6-7分鐘來達(dá)到起始OD的50％。1-mer比2-mer具有更大的活性，但是與未軛合的溶葡萄球菌素相比，兩者都具有顯著降低的活性(圖8和9)。
殺滅活性分析用不同濃度的酶來試驗(yàn)溶葡萄球菌素殺滅在生理鹽水中的SA的能力。在接種溶葡萄球菌素1-2小時(shí)后，將細(xì)菌劃在血液瓊脂平板上，并在第二天計(jì)數(shù)存活的菌落。此數(shù)據(jù)作為SA的存活菌落被報(bào)告，圖上的值越低，溶葡萄球菌素對(duì)SA的殺滅越有效。與2-mer相比，1-mer具有更大的活性，但是與未軛合的溶葡萄球菌素相比，它們兩者都具有顯著降低的活性。(圖10)抗體反應(yīng)性用ELISA測(cè)量抗-溶葡萄球菌素抗體對(duì)PEG化的溶葡萄球菌素的反應(yīng)性。用多克隆抗溶葡萄球菌素Ab覆蓋96-孔板，然后接種溶葡萄球菌素。然后用多克隆、HRP-標(biāo)記的、抗-溶葡萄球菌素Ab檢測(cè)結(jié)合的溶葡萄球菌素。測(cè)定溶葡萄球菌素對(duì)這些抗體的結(jié)合水平(在圖中y軸上的平均值)作為酶濃度的函數(shù)。與未軛合的溶葡萄球菌素相比，1-mer具有大約7X低的Ab結(jié)合活性且2-mer具有大約70X低的Ab結(jié)合活性(圖11)。
血清藥代動(dòng)力學(xué)給小鼠注射標(biāo)準(zhǔn)溶葡萄球菌素或PEG化的溶葡萄球菌素(30k 1和2-mers)并且經(jīng)24小時(shí)用ELISA測(cè)定血清濃度。用PEG化的酶獲得了較高的血清濃度并且藥物的半衰期顯著地增加。2-mer獲得了較高的峰血清溶葡萄球菌素濃度，而長(zhǎng)期的保留時(shí)間似乎可以比得上1-mer(圖12)。
殺滅活性分析用不同濃度的酶測(cè)定溶葡萄球菌素30kD和40kDPEG 1-mers殺滅鹽水中SA的能力。在接種溶葡萄球菌素1-2小時(shí)后，將細(xì)菌劃在血液瓊脂平板上，并在第二天計(jì)數(shù)存活的菌落。在圖13中此數(shù)據(jù)作為SA的存活菌落被報(bào)告，圖上的值越低，溶葡萄球菌素對(duì)SA的殺滅越有效。與30k 1-mer相比，40k 1-mer具有更大的活性，但是與未軛合的溶葡萄球菌素相比，它們兩者都具有顯著降低的活性。
實(shí)施例4用于聚合物軛合的帶有A末端半胱氨酸的重組體溶葡萄球菌素類似于溶葡萄球菌素，制備溶葡萄球菌素構(gòu)造，除了它包含氨基酸編碼丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(Ala-ala-cys)(換句話說，類似于“天然”溶葡萄球菌素，但是包含末端半胱氨酸)。Goodson等，在BioTechnology，8，343(1990)和Benhar等，J.Biol Chem.，269，13398(1994)中描述了該過程，隨后插入半胱氨酸。
天然溶葡萄球菌素不包括任何半胱氨酸。但是兩個(gè)丙氨酸對(duì)于溶葡萄球菌素的活性是不重要的，酶的這一部分可以被修飾而不影響活性。因此，為了以明確和控制的方式軛合溶葡萄球菌素和PEG，在E.coli.中生產(chǎn)帶有末端丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸的重組體溶葡萄球菌素。
包含半胱氨酸的重組體溶葡萄球菌素的純化通過離心分離和冷凍收集從250mL培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。通過在70ml0.1M的HCl中提取片狀沉淀物來溶化和溶解它們。在4000rpm離心提取物，并且在4℃用4升用水稀釋至1∶2的PBS透析上清液過夜。用水將透析液(大約150mL)進(jìn)一步稀釋至約250mL。
制備1.
將大約200mL粗制溶液泵入1ml的SP瓊脂糖柱(Pharmacia)，使其在12.5mM磷酸鈉，pH7中平衡。在加載后，用平衡緩沖液洗滌此柱，然后用pH7的在12.5mM磷酸鈉中的0.25M NaCl洗脫。利用Ultrafree4(10kDa分界的)裝置(微孔)將此洗脫液濃縮至700μl。在PBS中1∶20稀釋后，通過在280nm處的吸光度估算濃度，利用溶葡萄球菌素的吸光系數(shù)，0.49mg/ml/OD280OD280＝0.201×20×0.49mg/ml/OD280＝2.3mg/ml。
至于27kDa，如果100％純，這對(duì)應(yīng)于85μm溶葡萄球菌素，回收率為0.7mL×2.3mg/mL，或者1.6mg。
制備2以相同的方式處理剩余的50mL。這一物質(zhì)的濃度被測(cè)定為1.18mg/mL，體積為0.7L。回收量＝0.82mg?？傮w估計(jì)的回收量是1.6+0.8mg，或者2.4mg。
測(cè)定純度和硫醇的存在利用DTNB(埃爾曼試劑)測(cè)定重組體溶葡萄球菌素的游離硫醇基(SH基團(tuán))并且被發(fā)現(xiàn)為23.6μM。因此，至少23.6/85＝28％的溶葡萄球菌素包含游離硫醇基，假設(shè)沒有其它蛋白質(zhì)供給。利用8-25％快速凝膠(Pharmacia)的SDS PAGE指示一部分是二聚的，當(dāng)二聚物減少時(shí)進(jìn)一步增加了獲得的半胱氨酸溶葡萄球菌素的百分比。
用碘代乙?；锼?僅與硫醇基反應(yīng)的試劑)標(biāo)記確證了與天然溶葡萄球菌素不同，此重組體溶葡萄球菌素包含一個(gè)半胱氨酸。此半胱氨酸可以與試劑例如馬來酰亞胺-PEG或碘代乙酰基-PEG反應(yīng)，使PEG與溶葡萄球菌素在唯一位點(diǎn)軛合。
實(shí)施例5-通過位點(diǎn)專一氧化結(jié)合的NH2末端溶葡萄球菌素PEG化作用溶葡萄球菌素在其氨基端具有蘇氨酸。Fields等，Biochem.J.，108，883(1968)，Gaertner等，J.Biol.Chem.，269，7224(1994)和Geoghegan等，Bioconj.Chem.，3，7224(1992)已經(jīng)描述了在利用高碘酸鈉的溫和條件下，氨基端絲氨酸或蘇氨酸可以被氧化成乙醛酰衍生物。這一基團(tuán)然后能與氨基-氧PEG、酰肼PEG或肼PEG反應(yīng)來在其氨基端產(chǎn)生PEG化的溶葡萄球菌素。IL-8 PEG化作用的這一反應(yīng)的例子在Gaertner等，Bioconj.Chem.，7，38(1996)中有描述。如Gaertner等，Bioconjugate Chemistry中的描述制備氨基-氧PEG(30kD)，或購自Shearwater。在1％NH4(HCO3)，pH8.3和50倍摩爾過量的蛋氨酸中制備20mg/mL的溶葡萄球菌素。加入10倍摩爾過量的高碘酸鈉。在10分鐘后，在室溫黑暗中，通過加入1/20體積50％的甘油來結(jié)束反應(yīng)。然后在黑暗中，用pH4.6的0.1M醋酸鈉透析此溶液。用1N醋酸將氧化的溶葡萄球菌素溶液調(diào)節(jié)至pH3.6，然后在溫和的攪拌下在室溫在黑暗中使其與5倍摩爾過量的氨基-氧PEG反應(yīng)20小時(shí)。通過離子交換色譜法除去未反應(yīng)的PEG，隨后通過疏水作用色譜分離未軛合的溶葡萄球菌素。
氧化的溶葡萄球菌素也可以被試劑例如(2-硫代-吡啶基-半胱氨酸酰肼官能團(tuán)化(Zara等，Anal.Biochem.，194，156(1991))，然后它可以與硫醇基反應(yīng)性PEG例如PEG-馬來酰亞胺反應(yīng)。
殺滅活性測(cè)定用不同濃度的酶來試驗(yàn)N-末端30kD PEG化的溶葡萄球菌素殺滅在生理鹽水中的SA的能力。在接種溶葡萄球菌素1-2小時(shí)后，將細(xì)菌劃在血液瓊脂平板上，并在第二天計(jì)數(shù)存活的菌落。此數(shù)據(jù)在圖14中作為SA的存活菌落被報(bào)告，圖上的值越低，溶葡萄球菌素對(duì)SA的殺滅越有效。此N-末端30k 1-mer具有活性，但是與先前試驗(yàn)的1-mers(30k或40k)相比不是在較大的濃度。
實(shí)施例6-8-利用兩步heteroligation的PEG化作用Heteroligation化學(xué)包括用反應(yīng)性基團(tuán)標(biāo)記組分A(在此處是溶葡萄球菌素)，此基團(tuán)僅能夠與存在于組分B(在此處是PEG)上的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)。在這一實(shí)施例中，溶葡萄球菌素被化學(xué)修飾，在賴氨酸基團(tuán)上用硫醇基基團(tuán)修飾，然后與親電子的PEG試劑(例如PEG-馬來酰亞胺)反應(yīng)，這一點(diǎn)與實(shí)施例4比較，其中溶葡萄球菌素被遺傳地修飾，插入半胱氨酸基團(tuán)(其包括反應(yīng)性硫醇基基團(tuán))。在上面參考的Bioconjugate Chemistry中描述了Heteroligation化學(xué)。
20mg/mL溶葡萄球菌素的制備是在75mM HEPES+2mM EDTA，pH7.5緩沖液中，在攪拌同時(shí)逐滴加入N-琥珀酰亞胺基3-[2-吡啶二硫基]丙酸酯。SPDP與溶葡萄球菌素的摩爾比是變化的，以便變化標(biāo)記的程度。在1小時(shí)后，通過加入pH5的1/10體積1M的醋酸鈉來降低pH值，并用1N HCl調(diào)節(jié)至pH5。通過加入固體二硫蘇糖醇(DTT)將溶液制成25mM。在15分鐘后，將溶液在4℃ 10mM醋酸鈉，2mM EDTA pH5中透析過夜以除去DTT。通過應(yīng)用DTNB(埃爾曼試劑)和從利用在280nm處每吸光度0.49mg/ml的吸光系數(shù)在280nm處測(cè)定的摩爾濃度來測(cè)定標(biāo)記的程度。
然后將硫醇基化的溶葡萄球菌素與親電子的、硫醇基-選擇性的mPEG-乙烯基砜(Shearwater M-VS-5000)、mPEG-馬來酰亞胺(Shearwater M-MAL-5000)和mPEG-鄰吡啶二硫化物(ShearwaterM-OPSS-5000)反應(yīng)。鹵代酰基PEG也是合適的。在合適的pH進(jìn)行反應(yīng)，使PEG試劑對(duì)于硫醇基是選擇性的。例如，在約pH7-8進(jìn)行乙烯基砜加成。在pH6-7進(jìn)行馬來酰亞胺加成和二硫化物交換。
通過離子交換色譜除去過量的PEG。也可以使用疏水色譜。包含不同量PEG的溶葡萄球菌素因此被分開。
兩步法的優(yōu)點(diǎn)包括能限制或控制PEG化作用的程度。另外，可以使用長(zhǎng)鏈硫醇化試劑(例如LC-SPDP，Pierce，#21651)。這些試劑允許硫醇基團(tuán)進(jìn)一步擴(kuò)展超過蛋白質(zhì)表面和促進(jìn)與龐大的分子例如PEG的軛合。
上面兩步方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是硫醇會(huì)保持反應(yīng)性延長(zhǎng)的時(shí)間段，尤其是在缺乏氧的情況下，在包含EDTA的緩沖液中和在酸性條件下，所有這些都使氧化作用降到最小。同樣地，上述PEGS在試劑與硫醇是反應(yīng)性的pH下都是穩(wěn)定的。這與NHS-酯PEGS形成對(duì)比，其需要堿性條件來與氨基基團(tuán)反應(yīng)。在堿中，NHS酯是不穩(wěn)定的。
大體積的試劑通常比小試劑反應(yīng)更慢。通過使用在這一實(shí)施例中描述的兩步heteroligation方法，反應(yīng)能被允許進(jìn)行延長(zhǎng)的時(shí)間段和允許更有效的結(jié)合。這允許使用較少的PEG試劑，降低成本。此外，因?yàn)檩^高百分比的PEG是結(jié)合的，可以促進(jìn)預(yù)期的PEG-溶葡萄球菌素軛合物的純化。這些優(yōu)點(diǎn)也呈現(xiàn)在實(shí)施例4中。
在實(shí)施例1-8中描述的方法可以被擴(kuò)展至其它抗-微生物蛋白質(zhì)，例如乳酸鏈球菌肽。末端半胱氨酸可以如實(shí)施例4工程操作引入到蛋白質(zhì)中，然后像實(shí)施例6-8描述的那樣與PEG結(jié)合。
這一點(diǎn)能被容易地理解，即上面陳述的特征的大量的變化和組合在不偏離本發(fā)明如在權(quán)利要求中的陳述下可以被利用。這種變化不被認(rèn)為是偏離了本發(fā)明的精神和范圍，所有這些改變是預(yù)期的被包括在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.與抗微生物劑軛合的水溶性聚合物，從而保留所述抗微生物劑的至少部分抗微生物活性。
2.與抗微生物肽或蛋白質(zhì)軛合的水溶性聚合物，從而保留所述肽或蛋白質(zhì)的至少部分抗微生物活性。
3.權(quán)利要求2所述的與聚合物軛合的藥劑，其中所述肽或蛋白質(zhì)是抗菌酶。
4.權(quán)利要求3的與聚合物軛合的藥劑，其中所述酶是能夠斷裂葡萄球菌的細(xì)胞壁粘肽中的交聯(lián)多聚甘氨酸橋的溶解葡萄球菌活性酶。
5.權(quán)利要求4的與聚合物軛合的藥劑，其中所述酶是溶葡萄球菌素或溶葡萄球菌素類似物。
6.權(quán)利要求5的與聚合物軛合的藥劑，其中所述溶葡萄球菌素或溶葡球菌類似物是重組地表達(dá)的完全活性的同種溶葡萄球菌素。
7.權(quán)利要求5的與聚合物軛合的藥劑，其中所述溶葡萄球菌素是天然地衍生的。
8.權(quán)利要求5的與聚合物軛合的藥劑，其中所述溶葡萄球菌素是合成地構(gòu)成的。
9.權(quán)利要求1、2、5、7或8的與聚合物軛合的藥劑，其中所述水溶性聚合物選自聚(烯基氧化物)、聚氧乙烯化的多元醇和聚(乙烯醇)。
10.權(quán)利要求9的與聚合物軛合的藥劑，其中所述水溶性聚合物是聚(烯基氧化物)，選自聚(乙二醇)(PEG)、泊洛沙姆和polyoxamines。
11.權(quán)利要求10的與聚合物軛合的藥劑，其中所述聚(烯基氧化物)是PEG。
12.權(quán)利要求11的與聚合物軛合的藥劑，其中所述PEG是直鏈的。
13.權(quán)利要求12的與聚合物軛合的藥劑，其中所述PEG是支鏈的。
14.權(quán)利要求1或2的與聚合物軛合的藥劑，每分子抗微生物劑包含從一個(gè)至約四個(gè)聚合物分子。
15.權(quán)利要求1或2的與聚合物軛合的藥劑，其特征在于具有混合程度的軛合。
16.權(quán)利要求1或2的與聚合物軛合的藥劑，其特征在于是分級(jí)的。
17.治療感染的抗微生物藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的用于所述感染的抗微生物劑的水溶性聚合物軛合物，和藥學(xué)上可接受的載體。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述抗微生物劑是蛋白質(zhì)或肽。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述蛋白質(zhì)或肽是抗菌酶。
20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述酶是溶解葡萄球菌活性酶，其能夠斷裂在葡萄球菌的細(xì)胞壁粘肽中的交聯(lián)多聚甘氨酸橋。
21.權(quán)利要求19的藥物組合物，進(jìn)一步包括非軛合的抗菌酶。
22.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述非軛合的抗菌酶選自溶葡萄球菌素、溶菌酶、變?nèi)芫?、cellozyl溶菌酶和它們的組合。
23.權(quán)利要求19的藥物組合物，進(jìn)一步包括抗生素。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述抗生素選自β-內(nèi)酰胺、頭孢菌素類、氨基糖苷類、磺胺類、抗葉酸劑、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、糖肽類、多肽和它們的組合。
25.預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng)物微生物感染的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的根據(jù)權(quán)利要求17、19或21的藥物組合物來治療所述感染。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述感染是細(xì)菌感染，并且所述藥物組合物包含抗所述感染有效的抗菌酶的水溶性聚合物軛合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)菌感染是由在細(xì)胞壁粘肽中具有足夠多聚甘氨酸橋交聯(lián)的葡萄球菌類引起的，通過與溶葡萄球菌素的水溶性聚合物軛合物接觸使此物種的細(xì)胞中的粘肽被溶解。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述葡萄球菌感染是由金黃色葡萄球菌引起的。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述葡萄球菌感染是表皮葡萄球菌引起的。
全文摘要
抗微生物劑的水溶性聚合物軛合物，其保留藥物的至少部分的抗微生物活性，包含此聚合物軛合物的藥物組合物和用藥物組合物治療微生物感染的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1655812SQ03812031
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者S·沃爾斯, A·沙, J·蒙德, A·李斯, J·德拉比克 申請(qǐng)人:拜奧辛尼克休斯公司