專利名稱：含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。具體地是以含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中的一種或幾種為主要原料制備成各種藥物，用于治療阿爾茨海默病。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性癡呆，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的腦退行性疾病。表現(xiàn)為全面持久的智能減退，包括記憶力、計算力、抽象思維能力和語言功能的減退，出現(xiàn)情感和行為異常，喪失工作能力和獨立生活能力。老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)和基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失為AD的主要病理改變。
近年來在家族性AD基因型向表型的轉(zhuǎn)變的研究取得許多進(jìn)展，人們認(rèn)識到這些基因的改變能夠增加Aβ的產(chǎn)量，Aβ的積累與聚集能最終形成AD兩大病理改變——老年斑與神經(jīng)原纖維纏結(jié)。特別是近些年在Aβ代謝的關(guān)鍵酶α、β、γ分泌酶所取得的進(jìn)展，使得人們更進(jìn)一步深入了解AD發(fā)病機(jī)制，也為藥物治療AD帶來了希望。目前多數(shù)學(xué)者傾向于，β淀粉樣蛋白的沉積是AD發(fā)病機(jī)制的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。
目前應(yīng)用的老年癡呆治療藥大多以膽堿酯酶抑制劑為主，如他克林(Tacrine)、哈伯因(Huperzine A)、安理申(Aricept)、艾斯能(Exelon)、多奈哌齊(Donepezil)等。然而，這些藥物遠(yuǎn)期效果并不理想，原因是老年性癡呆并不僅僅是一個膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的問題，越來越多的研究結(jié)果表明，老年性癡呆與腦內(nèi)β淀粉樣蛋白關(guān)系密切，因此從中藥和天然藥物中尋找針對β淀粉樣蛋白治療老年性癡呆的有效成分具有重要意義。
含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)最早是從中藥和天然藥物中發(fā)現(xiàn)的，主要分布于五味子科(Schisandraceae)植物如五味子、南五味子、異型南五味子等中。五味子科植物全世界約有50種，我國即有30多種，是世界上本科種類分布最多的國家。目前從五味子科植物中分離得到的含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的木脂素類成分已近100種，主要包括從五味子屬Schisandra植物中得到的五味子素(schizandrin＝wuweizichun A)、五味子甲素(deoxyschizandrin)、五味子乙素(γ-schizandrin)、五味子丙素(wuweizisu C)、五味子醇(schizandrol)、五味子酚(schizandronol)、五味子酯甲、乙、丙、丁、戊(schizantherinA，B，C，D，E)、戈米辛A～P(gomisinA～P)及其衍生物等；從南五味子屬Kadsura植物中得到的南五味子素(kadsurin)、南五味子寧(kadsuranin)、南五味子酯(kadsutherin)、異南五味子酯(isokadsutherin)、南五木脂素A、B(kadsulignanA，B)、五味子酯L、M、N、O(schisantherin L，M，N，O)、異型南五味子素A～G(heteroclitinA～G)、內(nèi)南五味子素A～D(interiorin A～D)和南五木脂素A～G(kadsulignanA～G)以及上述化合物的衍生物等。它們化學(xué)結(jié)構(gòu)的共同特點是含有如下圖所示的聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)。
對上述化合物中的一些進(jìn)行了藥理活性方面的研究。結(jié)果表明這些木脂素類成分均有不同程度的降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、中樞神經(jīng)抑制或興奮、抗氧化、舒張平滑肌等方面的作用。目前未見有以其中一種或幾種單獨或混合制成藥物用來治療阿爾茨海默病的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人經(jīng)過探索性試驗發(fā)現(xiàn)，含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有顯著地治療阿爾茨海默病的作用。采用體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染有人類APP及突變型PS1基因的CHO細(xì)胞系，建立Aβ1-42過度表達(dá)的細(xì)胞模型，加入含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，結(jié)果表明不同劑量組對細(xì)胞分泌的Aβ1-42均有降低作用，以高劑量組最為明顯。采用老年性癡呆多重復(fù)制動物模型進(jìn)行整體動物試驗，結(jié)果表明含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)能有效減少Aβ的產(chǎn)量，抑制老年斑的形成，改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，從而達(dá)到治療與延緩AD疾病的目的。
本發(fā)明的目的在于提供一類含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的治療阿爾茨海默病的藥物是由含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中的一種或幾種為主要原料制成的。
所述的含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)是從中藥或天然藥物中提取分離得到的或以化學(xué)合成方式得到的。
所述藥物是任何一種藥學(xué)上所說的劑型，例如口服液、散劑、丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、粉針劑或注射劑等。
本發(fā)明還可以將含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中的一種或幾種與其他中藥或化學(xué)藥搭配組成復(fù)方后制成各種藥物制劑治療阿爾茨海默病。
現(xiàn)有技術(shù)中沒有涉及到將含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)制成含有穩(wěn)定量有效成分的藥物制劑的方法，也沒有涉及到將含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)應(yīng)用于阿爾茨海默病藥物的治療。本發(fā)明將含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)制成含有穩(wěn)定量有效成分的質(zhì)量穩(wěn)定的臨床常用制劑，便于臨床應(yīng)用治療疾病。


圖1為AD模型組免疫組化顯示老年斑(海馬)圖2為AD模型組免疫組化顯示老年斑(大腦皮層)圖3為異型南五味子素A各給藥組大腦皮層免疫組化顯示老年斑(低劑量組)圖4為異型南五味子素A各給藥組大腦皮層免疫組化顯示老年斑(中劑量組)圖5為異型南五味子素A各給藥組大腦皮層免疫組化顯示老年斑(高劑量組)具體實施方式
實施例1五味子素的結(jié)構(gòu)如下圖所示。聯(lián)苯環(huán)辛烯母核上7，8位為甲基，1，2，3，12，13，14位為甲氧基，9位為羥基時，即為五味子素的結(jié)構(gòu)。
實施例2五味子甲素的結(jié)構(gòu)如下圖所示。聯(lián)苯環(huán)辛烯母核上7，8位為甲基，1，2，3，12，13，14位為甲氧基時，即為五味子甲素的結(jié)構(gòu)。
實施例3五味子乙素的結(jié)構(gòu)如下圖所示。聯(lián)苯環(huán)辛烯母核上7，8位為甲基，1，12，13，14位為甲氧基，2-3位為亞甲二氧基時，即為五味子乙素的結(jié)構(gòu)。
實施例4戈米辛A的結(jié)構(gòu)如下圖所示。聯(lián)苯環(huán)辛烯母核上7，8位為甲基，1，2，3，14位為甲氧基，9位為羥基，12-13位為亞甲二氧基時，即為戈米辛A的結(jié)構(gòu)。
實施例5異型南五味子素A的結(jié)構(gòu)如下圖所示。聯(lián)苯環(huán)辛烯母核上7，8位為甲基，1，2，3，14位為甲氧基，9位為異戊酮基，12-13位為亞甲二氧基時，即為異型南五味子A的結(jié)構(gòu)。

實施例6南五味子素的結(jié)構(gòu)如下圖所示。聯(lián)苯環(huán)辛烯母核上7，8位為甲基，1，2，3，14位為甲氧基，9位為乙?；?，12-13位為亞甲二氧基時，即為南五味子素的結(jié)構(gòu)。
實施例7稱取五味子甲素10g，加入120g淀粉和50g糊精和2％羧甲基纖維素鈉水溶液40ml，在攪拌器中充分混勻，制成軟材。軟材用搖擺式顆粒機(jī)制成20目顆粒，流化床60℃沸騰干燥1h，干顆粒以高速整粒機(jī)整粒后加入硬脂酸鎂3g，羥丙基纖維素3g，于V型混合機(jī)中充分混合，用自動膠囊填充機(jī)制成膠囊500粒，鋁塑包裝，即得五味子甲素的膠囊劑。
實施例8分別稱取五味子素和南五味子素各10g，加入淀粉200g，置于快速制粒機(jī)中，加入2％羧甲基纖維素鈉水溶液25ml，一步制粒法制成12目顆粒。顆粒于烘箱中60℃干燥4小時，以搖擺式顆粒機(jī)12目篩網(wǎng)整粒，按5g/袋分裝于鋁箔袋中，密封即得復(fù)方五味子素的顆粒劑。
實施例9稱取五味子乙素20g，加入注射用水1000ml和0.2％的吐溫-80使溶解，加入0.1％活性炭，煮沸30min，放冷，濾除活性炭，灌裝至2ml安瓿中，熔封，熱壓蒸汽滅菌，即得五味子乙素的注射劑。
實施例10 五味子乙素對轉(zhuǎn)染人類APP和PS1基因的M146L細(xì)胞分泌的β淀粉樣蛋白的抑制作用取對數(shù)生長期的M146L細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2.4×106個/mL。24孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板每孔先加入培養(yǎng)液400μL，取60μL細(xì)胞懸液加入每孔中。培養(yǎng)8h后，M146L細(xì)胞已鋪滿大約至80％的密度。吸出培養(yǎng)液，用不含G418和puromycin的DMEM培養(yǎng)液沖洗1次，并更換不含G418和puromycin的DMEM培養(yǎng)液999.7mL，加入0.3％DMSO溶媒及低、中、高劑量五味子乙素，給藥1次，每組做6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔取100μL培養(yǎng)液，按ELISA試劑盒上的方法測定Aβ1-42含量。結(jié)果見表1。
表1五味子乙素對M146L細(xì)胞分泌的β淀粉樣蛋白的影響組別 樣本數(shù) OD值 Aβ1-42(pg·mL-1)0.3％DMSO溶媒對照組 6 0.436±0.02323.44±18.34低劑量五味子乙素組(1.67μg·mL-1)6 0.446±0.05332.23±43.23中劑量五味子乙素組(5μg·mL-1) 6 0.386±0.05280.40±44.87*高劑量五味了乙素組(15μg·mL-1) 6 0.223±0.02139.62±17.23**與溶媒對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01由表1可看出低劑量五味子乙素對Aβ1-42的生成沒有影響，中、高劑量的五味子乙素可以明顯降低Aβ1-42的產(chǎn)量，特別是高劑量組抑制率超過50％，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
實施例11 五味子甲素對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響選用昆明種小鼠，腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化鋁90d制備老年癡呆小鼠模型，3個治療組在造模的后40d分別灌胃低、中、高劑量五味子甲素。通過Morris水迷宮觀察五味子甲素對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響。結(jié)果見表2、3和圖1、2。
表2Morris水迷宮測試各組小鼠的逃避潛伏期(x±s，n＝20)單位S)組別 第一天第二天第三天第四天 第五天空白對照組31.3±10.322.0±9.1 19.7±8.9 10.4±4.7**9.0±3.4**AD模型組 37.9±12.128.7±13.026.4±12.221.4±12.2 20.6±9.6低劑量五味子甲素組32.6±13.423.7±11.821.4±10.415.0±7.0**12.2±4.7**中劑量五味子甲素組38.7±11.422.1±10.420.7±7.6 13.5±6.2**11.2±4.3**高劑量五味子甲素組32.8±11.122.8±11.917.8±8.1 11.2±5.1**10.1 ±3.5****與AD模型組比P＜0.01由表2可以看出，各組小鼠的逃避潛伏期隨著時間的延長而逐漸減少，到達(dá)第5天時(d5)，曲線已平緩，說明已接近潛伏期的極限，再增加測試時間已不能使成績提高很多。AD模型組小鼠在d4和d5逃避潛伏期明顯比空白對照組長，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.01)。各給藥組d4和d5天如模型組潛伏期均比模型組短(P＜0.01)。說明五味子甲素可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高其空間參考記記憶(reference memory)能力，以高劑量較強(qiáng)。
表3平臺所在象限停留時間及占總時間百分比(x±s，n＝20)撤除平臺后在平臺所在象限停留時占總時間百分比組別間(S) (以總時間60S記，％)空白對照組29.7±4.3**49.5±7.1**AD模型組 17.9±5.3 29.8±8.8低劑量五味子甲素組24.6±3.8**41.0±6.4**中劑量五味子甲素組27.3±3.0**45.5±5.0**高劑量五味子甲素組28.9±2.6**48.2±4.4**與AD模型組比**P＜0.01由表3可以看出，當(dāng)?shù)?天下午撤除平臺后，AD模型組平臺所在象限停留時間及占總時間百分比明顯比空白對照組短(P＜0.01)，各給藥組均比模型組長(P＜0.01)。說明五味子甲素可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
實施例12 五味子素對AD小鼠膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響選用昆明種小鼠，腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化鋁90d制備老年癡呆小鼠模型，3個治療組在造模的后40d分別灌胃低、中、高劑量五味子素。通過Ach、AchE試劑盒檢測五味子素對AD模型小鼠腦內(nèi)Ach、AchE活性的影響。結(jié)果見表4。
表4五味子素對AD模型Ach、AchE活性的影響(x±s，n＝10)Ach 蛋白含量 AchE組別(μg·mg-1) (mg·mL-1) (μmol·mg-1)空白對照組 383.8±26.7**2.99±0.30 1.17±0.25**AD模型組140.2±31.5 2.81±0.25 3.15±0.34低劑量五味子素組222.9±43.4*2.94±0.29 1.85±0.30**中劑量五味子素組379.2±52.2**3.01±0.33 1.52±0.50**高劑量五味子素組409.1±32.1**2.74±0.16 1.38±0.20**與AD模型組比**P＜0.01*P＜0.05
由表4可以看出，AD模型組Ach含量明顯下降，給予中、高劑量五味子素后都恢復(fù)至空白對照組水平，但低劑量組Ach未完全恢復(fù)正常，雖較AD模型組有顯著性差別(P＜0.05)，與空白對照仍有一定距離。AD模型組AchE活性明顯升高，給予中、高劑量五味子素后都恢復(fù)至空白對照組水平，與其無顯著性差別。給予低劑量五味子素組AchE活性有所降低，與AD模有顯著性差別(P＜0.01)，但仍高于空白對照組。提示五味子素在治療AD模型小鼠，能提高膽堿能遞質(zhì)含量，體現(xiàn)出量效關(guān)系，中、高劑量提高膽堿能遞質(zhì)的作用優(yōu)于低劑量。
實施例13 南五味子素對AD小鼠APP、PS1、BACE基因表達(dá)的影響選用昆明種小鼠，腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化鋁90d制備老年癡呆小鼠模型，3個治療組在造模的后40d分別灌胃低、中、高劑量南五味子素。通過RT-PCR觀察南五味子素對AD模型小鼠腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)、早老素1(PS1)、β位點APP內(nèi)切酶(BACE)基因表達(dá)的影響。結(jié)果見表5。
表5南五味子素對AD小鼠腦內(nèi)APP、PS1、BACE mRNA含量的影響(x±s，n＝6)組別 APP/β-actin(％) PS1/β-actin(％) BACE/β-actin(％)空白對照組41.17±6.50**28.35±3.49**102.75±14.45**AD模型組 94.15±8.09 62.97±5.56 168.95±13.18低劑量南五味子素組63.58±4.89**45.48±3.24**139.54±7.93**中劑量南五味子素組48.25±2.60**30.88±4.82**97.45±11.09**高劑量南五味子素組36.40±6.53**27.03±4.16**68.88±5.72**Δ與AD模型組相比，**P＜0.01 與空白對照組相比，ΔP＜0.05從表5可看出，AD模型組APP、PS1、BACE mRNA的含量與內(nèi)參照基因β-actin mRNA的含量百分比值較空白對照組明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P＜0.01)，各給藥組表達(dá)量比值較AD模型組明顯降低(P＜0.01)。其中低劑量組APP、PS1、BACE mRNA相對含量雖較AD模型組明顯降低，但仍不能恢復(fù)正常水平，與空白對照組相比有顯著性差異。高劑量組BACE mRNA的表達(dá)量較空白對照組低(P＜0.05)，提示高劑量組抑制其基因表達(dá)能力最強(qiáng)，特別是對于BACE基因表達(dá)的抑制能力更為突出。
實施例14 異型南五味子素A對AD小鼠海馬及皮層老年斑的影響選用昆明種小鼠，腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化鋁90d制備老年癡呆小鼠模型，3個治療組在造模的后40d分別灌胃低、中、高劑量異型南五味子素A。通過Aβ1-40免疫組化染色觀察異型南五味子素A對AD模型小鼠海馬及皮層老年斑的影響。結(jié)果見附圖1～5。
Aβ1-40免疫組化染色顯示，空白對照組反應(yīng)陰性，說明Aβ1-40蛋白在正常狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或表達(dá)量極微，而模型組及各給藥組均為陽性。模型組顯示，在海馬及皮質(zhì)均可見較多可見到Aβ的沉積形成的老年斑，在其周圍可看到一腫脹變形的神經(jīng)元，另見到少量Aβ樣免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，陽性產(chǎn)物主要位于神經(jīng)元核周及突起。低劑量組與模型相比，老年斑的數(shù)量差別不明顯，但中、高劑量組明顯減少。
權(quán)利要求
1.一種含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于該物質(zhì)含有下述結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述物質(zhì)為五味子素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇、五味子酚、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酯丙、五味子酯丁、五味子酯戊、戈米辛A、戈米辛B、戈米辛C、戈米辛D、戈米辛E、戈米辛F、戈米辛G、戈米辛H、戈米辛I、戈米辛J、戈米辛K、戈米辛L、戈米辛M、戈米辛N、戈米辛O、戈米辛P、南五味子素、南五味子寧、南五味子酯、異南五味子酯、南五木脂素A、南五木脂素B、五味子酯L、五味子酯M、五味子酯N、五味子酯O、異型南五味子素A、異型南五味子素B、異型南五味子素C、異型南五味子素D、異型南五味子素E、異型南五味子素F、異型南五味子素G、內(nèi)南五味子素A、內(nèi)南五味子素B、內(nèi)南五味子素C、內(nèi)南五味子素D、南五木脂素A、南五木脂素B、南五木脂素C、南五木脂素D、南五木脂素E、南五木脂素F、南五木脂素G中的一種或一種以上的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物的劑型為口服液、散劑、丸劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、粉針劑或注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為抑制導(dǎo)致阿爾茨海默病的淀粉樣蛋白的過度表達(dá)或改善阿爾茨海默病癥狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于該物質(zhì)含有右式結(jié)構(gòu)，本發(fā)明所述含有聯(lián)苯環(huán)辛烯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)能有效減少Aβ的產(chǎn)量，抑制老年斑的形成，改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，從而達(dá)到治療與延緩AD疾病的目的。
文檔編號A61K9/10GK1593391SQ20041002796
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者羅煥敏, 肖飛, 李曉光 申請人:暨南大學(xué)