專利名稱：復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明旨在研制一種具有良好生物相容性和生物可降解性的中樞及外周神經(jīng)損傷后的修復(fù)橋接物，涉及膠原、明膠及氨基聚糖等多種生物原材料以及其加工工藝和制作方法。本材料既可用于神經(jīng)損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究，也可用于臨床人體脊髓、外周神經(jīng)節(jié)段性損傷、缺損后的橋接修復(fù)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是細(xì)胞賴以生存和維持細(xì)胞功能及生物學(xué)特征的基礎(chǔ)，是生命的基本載體為生物提供其用以維持結(jié)構(gòu)的支架和生物學(xué)功能的場所。ECM所具有的細(xì)胞黏附、細(xì)胞間信號傳遞、遷移等功能是獨特的、其他物質(zhì)所不具備的，對生物體的功能具有深遠(yuǎn)的影響。ECM包括三大類膠原、蛋白聚糖、糖蛋白。其中膠原在人體分布最廣，約占30％，而一型膠原則是各種膠原中含量最多的，它為生物細(xì)胞提供用于維持結(jié)構(gòu)的支架。I型膠原由三個α鏈組成，構(gòu)成直徑為67nm的三螺旋結(jié)構(gòu)的原纖維，是基模的主要組成部分，具有抗壓和維持空間結(jié)構(gòu)的功能，主要分布在骨角膜，肌腱等處；明膠是一種由膠原分子降解而制得的多肽混合物，共有18種氨基酸組成了明膠肽鏈，膠原廣泛存在于動物的骨、肌腱及結(jié)締組織中，可被生物酶降解。大量的實驗表明用細(xì)胞外基質(zhì)制成的神經(jīng)組織工程材料不僅具有良好的生物相容性，同時也有利于神經(jīng)再生纖維的遷延和生長。但由于既往復(fù)合的橋接載體材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)均無一定規(guī)律(在孔徑大小和方向上)，不利于脊髓或外周神經(jīng)節(jié)段性損傷再生纖維定向生長，從而影響了治療或?qū)嶒灥男Ч?。制備具有縱軸向孔徑的膠原橋接材料，目前世界上尚無類似報道，我們所研制材料具有同一條件下材料的內(nèi)部孔隙大小均勻，孔隙平行——完全與軸向平行等優(yōu)點。因此，在神經(jīng)修復(fù)組織工程中，更具有適宜脊髓和外周神經(jīng)順軸向孔定向生長和遷移的特點，獲得脊髓和外周神經(jīng)的有效修復(fù)、再生。在臨床和實驗中，應(yīng)用前景廣闊，作用巨大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在通過對原材料的配方及其加工工藝的改進(jìn)提供一種生物相容性力學(xué)性質(zhì)更好的復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料及其制備方法，該材料不僅內(nèi)部具有排列規(guī)律的微管型孔隙結(jié)構(gòu)，而且孔徑大小及方向可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)控，有利于神經(jīng)再生纖維的生長，可用于脊髓、周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)；通過調(diào)整制備材料的各基本成分，使該材料具有更好的促進(jìn)神經(jīng)再生纖維生長的作用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案該材料用膠原及氨基聚糖混合制成，材料采用I型膠原蛋白(collagen I)、IV型膠原蛋白(collagenIV)、硫酸類肝素(heparan sulfate)、明膠(gelatin)。其配方比例為(230∶5∶1∶115)～(4600∶100∶1∶2300)上述配方在溫度梯度條件下通過調(diào)整原料混合物的冷淋速度及溫度梯度，達(dá)到制備內(nèi)部具有軸向平行均勻排列的微管結(jié)構(gòu)，且微管直徑具有可調(diào)節(jié)性的特殊神經(jīng)損傷、缺損修復(fù)材料；其制作方法按以下步驟進(jìn)行1)按比率稱取一定量的I型膠原蛋白按27.5mg/ml的濃度放入0.05M醋酸溶液中溶解24小時；2)在4℃恒溫環(huán)境中，18000r/min攪拌90min，制成懸濁液；3)另按比率稱取一定量的硫酸類肝素、IV型膠原蛋白加入0.05M醋酸溶液中溶解24小時；4)在4℃恒溫，18000r/min攪拌90min制成懸濁液；5)混合兩種懸濁液保持4℃恒溫，18000r/min攪拌90min，制成膠原蛋白和硫酸類肝素的懸濁液，抽真空靜置12小時。
6)將制備好的橋接材料懸濁液注入內(nèi)徑為3mm、外徑為4.2mm、長3cm至20cm的硅膠管中密封兩端，沿管軸方向緩慢放入深低溫冷淋劑中，進(jìn)入速度控制為10×10-5m·s-1至10×10-7m·s-1；
7)將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷好的鋁盤中，于-30℃、100mtorr條件中凍干48h；8)真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h，再繼續(xù)升溫至22℃保持45~90min，解除真空，升至常溫；9)將材料用20％戊二醛浸泡24小時固化，對雙蒸水反復(fù)透析，再經(jīng)紫外線照射交聯(lián)16小時；10)將材料無菌密封包裝并置于2000倫琴CO60環(huán)境中照射消毒24小時。
本發(fā)明所研制的新型脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)橋接材料具有①材料的外表面均為全封閉結(jié)構(gòu)。②材料的微管孔徑大小可控制在20μm～300μm；③微管的走行方向為軸向且平行、均勻。在生物組織材料復(fù)合中，大孔徑的材料對細(xì)胞的附壁爬行或灌注如嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等起支架載體作用；而小孔徑的材料則適宜于復(fù)合各種神經(jīng)生長因子、藥物等，用于脊髓和外周神經(jīng)缺損處的橋接。所研制的材料表面無孔裂，使得在植入脊髓或外周神經(jīng)缺損處能防止增生結(jié)締組織纖維長入缺損段，避免阻礙神經(jīng)再生軸突的定向生長。
本發(fā)明提出的復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料具有以下特點1.采用了生物相容性更好的原料，更接近生物的體內(nèi)環(huán)境，更加有利于神經(jīng)的再生。其中IV型膠原蛋白(collagen IV)是神經(jīng)基膜的構(gòu)成組分，硫酸類肝素(heparan sulfate)有利于神經(jīng)的再生，明膠(gelatin)則是神經(jīng)營養(yǎng)因子最理想的載體。
2.探明了I型膠原蛋白(collagen I)、IV型膠原蛋白(collagen IV)、硫酸類肝素(heparan sulfate)、明膠(gelatin)等生物材料的最佳混合比例及對材料在生物學(xué)性質(zhì)及力學(xué)性質(zhì)等方面的影響；3.探明了溫度、速度與新型神經(jīng)組織工程修復(fù)材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)間關(guān)系；4.探明了各種成分不同比例混合對材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。
5.探明了組分之間膠聯(lián)、固化的最佳條件增加了材料的抗拉強度和剛度，更好的改善了材料的力學(xué)性質(zhì)。
6.通過控制材料的成分構(gòu)成比率，有效的降低了材料在體內(nèi)的分解速度。
7.研制了①多級可調(diào)式速度調(diào)控儀，使材料加工過程中冷淋速度在10×10-5～1.5×10-7m/s之間可隨意進(jìn)行多級可變式調(diào)控；②冷淋溫控儀，使冷淋溫度在0℃～-180℃之間任意調(diào)控。
本發(fā)明的復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料是一種新型脊髓、周圍神經(jīng)修復(fù)橋接材料，既可直接植入脊髓、周圍神經(jīng)缺損處；也可作為神經(jīng)組織工程各種子細(xì)胞移植的載體，可復(fù)合、攜帶各種促進(jìn)神經(jīng)再生的藥物，用于人體脊髓、外周神經(jīng)節(jié)段性損傷、缺損后的橋接；同樣可用于脊髓、外周神經(jīng)節(jié)段損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究。


圖1是400倍掃描電鏡下軸向切面觀察的圖片，其材料內(nèi)部為走向平行、孔徑均一、排列規(guī)律的縱向微孔；圖2是70倍電鏡下軸向切面觀察的圖片，顯示材料內(nèi)部為縱向微孔結(jié)構(gòu)。
圖3是45°斜切面在300倍電鏡下的圖片，顯示材料內(nèi)部為立體縱向管狀結(jié)構(gòu)；圖4是橫切面400倍電鏡下圖片，顯示材料內(nèi)部微孔內(nèi)徑較為均一。
具體實施實例以下結(jié)合制作工藝及實施實例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
依照本發(fā)明的技術(shù)方案，該復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料用膠原及氨基聚糖混合制成，材料采用I型膠原蛋白(collagen I)、IV型膠原蛋白(collagen IV)、硫酸類肝素(heparan sulfate)、明膠(gelatin)。其配方比例為(230∶5∶1∶115)～(4600∶100∶1∶2300)上述材料在一定的低溫溫度梯度環(huán)境中，溫度梯度遞減速率是決定材料內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)孔徑大小、微孔取向的關(guān)鍵因素，改變注有膠原—氨基聚糖混合物硅膠管進(jìn)入冷淋劑的速度可以達(dá)到對所需制備的材料在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上孔徑大小和孔隙方向及均勻程度均具有可調(diào)控性，從而得到復(fù)合型脊髓、周圍神經(jīng)組織工程損傷修復(fù)材料。
實施例1(按照I型膠原蛋白∶IV膠原蛋白∶硫酸類肝素∶明膠的比例為2300∶50∶1∶1150)按照本發(fā)明的技術(shù)方案，以膠原蛋白、明膠和硫酸類肝素為例，其制作方法按以下步驟進(jìn)行1.按比率稱取一定量的I型膠原蛋白按27.5mg/ml的濃度放入0.05M醋酸溶液中溶解24小時；2.在4℃恒溫環(huán)境中，18000r/min攪拌90min，制成懸濁液；3.另按比率稱取一定量的硫酸類肝素、IV型膠原蛋白加入0.05M醋酸溶液中溶解24小時；4.在4℃恒溫，18000r/min攪拌90min制成懸濁液；5.混合兩種懸濁液保持4℃恒溫，18000r/min攪拌90min，制成膠原蛋白和硫酸類肝素的懸濁液，抽真空靜置12h。
6.將制備好的橋接材料懸濁液注入內(nèi)徑為3mm、外徑為4.2mm、長3cm至20cm的硅膠管中密封兩端，沿管軸方向緩慢放入深低溫冷淋劑中，進(jìn)入速度控制為10×10-5m·s-1、5×10-5m·s-1至10×10-7m·s-1；7.將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷好的鋁盤中，于-30℃、100mtorr條件中凍干48h；8.真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h，再繼續(xù)升溫至22℃保持45~90min，解除真空，升至常溫；9.將材料用20％戊二醛浸泡24小時固化，對雙蒸水反復(fù)透析，再經(jīng)紫外線照射交聯(lián)16小時；10.將材料無菌密封包裝并置于2000倫琴CO60環(huán)境中照射消毒24小時。
溫度和冷淋速率是制備本材料的的兩個關(guān)鍵因素。為了獲得均勻穩(wěn)定的冷淋速度，通過多次實驗摸索，申請人研制了多級可變式調(diào)速儀，使冷淋速率和溫度均可在所需范圍內(nèi)調(diào)控。
本發(fā)明所研制出的橋接材料具有以下特點①材料的外表面為全封閉結(jié)構(gòu)，無裂孔可有效的阻止疤痕組織長入；②材料的微孔直徑可人為簡單調(diào)控，既有利于神經(jīng)再生纖維的長入，又有利于神經(jīng)因子和種子細(xì)胞的植入；③內(nèi)部微管尺寸均勻，排列規(guī)律，有利于神經(jīng)再生纖維的定向生長；④動物實驗證明該材料生物相容性好且降解速度適中有利于神經(jīng)再生；⑤該材料經(jīng)特殊工藝處理后，力學(xué)性質(zhì)好，抗拉及抗變形能力好。
以下實例2～8各原材料的混合比相同。
實施例2采用膠原(I型)、硫酸類肝素和明膠作為原材料，其重量分別為1150mg、0.5mg、575mg，實施過程同實例1；實施例3采用膠原(I型、IV型)和明膠作為原材料，其重量分別為1150mg、25mg、575mg，實施過程同實例1；實施例3采用膠原(I型)和硫酸類肝素作為原材料，其重量分別為1150mg、0.5mg，實施過程同實例1；實施例4采用膠原(IV型)和硫酸類肝素作為原材料，其重量分別為25mg、0.5mg、，實施過程同實例1；實施例5采用膠原(I型)和明膠作為原材料，其重量分別為1150mg、575mg，實施過程同實例1；實施例6采用膠原(IV型)和明膠作為原材料，其重量分別為25mg、575mg，實施過程同實例1；實施例7采用膠原(I型、IV型)和硫酸類肝素作為原材料，其重量分別為1150mg、25mg、0.5mg，實施過程同實例1；實施例8采用膠原(IV型)、明膠和硫酸類肝素作為原材料，其重量分別為25mg、575mg、0.5mg，實施過程同實例1。
本發(fā)明所研制的新型復(fù)合型神經(jīng)組織工程修復(fù)材料具有具有可簡易調(diào)控的內(nèi)徑大小在20μm～300μm之間的各種尺寸的孔徑和平行、均勻的單一取向的縱軸向微孔。該材料還可方便的制成不同的外型，如圓柱型，橢圓柱型等。在生物組織工程材料的應(yīng)用中，較大孔徑的對細(xì)胞附壁爬行或灌注如嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等起支架、載體作用；而較小孔徑的則適宜于復(fù)合各種神經(jīng)生長因子、藥物等，作為其緩釋的載體，用于脊髓或外周神經(jīng)組織缺損處的橋接。本發(fā)明所研制的材料表面結(jié)構(gòu)接近于正常的神經(jīng)且無孔裂，使得植入脊髓或外周神經(jīng)組織缺損處，能防止增生結(jié)締組織長入缺損段，影響神經(jīng)再生纖維的定向生長。廣泛用于人體周圍神經(jīng)或脊髓節(jié)段性損傷的臨床治療和動物外周神經(jīng)或脊髓節(jié)段性損傷的實驗研究中。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料，其特征在于，它包括I型膠原蛋白、硫酸類肝素、IV型膠原蛋白和明膠；其配方的重量百分比為I型膠原蛋白65.53％～65.71％；硫酸類肝素0.01％～0.28％；IV型膠原蛋白1.42％～1.43％；明膠32.77％～32.85％。
2.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料的制備方法，在溫度梯度條件下通過調(diào)整原料混合物的冷淋速度及溫度梯度，達(dá)到制備內(nèi)部具有軸向平行均勻排列的微管結(jié)構(gòu)，且微管直徑具有可調(diào)節(jié)性的特殊神經(jīng)損傷、缺損修復(fù)材料；其特征在于，按以下步驟進(jìn)行1)原材料配方的重量百分比I型膠原蛋白65.53％硫酸類肝素0.28％IV型膠原蛋白1.42％明膠32.77％2)按上述比率稱取I型膠原蛋白，按27.5mg/ml的濃度放入0.05M醋酸溶液中溶解24h；3)在4℃恒溫環(huán)境中，18000r/min攪拌90min，制成懸濁液；4)另按上述比率稱取硫酸類肝素、IV型膠原蛋白加入0.05M醋酸溶液中溶解24小時；5)在4℃恒溫，18000r/min攪拌90min制成懸濁液；6)混合兩種懸濁液保持4℃恒溫，18000r/min攪拌90min，制成膠原蛋白和硫酸類肝素的懸濁液，抽真空靜置12h；7)將制備好的橋接材料懸濁液注入內(nèi)徑為3mm、外徑為4.2mm、長3cm至20cm的硅膠管中密封兩端，沿管軸方向緩慢放入深低溫冷淋劑中，進(jìn)入速度控制為10×10-5m·s-1、5×10-5m·s-1至10×10-7m·s-1；8)將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷好的鋁盤中，于-30℃、100mtorr條件中凍干48h；9)真空狀態(tài)下升溫至0℃保持24h，再繼續(xù)升溫至22℃保持45min～90min，解除真空，升至常溫；10)將材料用20％戊二醛浸泡24h固化，對雙蒸水透析，再經(jīng)紫外線照射交聯(lián)16h；11)將材料無菌密封包裝并置于2000倫琴CO60環(huán)境中照射消毒24h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合型組織工程神經(jīng)損傷修復(fù)材料，它包括I型膠原蛋白、硫酸類肝素、IV型膠原蛋白和明膠；該材料具有可簡易調(diào)控的內(nèi)徑，大小在7.95μm～178.47μm之間的各種尺寸的孔徑和平行、均勻的單一取向的縱軸向微孔。可方便的制成不同的外型，如圓柱型，長方型等。在生物組織工程材料的應(yīng)用中，其較大孔徑的對細(xì)胞附壁爬行或灌注如嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等起支架、載體作用；而較小孔徑的則適宜于復(fù)合各種神經(jīng)生長因子、藥物等，作為其緩釋的載體，用于脊髓或外周神經(jīng)組織缺損處的橋接。本發(fā)明所研制的材料表面結(jié)構(gòu)接近于正常的神經(jīng)且無孔裂，使得植入脊髓或外周神經(jīng)組織缺損處，能防止增生結(jié)締組織長入缺損段，影響神經(jīng)再生纖維的定向生長。
文檔編號A61L31/04GK1546182SQ20031011899
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者羅卓荊, 梁偉, 王樹森 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)