專(zhuān)利名稱(chēng)：高純度胰激肽原酶的制備方法及其藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高純度胰激肽原酶的制備方法，具體地說(shuō)涉及采用免疫親和層析法制備的高純度胰激肽原酶。
本發(fā)明還涉及采用本發(fā)明方法制備的高純度胰激肽原酶及其制劑。
背景技術(shù)：
胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又稱(chēng)為胰激肽釋放酶(PancreaticKallikrein)是一類(lèi)內(nèi)切型蛋白水解酶，存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種組織，尤以胰臟中含量最為豐富。在體內(nèi)作用于激肽原，使其釋放出激肽，從而發(fā)揮出一系列的藥理作用使微血管擴(kuò)張，改善外周血液循環(huán)；促進(jìn)前列腺素分泌，擴(kuò)張小動(dòng)脈，增加腎血管流量；激活纖溶酶系統(tǒng)，使纖維蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。臨床上主要用于微循環(huán)障礙引起的腎病變及眼底供血障礙、高血壓癥、腦動(dòng)脈硬化和腦動(dòng)脈血栓、冠心病及其它閉塞性周?chē)苄约膊〉闹委煛?br> 國(guó)家衛(wèi)生部藥典會(huì)一九九八年編制的藥品標(biāo)準(zhǔn)二部第六冊(cè)(生化藥品)第一分冊(cè)中收載了胰激肽原酶原料藥及其制劑，國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為生化藥品執(zhí)行部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定胰激肽原酶系自豬胰中提取的蛋白酶，干品效價(jià)每lmg不得少于50單位，比活不得少于300單位/mg蛋白。由于純度較低，只有腸溶片和凍干粉針劑兩種劑型，供口服和肌內(nèi)注射給藥。腸溶片有20單位和60單位兩種規(guī)格，一次120～240單位，一日360～720單位空腹服用；凍干粉針劑有10單位、20單位和40單位三種規(guī)格，一日10～40單位，一日1次或隔日1次肌內(nèi)注射。已公布的上?；莺Ｉ扑帍S申請(qǐng)的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?0119540.9)，用胰蛋白酶抑制劑為配基與瓊脂糖結(jié)合親和層析純化獲得的胰激肽原酶單位效價(jià)為250～300單位/mg干品，比活800～1000單位/mg蛋白。日本申請(qǐng)的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?6104618)，將人尿濃縮后用聚氨基葡聚糖吸附的方法獲得純度為8.2單位/mg的胰激肽原酶粗品，再用抑肽酶—瓊脂糖親和層析獲得828單位/mg蛋白的胰激肽原酶。但是這些產(chǎn)品對(duì)其組成未作介紹，也未見(jiàn)成功的產(chǎn)品上市。
針對(duì)上述胰激肽原酶制劑，由于純度較低，安全上的限制只能用于口服和肌內(nèi)注射，使其應(yīng)用范圍、適應(yīng)癥及其療效受到很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種高純度胰激肽原酶的制備方法，利用免疫親和層析法制備得到了高純度的胰激肽原酶。
本發(fā)明的另一目的在于提供使用本發(fā)明方法制備的高純度胰激肽原酶。
本發(fā)明的再一目的在于提供含有本發(fā)明的高純度胰激肽原酶的藥物。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，制備高純度胰激肽原酶的方法，包括下述步驟1)含胰激肽原酶的豬胰或牛胰臟初步純化、分離，獲得主要成分為胰激肽原酶的活性組分1；2)將所述活性組分1進(jìn)一步純化，獲得活性組分2；3)以所述活性組分2作為抗原，制備抗胰激肽原酶特異性抗體；4)將所述制備得到的抗胰激肽原酶特異性抗體與親和層析載體結(jié)合，制備抗體親和層析柱；5)以所述抗體親和層析柱分離純化步驟1)中的活性組分1，獲得高純度胰激肽原酶。
本發(fā)明的方法中，將抗原抗體反應(yīng)與親和層析技術(shù)結(jié)合，從含胰激肽原酶的豬胰或牛胰臟中將胰激肽原酶分離純化，制備得到純度高的胰激肽原酶。該方法中，首先需制備獲得針對(duì)胰激肽原酶的特異性抗體，再將該特異性抗體與適宜的親和層析載體結(jié)合，制備成抗體親和層析柱，利用該抗體親和層析柱可對(duì)原料進(jìn)行純化，制備高純度的胰激肽原酶。
在本發(fā)明方法中，針對(duì)胰激肽原酶的特異性抗體可以采用多種方法制備，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，首先以胰激肽原酶為抗原免疫小鼠，獲得含抗胰激肽原酶抗體的小鼠抗血清，同時(shí)將該胰激肽原酶與親和層析載體結(jié)合，制備成抗原親和層析柱，將小鼠抗血清上抗原親和層析柱，利用結(jié)合于親和層析載體上的抗原蛋白與血清中的抗體特異結(jié)合，獲得純化的特異性抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以采用單克隆抗體技術(shù)來(lái)制備本發(fā)明的胰激肽原酶的特異性抗體，將經(jīng)胰激肽原酶免疫后的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞，篩選分泌胰激肽原酶抗體的雜交瘤細(xì)胞建株，由此可獲得穩(wěn)定的胰激肽原酶的特異性抗體。
將制備獲得的抗胰激肽原酶特異性抗體與適宜的親和層析載體結(jié)合，制備成抗體親和層析柱，使用該抗體親和層析柱即可對(duì)原料進(jìn)行分離純化，制備高純度的胰激肽原酶。
在本發(fā)明方法中，為了獲得高純度的胰激肽原酶，可以采用對(duì)原料進(jìn)行分步純化的方法，例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，首先將原料胰臟進(jìn)行透析截留一定分子量的成分，然后將獲得的樣品通過(guò)離子交換層析進(jìn)行初步純化，獲得活性組分1，該活性組分1再經(jīng)本發(fā)明的抗體親和層析柱純化，即可獲得高純度的胰激肽原酶。
用作抗原的胰激肽原酶最好使用純度較高的胰激肽原酶，在本發(fā)明方法中，該用作抗原的胰激肽原酶可以通過(guò)將上述初步純化的活性組分1進(jìn)一步經(jīng)過(guò)制備型高效液相色譜(HPLC)的分離而獲得，這樣獲得的胰激肽原酶(活性組分2)可以用作免疫小鼠的抗原和制備抗原親和層析柱的抗原使用。
本發(fā)明方法中用作親和層析柱的載體的材料可以使用各種適宜的載體材料，優(yōu)選的載體材料可以使用多糖基質(zhì)，例如Sepharose 4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠，在使用前可以先將載體活化，本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用溴化氰作為活化劑，將制備得到的抗原或特異性抗體偶聯(lián)到活化了的載體上，即可制備抗原親和層析柱與抗體親和層析柱。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供通過(guò)本發(fā)明方法制備的高純度胰激肽原酶，其具有以下特性比活性為每毫克蛋白800單位以上；高效液相色譜法檢測(cè)，為單一組分，主峰面積大于95％，保留時(shí)間為7.8±0.5min。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示一條帶，分子量為34～44千道爾頓；氨基酸序列分析，N-末端15個(gè)氨基酸序列為Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供含有本發(fā)明高純度胰激肽原酶的藥物制劑，以本發(fā)明的高純度胰激肽原酶為藥效成分，添加藥學(xué)上可接受的藥用輔料制備得到適于臨床應(yīng)用各種藥物制劑，這些制劑的劑型包括但不限于片劑、膠囊劑、小容量注射劑、凍干粉針劑及專(zhuān)供靜脈注射和靜脈滴注用的大輸液或凍干制劑。例如，注射用胰激肽原酶(凍干靜脈注射用胰激肽原酶)、胰激肽原酶注射液(靜脈注射用胰激肽原酶)、胰激肽原酶腸溶膠囊以及胰激肽原酶腸溶片等。
本發(fā)明采用免疫親和層析技術(shù)，從胰臟中提取的激肽原酶純度高，獲得的產(chǎn)品比活高、純度高，不含或僅含少量雜質(zhì)，使用安全，能達(dá)到靜脈給藥的要求。與口服與肌注給藥相比，靜脈給藥可使藥品的有效成分全部直接進(jìn)入血液，縮短吸收過(guò)程并減少損耗，因而藥效迅速，療程縮短，減少患者的痛苦并能節(jié)省醫(yī)藥費(fèi)用；尤其適用于急性心腦血管栓塞性疾病的搶救，可以贏得寶貴的救治時(shí)間，提高治愈率減少病死率。本發(fā)明高純度胰激肽原酶的開(kāi)發(fā)擴(kuò)大了該品的適應(yīng)癥與使用范圍。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1為本發(fā)明方法中制備活性組分1的陰離子交換柱層析紫外吸收?qǐng)D譜；圖2為本發(fā)明方法中抗胰激肽原酶特異性抗體純化過(guò)程記錄儀圖譜；圖3為本發(fā)明方法中制備高純度胰激肽原酶的親和層析流程記錄儀圖譜；圖4為本發(fā)明制備的高純度胰激肽原酶高效液相色譜圖譜；圖5為本發(fā)明制備的另一批次的高純度胰激肽原酶高效液相色譜圖譜；圖6為本發(fā)明制備的又一批次的高純度激肽原酶高效液相色譜圖譜；圖7為胰激肽原酶SDS-聚丙烯酰胺凝較電泳圖譜圖中泳道1、2、4、5、6、7、9、10為胰激肽原酶樣品；泳道3、8為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(分子量范圍為14,000～97,400，其組成及分子量為兔磷酸化酶B 97,400，牛血清白蛋白66,200，兔肌動(dòng)蛋白43,000，牛碳酸酐酶31,000，胰蛋白酶抑制劑20,100，雞蛋清溶菌酶14,400)發(fā)明的具體實(shí)施方式
高純度胰激肽原酶的制備1、胰激肽原酶粗品的提取新鮮或冷凍的豬胰或牛胰臟稱(chēng)重后，用水清洗干凈，置消毒容器內(nèi)。加1～3倍(W/V)生理鹽水制成勻漿。3000～4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20～40分鐘取上清液。上清液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量10000～50000道爾頓(10～50KD)組分，凍干即為胰激肽原酶粗品。
2、離子交換層析初步純化胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液溶解，2500～3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5～20分鐘取上清，沉淀加少量緩沖液再次溶解，離心取上清。合并兩次上清液，上陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose)，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩沖液平衡洗脫至基線(xiàn)，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰，得活性組份1?；钚越M分1的主要成分為胰激肽原酶，具胰激肽原酶活性，根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的主要帶計(jì)算的分子量與胰激肽原酶吻合。此流程用280nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，并用記錄儀記錄，如圖1所示。
3、用作抗原的胰激肽原酶的制備將離子交換層析收集的活性組分1濃縮，用制備型高效液相色譜分離，收集活性組分，并定性，得胰激肽原酶樣品(活性組分2)。其具胰激肽原酶活性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示為一條帶，計(jì)算的分子量與胰激肽原酶標(biāo)準(zhǔn)品吻合；HPLC檢測(cè)為單一組分，保留時(shí)間與胰激肽原酶標(biāo)準(zhǔn)品吻合。
4、免疫親和層析制備胰激肽原酶特異性抗體(1)親和層析柱的制備稱(chēng)2g活化的Sephose-4B，加300ml 1mol/L的HCL充分?jǐn)嚢枋怪蛎?，另?0mg胰激肽原酶溶于0.1mol/L Na2CO3(含0.5mol/l NaCL)pH8.3緩沖液中。將上述Sephose-4B與胰激肽原酶溶液混合，在室溫?cái)嚢?h，用0.1mol/LpH8.3Na2CO3(含0.5mol/l NaCL)緩沖液充分洗滌后，再用0.1mol/L Tris-HCL緩沖液(pH8.30)再洗一次，加同一緩沖液，于室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。備用。
(2)小鼠抗血清制備用上述活性組分2(50～500μg/ml)與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠(中檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在采血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫
(3)制備抗胰激肽原酶特異性抗體取上述免疫小鼠血清，將血清樣品上抗原親和層析柱，用結(jié)合在凝膠上的抗原蛋白與樣品中的抗體特異性結(jié)合，純化得到特異性抗體。具體步驟為用平衡液(0.02MTris-HCL緩沖液，pH＝7.2)平衡抗原親和層析柱后，將血清樣品上抗原親和層析柱，用平衡液平衡至流出液在蛋白檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線(xiàn)后，用洗脫液(0.02MTris-HCL緩沖液，pH＝7.2，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脫，收集活性組分，如圖2所示。將收集到的活性組分用透析袋(截留分子量為10000，對(duì)聚乙二醇濃縮)濃縮后，冷凍干燥，即為抗胰激肽原酶特異性抗體。
5.單克隆抗體技術(shù)制備胰激肽原酶特異性抗體(1)免疫用上述活性組分2(50～500μg/ml)與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
(2)細(xì)胞融合取經(jīng)免疫的BALA/c小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按(5～10)∶1的比例混合，加入分子量40000～60000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
(3)特異雜交瘤細(xì)胞篩選將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價(jià)測(cè)定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細(xì)胞挑選出來(lái)傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此可獲得穩(wěn)定的抗體。
6、抗體親和層析柱的制備選擇瓊脂糖4B、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠作為親和層析的載體，用溴化氰活化該載體；取上述由免疫親和層析或單克隆抗體技術(shù)制備的抗體100mg溶于20ml硼酸緩沖液中，過(guò)濾，濾液加至活化的瓊脂糖4B中，在10℃下攪拌反應(yīng)18小時(shí)，次日裝柱，用10倍柱體積的pH10.2硼酸緩沖液以5～6ml/min流速洗滌柱體，收集流出液，然后再依次用5倍柱體積的pH10.00.1mol/L的乙醇胺溶液及0.1mol/L的硼酸緩沖液(pH8.0)充分洗滌，最后用pH7.4的0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌平衡，即得到抗體親和層析柱。該柱可重復(fù)使用200次以上，用20％的乙醇可長(zhǎng)期保存。
7、胰激肽原酶的制備將上述離子交換層析得到的活性組分1用親和層析平衡緩沖液(0.02MTris-HCL緩沖液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上抗體親和層析柱，用該緩沖液平衡至流出液在蛋白檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線(xiàn)后，用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫(0.02MTris-HCL緩沖液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)。收集各洗脫峰，如圖3所示，鑒定胰激肽原酶活性峰并測(cè)定效價(jià)，冷凍干燥后即為胰激肽原酶原料藥。滿(mǎn)足高純度胰激肽原酶的性能評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。
下面，通過(guò)對(duì)具體實(shí)施例的詳細(xì)描述，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1免疫抗體親和層析柱的制備用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的胰激肽原酶(活性組分2)50μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在采集血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。
用溴化氰活化4B-Sepharose瓊脂糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成免疫抗體親和層析柱。
實(shí)施例2免疫抗體親和層析柱的制備用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的胰激肽原酶(活性組分2)250μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成免疫抗體親和層析柱。
實(shí)施例3免疫抗體親和層析柱的制備用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的胰激肽原酶(活性組分2)500μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成免疫親和層析柱。
實(shí)施例4單克隆抗體親和層析柱的制作方法用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的胰激肽原酶(活性組分2)500μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按5∶1的比例混合，加入分子量40000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞懸液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
將接種細(xì)胞懸液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價(jià)測(cè)定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細(xì)胞挑選出來(lái)傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此獲得穩(wěn)定的抗體。
用溴化氰活化4B-Sepharose瓊脂糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成單克隆抗體親和層析柱。
實(shí)施例5單克隆抗體親和層析柱的制作方法用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的胰激肽原酶(活性組分2)250μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按7∶1的比例混合，加入分子量50000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價(jià)測(cè)定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細(xì)胞挑選出來(lái)傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此獲得穩(wěn)定的抗體。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成單克隆抗體親和層析柱。
實(shí)施例6單克隆抗體親和層析柱的制作方法用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的胰激肽原酶(活性組分2)50μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對(duì)7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按10∶1的比例混合，加入分子量60000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價(jià)測(cè)定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細(xì)胞挑選出來(lái)傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此獲得穩(wěn)定的抗體。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成單克隆抗體親和層析柱。
實(shí)施例7胰激肽原酶原料藥制備取新鮮豬胰10kg，用水清洗干凈，置消毒容器內(nèi)。加1～3倍(W/V)生理鹽水制成勻漿。3000～4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20～40分鐘取上清液。離心上清液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量10000～50000道爾頓(10～50KD)組分，凍干即為胰激肽原酶粗品。胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液500ml溶解，2500～3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5～20分鐘取上清，沉淀加少量緩沖液再次溶解，離心取上清。合并兩次上清液，上陰離子交換層析柱，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩沖液平衡洗脫至基線(xiàn)，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰(活性組分1)。將上述離子交換層析得到的活性組分1用親和層析平衡緩沖液(0.02M Tris-HCL緩沖液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)200ml溶解，上親和層析柱，用該緩沖液平衡至流出液在蛋白檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線(xiàn)后，用含有洗脫劑(0.02M Tris-HCL緩沖液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)的親和層析洗脫液洗脫。收集各洗脫峰，鑒定胰激肽原酶活性峰并測(cè)定效價(jià)，冷凍干燥后即為胰激肽原酶原料藥。
實(shí)施例8胰激肽原酶原料藥制備取新鮮牛胰10kg，用水清洗干凈，置消毒容器內(nèi)。加3倍(W/V)生理鹽水制成勻漿。3000～4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20～40分鐘取上清液。離心上清液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量10000～50000道爾頓(10～50KD)組分，凍干即為胰激肽原酶粗品。胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液500ml溶解，2500～3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5～20分鐘取上清，沉淀加少量緩沖液再次溶解，離心取上清。合并兩次上清液，上陰離子交換層析柱，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩沖液平衡洗脫至基線(xiàn)，用含0.01～0.5mol/LNaCl的上述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰。將上述離子交換層析得到的活性組分1用親和層析平衡緩沖液200ml(0.02M Tris-HCL緩沖液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上親和層析柱，用該緩沖液平衡至流出液在蛋白檢測(cè)儀上繪出穩(wěn)定的基線(xiàn)后，用含有洗脫劑的親和層析洗脫液(0.02M Tris-HCL緩沖液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脫。收集各洗脫峰，鑒定胰激肽原酶活性峰并測(cè)定效價(jià)，冷凍干燥后即為胰激肽原酶原料藥。
高純度胰激肽原酶的性能評(píng)定1、高純度胰激肽原酶對(duì)N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽底物水解速率的測(cè)定溶液的配制(1)磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稱(chēng)取磷酸氫二鈉10.9g，磷酸二氫鈉2.3g，加水約700ml使溶解，調(diào)pH值至7.0，加水稀釋至1000ml，混勻即得。
(2)0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷12.114g，加水約800ml溶解，用6mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，加水至1000ml，混勻即得。
(3)胰蛋白酶抑制劑溶液稱(chēng)取大豆胰蛋白酶抑制劑(Amresco)5mg，加入磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解并稀釋至10ml，混勻即得。
(4)供試品溶液取供試品(依前述實(shí)施例7～8制備的高純度胰激肽原酶，批號(hào)為040218、040220和040223，下同)適量，加入磷酸鹽緩沖液(pH7.0)使溶解，制成每1ml含10單位的溶液。量取4.0ml，置10ml量瓶中，加胰蛋白酶抑制劑溶液1ml，再用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋至刻度。
(5)底物溶液取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽17.7mg，精密稱(chēng)定，加0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)至100ml，充分混勻，4℃保存。
水解速率測(cè)定 量取在30±0.5℃預(yù)熱5分鐘的底物溶液2.9ml置1cm比色池中，加供試品溶液0.1ml，混勻，立即計(jì)時(shí)，在30±0.5℃下，照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄IV A)在253nm波長(zhǎng)處測(cè)定4分鐘的吸光度(A4)和6分鐘的吸光度(A6)。另取胰蛋白酶抑制劑1.0ml，加入磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋至10ml，量取0.1ml置1cm比色池中，加入30±0.5℃預(yù)熱5分鐘的底物溶液2.9ml，混勻?yàn)榭瞻?，求得A值[(A6-A4)/2]，按下式計(jì)算R值(水解速率)。
R值(水解速率)應(yīng)為0.12～0.17R=A0.0383×a×b]]>式中a為供試品溶液每1ml中的mg數(shù)；b為供試品每1mg的效價(jià)單位數(shù)。
2、純度檢查(主要用于檢查原料)(1)照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000版附錄VI H)測(cè)定，應(yīng)為單一組分。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)儀器型號(hào)SHIMADZU(島津)液相色譜儀；SPD-10A vp檢測(cè)器；SCL-10A vp控制器；LC-AT vp輸液泵；FCV-10AL vp溶劑切換器；PGU-14A脫氣機(jī)；Class-vp6.10色譜工作站；色譜柱為T(mén)SK-2000凝膠色譜柱300×7.5mm，5μm；流動(dòng)相0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；流速1.0ml/min；檢測(cè)溫度25℃；理論板數(shù)按胰激肽原酶峰計(jì)算應(yīng)不小于3000。
測(cè)定法取供試品用流動(dòng)相制成每1ml含10單位的溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計(jì)算，主峰面積應(yīng)大于95％，保留時(shí)間應(yīng)為7.8±0.5min，結(jié)果見(jiàn)圖4～6。
(2)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上應(yīng)顯示一條帶(詳見(jiàn)分子量測(cè)定)。
3、分子量測(cè)定照電泳法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法)測(cè)定。
供試品緩沖液取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml，10％十二烷基硫酸鈉2.0ml，0.5％溴酚藍(lán)溶液0.5ml，β-巰基乙醇0.5ml，混勻。
標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備 取分子量測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分子量范圍1～10萬(wàn))適量，加供試品緩沖液制成每1ml中含1μg蛋白的溶液。臨用前置沸水浴中5min，冷卻。
供試品溶液的制備取供試品適量(按蛋白含量計(jì)算)，加供試品緩沖液制成每1μl中含2μg蛋白的溶液，臨用前置沸水浴中5min，冷卻。
測(cè)定法照上述電泳法試驗(yàn)，采用垂直板電泳，每孔加5～10μl供試品溶液或標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，考馬斯亮藍(lán)染色。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以遷移率為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線(xiàn)回歸，由回歸方程計(jì)算供試品的分子量。
測(cè)定結(jié)果應(yīng)為一條帶，分子量應(yīng)為39000±5000道爾頓，見(jiàn)圖7。
4、序列測(cè)定將前述實(shí)施例7～8制備的高純度胰激肽原酶經(jīng)北京大學(xué)生命科學(xué)院氨基酸序列分析，N-末端15個(gè)氨基酸序列為Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
5、效價(jià)及比活力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取胰激肽原酶標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)適量，精密稱(chēng)重，加上述磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解并制成每1ml中含10單位的溶液。
供試品溶液的制備取供試品適量，精密稱(chēng)重，加磷酸鹽緩沖液(pH7.0)制成每1ml中約含10單位的溶液。
底物溶液的制備取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽17.7mg，精密稱(chēng)定，加0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)至100ml，4℃保存。
測(cè)定法量取25±0.5℃水浴中預(yù)熱的底物溶液2.5ml置1cm比色池中，精密加入供試品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml，混勻，立即計(jì)時(shí)。照紫外分光光度法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄IV A)，在25±0.5℃于253nm波長(zhǎng)處測(cè)定，以底物溶液為空白，準(zhǔn)確讀取1分鐘的吸光度A1和3分鐘的吸光度A3。標(biāo)準(zhǔn)品和供試品平行測(cè)定3次取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的A值(A＝A3-A1)，按下式計(jì)算每1mg供試品的效價(jià)
蛋白含量取供試品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1ml中約含0.15mg蛋白的溶液，精密量取供試品1.0ml。照福林酚測(cè)定法(見(jiàn)注)測(cè)定，計(jì)算每1mg供試中的蛋白毫克數(shù)。
比活力按下式計(jì)算 注福林酚測(cè)定法試劑堿性銅試液取氫氧化鈉10g，硫酸鈉50g，加水400ml使其溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸銅0.25g加水30ml使其溶解，將兩液混合作為乙液。
臨用前，合并甲、乙兩液，并加水至500ml。
對(duì)照品溶液的制備取牛血清白蛋白對(duì)照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
供試品溶液的制備取供試品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1ml中約含0.15mg蛋白的溶液。
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備精密量取對(duì)照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml。再分別加堿性銅試液1.0ml，搖勻；各加入福林試液(中國(guó)藥典2000年版二部附錄XV B，取福林試液貯備液，按1∶15用水稀釋)4.0ml，蓋塞，立即混勻。置55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，置冷水浴中10min，照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄IV B)以0號(hào)管為空白，在650nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)的吸收度A對(duì)照進(jìn)行直線(xiàn)回歸，求出回歸方程。
測(cè)定法精密量取供試品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法，自“加入堿性銅試液”起操作，測(cè)得其樣品的吸光度A樣品，從回歸方程計(jì)算蛋白的含量，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。
6、過(guò)敏試驗(yàn)取供試品適量，加0.9％氯化鈉注射液制成每1ml含100單位的溶液作為供試品致敏液與攻擊液。
取體重250-350g豚鼠6只，間日腹腔注射供試品致敏液0.5ml，連續(xù)3次使致敏。然后將動(dòng)物分成兩組，每組3只，分別在第一次注射后第14日及第21日靜脈注射供試品攻擊液1.0ml進(jìn)行攻擊。仔細(xì)觀察注射后15min內(nèi)豚鼠的反應(yīng)，均不得出現(xiàn)過(guò)敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽3聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者；或啰音、抽搐、虛脫或死亡現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽(yáng)性。
7、異常毒性取本品，加0.9％氯化鈉注射液制成每1ml含10單位的溶液，依法檢查(中國(guó)藥典2000版二部附錄XI C)，按靜脈法給藥，符合規(guī)定。三個(gè)批次樣品的檢定結(jié)果列表如下 由檢定結(jié)果可以得出結(jié)論運(yùn)用免疫親和層析技術(shù)，提取的胰激肽原酶純度高，獲得的產(chǎn)品比活高，達(dá)到每毫克蛋白800單位以上，經(jīng)HPLC檢查為單一組分，在SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示一條帶，分子量測(cè)定為34～44KD不含雜質(zhì)，使用安全，能達(dá)到靜脈給藥的要求。
含高純度胰激肽原酶的藥物制劑實(shí)施例9注射用胰激肽原酶(凍干靜脈注射用胰激肽原酶)制劑生產(chǎn)工藝。
首先，在局部百級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)按配制處方將胰激肽原酶原料藥((按照本發(fā)明前述實(shí)施例制備，并經(jīng)各項(xiàng)檢測(cè)合格，下同))與磷酸鹽、氯化鈉、右旋糖酐等輔料準(zhǔn)確稱(chēng)量在配液容器內(nèi)；加注射用水充分溶解或稀釋?zhuān)瑪嚢杌靹蚝?，使磷酸鹽的濃度為0.03mol/L，氯化鈉濃度為0.9％，右旋糖苷濃度為3％，得到制劑中間體；除菌過(guò)濾，其中過(guò)濾前后應(yīng)對(duì)除菌過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行完整性測(cè)試。然后，將過(guò)濾后的中間體按裝量裝入抗生素瓶，在分裝過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行至少4次裝量檢查，保證每一只瓶?jī)?nèi)裝入的藥量準(zhǔn)確。最后，將裝入藥品的抗生素瓶碼在凍干箱各層的隔板上，按照品種凍干曲線(xiàn)進(jìn)行速凍至零下20～30℃，維持8小時(shí)；然后抽真空，在真空狀態(tài)下緩慢升溫至35～40℃，保持一定時(shí)間，再降至室溫后取出。壓塞、軋蓋得成品。經(jīng)過(guò)成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行包裝，入成品庫(kù)存放。
實(shí)施例10胰激肽原酶注射液(靜脈注射用胰激肽原酶制劑)生產(chǎn)工藝。
首先，在局部百級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)按配制處方將胰激肽原酶原料藥、磷酸鹽、氯化鈉等輔料準(zhǔn)確稱(chēng)量在配液容器內(nèi)；加注射用水充分溶解或稀釋?zhuān)瑪嚢杌靹蚝螅沽姿猁}的濃度為0.03mol/L，氯化鈉濃度為0.9％，得到制劑中間體；除菌過(guò)濾，其中過(guò)濾前后應(yīng)對(duì)除菌過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行完整性測(cè)試。然后，將過(guò)濾后的中間體按裝量裝入抗生素瓶同時(shí)壓塞、軋蓋即得成品，在分裝過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行至少4次裝量檢查，保證每一只瓶?jī)?nèi)裝入的藥量準(zhǔn)確。最后，經(jīng)過(guò)成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行包裝，入成品庫(kù)存放。
實(shí)施例11胰激肽原酶腸溶膠囊制劑生產(chǎn)工藝。
首先，在十萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)將胰激肽酶原料藥與淀粉、乳糖等輔料準(zhǔn)確稱(chēng)量，輔料配比為淀粉乳糖為1∶1，充分混合均勻，得到制劑中間體。然后，取外觀、長(zhǎng)度、厚度、臭味、水分、脆碎度、融化時(shí)限、熾灼殘?jiān)拔⑸飳W(xué)檢查均符合規(guī)定的膠囊殼，填充中間體藥粉，得到半成品。最后蓋上膠囊上節(jié)、壓平打光，制得成品。經(jīng)過(guò)成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，用玻璃瓶或塑料瓶密閉包裝，入成品庫(kù)，放置在陰涼干燥處，溫度不得超過(guò)25℃，相對(duì)濕度不得超過(guò)45％。
實(shí)施例12為胰激肽原酶腸溶片生產(chǎn)工藝。
首先，在十萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)將胰激肽原酶原料藥與淀粉、羧丙基纖維素鈉等輔料準(zhǔn)確稱(chēng)量(淀粉∶羧丙基纖維素鈉＝1∶1)，充分混合均勻，得到制劑中間體。然后，進(jìn)行制粒與壓片，在壓片過(guò)程中隨時(shí)注意片劑的外觀，定時(shí)抽查藥片的重量差異、硬度和崩解時(shí)限。最后，包腸溶衣得到成品。經(jīng)過(guò)成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行包裝，入成品庫(kù)，貯存在陰涼、通風(fēng)、干燥處，注意防止受潮、發(fā)霉、變質(zhì)。
以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
權(quán)利要求
1.制備高純度胰激肽原酶的方法，包括下述步驟1)將含胰激肽原酶的豬胰或牛胰臟初步純化、分離，獲得主要成分為胰激肽原酶的活性組分1；2)將所述活性組分1進(jìn)一步純化，獲得活性組分2；3)以所述活性組分2作為抗原，制備抗胰激肽原酶特異性抗體；4)將所述制備得到的抗胰激肽原酶特異性抗體與親和層析載體結(jié)合，制備抗體親和層析柱；5)用所述抗體親和層析柱分離純化步驟1)中的活性組分1，獲得高純度胰激肽原酶。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述制備抗胰激肽原酶特異性抗體包括下述步驟3a)以所述活性組分2作為抗原，免疫小鼠，制備抗血清；3b)將所述活性組分2與親和層析載體結(jié)合，制備抗原親和層析柱；3c)將所述抗血清上抗原親和層析柱，分離得到抗胰激肽原酶特異性抗體。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述制備抗胰激肽原酶特異性抗體包括下述步驟3i)以所述活性組分2作為抗原，免疫小鼠，制備免疫小鼠脾細(xì)胞；3ii)將所述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，制備融合的雜交瘤細(xì)胞；3iii)篩選表達(dá)抗胰激肽原酶抗體的雜交瘤細(xì)胞，建立細(xì)胞株；3iv)培養(yǎng)所述細(xì)胞株獲得所述抗胰激肽原酶特異性抗體。
4.權(quán)利要求1、2或3所述方法，其特征在于步驟1)所述豬胰或牛胰臟原料初步純化、分離包括下述步驟1a)將胰臟原料經(jīng)透析，截留分子量10000～50000道爾頓部分；1b)將上述截留部分經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換柱吸附，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩沖液平衡洗脫至基線(xiàn)，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰，制備活性組分1。
5.權(quán)利要求1、2或3所述方法，其特征在于所述親和層析載體為Sepharose4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠。
6.權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中進(jìn)一步純化活性組分1的方法為將活性組分1經(jīng)制備型高效液相色譜分離，制備胰激肽原酶，即為活性組分2。
7.權(quán)利要求1方法制備的高純度胰激肽原酶。
8.權(quán)利要求7所述的高純度胰激肽原酶，其特征在于所述高純度胰激肽原酶具有以下特性比活性為每毫克蛋白800單位以上；高效液相色譜法檢測(cè)，單組分圖譜，主峰面積大于95％，保留時(shí)間為7.8±0.5min；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示一條帶，分子量為34～44千道爾頓；氨基酸序列分析，N-末端15個(gè)氨基酸序列為Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
9.一種藥物制劑，含有權(quán)利要求7所述高純度胰激肽原酶以及藥學(xué)上可接受的藥用輔料。
10.權(quán)利要求9所述的藥物制劑，其特征在于所述藥物制劑為靜脈給藥劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備高純度胰激肽原酶的方法，將抗原抗體反應(yīng)與親和層析技術(shù)結(jié)合，從含胰激肽原酶的胰臟中將胰激肽原酶分離純化，制備得到純度高的胰激肽原酶。本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明方法制備的高純度胰激肽原酶及其藥物制劑，獲得的產(chǎn)品比活高、純度高，不含或僅含少量雜質(zhì)，使用安全，能達(dá)到靜脈給藥的要求。
文檔編號(hào)A61K38/48GK1737134SQ200410009460
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者馬骉, 魏化偉, 王天燕 申請(qǐng)人:北京賽生藥業(yè)有限公司