專利名稱：PDGF受體α基因的外顯子1β及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的多核苷酸，以及以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的RNA為靶的PDGF受體α的表達(dá)抑制方法、表達(dá)抑制物質(zhì)和表達(dá)抑制劑，以及癌癥的治療劑。
背景技術(shù)：
血小板衍生生長因子(PDGF)在細(xì)胞的增殖和發(fā)生、分化、創(chuàng)傷愈合以及癌惡變和動脈硬化等中起著重要作用。因此預(yù)期控制PDGF信號的物質(zhì)可作為這些疾病的治療劑。實(shí)際上已提出作為治療劑的PDGF表達(dá)抑制劑(例如，參照日本專利特開平10-59850號公報)、PDGF與PDGF受體α的結(jié)合阻斷劑(例如，參照日本專利特表平8-500010號公報)和PDGF受體α酪氨酸激酶抑制劑(例如，參照日本專利特表2002-514228號公報)。
然而，擔(dān)心這些抑制劑和阻斷劑不僅對癌特異性PDGF信號、也對正常PDGF信號產(chǎn)生影響。本發(fā)明的目的在于提供用于可僅選擇性抑制癌細(xì)胞特異性PDGF信號的表達(dá)抑制方法的多核苷酸、表達(dá)抑制物質(zhì)、表達(dá)抑制劑和癌治療劑。
發(fā)明的揭示本發(fā)明的多核苷酸的特征在于，具有序列編號2所示的堿基序列或其一部分。作為具有序列編號2所示的堿基序列的一部分的多核苷酸，可列舉具有序列編號1所示的堿基序列的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸的特征在于，具有在序列編號2所示的堿基序列中，缺失、取代或插入1個或數(shù)個堿基，并包含在PDGF受體α基因的有意義鏈的堿基序列中的堿基序列或其一部分。
這里“PDGF受體α基因”是GenBank登錄號AC026580及AC025013所示的堿基序列構(gòu)成的基因及其同系物。
而且，本發(fā)明的多核苷酸也可以是具有與上述多核苷酸互補(bǔ)的堿基序列或其一部分的多核苷酸。
這些多核苷酸可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA中的任一種。此外，具有1個或數(shù)個堿基的缺失、取代或插入等的基因多態(tài)性(geneticpolymorphism)、具有包含在PDGF受體α基因的有意義鏈的堿基序列中的堿基序列的多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但較好是具有同等機(jī)能的多肽，特別好的是由E2F-1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的多肽。
本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制方法的特征是，以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA作為靶。這里“mRNA”是指從經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成的hnRNA除去內(nèi)含子部分、外顯子部分結(jié)合而形成的RNA?！耙詍RNA作為靶”是指直接或間接地特異地使該mRNA不生成其編碼的蛋白質(zhì)。“蛋白質(zhì)的表達(dá)”表示DNA上的遺傳信息由mRNA被正確地翻譯而產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制方法也可以是使用反義核苷酸、核酶、大酶(maxizyme)或RNAi的方法。
這里“PDGF受體α基因的反義核苷酸”是指與PDGF受體α基因的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的核苷酸，可以是反義RNA或反義DNA，核苷酸也可以被修飾。上述反義RNA或DNA指與從作為對象的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序列互補(bǔ)的RNA或DNA，用于阻斷細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息的表達(dá)，特異地抑制靶蛋白的產(chǎn)生。
“核酶”是具有酶活性的RNA的總稱，指特異地切斷來自生物的RNA的酶。如果被摻入細(xì)胞內(nèi)，則具有切斷靶RNA序列的機(jī)能。其結(jié)果是，抑制了蛋白質(zhì)由靶RNA的表達(dá)。由于對靶RNA序列的特異性高，所以作為蛋白質(zhì)的表達(dá)抑制物質(zhì)較好。核酶包括錘頭型核酶和發(fā)夾型核酶(hairpin ribozyme)等。
“大酶”一般如WO99/46388號公報的說明書記載，是形成二聚體結(jié)構(gòu)的RNA分子，例如，它的兩個RNA分子不識別正常細(xì)胞中的mRNA，而通過構(gòu)成大酶能識別癌細(xì)胞中特異性的mRNA，因而可只切斷癌細(xì)胞中特異性的mRNA。
“RNAi”指利用誘導(dǎo)被稱為RNA干擾(RNA interference)的現(xiàn)象的雙鏈RNA(dsRNA)的方法。“被稱為RNA干擾的現(xiàn)象”是將上述雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)抑制靶基因表達(dá)的現(xiàn)象，目前認(rèn)為是通過宿主內(nèi)在的機(jī)制被切短成為21～23堿基對，切短的RNA分子識別由宿主基因轉(zhuǎn)錄而成的mRNA，發(fā)生序列特異性的分解，其結(jié)果是，特異地抑制由宿主基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制方法可以是利用編碼反義RNA、核酶、大酶、或RNAi中的任一種的DNA的方法。
本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)的特征在于，以含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA作為靶。例如通過表達(dá)抑制物質(zhì)使其結(jié)合于該mRNA，或使該mRNA分解，也可以是表達(dá)抑制物質(zhì)間接地使其他物質(zhì)結(jié)合于該mRNA，或由其他物質(zhì)使該mRNA分解?！癙DGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)”是指抑制PDGF受體α蛋白質(zhì)由PDGF受體α基因產(chǎn)生的物質(zhì)。
作為本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)，具體可列舉反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi等。
作為本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)，具體可列舉編碼反義RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一種的DNA等。
本發(fā)明的PDGF受體α的表達(dá)抑制劑的特征在于，以上述表達(dá)抑制物質(zhì)為有效成分。
本發(fā)明的癌癥的治療劑的特征在于，含有上述表達(dá)抑制劑。
本發(fā)明的癌的治療方法的特征在于，含有上述表達(dá)抑制劑。
附圖的簡單說明

圖1是顯示本發(fā)明實(shí)施例2中用RT-PCR揭示的PDGF受體α基因的外顯子1β～4的表達(dá)模式的圖。
圖2是顯示核酶結(jié)構(gòu)的圖。
圖3是顯示大酶結(jié)構(gòu)的圖。
圖4是顯示本發(fā)明的實(shí)施例1中用含-1395至+312的堿基序列的報道構(gòu)建物(reporter construct)進(jìn)行熒光素酶測定的結(jié)果的圖。圖中的“+”表示導(dǎo)入100ng含-1395至+312的堿基序列的報道構(gòu)建物的結(jié)果，“-”表示導(dǎo)入100ng不含-1395至+312的堿基序列的報道構(gòu)建物的結(jié)果。
圖5是表示本發(fā)明的實(shí)施例1中用含-517至+1445的堿基序列的報道構(gòu)建物進(jìn)行熒光素酶測定的結(jié)果的圖。
圖6是表示本發(fā)明的實(shí)施例1中用缺失轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的不同長度的缺失突變體進(jìn)行熒光素酶測定的結(jié)果的圖。
圖7是表示由基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄的PDGFRα的mRNA和由E2F-1轉(zhuǎn)錄的PDGFRα的mRNA的示意圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳形式已知在癌細(xì)胞中，大部分的場合，RB蛋白等抑制癌的蛋白質(zhì)參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生異常。例如，在RB蛋白上游起作用的細(xì)胞周期蛋白D1的過度表達(dá)，通過增強(qiáng)對生長因子的敏感性，認(rèn)為其參與癌細(xì)胞的惡變。在體外的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，通過向過度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的細(xì)胞株加入FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)，可使該細(xì)胞惡變。本申請的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)PDGF(血小板衍生生長因子)也起同樣作用，可使過度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的細(xì)胞株惡變。
在細(xì)胞周期蛋白D1-RB途徑的下游存在轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，通過增加FGF受體的表達(dá)而使對FGF的敏感性提高。如下列實(shí)施例詳述，E2F-1也使PDGF受體α的表達(dá)亢進(jìn)，但本申請的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)它不作用于以往知道的啟動子，而作用于以往的內(nèi)含子1中由E2F-1控制的新啟動子區(qū)域，對通過該新啟動子轉(zhuǎn)錄時所用的新外顯子1β進(jìn)行了鑒定。
這樣，在E2F-1和PDGF參與的癌的惡變中，了解到這些因子的一個靶是具有PDGF受體α的外顯子1β的mRNA。因此，通過特異性抑制從具有該外顯子1β的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生PDGF受體α，可阻斷與癌細(xì)胞惡變有關(guān)的信號，從而抑制癌細(xì)胞增殖。并且，不限于細(xì)胞周期蛋白D1-E2F-1途徑，如果癌細(xì)胞的增殖是由于通過具有外顯子1β的mRNA的過度轉(zhuǎn)錄而與PDGF受體α共同引起癌惡變的因子的話，本發(fā)明可應(yīng)用于這種癌細(xì)胞的增殖抑制。
以下，對根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)完成的本發(fā)明的實(shí)施方式舉實(shí)施例詳細(xì)說明。實(shí)施方式和實(shí)施例如無特別說明，可用J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual(2nd edition)，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York(1989)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Ltd.等的標(biāo)準(zhǔn)方案集記載的方法，或其經(jīng)修飾、改變的方法。使用市售的試劑盒和測定裝置時，如無特別說明，可使用其所附的方案。
本發(fā)明的目的，特征、優(yōu)點(diǎn)及其思路，根據(jù)本說明書的說明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該可以明白，從本說明書的記載，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下說明的發(fā)明的實(shí)施方式及具體實(shí)施例等是說明本發(fā)明的較好實(shí)施方式的例子，僅是為舉例或說明而提出的，本發(fā)明并不限于此。在本說明書揭示的本發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)，根據(jù)本說明書的記載，可作各種改變和改進(jìn)，這對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
具有序列編號2所示的人PDGF受體α基因的外顯子1β的堿基序列或其一部分的多核苷酸，根據(jù)序列編號2所示的堿基序列信息，可從cDNA文庫、基因組文庫等人基因文庫制備。而且，來自小鼠、大鼠、雞、豬、狗、猴等人以外的生物物種的PDGF受體α基因的外顯子1β也可以用E2F-1控制轉(zhuǎn)錄來確定，例如與人PDGF受體α基因的外顯子1β的雜交也可通過檢查以往的內(nèi)含子1中的序列中的新外顯子等來鑒定，它們也包含在本發(fā)明的多核苷酸中。
這里，“人PDGF受體α基因的外顯子1β”是指包含具有序列編號2所示的堿基序列的多核苷酸而構(gòu)成的外顯子，“PDGF受體α基因的外顯子1β”是指包含具有序列編號2所示的堿基序列的多核苷酸而構(gòu)成的外顯子以及在人以外的生物物種中與此對應(yīng)的外顯子。
PDGF受體α基因的外顯子1β由于是mRNA上的非翻譯區(qū)域，在人以外的生物物種中，在堿基序列水平上不一定要求有高度同源性，但有必要在特定種類的細(xì)胞中保存轉(zhuǎn)錄機(jī)能，例如必需有由E2F-1控制轉(zhuǎn)錄這一其它外顯子1所沒有的特征。
如圖1所示，含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA，僅在特定的癌細(xì)胞中被檢出。因此，以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA為靶的表達(dá)抑制方法，以及本發(fā)明的多核苷酸，表達(dá)抑制物質(zhì)和表達(dá)抑制劑等，作為攻擊特定癌細(xì)胞(如具體可列舉人大腸癌細(xì)胞SW480和人食道癌細(xì)胞TTn等)用的癌治療方法和癌治療劑是有用的。
本發(fā)明的表達(dá)抑制方法是以含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA作為靶的方法，例如，可以是結(jié)合于含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA，抑制翻譯從而抑制PDGF受體α的表達(dá)的方法，或是分解或切斷上述mRNA從而抑制PDGF受體α的表達(dá)的方法。以下對使用反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi等表達(dá)抑制物質(zhì)的表達(dá)抑制方法舉例進(jìn)行說明。
(1)反義核苷酸的制備作為本發(fā)明的表達(dá)抑制方法中使用的反義核苷酸，具體可例舉含與PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β對應(yīng)的這部分堿基序列或其一部分互補(bǔ)的堿基序列的反義RNA或反義DNA。還可以是由15～30個堿基序列組成的反義寡核苷酸。
本發(fā)明的反義核苷酸在結(jié)構(gòu)上不受其序列的位置、長度、修飾、錯配序列的存在等的限制。作為經(jīng)過上述修飾的反義核苷酸，具體可例舉為使反義核苷酸在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)保持穩(wěn)定而使磷酸二酯鍵的磷酸基的一個氧原子被硫原子或甲基修飾的反義核苷酸、嗎啉-4-基修飾的反義核苷酸。
本發(fā)明的反義DNA可用S1核酸酶等依賴DNA的DNA聚合酶經(jīng)引物延伸法在體外合成。此外，將反義鏈的一部分作為引物進(jìn)行PCR，可僅合成反義鏈。也可用DNA合成儀等進(jìn)行人工合成。反義寡核苷酸的合成可依據(jù)反義DNA進(jìn)行，最好人工合成。
另一方面，本發(fā)明的反義RNA，例如用RNA合成儀和固相合成法等可容易地合成。其后用HPLC以NH3OH/EtOH洗脫，可分離出目標(biāo)RNA。
本發(fā)明的反義RNA可通過以上方法人工合成，也可制作在特異地識別T7RNA聚合酶的啟動子序列(5’-TAATACGACTCACTATA-3’序列編號3)的下游插入了具有與反義RNA對應(yīng)的DNA序列的雙鏈DNA的載體，用T7RNA聚合酶由體外轉(zhuǎn)錄體系合成。
此外，也可以使用摻入了與反義RNA對應(yīng)的DNA的病毒載體或質(zhì)粒等表達(dá)載體，在細(xì)胞內(nèi)使反義RNA表達(dá)。作為病毒載體，可以是腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
(2)插入了核酶的質(zhì)粒的制備如圖2所示，核酶具有與靶mRNA的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列(表示核酶的5’末端部分和3’末端部分的堿基序列)和具催化活性部位(以○記號表示的堿基)的24個堿基序列。核酶的5’末端部分和3’末端部分的堿基序列如果與靶mRNA的堿基序列特異地結(jié)合，則切斷存在于mRNA上的NUX序列(N為任意堿基，X是a、u、c中的任一個堿基)而使靶mRNA分解。即，認(rèn)為如果基于與PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β對應(yīng)的部分的堿基序列合成核酶并給予細(xì)胞內(nèi)，則可特異地切斷含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA。
因此，作為本發(fā)明的表達(dá)抑制物質(zhì)的核酶，可從序列編號2所示的人PDGF受體α基因的外顯子1β的堿基序列中選擇與NUX序列對應(yīng)的序列，使其包含與含有該序列的15～20個堿基序列互補(bǔ)的堿基序列以及具有催化活性部位(以○記號表示的堿基)的24個堿基序列。作為與NUX對應(yīng)的序列，可例舉序列編號2表示的34～36位的GTC、75～77位的GTC、78～80位的GTC、81～83位的GTC、172～174位的GTC、267～269位的GTC。此外，上述核酶可以是錘頭型核酶或發(fā)夾型核酶。
實(shí)際的合成方法有人工合成、體外合成、由表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)合成等，與(1)的反義RNA的情況相同，故在此省略說明。
(3)大酶的設(shè)計與制備如圖3所示，大酶由形成二聚體結(jié)構(gòu)的RNA分子構(gòu)成，兩個RNA分子具有特異地識別靶RNA的傳感器部位(圖中表示成X···X部分，X指任意堿基。上行的X和下行的X表示互補(bǔ)的堿基)、催化活性部位(圖中不形成雙鏈的部分)、存在于含靶RNA的mRNA上的NUX序列(N為任意堿基，X表示A、U、C中的任一堿基。圖中表示成GUC序列的部分。)以及識別其上游(圖中GUC序列部分的上游)或下游(圖中GUC序列部分的下游)的部位。大酶的傳感器部位特異地識別靶RNA并與其結(jié)合，而該大酶的另一傳感器部分特異地識別存在于含靶RNA的mRNA上的NUX序列的上游和下游并與其結(jié)合，切斷存在于含靶RNA的mRNA上的NUX序列，可使靶mRNA特異地分解。即，如果基于與PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β對應(yīng)的部分的堿基序列合成大酶并給予細(xì)胞內(nèi)，認(rèn)為可特異地切斷含PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA。
例如，將PDGF受體α基因的外顯子1β作為靶RNA，將與該靶RNA互補(bǔ)的堿基序列作為傳感器部位。此外，從PDGF受體α的mRNA選擇存在于靶RNA下游的NUX序列，確定與NUX序列上游和下游的序列互補(bǔ)的堿基序列。NUX序列可以是PDGF受體α基因的外顯子1β的mRNA上的序列。由這些信息，通過RNA合成儀合成大酶的各RNA分子，可制作大酶。圖中X的數(shù)目可以增減1個或數(shù)個。
實(shí)際合成方法有人工合成、體外合成、由表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)合成等，與(1)的反義RNA的情況相同，這里省略說明。但因大酶使用2分子的RNA，用表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，2分子RNA可摻入1個載體，也可分別摻入2個載體中。
(4)RNAi的制備如果將與目標(biāo)基因?qū)?yīng)的雙鏈RNA導(dǎo)入體內(nèi)，有報道認(rèn)為對應(yīng)的mRNA會發(fā)生分解(Bass，B.L.(2000)Cell 101，235-238；Fire，A.(1999)Trends Genet.15，358-363；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490)。因此，如果將與具有PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的mRNA對應(yīng)的雙鏈RNA(RNAi)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)，則認(rèn)為含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA會發(fā)生分解。
作為本發(fā)明的表達(dá)抑制物質(zhì)的RNAi可如下制備。即，可用RNA合成儀人工合成與PDGF受體α基因的外顯子1β的有意義鏈或其一部分的堿基序列對應(yīng)的RNA以及與該RNA互補(bǔ)的RNA。此外，也可用HiScribe RNAi Transcription Kit(NEB公司制)在體外和體內(nèi)合成。
另外，可將在正、負(fù)兩個方向克隆了PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的病毒載體或質(zhì)粒等表達(dá)載體分別導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使DNA的兩鏈在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)形成RNAi，并使靶的mRNA分解。也可使用具有將對應(yīng)于PDGF受體α基因的外顯子1β或其一部分的雙鏈的各鏈的DNA序列融合的序列的DNA，即，具有使有意義鏈DNA的3’末端和反義鏈DNA的5’末端融合的序列的DNA，或者將具有使互補(bǔ)的DNA的3’末端和有意義鏈的DNA的5’末端融合的序列的DNA摻入表達(dá)載體。上述病毒載體可以是腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。這樣的RNAi希望在30個堿基以內(nèi)，最好是21個堿基。
(5)表達(dá)抑制物質(zhì)的導(dǎo)入在體外的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中將表達(dá)抑制物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，可將制備的反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi等表達(dá)抑制物質(zhì)，用電穿孔法、微量注射法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、用腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體等的病毒感染法或用鈣的轉(zhuǎn)染法等，導(dǎo)入作為對象的癌細(xì)胞。
作為將表達(dá)抑制劑導(dǎo)入個體體內(nèi)的方法，可以是將以如上制備的反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi等表達(dá)抑制物質(zhì)作為有效成分的表達(dá)抑制劑，直接給于人或人以外的脊椎動物中作為導(dǎo)入對象的癌細(xì)胞附近，也可根據(jù)表達(dá)抑制劑不經(jīng)口、口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)給予的方法。這種情況下，表達(dá)抑制劑可根據(jù)使用部位和目的還含有藥理學(xué)上許可的適當(dāng)?shù)馁x形劑或基質(zhì)。
作為給予個體的表達(dá)抑制劑，較好是配制成使表達(dá)抑制物質(zhì)容易被細(xì)胞攝取的形態(tài)。例如，可以是將編碼上述反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi的DNA融合入病毒載體而得到的表達(dá)載體，在體外感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞株，產(chǎn)生病毒，并注射此病毒引起感染的方法。作為病毒載體，可以用在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
此外，可通過使上述表達(dá)載體包裹入脂質(zhì)體中，與癌細(xì)胞融合而將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。也可用TransIT In Vivo Gene Delivery System(TakaRa的商品名)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。這種情況下，表達(dá)抑制劑可直接注射于患部或靜脈注射。
也可將如上制備的反義核苷酸、核酶、大酶、RNAi等RNA，經(jīng)體外選擇法(invitro selection)與易導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的HIV的TAT等肽結(jié)合，將形成的RNA適體(RNAaptamer)作為表達(dá)抑制劑進(jìn)行注射。
作為對象的癌細(xì)胞，具體可例舉人大腸癌細(xì)胞SW480和人食道癌細(xì)胞TTn，但只要是能確認(rèn)由DPGF受體α基因的外顯子1β轉(zhuǎn)錄的mRNA，什么癌細(xì)胞都可以。
(6)表達(dá)抑制物質(zhì)的表達(dá)抑制作用的評價用上述(5)記載的方法，對在體外培養(yǎng)的特定的癌細(xì)胞導(dǎo)入了表達(dá)抑制物質(zhì)和未導(dǎo)入的，通過RT-PCR法比較評價由PDGF受體α基因的外顯子1β轉(zhuǎn)錄的mRNA的量，可對表達(dá)抑制物質(zhì)的表達(dá)抑制作用進(jìn)行評價。此外，也可用通過Northern印跡法等評價由PDGF受體α基因的外顯子1β轉(zhuǎn)錄的mRNA的量的方法。根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)可更有效地抑制由PDGF受體α基因的外顯子1β轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯的反義核苷酸。
上述是體外試驗(yàn)，也可能用體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行評價。
作為體內(nèi)評價方法，具體可例舉以下方法。即，對正常小鼠皮下注射上述特定的癌細(xì)胞，在一定期間內(nèi)使腫瘤生長，其后用(5)的導(dǎo)入方法給予如上制備的表達(dá)抑制劑一至數(shù)次。給予后，通過比較評價導(dǎo)入了表達(dá)抑制劑的小鼠和未導(dǎo)入表達(dá)抑制劑的小鼠的癌的大小和生存率，可進(jìn)行表達(dá)抑制物質(zhì)的表達(dá)抑制作用的評價。
以下，詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例。
<實(shí)施例1>
本實(shí)施例鑒定PDGF受體α基因中由轉(zhuǎn)錄因子E2F-1控制的新外顯子。
首先，本申請的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)小鼠NIH3T3細(xì)胞加入PDGF后其增殖不依賴于支架(scaffold)。因此考察了該細(xì)胞株中PDGF受體α(PDGFR-α)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PDGF受體的表達(dá)上升，它在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。
由于細(xì)胞周期蛋白D1通過依賴細(xì)胞周期的pRb磷酸化而使轉(zhuǎn)錄因子E2F-1活化，研究了其上升是否是由于E2F-1對人PDGF受體α的啟動子的調(diào)節(jié)。將轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的-1395至+312的序列(根據(jù)Genomics，Vol.30，224-232，1995報道的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)將堿基編號。參照GenBank登錄編號D50001S01)組成的啟動子區(qū)域，用pGL3熒光素酶載體克隆在熒光素酶基因的上游，在細(xì)胞周期蛋白D1過度表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞中用轉(zhuǎn)染法與E2F-1的表達(dá)載體一起導(dǎo)入。培養(yǎng)24～72小時后，進(jìn)行熒光素酶測定，考察上述啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。作為陽性對照，使用在mFGFR-1的啟動子的下游插入了熒光素酶基因的質(zhì)粒。其結(jié)果是，mFGFR-1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性上升，但PDGF受體α的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性未見上升(圖4)。因此，表明以前知道的PDGF受體α的啟動子并不參與過度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的小鼠NIH3T3細(xì)胞中的PDGF受體α的表達(dá)的上升。
另外，通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列檢索(TF search)，考察在人PDGFR-α基因的外顯子1β的下游是否是與E2F-1結(jié)合的共有序列，發(fā)現(xiàn)據(jù)認(rèn)為E2F-1可結(jié)合的序列在報告的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游約1kbp附近成群地存在于4個位置。因此，將由-295至+1445的堿基序列組成的DNA結(jié)合在熒光素酶基因的上游，用所得的報道構(gòu)建物與上述記載的方法同樣進(jìn)行熒光素酶測定，考察E2F-1的轉(zhuǎn)錄活性。其結(jié)果是，可確認(rèn)該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性由于E2F-1而上升(圖5)。此外，無E2F-1轉(zhuǎn)錄活化能的突變E2F-1(1～368位的氨基酸序列)或132位的亮氨酸被谷氨酸取代而無DNA結(jié)合能的突變E2F-1均未見轉(zhuǎn)錄活性，因而提示該區(qū)域?qū)嶋H由E2F-1調(diào)節(jié)。
然而，推定的E2F-1結(jié)合位點(diǎn)位于所報告的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游約1.2kbp，很難認(rèn)為該啟動子活性作用于以前報告的轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)。因此，為考察該區(qū)域是否作用于以前報道的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，制作了缺失該轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的不同長度的缺失突變體，與上述方法同樣進(jìn)行熒光素酶測定，考察E2F-1的轉(zhuǎn)錄活性。其結(jié)果是，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游缺失達(dá)到約1kbp的構(gòu)建物也具有啟動子活性，而且E2F-1引起的轉(zhuǎn)錄活性也見上升。由這些結(jié)果提示PDGFR-α由E2F-1調(diào)節(jié)的mRNA從新的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)表達(dá)的可能性(圖6)。
因此，用5’-RACE法確定E2F-1引起的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。將熒光素酶基因上游結(jié)合了-295至+1445的堿基序列組成的DNA的報道構(gòu)建物經(jīng)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞株，從該細(xì)胞株提取mRNA，用5’-Full RACE Core Set(TakaRa的商品名)，通過對熒光素酶基因序列具特異性的引物[正向引物-1(序列編號45’-CCTTAATTAAGGGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTA-3’)和反向引物-1(序列編號55’-CCTTAATTAAGGGGCGCAACTGCAACTCCGATAAAT-3’)]進(jìn)行PCR，得擴(kuò)增產(chǎn)物?？疾煸摂U(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列后發(fā)現(xiàn)，在以前認(rèn)為是內(nèi)含子的區(qū)域存在新的外顯子。這樣，證明在以前認(rèn)為是內(nèi)含子的區(qū)域存在著由E2F-1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的新的外顯子。
<實(shí)施例2>
本實(shí)施例確定PDGF受體α基因的外顯子1β是否在癌細(xì)胞中特異地表達(dá)。
根據(jù)PDGF受體α基因的外顯子1β和已知的外顯子4的序列設(shè)計引物[正向引物-2(序列編號65’-CCTTAATTAAGGAACCGCACACCAAGGGGCCCTCATT-3’)和反向引物-2(序列編號75’-AACAGCACAGGTGACCACAATCG-3’)]，用從圖1所示的各癌細(xì)胞提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR。如圖1所示，人大腸癌細(xì)胞SW480和人食道癌細(xì)胞TTn中檢出信號?；厥者@些擴(kuò)增的條帶，測定DNA序列后發(fā)現(xiàn)，這些條帶是PDGF受體α基因的外顯子1β和已知的外顯子2～4的序列連結(jié)的人PDGFR-α的mRNA片斷，同時測定了序列編號1所示的全長338bp的外顯子1β的序列。即發(fā)現(xiàn)新鑒定的啟動子區(qū)域是人PDGFR的mRNA2(圖7)。
<實(shí)施例3>
用5’-RACE法測定外顯子1β的5’末端的更正確的位置。從表達(dá)含外顯子1β的PDGFR-αmRNA的人骨肉癌細(xì)胞MG-63提取mRNA，用5’-Full RACE Core Set，以對外顯子1β特異的引物[正向引物-2(序列編號6)和反向引物-3(序列編號85’-CCGCTCGAGGCGACGACGACTTCTTCACTCAGG-3’)]進(jìn)行PCR。測定該P(yáng)CR所得擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列的結(jié)果是，得到序列編號2所示的363bp的堿基序列，發(fā)現(xiàn)外顯子1β的5’末端至少延伸到+1210。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如上所述，本發(fā)明可提供用于僅選擇性抑制癌特異性PDGF信號的表達(dá)抑制方法的多核苷酸、表達(dá)抑制物質(zhì)、表達(dá)抑制劑以及癌癥的治療劑。
序列表<110>學(xué)校法人慶應(yīng)義塾(KEIO UNIVERSITY)<120>PDGF受體α基因的外顯子1β及其應(yīng)用<130>PCT/711<150>JP 02/332142<151>2002-11-15<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>338<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<223>發(fā)明人Imoto，Masaya發(fā)明人Minato，Yusuke發(fā)明人Tashiro，Etsu<400>1gcgcgggggc gacagcggcg gcgcgggcgg gcggtctgga ataatgacaa acacatttgg 60ccctgagtga agaagtcgtc gtcgcctcgc attccagcaa ctgggatttg aggaatttcg120aaccgcacac caaggggccc tcattgtgct ccgtggcccc cgcccccgcc cgtcttcccg180cgccccctcc tcggtggaat catttctgca ttgcccgggg gctctgcttt cgctcagttc240tggccgcagg caggaagaga ggaaaggtct ccaggaaggt gccgaacttc ttgtgaggaa300gttagggacg acttggaact ggggaaactt gtttgcag338<210>2<211>363<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>2cagtgtgctc gggttgcacg ccctagcgcg ggggcgacag cggcggcgcg ggcgggcggt 60ctggaataat gacaaacaca tttggccctg agtgaagaag tcgtcgtcgc ctcgcattcc120agcaactggg atttgaggaa tttcgaaccg cacaccaagg ggccctcatt gtgctccgtg180gcccccgccc ccgcctgtct tcccgcgccc cctcctcggt ggaatcattt ctgcattgcc240cgggggctct gctttcgctc agttctggcc gcaggcagga agagaggaaa ggtctccagg300aaggtgccga acttcttgtg aggaagttag ggacgacttg gaactgggga aacttgtttg360cag 363<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>啟動子序列<400>3taatacgact cactata17<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物1<400>4ccttaattaa gggattctcg catgccagag atccta 36<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>反向引物1<400>5ccttaattaa ggggcgcaac tgcaactccg ataaat36<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物2<400>6ccttaattaa ggaaccgcac accaaggggc cctcatt 37<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物2<400>7aacagcacag gtgaccacaa tcg 23<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物3<400>8ccgctcgagg cgacgacgac ttcttcactc agg 3權(quán)利要求
1.多核苷酸，其特征在于，具有序列編號2所示的堿基序列或其一部分。
2.多核苷酸，其特征在于，具有在序列編號2所示的堿基序列中缺失、取代或插入一個或數(shù)個堿基，并包含在PDGF受體α基因的有意義鏈的堿基序列中的堿基序列或其一部分。
3.多核苷酸，其特征在于，具有與權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸互補(bǔ)的堿基序列或其一部分。
4.PDGF受體α的表達(dá)抑制方法，其特征在于，以含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA為靶。
5.如權(quán)利要求4所述的PDGF受體α的表達(dá)抑制方法，其特征還在于，使用反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi。
6.如權(quán)利要求4所述的PDGF受體α的表達(dá)抑制方法，其特征還在于，使用編碼反義RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一種的DNA。
7.PDGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)，其特征在于，以含有PDGF受體α基因的mRNA中的外顯子1β的mRNA為靶。
8.如權(quán)利要求7所述的PDGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)，其特征還在于，它是反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi。
9.如權(quán)利要求7所述的PDGF受體α的表達(dá)抑制物質(zhì)，其特征還在于，它是編碼反義RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一種的DNA。
10.PDGF受體α的表達(dá)抑制劑，其特征在于，以權(quán)利要求7所述的表達(dá)抑制物質(zhì)為有效成分。
11.癌癥的治療劑，其特征在于，含有權(quán)利要求10所述的表達(dá)抑制劑。
12.癌癥的治療方法，其特征在于，使用權(quán)利要求10所述的表達(dá)抑制劑。
全文摘要
用基于特定的癌細(xì)胞中表達(dá)的PDGF受體α基因的外顯子1β的堿基序列或其一部分多肽制作的反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi，抑制由PDGF受體α基因的外顯子1β轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯。以反義核苷酸、核酶、大酶或RNAi等抑制表達(dá)的物質(zhì)為有效成分的表達(dá)抑制劑作為癌癥的治療劑是有效的。
文檔編號A61K31/7088GK1729291SQ20038010705
公開日2006年2月1日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者井本正哉, 湊雄介, 田代悅 申請人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾