專利名稱:甲基汞化合物作為抗癌新藥在顱內(nèi)惡性腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明是涉及甲基汞化合物的新用途。
背景技術(shù):
腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類生命的難治性疾病,中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是腫瘤的常見類型,據(jù)世界衛(wèi)生組織1992年統(tǒng)計腦原發(fā)腫瘤年發(fā)病率為2-19/10萬,我國的年發(fā)病率為10/10萬。顱內(nèi)腫瘤45-50%為高惡性度的神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤手術(shù)治療為首選,其最好的結(jié)果也只能肉眼全切除,但術(shù)后因留有侵襲性增殖的腫瘤細(xì)胞而常復(fù)發(fā),且往往遺留神經(jīng)功能缺失,如偏癱,失語,甚至出現(xiàn)思維,情感障礙。傳統(tǒng)的放化療雖然對腫瘤具有一定療效,但因多數(shù)化療藥物不易通過血腦屏障,臨床應(yīng)用受到極大的限制,病人的生存期平均不足一年。有的學(xué)者認(rèn)為高惡性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤實際是不治之癥,盡管經(jīng)手術(shù)、放化療其結(jié)果仍不可避免地導(dǎo)致死亡。因此,尋找和研制理想的腦靶向抗癌藥物是亟待解決的的問題。
人類在尋找新藥的歷史長河中,利用化學(xué)物質(zhì)的毒性尋找新藥積累了一些經(jīng)驗,并取得了一些規(guī)律性的認(rèn)識。目前,根據(jù)癌癥治療藥物的抗癌作用機(jī)制,可分為抑制細(xì)胞效應(yīng)藥物和毒害細(xì)胞效應(yīng)藥物。抑制細(xì)胞效應(yīng)的藥物可阻止癌的進(jìn)一步生長,但不能根除癌,而毒害細(xì)胞效應(yīng)的藥物具備治愈病人的潛能。有毒金屬順鉑作為治療腫瘤的抗癌藥物是化療上的一次革命。近年來,砒霜的主要成分三氧化二砷(As2O3)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocyticLeukemia.APL)臨床基礎(chǔ)方面取得了令人矚目的進(jìn)展,《Science》著文稱之為繼維甲酸(ATRA)之后又一令人震驚的發(fā)現(xiàn)<1>。這些都是通過毒作用來尋找新藥的成功嘗試。
氯化甲基汞過去主要用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作為殺真菌劑,由于其應(yīng)用帶來環(huán)境的污染和誤服,在世界范圍內(nèi)曾發(fā)生幾起嚴(yán)重的中毒事件<2-3 >。
1.氯化甲基汞腦靶向蓄積作用(1)理化特性屬烷基汞化合物,結(jié)構(gòu)式為CH3-Hg-CI,分子量小Mr=251.04,碳鏈短,碳汞共價結(jié)合牢固,非電離,具有良好的脂溶性,極易透過血腦屏障。
(2)藥代動力學(xué)(吸收、分布、排泄和轉(zhuǎn)化)吸收氯化甲基汞能溶于有機(jī)溶劑和類脂質(zhì)中,口服后,90%以上可由小腸吸收。呼吸道、皮膚和粘膜也極易吸收。甲基汞也能通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)。
分布進(jìn)入機(jī)體的氯化甲基汞,主要集中在腦、腎、肝、血和毛發(fā)。慢性給藥(通過調(diào)整給藥劑量和時間)腦中甲基汞的含量可占全身總含量的10%。
Berlin等人給鼠猴(squirrel monkeys)喂飼含有放射性標(biāo)記甲基汞的乳汁,探討氯化甲基汞的神經(jīng)毒性及其藥代動力學(xué),結(jié)果表明甲基汞在腦中靶向蓄積,腦與血汞的比值為5.6,與Carlson等人報道的結(jié)果相一致<4-5>。Rice等人給雌猴10、25、50mg/kg/day氯化甲基汞,至少半年,觀察其生物半減期,血汞生物半減期為14天,而猴腦汞生物半減期是38-56天之間,腦血汞比值為3到10。<6>
排泄氯化甲基汞在人和動物體內(nèi)主要通過糞便排泄,尿中的排泄不足10%,甲基汞由膽汁排到小腸,然后幾乎立即又由小腸回吸收,于是構(gòu)成甲基汞在機(jī)體內(nèi)的反復(fù)循環(huán)(肝腸循環(huán)),使得其在體內(nèi)長期存留,甲基汞在人體內(nèi)的生物半減期為70天,每日排出量約為體內(nèi)貯存量的1%,腦中的生物半減期為230天,清除更為緩慢<7 >。
轉(zhuǎn)化各種有機(jī)汞在機(jī)體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成無機(jī)汞(無機(jī)汞的毒性比甲基汞弱),表明有機(jī)汞在體內(nèi)可以分解。動物注射氯化甲基汞在腎和肝的轉(zhuǎn)化率較高,腦中的轉(zhuǎn)化率極低。氯化甲基汞在腦比在其他器官組織穩(wěn)定,不易被降解,腦中的汞幾乎都以甲基汞的形式存在。
綜上可見氯化甲基汞在機(jī)體內(nèi)的生物半減期長,尤其在腦中的半減期更長,腦中甲基汞轉(zhuǎn)化成毒性低的無機(jī)汞的轉(zhuǎn)化率比其他臟器的轉(zhuǎn)化率低??梢?,氯化甲基汞具有腦靶向蓄積特性。
2.氯化甲基汞多靶點毒害細(xì)胞效應(yīng)由于氯化甲基汞具有上述特殊的理化特性,進(jìn)入腦組織后,與細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體等)的膜、胞漿、核蛋白以及核酸相互作用,從而對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多靶點毒害細(xì)胞效應(yīng)。
(1)氯化甲基汞具有類放射損傷效應(yīng),可引起DNA斷裂。其烷基結(jié)構(gòu)能與DNA堿基相互作用,在DNA雙鏈內(nèi)形成鏈內(nèi)鏈間交聯(lián),影響DNA的正常復(fù)制<8-9>。
(2)除具有烷基結(jié)構(gòu)外,還具有Hg2+結(jié)構(gòu),可與生物大分子(轉(zhuǎn)錄因子、信號分子、巰基酶)的-SH相互作用,干擾正常生化過程,導(dǎo)致異常分子事件<10>。
(3)氯化甲基汞抑制神經(jīng)元蛋白質(zhì)和核酸合成<11-12>,影響神經(jīng)元蛋白質(zhì)磷酸化<13-14>,抑制神經(jīng)元微管解聚,破壞微管結(jié)構(gòu),阻止細(xì)胞有絲分裂<15>。
(4)氯化甲基汞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡/壞死。線粒體是氯化甲基汞作用的主要靶點,氯化甲基汞可抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物II,導(dǎo)致不完全氧化產(chǎn)物ROS、自由基的生成<16>;同時影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+環(huán)境,升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度<17>;亦可影響神經(jīng)元線粒體膜電位,改變其膜透性,使細(xì)胞色素C釋放至胞漿并與Apaf-1結(jié)合,引起Caspase級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡/壞死<18-20>。
(5)氯化甲基汞干擾發(fā)育階段腦神經(jīng)元細(xì)胞周期進(jìn)程,誘導(dǎo)p21Waf1/Cip1、Gadd45、Gadd153表達(dá),使神經(jīng)元阻滯在G0/G1、G2/M期<21-23>。
基于上述氯化甲基汞腦靶向蓄積作用和對中樞神經(jīng)系統(tǒng)多靶點毒害細(xì)胞效應(yīng),我們認(rèn)為氯化甲基汞劇神經(jīng)毒物具有治愈中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的潛能,提出用氯化甲基汞治療顱內(nèi)惡性腫瘤的新觀點。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種甲基汞化合物的新用途。
具體的是關(guān)于甲基汞化合物在治療顱內(nèi)惡性腫瘤疾病的藥品中的應(yīng)用。
圖1是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體外抑制作用對照組;圖2是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體外抑制作用接觸0.063μM氯化甲基汞;圖3是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體外抑制作用接觸0.125μM氯化甲基汞;圖4是本發(fā)明氯化甲基汞對SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用;圖5是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用;圖6是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用未接觸氯化甲基汞的C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
圖7是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用接觸0.25μM氯化甲基汞的C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,可見核固縮、壞死;圖8是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷作用;圖9是本發(fā)明氯化甲基汞對SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用;圖10是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡/壞死的影響(流式細(xì)胞儀分析)A對照組B、C、D實驗組;圖11是本發(fā)明氯化甲基汞誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡/壞死分析;
圖12是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期影響(流式分析)左是對照組,右是實驗組;圖13是本發(fā)明氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期影響分析圖;圖14是本發(fā)明大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型左鼠左前肢不能站立,右鼠自身旋轉(zhuǎn);圖15是本發(fā)明腦膠質(zhì)瘤動物模型的大體病理左實驗組,右對照組;圖16是本發(fā)明腦膠質(zhì)瘤動物模型的組織病理左對照組,右實驗組,可見膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量減少、液化性壞死(HE染色中倍);圖17是本發(fā)明大鼠腦膠質(zhì)瘤組織切片原位末端熒光凋亡檢測上為對照組,下為實驗組;圖18是本發(fā)明大鼠腦膠質(zhì)瘤電鏡觀察 A.對照組膠質(zhì)瘤細(xì)胞×7500 B.實驗組膠質(zhì)瘤細(xì)胞空泡、核固縮×7500C.實驗組膠質(zhì)瘤細(xì)胞核固縮、核裂解×20K。
具體實施例方式氯化甲基汞對腦膠質(zhì)瘤抗癌作用的實驗研究(一).體外實驗研究1.氯化甲基汞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用材料方法主要試劑氯化甲基汞購于德國Merck公司純度99%以上,RpmI1640,和IMDM培養(yǎng)基(Gibco,美國),胰蛋白酶(sigma),MTT(sigma),DMSO(sigma)
細(xì)胞株SHG44細(xì)胞系(由衛(wèi)生部重點實驗室提供)C6細(xì)胞株購自美國ATCC(pockvi,MD)方法SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別在含10%胎牛血清的RpmI1640和IMDM培養(yǎng)基中,5%CO2,37℃條件下培養(yǎng),細(xì)胞處于對數(shù)生長期,加入0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度,在含有不同濃度(20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31和0.16μM)氯化甲基汞的96孔平底培養(yǎng)皿中,每孔中含1×103個SHG44或C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,培養(yǎng)3d。采用MTT法用Microplat reader(Bio-Rad 550型美國)測量細(xì)胞光密度值。觀察不同濃度氯化甲基汞對其增殖能力的影響,見表1和圖1-5。同時用上述氯化甲基汞相應(yīng)濃度的三氧化二砷(As2O3)和順氯氨鉑對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行對照研究,結(jié)果見表2。
表1.氯化甲基汞對SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用濃度(μM) SHG44 C610.00 10.6±2.1* 10.5±0.6*5.00 39.6±1.1* 17.2±4.2*2.50 48.2±8.0 59.0±1.7*1.25 94.2±8.0 74.6±3.9*0.63 101.1±21.080.6±3.30.31 128.0±6.3 83.6±1.20.16 118.8±4.7 81.6±6.20.08 91.0±20.0 85.1±3.70.00(對照)100.0±4.2 100.0±2.2X±S(n=3),數(shù)據(jù)為占對照組細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù),*p<0.05 **p<0.01表2.氯化甲基汞、三氧化二砷和順氯氨鉑對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用濃度(μM) 氯化甲基汞 三氧化二砷順氯氨鉑
5.0041.7±17.1** 45.8±7.6**48.9±3.8**2.5049.1±26.4*69.6±11.8** 80.9±4.1*1.2561.8±17.1*85.5±5.7 87.4±3.90.6373.0±15.0 87.9±5.7 86.8±4.50.3198.3±15.5 86.4±7.4 93.2±7.40.1694.8±22.0 86.2±6.50 89.6±12.50.0895.4±11.0 90.3±0.7 89.9±5.70.00(對照) 100.0±12.0100.0±12.0100.0±12.0X±S(n=3),數(shù)據(jù)為占對照組細(xì)胞數(shù)的白分?jǐn)?shù),*p<0.05 **p<0.01實驗結(jié)果從表1和圖4、5顯示當(dāng)SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接觸不同濃度(10、5、2.5、1.25μM)氯化甲基汞作用3d后,SHG44組的細(xì)胞存活數(shù)分別為對照組的10.6%、39.6%、48.2%和94.2%;C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活數(shù)僅為對照組的10.5%、17.2%、59.0%和74.6%,并存在劑量反應(yīng)關(guān)系,結(jié)果表明氯化甲基汞對SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。從表2中可看出C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接觸0.08μM-5.00μM濃度氯化甲基汞、三氧化二砷和順氯氨鉑,發(fā)現(xiàn)三者對其細(xì)胞增殖的抑制作用大致相同。
2.氯化甲基汞對SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用方法在96孔平底培養(yǎng)皿中分別加入1×103個C6或SHG44細(xì)胞,培養(yǎng)3d后,在培養(yǎng)基中加入含有不同濃度氯化甲基汞(10、5、2.5、1.25、0.62、0.31和0.16μM),分別作用4、8、16、32h后,采用MTT法測定其細(xì)胞數(shù)。用Microplat reader(Bio Rad 550型美國)測細(xì)胞光密度,觀察不同濃度氯化甲基汞對SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用,同時用上述氯化甲基汞相應(yīng)濃度的三氧化二砷(As2O3)和順氯氨鉑對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行對照研究,試驗結(jié)果如表3、4、5和圖6、7、8、9。
表3.氯化甲基汞對SHG44細(xì)胞的殺傷作用濃度(μM) 4h8h 16h 32h10.00 15.4±2.7*18.9±11.7*37.2±0.9*13.4±5.6*5.0050.5±8.7*32.1±7.2* 35.6±9.9*20.7±2.9*2.5056.9±9.9*33.2±18.3*57.1±4.8*22.2±0.9*1.2578.4±7.9 80.9±1.5 78.6±1.3 42.6±17.3*0.6279.5±9.7 79.8±0.6 96.3±2.8 68.3±18.5*0.3177.9±8.2 98.6±2.9 92.6±1.4 94.8±17.60.1681.8±0.4 91.6±13.5 102.0±7.1103.5±9.30.00(對照) 100.0±19.7 100.0±19.1100.0±10.4 100.0±14.3X±S(n=3),數(shù)據(jù)為占對照組細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù),*p<0.05 **p<0.01表4.氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用濃度(μM) 4h 8h 16h 32h10.00 36.7±10.9**45.7±11.2** 20.6±3.7** 14.9±2.3**5.0036.7±10.2**53.1±5.4* 23.4±3.3** 14.6±2.8**2.5044.8±2.5* 59.7±9.0* 45.9±17.7* 11.8±7.6**1.2565.7±2.5* 76.8±4.4 60.8±9.0 52.8±5.4*0.6278.3±2.2* 83.5±4.5 77.5±8.2 67.8±4.2*0.3182.9±3.9 100.1±22.089.9±17.398.2±0.50.1696.0±2.8 113.3±7.7 97.5±12.899.1±1.40.00(對照) 100.0±10.3 100.0±4.4 100.0±8.0100.0±3.0X±S(n=3),數(shù)據(jù)為占對照組細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù),*p<0.05 **p<0.01表5 氯化甲基汞、三氧化二砷和順氯氨鉑對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷作用濃度(μM)氯化甲基汞 三氧化二砷 順氯氨鉑5.00 57.8±8.4* 61.2±16.1*103.3±2.82.50 90.6±8.8 92.0±11.3 120.9±15.81.25 103.0±14.6102.2±13.4145.4±31.90.62 119.2±6.5 96.4±10.4 126.5±26.20.31 110.7±10.396.9±6.2 112.6±29.40.16 110.3±12.099.5±7.4 126.3±28.10.08 121.5±14.2108.0±13.2128.4±36.0
0.00(對照)100.0±24.5100.0±24.5100.0±24.5X±S(n=3),數(shù)據(jù)為占對照組細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù),*p<0.05 **p<0.01,實驗結(jié)果當(dāng)SHG44和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接觸5.00μM濃度的氯化甲基汞與對照組相比細(xì)胞殺傷達(dá)50%以上,氯化甲基汞對上述兩種細(xì)胞殺傷作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系,并隨時間的延長有逐漸增強(qiáng)的趨勢。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接觸0.08μM-5.00μM的氯化甲基汞、三氧化二砷和順氯氨鉑作用4h后,發(fā)現(xiàn)氯化甲基汞和的殺傷活性大致相同,而順氯氨鉑則沒有明顯殺傷活性。
3.氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡/壞死的影響。
方法試驗選用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中,5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)。待C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期,用0.25%胰蛋白酶消化,制備單細(xì)胞懸液,調(diào)至細(xì)胞濃度為1×107/ml,臺盼蘭檢測細(xì)胞存活率>98%以上,用于細(xì)胞凋亡/壞死和細(xì)胞周期的研究。
細(xì)胞凋亡/壞死檢測上述細(xì)胞接種于24孔平底培養(yǎng)板中,每孔為1×106細(xì)胞,接觸不同濃度氯化甲基汞(0.00、0.16、0.32、0.63、1.25、2.50、5.00和10.00μM),培養(yǎng)24h后,用0.25%胰蛋白酶消化,用PBS洗滌后加入Hochest33258 150μl(100mg/ml),37℃溫育30min,再加入100μl PI(不含tritonX100),4℃條件下避光放置30min,Hochest 33258用氬離子激光激發(fā),波長352 nm,PI激發(fā)波長488nm,用FACScan流式細(xì)胞儀,收集1×104細(xì)胞,用Cellguest軟件進(jìn)行分析處理。見圖10、11,表6。
結(jié)果表明從圖11中可看出C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接觸0.32、0.63、2.50、5.00和10.00μM氯化甲基汞作用24h其細(xì)胞凋亡/壞死率明顯高于對照組(P<0.05)。C6膠質(zhì)瘤正常細(xì)胞率也明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明氯化甲基汞可誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡/壞死。
表6.C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接觸不同濃度氯化甲基汞24h后凋亡/壞死率濃度(μM)正常細(xì)胞(%)凋亡/壞死細(xì)胞(%)0.00 48.49±3.34 51.72±3.360.16 38.73±8.52*61.49±8.570.32 34.99±5.27*65.18±5.26*0.63 33.69±4.82*66.60±4.82*1.25 38.74±8.95 61.52±8.992.50 38.08±10.17* 65.20±6.93*5.00 29.52±11.30* 70.68±11.27*10.0024.97±6.87*75.21±6.89*X±S(n=3),數(shù)據(jù)為細(xì)胞群的百分?jǐn)?shù),*p<0.054.氯化甲基汞對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響方法C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞處理同上,培養(yǎng)72h后,收獲細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌后,每孔加入RNA酶(0.1mg/ml)100μl,PI(0.05mg/ml)100μl(含0.01%TritonX100),4℃條件下避光放置30min,用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定,氬離子激發(fā)波長488nm,每孔收集1×104細(xì)胞,采用HodFlit軟件進(jìn)行分析處理。見表7和圖12、13。
表7 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接觸不同濃度氯化甲基汞72h后對細(xì)胞周期的影響濃度(μM) G0/G1期細(xì)胞(%)s期細(xì)胞(%)0.0042.78±9.9254.77±8.230.1645.41±5.0453.47±5.060.3242.90±2.4955.39±2.470.6345.06±2.7348.51±7.721.2555.56±2.79* 43.34±3.78*
2.5057.09±1.49* 41.65±0.81*5.0069.45±3.28**27.52±5.11**X±S(n=3),數(shù)據(jù)為細(xì)胞群的百分?jǐn)?shù),*p<0.05 **p<0.01結(jié)果表明從表7和圖13中可看出C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接觸5.00、2.50和1.25μM氯化甲基汞,其G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于對照組(P<0.05),S期明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明氯化甲基汞使C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1,減少進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù),抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期進(jìn)程。
(二).體內(nèi)實驗研究1.腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立方法(1)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在含10%胎牛血清的IMDM(Gibco)培養(yǎng)基中,5%CO2,37℃條件下培養(yǎng),每天更換一次培養(yǎng)液,在細(xì)胞處于指數(shù)生長期大約長滿80%時,用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞,收集離心,用Hank’s液洗滌后,制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞活力用臺盼藍(lán)檢測,細(xì)胞存活率>90%,冰浴條件下存放待用。
(2)大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型實驗動物選用中科院上海實驗動物中心提供的Wistar系大鼠20只,體重在150±10g選取大鼠右側(cè)腦尾狀核區(qū)為靶點,其定位前囟門點前1.0mm,矢狀縫右旁開3.5mm,硬膜下5.0mm,大鼠腹腔注射10%水合氯醛。麻醉后,固定于大鼠腦立體定向儀上(自制的)見圖剪去頭皮的毛,強(qiáng)力碘消毒,正中切口,手術(shù)暴露顱骨標(biāo)志,前囟門中點前1.0mm,矢狀縫旁開3.5mm,硬膜下5.0mm處,微型電鉆(直徑為1mm)鉆孔,用微量注射器吸20μl單細(xì)胞懸液使其達(dá)到1×106個細(xì)胞,垂直延伸至硬膜下6mm,然后后退1mm,將其細(xì)胞懸液以1μl/min速度注入靶區(qū)。除針前停留5min,避免反流。顱骨鉆孔用骨蠟封閉,縫合頭皮。
2.氯化甲基汞對大鼠腦膠質(zhì)瘤的抗癌作用上述模型動物隨機(jī)分為實驗組和對照組,實驗組大鼠腦注射C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞一周后,每天灌胃10mg/kgBW MMC,連續(xù)5d,對照組給予相同體積的生理鹽水。
觀察指標(biāo)a 觀察大鼠試驗期間的一般狀態(tài)b 腫瘤病理學(xué)研究大體(腫瘤大小計算,腦針刺點橫斷面,以腫瘤長徑×短徑2×0.5236)、光鏡、電鏡、原位末端熒光標(biāo)記凋亡檢測c 腦汞含量測定(采用Varian Spectr AA220原子吸收分光光度計,用氫化物原子吸收法測定)d 荷瘤動物存活時間腦汞含量測定表8 腦膠質(zhì)瘤大鼠腦汞含量
結(jié)果大鼠腦接種C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞7d后,出現(xiàn)各種神經(jīng)癥狀,表現(xiàn)為活動能力減弱,肢體肌力減退,癲癇樣發(fā)作、自身旋轉(zhuǎn)、蹣跚步態(tài)等癥狀。圖14示大鼠(左)左前肢不能直立,大鼠(右)自身旋轉(zhuǎn)。病理學(xué)檢查實驗組和對照組大鼠腦大體病理見圖15,對照組腫瘤體積為231.24±215.10mm3,實驗組腫瘤體積為7.56±3.81mm3,實驗組腫瘤體積小于對照組,p<0.05。組織病理學(xué)檢查見圖16,實驗組腫瘤細(xì)胞密度明顯減少伴有液化壞死。圖17示,實驗組腫瘤細(xì)胞凋亡明顯高于對照組。電鏡病理見圖18,實驗組腫瘤細(xì)胞發(fā)生固縮,染色質(zhì)周邊化,核斷裂,空泡變性等改變。腦汞含量測定結(jié)果見表8,實驗組腦汞含量為1.95±0.57μg/g,對照組腦汞含量均小于0.010μg/g。荷瘤動物存活時間,對照組大鼠在接種C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后共死亡5只(第13d死亡1只,15d死亡2只,19d死亡1只,21d死亡1只),實驗組于第18d死亡1只。除自然死亡外,其余兩組存活大鼠在第24d全部計劃處死,實驗組荷瘤動物存活時間大于對照組。
綜上通過體內(nèi)、體外實驗研究證實氯化甲基汞對C6腦膠質(zhì)瘤具有明顯的靶向抗癌作用。
四、實施方案1.劑量我們根據(jù)氯化甲基汞急性中毒、慢性中毒實驗和人群甲基汞每日攝入量的允許值,人群甲基汞中毒的體內(nèi)負(fù)荷量與中毒癥狀發(fā)生的劑量關(guān)系以及甲基汞在動物人體中的藥代動力學(xué)資料,可確定其抗癌治療劑量。
2.用法可通過口服或靜脈途徑給予。
3.毒副作用病人可有不同程度的神經(jīng)衰弱癥候群,如不時頭痛失眠、記憶力減退等癥狀,該藥可能對部分人有心、腎、肝功能輕度損害,停藥后可恢復(fù),故有嚴(yán)重的心、腎、肝患者慎用。
4.對副作用的處理①采取對癥治療②用抗氧化劑維生素C、E③驅(qū)汞藥物治療
權(quán)利要求
1.甲基汞化合物在治療顱內(nèi)惡性腫瘤疾病的藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
氯化甲基汞在治療顱內(nèi)惡性腫瘤疾病的藥品中的應(yīng)用。涉及氯化甲基汞的新用途。氯化甲基汞具有脂溶性等特殊理化特性,極易透過血腦屏障,具有腦靶向蓄積作用,對腫瘤細(xì)胞有多靶點毒害細(xì)胞效應(yīng),具有治愈腫瘤的潛能,是治療顱內(nèi)惡性腫瘤的理想抗癌藥物??赏ㄟ^口服或靜脈途徑給予。
文檔編號A61K31/28GK1568962SQ20041001082
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者李志杰 申請人:李志強(qiáng)