本發(fā)明屬于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的診斷和治療靶點(diǎn)，以及相應(yīng)的診斷、治療方法和相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)：

AD是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其以進(jìn)行性進(jìn)展的記憶、視空間及執(zhí)行功能障礙為典型臨床表現(xiàn)^[1]。近年來，隨著老齡化程度的加快，我國AD患者數(shù)量大幅增加，由此給患者、家庭及社會(huì)帶來了十分沉重的負(fù)擔(dān)^[2]。截至目前為止，該病病因尚不明確，且無有效的治療手段。

根據(jù)已有研究，AD的主要病理特征之一是腦內(nèi)累積大量β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)，進(jìn)而誘發(fā)一系列神經(jīng)毒性反應(yīng)，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙^[3]。因此，Aβ是現(xiàn)階段相當(dāng)一部分AD治療的主要研究靶點(diǎn)。大量證據(jù)表明，腦組織對(duì)Aβ的清除能力下降，是導(dǎo)致病程早期Aβ累積的主要原因^[4]。新進(jìn)證據(jù)提示，在起病早期清除AD模型小鼠腦內(nèi)的Aβ后，小鼠的認(rèn)知功能有所恢復(fù)，提示針對(duì)Aβ療法的早期應(yīng)用可延緩AD病程的進(jìn)展^[5]。

然而，AD早期診斷手段的缺乏是應(yīng)用此類療法的最大阻礙。目前，在AD患者中開展腦組織活檢較為困難，而通過病史及量表評(píng)估法診斷AD，其敏感性及特異性又十分有限。因此，探明一種較易操作的，特異性及敏感性較高的AD診斷方法亦成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的在于提供一種早期診斷及治療AD的方法。

具體地，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)TREM1蛋白是AD發(fā)病機(jī)制中重要一環(huán)，其在單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)水平下調(diào)直接影響該系統(tǒng)對(duì)Aβ的清除能力，從而導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)累積。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種早期診斷AD的方法，其關(guān)鍵點(diǎn)為檢測TREM1在外周單核中的表達(dá)水平。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過qRT-PCR檢測TREM1基因轉(zhuǎn)錄水平以評(píng)估TREM1表達(dá)水平。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過ELISA、免疫印跡或免疫組化方法直接檢測TREM1蛋白表達(dá)水平。

此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療AD的方法，其關(guān)鍵點(diǎn)為上調(diào)TREM1水平或激活TREM1通路以恢復(fù)腦內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(即小膠質(zhì)細(xì)胞)對(duì)Aβ的吞噬能力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過向腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)入外源性TREM1基因以提高其表達(dá)水平。其載體可以是質(zhì)粒、慢病毒或其他可行的核酸形式。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，向機(jī)體內(nèi)引入能夠提高TREM1基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物質(zhì)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，向腦內(nèi)引入特定物質(zhì)以靶向激活TREM1通路，所述特定物質(zhì)可以 是激動(dòng)性抗體及其活性片段、激動(dòng)性配體或通路下游分子的激動(dòng)劑。

附圖說明

圖1.Trem1可以促進(jìn)WT幼鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的吞噬作用。為弄清生理?xiàng)l件下TREM1在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ中的作用，我們利用慢病毒機(jī)制操縱從WT幼鼠中分離出的原代小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)72h后，分別利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)證實(shí)了Trem1 mRNA的表達(dá)水平(a)和Trem1蛋白水平(b)的改變。之后，應(yīng)用Griciuc等人提供的離體試驗(yàn)方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的吞噬和降解作用。(c)將小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞置于5μM Aβ_1-42培育6h。利用ELISA技術(shù)對(duì)內(nèi)化的Aβ_1-42數(shù)量進(jìn)行檢測(t＝0h)。(d)繼而，將培養(yǎng)基中剩余的Aβ_1-42清洗出去，將原代小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)6h以使得Aβ_1-42充分降解。利用ELISA技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Aβ_1-42水平進(jìn)行測定(t＝6h)。(e)將Aβ_1-42剩余量(t＝6h)與總的Aβ_1-42內(nèi)化量(t＝0h)的比值視為Aβ_1-42降解指數(shù)。降解指數(shù)越高，代表降解Aβ_1-42的能力越低。利用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4，一式三份)，*P＜0.05。

圖2.Trem1可以促進(jìn)成年APP/PSEN1小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的吞噬作用。為了進(jìn)一步在AD相關(guān)的背景下證實(shí)TREM1對(duì)Aβ吞噬作用的調(diào)節(jié)作用，我們通過慢病毒機(jī)制操縱7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)72h后，分別利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)證實(shí)了Trem1 mRNA的表達(dá)水平(a)和Trem1蛋白水平(b)的改變。之后，應(yīng)用Griciuc等人提供的離體試驗(yàn)方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的吞噬和降解作用。(c)將小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞置于5μMAβ_1-42培育6h。利用ELISA技術(shù)對(duì)內(nèi)化的Aβ_1-42數(shù)量進(jìn)行檢測(t＝0h)。(d)繼而，將培養(yǎng)基中剩余的Aβ_1-42清洗出去，將原代小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)6h以使得Aβ_1-42充分降解。利用ELISA技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Aβ_1-42水平進(jìn)行測定(t＝6h)。(e)將Aβ_1-42剩余量(t＝6h)與總的Aβ_1-42內(nèi)化量(t＝0h)的比值視為Aβ_1-42降解指數(shù)。降解指數(shù)越高，代表降解Aβ_1-42的能力越低。利用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4，一式三份)，*P＜0.05。

圖3.敲除Trem1可促進(jìn)APP/PSEN1小鼠中Aβ神經(jīng)病理發(fā)生。將含有Trem1shRNA的慢病毒或其對(duì)照組慢病毒注入7月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠的雙側(cè)大腦皮層和海馬中。(a)注射2個(gè)月后，通過qRT-PCR證實(shí)了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1mRNA的表達(dá)發(fā)生的改變。(b)注射2個(gè)月后，通過ELISA證實(shí)了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1蛋白的表達(dá)發(fā)生的改變。(c)代表接受載體，對(duì)照組病毒或含有Trem1shRNA的慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠大腦皮層的淀粉樣斑塊照片。根據(jù)免疫化學(xué)法，使用抗Aβ抗體檢測淀粉樣斑塊。在×200顯微鏡下觀察這些斑塊。比例尺＝200μm。(d)在注射2個(gè)月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠大腦皮層中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。(e)在注射2個(gè)月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠海馬組織中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。通過單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。每組n＝12，*P＜0.05。

圖4.過表達(dá)Trem1可以減弱APP/PSEN1小鼠中Aβ病理水平。將含有Trem1 cDNA的慢病毒或其對(duì)照組 慢病毒注入7月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠的雙側(cè)大腦皮層和海馬中。(a)注射2個(gè)月后，通過qRT-PCR證實(shí)了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1mRNA的表達(dá)發(fā)生的改變。(b)注射2個(gè)月后，通過ELISA證實(shí)了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1蛋白的表達(dá)發(fā)生的改變。(c)代表接受載體，對(duì)照組病毒或含有Trem1 shRNA的慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠大腦皮層的淀粉樣斑塊照片。根據(jù)免疫化學(xué)法，使用抗Aβ抗體檢測淀粉樣斑塊。在×200顯微鏡下觀察這些斑塊。比例尺＝200μm。(d)在注射2個(gè)月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠大腦皮層中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。(e)在注射2個(gè)月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠海馬組織中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。每組n＝12，*P＜0.05。

圖5.表達(dá)Trem1可以挽救APP/PSEN1小鼠的AD相關(guān)的空間認(rèn)知損害。將含有Trem1 cDNA的慢病毒或其對(duì)照組慢病毒注入7月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠的雙側(cè)大腦皮層和海馬中。慢病毒注射2個(gè)月后，利用Y-迷宮試驗(yàn)檢測Trem1過表達(dá)對(duì)小鼠短期空間記憶的影響。在暴露期，將小鼠放置在“起始”臂末端，并允許其在5分鐘內(nèi)自由探索Y-迷宮的第一臂部分(定義為“起始”臂)和第二臂部分(定義為“其它”臂)。該階段，我們將通往迷宮第三臂部分(定義為“新”臂)的入口臨時(shí)阻斷。我們計(jì)算了相對(duì)于“起始”臂，小鼠在“其它”臂區(qū)域內(nèi)所花費(fèi)的時(shí)間(a)。采用單樣本t檢驗(yàn)(與50％機(jī)會(huì)相比，用紅色虛線表示)或單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)(組間差異)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。之后，小鼠被從迷宮中轉(zhuǎn)移到其居住的籠子里待上2min。在試驗(yàn)階段，將小鼠再次放入迷宮的“起始”臂內(nèi)。同時(shí)，“新”臂入口被打開，并允許小鼠在迷宮中自由探索1min。(b)對(duì)于試驗(yàn)期，我們計(jì)算了一個(gè)鑒別指數(shù)＝[新臂時(shí)間/(新臂時(shí)間+其它臂時(shí)間)]×100。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，*P＜0.05。在處死小鼠前的最后5天，通過Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)小鼠的空間認(rèn)知功能進(jìn)行測定。(c)代表5天測試中各組的游泳速度。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。(d)代表各組在水迷宮試驗(yàn)中的路徑長度。采用二因素重復(fù)測量方差分析及Bonferroni多重比較檢驗(yàn)對(duì)路徑長度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。#相對(duì)于對(duì)照組WT小鼠，P＜0.05；*相對(duì)于接受對(duì)照組病毒注射的APP/PSEN1小鼠，P＜0.05。(e)探索試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)形式為：相對(duì)于在其它三個(gè)象限(A.O.)內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間，小鼠在在靶象限(Q1)內(nèi)所花費(fèi)的時(shí)間比例。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。*相對(duì)于在其它三個(gè)象限(A.O.)內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間，P＜0.05。柱形圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。每組n＝24。

圖6.激動(dòng)性Trem1抗體激活Trem1信號(hào)途徑可以減弱APP/PSEN1小鼠腦內(nèi)Aβ病理及挽救其空間認(rèn)知損害。為了進(jìn)一步證實(shí)TREM1在AD進(jìn)展期的保護(hù)性作用，我們使用微型滲透泵持續(xù)6周向7月齡APP/PSEN1小鼠大腦第三腦室背側(cè)灌入一種激動(dòng)性Trem1抗體以激活Trem1信號(hào)途徑。之后，我們測定了Trem1信號(hào)途徑的激活對(duì)Aβ病理的影響。(a)利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠大腦皮層中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05.每組n＝12。(b)利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠海馬組織中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05.每組n＝12。繼而，利用Y-迷宮試驗(yàn)評(píng)估小鼠的短期空間記憶功能。(c)對(duì)于試驗(yàn)期，我們計(jì)算了一個(gè)鑒別指數(shù)＝[新臂時(shí)間/(新臂時(shí)間+其它臂時(shí)間)]×100。采用單樣本t檢驗(yàn)(與50％機(jī)會(huì)相比，用紅色虛線表示)或單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)(組間差異)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每組n＝24。(d)對(duì)于試驗(yàn)期，我們計(jì)算了一個(gè)鑒別指數(shù)＝[新臂時(shí)間/(新臂時(shí)間+其它臂時(shí)間)]×100。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，*P＜0.05，每組n＝24。才處死小鼠前的最后5天，通過Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)小鼠的空間認(rèn)知功能進(jìn)行測定。(e)代表5天測試中各組的游泳速度。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每組n＝24。(f)代表各組在水迷宮試驗(yàn)中的路徑長度。采用二因素重復(fù)測量方差分析及Bonferroni多重比較檢驗(yàn)對(duì)路徑長度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。#相對(duì)于對(duì)照組WT小鼠，P＜0.05；*相對(duì)于接受對(duì)照組病毒注射的APP/PSEN1小鼠，P＜0.05，每組n＝24。(g)探索試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)形式為：相對(duì)于在其它三個(gè)象限(A.O.)內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間，小鼠在在靶象限(Q1)內(nèi)所花費(fèi)的時(shí)間比例。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。*相對(duì)于在其它三個(gè)象限(A.O.)內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間，P＜0.05。柱形圖代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。每組n＝24。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中所指的TREM1，英文全稱為triggering receptor expressed on myeloid cells-1，即1型髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體，是表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞表面的一種受體，其與受體酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián)，進(jìn)而調(diào)控免疫反應(yīng)。

本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的TREM1對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ的關(guān)鍵性促進(jìn)作用。下調(diào)的TREM1表達(dá)直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力下降，即使在某些Aβ的生成速度并未加快的生理情形下，仍然不能清除Aβ使得后者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量累積，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，進(jìn)展到一定程度即發(fā)生阿爾茨海默病(AD)。雖然阿爾茨海默病的病因非常復(fù)雜，難以用單一原因或誘因概而論之，但是如果檢出單核細(xì)胞中TREM1表達(dá)量顯著下調(diào)，這一情形可能與阿爾茨海默病有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。

同時(shí)，本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于Aβ累積的情形，上調(diào)TREM1的表達(dá)量或者激活其通路，能夠顯著增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ的能力，加快清除累積的Aβ，消除其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，并且可能改善已經(jīng)出現(xiàn)的癥狀。因此，本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)了TREM1是一個(gè)阿爾茨海默病的診斷和治療的靶點(diǎn)。

本發(fā)明所指的檢測TREM1的表達(dá)量，指的是根據(jù)本領(lǐng)域常用的檢測技術(shù)，包括但不限于qRT-PCR，ELISA，免疫印跡，免疫組織化學(xué)等等方法，檢測TREM1的mRNA和/或蛋白的表達(dá)水平，其特異性的引物/探針/抗體/結(jié)合物等可以是自行設(shè)計(jì)的，也可以是商品化的。

本發(fā)明所指的上調(diào)TREM1的表達(dá)量，指的是通過向單核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)入TREM1基因本身，或轉(zhuǎn)入其上游強(qiáng)啟動(dòng)子，或相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，或消除抑制其表達(dá)的因素，或其他能夠達(dá)到類似效果的、已知的其他手段或方案，實(shí)際達(dá)到TREM1分子表達(dá)數(shù)量增加的效果。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，通過向活體腦內(nèi)注射TREM1-載體顆粒實(shí)現(xiàn)，所述的載體優(yōu)選地是病毒載體，更優(yōu)選地是慢病毒載體。

本發(fā)明所指的活化TREM1通路，指的是通過激動(dòng)性配體、激動(dòng)性抗體或模擬分子活化TREM1，并進(jìn)而激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明所指的活化TREM1通路，也包括本領(lǐng)域所公知的，直接活化TREM1的下游分子，例如DAP12等。

實(shí)施例1 本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)材料與方法

人類研究對(duì)象

本研究遵循赫爾辛基宣言并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。研究對(duì)象來源于南京市第一醫(yī)院在職及退休員工中的健康青年人和老年人，所有參與對(duì)象均為漢族中國人，且彼此無任何血緣關(guān)系。每一名參與者均簽署了書面同意書。

人體循環(huán)血中單核細(xì)胞的純化和培養(yǎng)

依據(jù)Zondler及其同事所描述的方法^[6]，從人體靜脈全血中分離得到單核細(xì)胞。大體過程為：使用 (Sigma-Aldrich公司)儀器，采用密度梯度離心及CD-14陽性磁珠分離技術(shù)(Miltenyi Biotec公司)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。在添加10％胎牛血清(FBS)和1％盤尼西林/鏈霉素(P/S)的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞的再懸浮。通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法控制分離得到單核細(xì)胞的純度。繼而，將單核細(xì)胞以1×10⁶細(xì)胞/mL的密度轉(zhuǎn)移至裸96孔板中，放置24小時(shí)以備功能分析。

動(dòng)物

申請(qǐng)人從南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲取了雄性APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠及與其年齡相匹配的野生型(WT)小鼠。整個(gè)研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷和管理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究所進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)均遵守美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷和使用指導(dǎo)意見。

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離

依據(jù)申請(qǐng)人以前描述的方法^[7]，從產(chǎn)后1天的野生型幼鼠腦組織中分離出小膠質(zhì)細(xì)胞。利用細(xì)胞免疫化學(xué)法對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度進(jìn)行確認(rèn)。

申請(qǐng)人對(duì)Bliederhaeuser及其同事描述的方法^[8]進(jìn)行了微調(diào)后，利用其從APP/PSEN1成年小鼠和野生型小鼠腦組織中分離出小膠質(zhì)細(xì)胞。大體過程為：小鼠被深度麻醉后，經(jīng)賁門灌入冰的Ringer溶液。用解剖刀將小鼠大腦切碎，在37℃溫度和5％CO₂濃度的條件下，將腦組織置于含有木瓜蛋白酶的酶溶液中孵育60min。隨后添加含20％FBS的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)對(duì)酶溶液進(jìn)行酸堿中和，并在200g(轉(zhuǎn)速)下離心4min。往離心出的顆粒狀物中再次加入2ml含0.5mg/mlDNA酶的HBSS溶液實(shí)現(xiàn)再懸浮，并在室溫下繼續(xù)孵育5min。利用經(jīng)火打磨過的巴氏吸管對(duì)腦組織進(jìn)行輕度破壞，然后經(jīng)70μm細(xì)胞篩過濾(Thermo Fisher Scientific公司)，并在200g(轉(zhuǎn)速)下離心4min。然后將所得到的顆粒狀物在20ml含20％(Sigma-Aldrich公司)的HBBS等滲溶液中實(shí)現(xiàn)再懸浮。小心地將純的HBSS(20ml)置于percoll層的上方， 然后在200g(轉(zhuǎn)速)下離心20min。丟棄含有髓磷脂和細(xì)胞碎片的交界層，將含有混合膠質(zhì)細(xì)胞群的顆粒樣物質(zhì)用HBSS洗脫下來，并在含有10％FBS，1％P/S，1×丙酮酸鹽，1×GlutaMAXTM(Thermo Fisher Scientific公司)以及5ng/mL不含載體的小鼠重組粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D systems公司)的杜氏改良培養(yǎng)基中再懸浮。在37℃溫度，5％CO₂濃度條件下，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至15cm²的多聚-1-賴氨酸涂層板上培養(yǎng)。每隔3天更換一次基質(zhì)直至整個(gè)底面被一層細(xì)胞覆蓋。在膠質(zhì)細(xì)胞層形成后，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)形成一層(與底部)不粘連的懸浮細(xì)胞層。申請(qǐng)人可以較容易地對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行收集、轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步培養(yǎng)。收集完懸浮細(xì)胞層后，將小膠質(zhì)細(xì)胞置于無GM-CSF的條件下孵育3天，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)操作或功能分析。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)所收集小膠質(zhì)細(xì)胞的純度進(jìn)行確認(rèn)。

Aβ_1-42吞噬和降解試驗(yàn)

采用Griciuc等人提供的離體試驗(yàn)方法對(duì)單核細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的吞噬和降解能力進(jìn)行測定^[9]。將人單核細(xì)胞或小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與5μM的Aβ_1-42共同孵育6h，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定內(nèi)化Aβ_1-42的數(shù)量，以評(píng)估細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的吞噬作用。先將人單核細(xì)胞或小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞與5μM的Aβ_1-42共同孵育6h，繼而用新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞洗脫下來并置于無Aβ_1-42的血清中繼續(xù)培養(yǎng)6h，以測定細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的降解能力。之后，利用ELISA法測定細(xì)胞內(nèi)Aβ_1-42的剩余水平。用Aβ_1-42的剩余量與內(nèi)化總量的比值表示細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的降解能力。比值越高意味著細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的降解能力越低。

慢病毒顆粒的準(zhǔn)備

為了使小膠質(zhì)細(xì)胞選擇性地過表達(dá)Trem1蛋白，申請(qǐng)人利用現(xiàn)有方法^[10]，構(gòu)建出在髓系分化CD11b啟動(dòng)子調(diào)控下可以編碼小鼠WT Trem1 cDNA(NM_021406.5)的慢病毒載體及對(duì)照組病毒。為了敲除Trem1，申請(qǐng)人利用現(xiàn)有方法^[11]，在慢病毒載體中合成并利用U6啟動(dòng)子克隆了以下短發(fā)夾序列(Trem1：5’-AATTCAAAAAAGACCAAGGGTTCT-3’和對(duì)照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)。將純化后的慢病毒載體與套裝載體共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞內(nèi)。48小時(shí)后收集上清液，然后利用超速離心法將上清液中慢病毒顆粒濃度濃縮至1∶100，用磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行懸浮回收。利用商業(yè)滴定ELISA試劑盒(Takara Bio公司)對(duì)病毒滴度進(jìn)行測定，未發(fā)現(xiàn)含有Trem1 cDNA或Trem1 shRNA的慢病毒顆粒及其對(duì)照組之間在滴度上存在顯著差異。

小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)

關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，將純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞以4×10⁵細(xì)胞/mL密度種植于24孔板上。向培養(yǎng)基中添加慢病毒顆粒和8μg/mL聚凝胺，并離心90min。轉(zhuǎn)染后立即除去上清液并替換成含10％FBS及50％膠質(zhì)培養(yǎng)上清液(轉(zhuǎn)染前從培養(yǎng)基中獲得)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。72h后，利用時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行測定。

慢病毒顆粒腦內(nèi)注射

注射過程遵循“盲法”，即負(fù)責(zé)立體定向顱內(nèi)注射慢病毒顆粒的技術(shù)人員對(duì)實(shí)驗(yàn)組情況不知情。大體過 程為：將七月齡APP/PSEN1及與其年齡相匹配的WT小鼠麻醉后固定于立體定向操作架上(David Kopf Instruments公司)。使用與漢密爾頓注射器相連接的30-gauge微量移液管(Sigma-Aldrich公司)將慢病毒制劑(2μl)注入小鼠每側(cè)大腦半球的大腦皮層(兩處注射點(diǎn))和海馬(一處注射點(diǎn))。注射位置的立體定向坐標(biāo)從前囟開始依次為：(1)大腦皮層：前后：-0.3，中間外側(cè)：2，背腹側(cè)：-1.5mm和前后：-2，中間外側(cè)：1.2，背腹側(cè)：-1.2mm；及(2)海馬：前后：-2；中間外側(cè)：1.2；背腹側(cè)：-2mm。完成注射2個(gè)月后對(duì)敲除效率和Trem1過表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

腦室內(nèi)抗體輸送

依據(jù)已有方法完成向腦室內(nèi)輸送抗體的操作^[12]。將激動(dòng)性Trem1抗體(100μg，catalog#：MAB1187-100，R&D Systems公司)或者其IgG_2A同型對(duì)照抗體(100μg，catalog#：MAB006，R&D Systems公司)加入到200μL人造腦脊液中再懸浮，并注入微型滲透泵(model 2006，ALZET公司)中。關(guān)于泵移植的操作：將七月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠麻醉后固定于立體定位操作架上(David Kopf Instruments公司)。將借乙烯塑料管與滲透泵相連的腦灌注套管(ALZET公司)移植進(jìn)第三腦室背側(cè)(前囟后方0.5mm，顱骨表面下方3mm)。同時(shí)將滲透泵置于小鼠兩側(cè)肩胛骨間的皮下位置。在以后6周時(shí)間內(nèi)，以0.15μL/h的泵度，持續(xù)將抗體泵入腦內(nèi)。術(shù)后，將手術(shù)切口仔細(xì)縫合關(guān)閉。在整個(gè)手術(shù)過程中，未觀察到小鼠出現(xiàn)任何神經(jīng)毒性表現(xiàn)。

Y-迷宮測試

在動(dòng)物被處死前的最后一天，按照之前描述的方法^[10]，采用“盲法”進(jìn)行了Y-迷宮試驗(yàn)以評(píng)估動(dòng)物的短期空間記憶功能。在暴露期，將小鼠放置在“起始”臂末端，并允許其在5分鐘內(nèi)自由探索Y-迷宮的第一臂部分(定義為“起始”臂)和第二臂部分(定義為“其它”臂)。該階段，將通往迷宮第三臂部分(定義為“新”臂)的入口臨時(shí)阻斷。之后，小鼠被從迷宮中轉(zhuǎn)移到其居住的籠子里待上2min。在試驗(yàn)階段，將小鼠再次放入迷宮的“起始”臂內(nèi)。同時(shí)，“新”臂入口被打開，并允許小鼠在迷宮中自由探索1rnin。利用追蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology公司)記錄下每一只小鼠于兩個(gè)階段內(nèi)在迷宮每一臂區(qū)內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間。對(duì)于暴露期，我們計(jì)算了小鼠待在“其它”臂的總時(shí)間與待在“起始”臂的總時(shí)間的比值。對(duì)于試驗(yàn)期，我們計(jì)算了一個(gè)鑒別指數(shù)＝[新臂時(shí)間/(新臂時(shí)間+其它臂時(shí)間)]×100。

Morris水迷宮測試

在處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前的最后6天內(nèi)，依據(jù)前述方法^[7]，采用“盲法”進(jìn)行了水迷宮試驗(yàn)。在連續(xù)5天內(nèi)給予小鼠4次/天的試驗(yàn)訓(xùn)練。并記錄下小鼠從起始處至找到水下隱藏平臺(tái)之間路線的總長度，同時(shí)計(jì)算出四次試驗(yàn)所用時(shí)間的平均值。在最后一天，對(duì)小鼠進(jìn)行一個(gè)移除平臺(tái)后的探索試驗(yàn)，并利用追蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology公司)記錄下其游泳路徑。

qRT-PCR(實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng))

利用Trizol試劑從人單核細(xì)胞或小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中提取得到總RNA。利用PrimeScript^TM RT Master Mix (Takara Bio公司)在標(biāo)準(zhǔn)條件下使等量的總RNA發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。接著根據(jù)廠商說明書，利用SYBR Green Premix Ex Taq(Takara Bio公司)和特定小鼠引物(GAPDH正向鏈：GGTGGTCTCCTCTGACTTCA，GAPDH反向鏈：TCCTTGGAGGCCATGTGGGC；Gapdh正向鏈：CAACAGCAACTCCCACTCTTC，Gapdh反向鏈：GGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT；TREM1正向鏈：AGTGGGGAGGATCATACTAGAAGAC，TREM1反向鏈：AGGCTGGTAGATCACACACTGATAC；Trem1正向鏈：TGCTGTGCGTGTTCTTTGTCT，Trem1反向鏈：CTTCTGGCTGTTGGCATACTT；TREM2正向鏈：CTATGACTCCATGAAGCA，TREM2反向鏈：GATTCCGCAGCGTAATGG；Trem2正向鏈：GACCTCTCCACCAGTTTCTCC，Trem2反向鏈：TACATGACACCCTCAAGGACTG；TYROBP正向鏈：AGCGATTGCAGTTGCTC，TYROBP反向鏈：GTGATACGCTGTTTCCGGGT；Tyrobp正向鏈：CGTACAGGCCCAGAGTGAC，Tyrobp反向鏈：CACCAAGTCACCCAGAACAA)進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)。

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)

為測定全長TREM家族蛋白在細(xì)胞膜上的水平，收集人類單核細(xì)胞和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，并依照Geumann及其同事所描述的辦法^[13]提取了細(xì)胞膜蛋白。依據(jù)廠商提供的手冊，我們利用特殊的ELISA試劑盒(對(duì)于人類TREM1：catalog#：EHTREM1，Thermo Fisher Scientific公司；對(duì)于小鼠Trem1：catalog#：EMTREM1，Thermo Fisher Scientific公司；對(duì)于人類TREM2：catalog#：MBS2022102，MyBioSource，Inc.；對(duì)于小鼠Trem2：catalog#：MBS2023874，MyBioSource，Inc.)對(duì)全長TREMs蛋白進(jìn)行檢測。

為了評(píng)估細(xì)胞內(nèi)Aβ_1-42的水平，我們參照之前方法^[7]收集并裂解了人類單核細(xì)胞和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞。為檢測腦內(nèi)可溶性和不可溶性Aβ_1-42水平，我們在4℃條件下，利用10個(gè)體積的含5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)，磷酸酶抑制劑，不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物及2mM 1，10-鄰二氮雜菲對(duì)大腦皮層和海馬組織獨(dú)立地進(jìn)行了均質(zhì)化處理。得到的勻漿在4℃，100,000g(轉(zhuǎn)速)條件下離心1h。我們對(duì)上清液進(jìn)行了收集以測定可溶性Aβ_1-42的含量。得到的顆粒狀物質(zhì)加入70％甲酸(FA，所用甲酸的體積等于用來離心的TBS勻漿的體積)作均質(zhì)化處理。樣本在4℃，100,000g(轉(zhuǎn)速)條件下離心1h并收集上清液。用1Mtris堿中和含有FA的上清液，所得樣本用來測定不可溶性Aβ1-42的含量。根據(jù)廠商提供手冊，利用Aβ1-42 ELISA試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)測定Aβ1-42的水平。

免疫組化分析

我們依據(jù)之前方法準(zhǔn)備了腦組織切片以供免疫組化分析使用^[7]。將腦組織與小鼠抗Aβ的單克隆抗體(Covance公司)一起孵育，然后加入生物素化的羊抗小鼠IgG抗體(Zhongshan Golden Bridge公司)。利用二氨基聯(lián)苯胺對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測。之后，將組織脫水、制片并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。依據(jù)我們之前描述的方法^[7]，采用“盲法”對(duì)總的淀粉樣蛋白水平進(jìn)行測定。

統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用單樣本t檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或 單因素方差分析(ANOVA)以及Tukey′s post hoc檢驗(yàn)對(duì)平均數(shù)之間差異進(jìn)行比較。對(duì)于Morris水迷宮這一隱藏平臺(tái)試驗(yàn)，用二因素重復(fù)測量方差分析及Bonferroni多重比較檢驗(yàn)對(duì)路徑長度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究中，數(shù)據(jù)表達(dá)形式為：平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。將P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)施例2 Trem1可以調(diào)節(jié)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的吞噬作用

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)唯一的單核吞噬細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬活動(dòng)參與Aβ的清除。為弄清TREM1在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ中的作用，我們利用慢病毒機(jī)制操縱從WT幼鼠中分離出的小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)72h后，分別利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)對(duì)Trem1 mRNA的表達(dá)水平和Trem1蛋白水平的改變進(jìn)行測定。之后，應(yīng)用Griciuc等人提供的離體試驗(yàn)方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的吞噬和降解作用。敲除Trem1導(dǎo)致WT幼鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化Aβ_1-42水平下降52％(P＜0.05)，而Trem1過表達(dá)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化Aβ_1-42水平增加將近1.7倍(P＜0.05)。值得注意的是：操縱Trem1表達(dá)水平并未顯著影響WT幼鼠源性小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的降解指數(shù)。

據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)：APP/PSEN1小鼠7月齡時(shí)會(huì)出現(xiàn)顯著的AD相關(guān)表型^[7]。因此，為了進(jìn)一步在AD相關(guān)的背景下證實(shí)以上發(fā)現(xiàn)，我們通過慢病毒機(jī)制操縱7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)。在完成轉(zhuǎn)導(dǎo)72h后，分別應(yīng)用qRT-PCR和ELISA法對(duì)Trem1mRNA表達(dá)和Trem1蛋白水平改變進(jìn)行測定。敲除Trem1使7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化Aβ_1-42的水平顯著下降46％(P＜0.05)。相反，Trem1過表達(dá)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化Aβ_1-42水平增加將近1.5倍(P＜0.05)。然而，操縱Trem1表達(dá)水平的改變并未對(duì)7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ_1-42的降解速率造成顯著影響。

實(shí)施例3 在APP/PSEN1小鼠的疾病進(jìn)展期，Trem1在小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。

由于TREM1在AD條件下可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的Aβ吞噬作用，我們合理地作出如下假設(shè)：TREM1可能在AD進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先探索了APP/PSEN1小鼠在1，4，7和10月齡時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞Trem1及其適配器蛋白Tyrobp水平的動(dòng)態(tài)改變。在APP/PSEN1小鼠疾病進(jìn)展期間，Trem1或Tyrobp的表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化(Trem1 mRNA水平：P＝0.31；Trem1蛋白水平：P＝0.4；Tyrobp mRNA水平：P＝0.77)。同時(shí)，我們也未發(fā)現(xiàn)APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠在小膠質(zhì)細(xì)胞Trem1或Tyrobp表達(dá)水平上存在任何顯著差異。

實(shí)施例4 敲除Trem1可促進(jìn)Aβ神經(jīng)病理發(fā)生

為進(jìn)一步探索TREM1蛋白在AD進(jìn)展中的作用，我們利用慢病毒機(jī)制敲除了7月齡APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)，并觀察其對(duì)Aβ病理的影響。慢病毒注射2個(gè)月后，我們通過RT-PCR和ELISA法證實(shí)了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)改變。APP/PSEN1小鼠大腦中總的 淀粉樣蛋白水平在敲除Trem1后上升了1.66倍。此外，敲除Trem1使APP/PSEN1小鼠大腦皮層中不可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著增加2.48倍(n＝12，P＜0.05)和1.57倍(n＝12，P＜0.05)。而且，敲除Trem1使APP/PSEN1小鼠大腦海馬中不可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著增加1.89倍(n＝12，P＜0.05)和1.58倍(n＝12，P＜0.05)。以上結(jié)果表明：敲除Trem1可以加重APP/PSEN1小鼠大腦的Aβ病理水平，這意味著TREM1可作為保護(hù)因子抑制AD的進(jìn)展。

實(shí)施例5 過表達(dá)Trem1可以減弱Aβ病理及挽救AD相關(guān)的空間認(rèn)知損害

為驗(yàn)證TREM1在AD進(jìn)展中的保護(hù)作用，我們對(duì)7月齡APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的Trem1進(jìn)行了選擇性過表達(dá)。慢病毒注射2個(gè)月后，我們通過RT-PCR和ELISA法證實(shí)了APP/PSEN1小鼠大腦小膠質(zhì)細(xì)胞中Trem1的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)改變。

首先，我們觀察了Trem1過表達(dá)對(duì)大腦Aβ病理水平的影響。Trem1過表達(dá)使大腦內(nèi)總淀粉樣蛋白水平下降了65.4％。同時(shí)，Trem1過表達(dá)分別使APP/PSEN1小鼠大腦皮層中不可溶性和可溶性Aβ_1-42水平下降了61.7％(n＝12，P＜0.05)和32.5％(n＝12，P＜0.05)。此外，Trem1過表達(dá)分別使APP/PSEN1小鼠海馬中不可溶性和可溶性Aβ_1-42水平下降了58％(n＝12，P＜0.05)和35.9％(n＝12，P＜0.05)。

下一步，我們利用Y-迷宮試驗(yàn)檢測了Trem1過表達(dá)對(duì)短期空間記憶的影響。在暴露期，各組小鼠在兩臂區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間差不多，可認(rèn)為各組小鼠對(duì)迷宮的探索程度相同。在試驗(yàn)期，我們發(fā)現(xiàn)WT小鼠的“鑒別指數(shù)”(反映相對(duì)“其它臂區(qū)域”，動(dòng)物探索“新臂區(qū)域”的偏好傾向)大于50％(n＝24，P＜0.05)。當(dāng)與WT小鼠相比較，APP/PSEN1小鼠對(duì)“新臂區(qū)域”的探索傾向出現(xiàn)受損(n＝24；與50％比較：P＜0.05；與WT小鼠比較：P＜0.05)。而過表達(dá)Trem1可以完全逆轉(zhuǎn)這一損害(n＝24；與50％機(jī)率比較：P＜0.05；與接受對(duì)照組慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠比較：P＜0.05)。值得注意的是，注射慢病毒操作并未影響兩種小鼠在試驗(yàn)期的表現(xiàn)。同時(shí)，WT小鼠中Trem1的過表達(dá)對(duì)試驗(yàn)表現(xiàn)沒有影響。

之后，在處死動(dòng)物前的最后5天里，我們利用水迷宮試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了測試。首先，我們比較了兩種小鼠的游泳速度，未觀察到顯著差異。慢病毒注射或Trem1過表達(dá)操作并未對(duì)兩種小鼠(WT和APP/PSEN1小鼠)的游泳速度產(chǎn)生明顯影響。這些結(jié)果確保我們排除動(dòng)機(jī)和感覺運(yùn)動(dòng)因素對(duì)試驗(yàn)表現(xiàn)的干擾。接下來我們利用一個(gè)隱藏平臺(tái)試驗(yàn)來測試動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)功能。如圖5d所示：從第2至第5天時(shí)間里，WT小鼠找到平臺(tái)位置所游過的距離均要比APP/PSEN1小鼠短(第2天：8.45±1.03vs.9.14±1.04m；第3天：7.52±0.98vs.8.96±0.84m；第4天：6.05±0.42vs.8.11±0.57m；第5天：5.38±0.79vs.7.56±0.72m；n＝24/每組，P＜0.05)。二因素重復(fù)測量方差分析表明：在整個(gè)任務(wù)期間，WT小鼠的表現(xiàn)較好(F_genotype(1，230)＝148.8，P＜0.05；F_days(4，230)＝173.9，P＜0.05；F_{genotype×days}(4，230)＝15.59，P＜0.05)，該結(jié)果證實(shí)了9月齡APP/PSEN1小鼠確實(shí)表現(xiàn)出空間記憶學(xué)習(xí)功能的損害。重要的是，Trem1過表達(dá)可以挽救APP/PSEN1小鼠的這一功能損害(F_treatment(1，230)＝59.72，P＜0.05；F_days(4，230)＝85.07，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝7.49，P＜0.05)。值得注意的是：慢病 毒注射操作并未影響兩種小鼠在水迷宮試驗(yàn)中的表現(xiàn)。同時(shí)，Trem1過表達(dá)也未對(duì)WT小鼠的測試表現(xiàn)產(chǎn)生影響(F_treatment(1，230)＝2.27，n.s.；F_days(4，230)＝168.4，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝0.95，n.s.)。為了檢測Trem1過表達(dá)對(duì)空間記憶的影響，我們將平臺(tái)從水下移除，并在上一次訓(xùn)練試驗(yàn)結(jié)束24h后再次讓小鼠進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。與WT小鼠表現(xiàn)相反，APP/PSEN1小鼠在目標(biāo)象限和其它任何象限花費(fèi)的探索時(shí)間幾乎完全相同，意味著動(dòng)物出現(xiàn)了明顯空間記憶損害。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)接受Trem1慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間要比其它任何象限都要長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n＝24；37.57±1.38％vs.20.81±0.46％；P＜0.05)，這表明動(dòng)物的空間記憶功能得到恢復(fù)。值得注意的是，慢病毒注射操作并未影響兩種小鼠在探索試驗(yàn)中的表現(xiàn)。同時(shí)Trem1過表達(dá)也未影響WT小鼠在試驗(yàn)中的表現(xiàn)。

實(shí)施例6 通過激動(dòng)性抗體激活Trem1信號(hào)通路可以緩和Aβ病理及AD相關(guān)空間認(rèn)知損害

為了將以上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化到臨床相關(guān)背景，我們使用微型滲透泵持續(xù)6周向7月齡APP/PSEN1小鼠大腦第三腦室背側(cè)灌入一種激動(dòng)性Trem1抗體以激活Trem1信號(hào)途徑。

首先，我們測定了Trem1信號(hào)途徑的激活對(duì)Aβ病理的影響。激動(dòng)性Trem1抗體的注入使APP/PSEN1小鼠大腦皮層中非可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著降低了31.4％(n＝12，P＜0.05)和24.6％(n＝12，P＜0.05)。同時(shí)，激動(dòng)性Trem1抗體的注入使APP/PSEN1小鼠海馬中非可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著降低了6.1％和22.6％(n＝12，P＜0.05)。

下一步，我們利用Y-迷宮試驗(yàn)評(píng)估了Trem1信號(hào)途徑的激活對(duì)短期空間記憶的影響。在暴露期，各組小鼠探索兩臂區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間差不多。在試驗(yàn)期，APP/PSEN1小鼠呈現(xiàn)出來的“新臂”探索傾向受損(n＝24；與50％機(jī)率相比：n.s.；與WT小鼠相比：P＜0.05)可被激動(dòng)性Trem1抗體所挽救(n＝24；與50％機(jī)率相比：P＜0.05；與接受對(duì)照組抗體注射的APP/PSEN1小鼠相比：P＜0.05)。需要指出的是，微型滲透泵的移植并未對(duì)兩種小鼠在試驗(yàn)期的表現(xiàn)產(chǎn)生影響。同時(shí)，WT小鼠在試驗(yàn)期的表現(xiàn)也未受激動(dòng)性Trem1抗體的影響。

此后在動(dòng)物處死前的最后5天，我們應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了測試。WT和APP/PSEN1小鼠的游泳速度均未受到微型滲透泵移植操作或激動(dòng)性Trem1抗體注入操作的明顯影響。我們接著利用隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測定了動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)功能。激動(dòng)性Trem1抗體的注入成功挽救了APP/PSEN1小鼠受損的空間學(xué)習(xí)能力(F_treatment(1，230)＝62.79，P＜0.05；F_days(4，230)＝103.4，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝4.02，P＜0.05)。值得注意的是，微型滲透泵的植入操作并未影響兩種小鼠在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)中的表現(xiàn)。同時(shí)，激動(dòng)性Trem1抗體的注入并未對(duì)WT小鼠試驗(yàn)期的表現(xiàn)產(chǎn)生任何影響(F_treatment(1，230)＝0.18，n.s.；F_days(4，230)＝203，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝2.31，n.s.)。為了檢測Trem1信號(hào)通路的激活對(duì)空間記憶的影響，我們將平臺(tái)移除并在上個(gè)訓(xùn)練試驗(yàn)結(jié)束后24h再次讓小鼠進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。接受激動(dòng)性Trem1抗體的注入的APP/PSEN1小鼠在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間要比其它任何象限長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_treatment(1，230)＝0.18，n.s.；F_days(4，230)＝203，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝2.31，n.s.)，表明小鼠空間記憶功能得到改善。值得注意的是，微 型滲透泵的植入并未影響兩種小鼠在探索試驗(yàn)中的表現(xiàn)。同時(shí)，激動(dòng)性Trem1抗體的注入對(duì)WT小鼠試驗(yàn)期的表現(xiàn)沒有影響。

參考文獻(xiàn)：

1.Scheltens P，Blennow K，Breteler MM，et al.Alzheimer′s disease.Lancet 2016.

2.Jiang T，Yu JT，Tian Y，et al.Epidemiology and Etiology of Alzheimer′s disease：From Genetic to Non-Genetic Factors.Curr Alzheimer Res 2013；10：852-67.

3.Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics.Science 2002；297：353-6.

4.Mawuenyega KG，Sigurdson W，Ovod V，et al.Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer′s disease.Science 2010；330：1774.

5.Jiang T，Yu JT，Zhu XC，et al.Temsirolimus promotes autophagic clearance of amyloid-beta and provides protective effects in cellular and animal models of Alzheimer′s disease.Pharmacol Res 2014；81：54-63.

6.Zondler L，Muller K，Khalaji S，et al.Peripheral monocytes are functionally altered and invade the CNS in ALS patients.Acta Neuropathol 2016.

7.Jiang T，Tan L，Zhu XC，et al.Upregulation of TREM2 ameliorates neuropathology and rescues spatial cognitive impairment in a transgenic mouse model of Alzheimer′s disease.Neuropsychopharmacology 2014；39：2949-62.

8.Bliederhaeuser C，Grozdanov V，Speidel A，et al.Age-dependent defects of alpha-synuclein oligomer uptake in microglia and monocytes.Acta Neuropathol 2016；131：379-91.

9.Griciuc A，Serrano-Pozo A，Parrado AR，et al.Alzheimer′s disease risk gene CD33 inhibits microglial uptake of amyloid beta.Neuron 2013；78：631-43.

10.Jiang T，Zhang YD，Chen Q，et al.TREM2 modifies microglial phenotype and provides neuroprotection in P301S tau transgenic mice.Neuropharmacology 2016；105：196-206.

11.Jiang T，Tan L，Zhu XC，et al.Silencing of TREM2 exacerbates tau pathology，neurodegenerative changes，and spatial learning deficits in P301S tau transgenic mice.Neurobiol Aging 2015；36：3176-86.

12.Tan MS，Yu JT，Jiang T，et al.IL12/23 p40 inhibition ameliorates Alzheimer′s disease-associated neuropathology and spatial memory in SAMP8 mice.J Alzheimers Dis 2014；38：633-46.

13.Geumann C，Gronborg M，Hellwig M，et al.A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of insoluble membrane and scaffold proteins.Anal Biochem 2010；402：161-9.