專利名稱：黃精多糖的用途之二的制作方法
黃精多糖的提取方已獲專利，專利號02102167.8證書號142840。一，黃精多糖對脂肪組織分泌的生物活性物質(zhì)致肝細胞HepG2分泌CRP的影響在細胞因子作用下，肝細胞HepG2合成CRP。肝功能正常時，CRP合成水平主要決定于細胞因子的水平。脂肪組織培養(yǎng)液含細胞因子等大量生物活性物質(zhì)，它是否引起肝臟產(chǎn)生CRP的變化呢？目前國內(nèi)外未見相關(guān)研究。本研究表明，腹腔及皮下脂肪組織產(chǎn)生炎性因子等生物活性物質(zhì)有差別，它們對肝臟產(chǎn)生CRP影響如何，值得進一步研究。本研究將脂肪組織培養(yǎng)液直接作用于肝細胞HepG2，分析其產(chǎn)生CRP的情況，并將黃精多糖作用于HepG2，觀察CRP的變化。
1，對象和方法1.1對象 湘雅二院外科行擇期膽囊結(jié)石及腎結(jié)石手術(shù)的住院者30例(其中性18例，女性12例)，排除標準(1)高血壓??；(2)急性感染；(3)自身免疫性疾??；(4)慢性腎功能不全；(5)惡性腫瘤疾病。
1.2方法1.2.1腹腔及腹部皮下脂肪組織的培養(yǎng)及培養(yǎng)液的提取脂肪組織塊被清除皮膚和血管，剪成數(shù)塊，大小約100mg，稱重，冷PBS液清洗3次后，分別置于EP管內(nèi)剪碎。按100mg脂肪組織加1ml培養(yǎng)基比例置于培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)基為DMEM/F12，其中含有10％熱滅活小牛血清，青霉素(200μ/ml)，鏈霉素(50μg/ml)，慶大霉素(200μg/ml)。
1.2.2.肝細胞HepG2的培養(yǎng)肝細胞HepG2購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞培養(yǎng)中心。細胞復蘇后，均勻傳代于24孔板，加入含10％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，同時分別加入脂肪組織培養(yǎng)上清液200μl及黃精多糖(濃度10-6mol/L)，置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時，待細胞融合達80％后，吸取上清液，置于-70℃冰箱保存待測。
1.2.3.黃精多糖由中南大學湘雅二醫(yī)院藥學實驗室提供。1ml含黃精生藥10g。
1.2.4.肝細胞培養(yǎng)液CRP檢測采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定，濃度單位為ng/ml，靈敏度為0.3ng/ml，批內(nèi)和批間差異均＜10％。檢測試劑由美國貝克曼公司提供。
1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS 8.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，各指標以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用One wayANOVA檢驗，采用雙側(cè)P＜0.05為統(tǒng)計學顯著性差異。
2，結(jié) 果2.1一般資料 共30例研究對象，其中男性18例，女12例，膽囊結(jié)石者8例，腎結(jié)石者22例，平均年齡46.9±10.3歲(范圍為32～62歲)，體重指數(shù)(BMI，體重/身高2)為22.05±2.62kg/m2(范圍為16.77～27.24kg/m2)。2.2腹腔及腹部皮下脂肪組織培養(yǎng)液致肝細胞HepG2分泌CRP濃度(表1)不同部位脂肪組織培養(yǎng)液均可刺激HepG2分泌CRP；腹腔內(nèi)脂肪培養(yǎng)液引起HepG2分泌CRP高于腹部皮下脂肪培養(yǎng)液。
2.3黃精多糖抑制脂肪培養(yǎng)液刺激HepG2分泌CRP情況黃精多糖使腹腔內(nèi)脂肪培養(yǎng)液及腹部皮下脂肪培養(yǎng)液刺激HepG2分泌CRP作用分別下降67％和45％。
表1腹腔及腹部皮下脂肪組織培養(yǎng)液刺激HepG2分泌CRP(ng/ml)組別例數(shù) 基礎分泌黃精多糖干預后基礎培養(yǎng)液(DMEM/F12)+HepG2＜0.3 ＜0.3內(nèi)臟脂肪培養(yǎng)液+HepG2+DMEM/F1230 3.84±0.92a1.28±0.37b皮下脂肪培養(yǎng)液+HepG2+DMEM/F1230 2.45±0.75 1.35±0.24ca與皮下脂肪培養(yǎng)液刺激組比較，P＜0.01；b、c與相應組基礎分泌值比較P＜0.01。
本研究表明，腹腔及腹部皮下脂肪組織培養(yǎng)液均可刺激肝細胞HepG2分泌CRP，腹腔內(nèi)脂肪組織培養(yǎng)液引起HepG2分泌CRP高于腹部皮下脂肪組織。脂肪組織的生物活性物質(zhì)致肝臟HepG2分泌CRP的作用機制存在多種途徑，但細胞因子起主要作用。業(yè)已證明，CRP不僅是炎癥反應的標志物，它還可調(diào)節(jié)巨噬細胞攝取低密度脂蛋白(LDL)，刺激單核細胞釋放IL-1b，IL-6、TNF-α等炎癥因子，誘導內(nèi)皮細胞表達單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)及血管內(nèi)皮粘附分子-1(VCAM-1)，從而促進動脈內(nèi)血栓形成和動脈粥樣硬化的形成；CRP升高可抑制肝細胞對膽固醇、甘油三酯的降解和轉(zhuǎn)運。本研究表明，黃精多糖具有抑制脂肪組織培養(yǎng)液致肝細胞HepG2產(chǎn)生CRP的作用，故最終可以(1)抑制動脈內(nèi)血栓形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生；(2)加速肝內(nèi)膽固醇、甘油三酯的降解和轉(zhuǎn)運(預防或治療脂肪肝)。
二，黃精多糖對糖尿病鼠心、腎組織糖基化終產(chǎn)物受體mRNA表達的影響糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展與慢性高血糖所致的蛋白非酶糖基化及其導致的氧化應激反應密切相關(guān)。因此，高血糖時蛋白質(zhì)的非酶糖基化作用抑制劑的開發(fā)和應用受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。
1.材料與方法1.1實驗動物 BALB/C小鼠30只，3月齡，雌雄各半，體重(19±2)g，隨機分3組正常對照組、糖尿病模型組和治療組，每組10只。
1.2實驗藥物 黃精多糖由中南大學湘雅二醫(yī)院臨床藥學研究室提供(每毫升相當于黃精生藥10g)，鏈脲佐菌素購自Sigma公司。
1.3實驗方法1.3.1糖尿病模型的建立實驗期間動物按組分籠飼養(yǎng)，自由飲水及進食標準飼料。模型組及治療組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素40mg·kg-1·d-1(臨用前用0.1mmol/l緩沖液配成2％濃度)，連續(xù)5天；7天后禁食6小時剪尾檢測血糖變化。凡血糖≥8.0mmol/L者視為糖尿病鼠，血糖測定方法為葡萄糖氧化酶法。
1.3.2給藥方法 治療組予以2ml·kg-1·d-1(相當于生藥20g·kg-1·d-1)的黃精多糖，每日一次灌胃給藥(臨用前溶于注射用水0.5ml)，給藥時間為12周；模型組以注射用水0.5ml每日一次灌胃給予，時間為12周。
1.4小鼠組織RAGE mRNA表達的測定1.4.1樣本制備實驗結(jié)束后斷頭處死小鼠，取其心、腎組織置于經(jīng)消毒的管，液氮速凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?br> 1.4.2 RT-PCR測定①引物合成根據(jù)小鼠RAGE cDNA序列(Accession；NM-007425，1348bp)用計算機在線設計，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限化司合成(Sensetct tgc tct atg ggg agc tg，Antisensectt ccc tcg cct qtt agt tg)，擴增片段長度為280bp；Mouse Beta actin引物(senseatg gat gac gat atcgct，Antisenseatg agg tag tct gtc agg t)，增片段長度為569bp。②總RNA提取用一步法總RNA提取試劑盒(GIBCO公司)提取動物心、腎組織中的總RNA，用全自動紫外分光光度計(美國Beckman Du-70)測OD值定量(A260/280比值均大于1.8)，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂勰孓D(zhuǎn)錄用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bebco公司)以總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物合成cDNA。反應條件42℃保溫1小時，90℃變性5分鐘；冰上冷卻5分鐘。用全自動紫外分光光度計測OD值定量，產(chǎn)物置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂躊CR擴增在0.2ml PCR反應管中分別加入10mM dnTP 1μl，Taq 酶(2U/μl)0.25μl，10×PCR Buffer 2μl，MgCl2(25Mm)1.25μl，小鼠RAGE上、下游引物(20pmol/μl)及β-actin上、下游引物(20pmol/μl)各0.5μl，cDNA2μl，并加去離子雙蒸水至終體積20μl，按下述反應條件在PTC220型PCR熱循環(huán)儀上進行擴增。95℃5′，[95℃ 60″-58℃ 60″-72℃ 60″]×30，72℃ 7′。⑤定量將RAGE和β-actin PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，在Eagle Eye II型圖像處理系統(tǒng)上測量出RAGE及β-actin電泳帶的光密度，用β-actin作為參照，求出RAGE的相對值(RAGE/β-actin)。
2.結(jié)果2.1各組實驗前后一般情況變化治療前各組體重無明顯差異，12周末，正常組小鼠體重增加，活動自如，模型組有消瘦、多尿、精神萎靡不振、反應遲鈍等表現(xiàn)，治療組小鼠多尿癥狀較輕，反應動作較模型組靈敏。
2.2各組實驗前后血糖變化(表1)正常對照組和模型組小鼠實驗前后血糖無顯著變化(p＞0.05)，治療組小鼠實驗后血糖顯著降低(p＜0.05)
表1 各組小鼠實驗前后血糖變化組 別n 實驗前 實驗后 P值正常對照組105.32±1.24 5.76±1.86 ＞0.05模型組109.36±1.08 10.74±1.45 ＞0.05治療組1010.25±1.377.18±0.84 ＜0.052.3黃精多糖對小鼠心、腎組織RAGE mRNA表達的影響2.3.1各組實驗小鼠心、腎組織RAGE mRNA凝膠電泳圖譜(

圖1，2)。
從以上圖譜可看出，模型組小鼠心、腎組織RAGE mRNA的表達較正常對照組增高，經(jīng)黃精多糖治療后，其表達較模型組降低。
2.3.2各組實驗小鼠心、腎組織RAGE的半定量測定(表2)RAGE及β-actin電泳帶光密度的圖像處理分析結(jié)果示模型組心、腎組織RAGE/β-actin相對值顯著高于正常對照組(p＜0.01)；經(jīng)黃精多糖治療后，其相對值較模型組顯著降低(p＜0.05)；說明黃精多糖可顯著減少RAGE mRNA在糖尿病小鼠心、腎組織的高表達。
表2各組小鼠心、腎組織RAGE/β-actin相對值RAGE/β-actin組別 n心腎正常對照組10 0.355±0.074*0.180±0.056*模型組10 0.998±0.202 0.765±0.1 13治療組10 0.760±0.121*0.609±0.146△*與模型組比較P＜0.01；與模型組比較P＜0.05。
晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展及機體的衰老有著密切聯(lián)系。RAGE(AGE受體)在正常情況下介導巨噬細胞對AGE的清除，在病理情況下促進AGE與細胞外基質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應，引起血管基膜增厚及通透性增加。AGE形成在糖尿病慢性血管病變發(fā)生機制中的作用目前已知三個方面1，AGE能與外滲性血漿蛋白如低密度脂蛋白(LDL)形成共價交聯(lián)，AGE-LDL形成后加速糖尿病動脈粥樣化的發(fā)生；2，AGE與血管壁鄰近基質(zhì)蛋白廣泛形成共價交聯(lián)，引起基膜增厚，最終導致血管閉塞；3，AGE與特異性RAGE結(jié)合，引起血管壁微循環(huán)中的細胞活素或細胞因子(如IGF-1，TNF，IL-1等)產(chǎn)生，這些物質(zhì)直接或間接刺激血管平滑肌細胞、纖維母細胞、內(nèi)皮細胞和膠原蛋白的增生，從而加速了血管的硬化和管腔閉塞。糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化的危險性較健康人增高3-4倍。近年來研究表明，長期高血糖狀態(tài)下蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的AGE參與了糖尿病患者動脈粥樣硬化的發(fā)生。AGE主要通過受體介導發(fā)揮其作用，目前發(fā)現(xiàn)包括平滑肌細胞在內(nèi)的多種細胞上有AGE受體的表達。正由于AGE的重要性，從阻斷RAGE的介導途徑著手，研究抑制AGE病理作用的藥物也引起了國內(nèi)外的重視。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖有顯著降低實驗糖尿病小鼠血糖及HbA1c的作用。HbA1c是體內(nèi)AGE的主要存在形式。本研究結(jié)果顯示黃精多糖可顯著下調(diào)糖尿病鼠心、腎組織中RAGE mRNA的表達，并再一次證實了其降低血糖的作用。黃精多糖對組織中RAGE mRNA表達的下調(diào)在很大程度上抑制了AGE的有效結(jié)合點及AGE與RAGE結(jié)合后發(fā)生的一系列損傷機體的細胞生物學效應。本課題的系列研究提示黃精多糖對糖尿病小鼠的作用有三1，降低血糖；2，降低HbA1c；3，下調(diào)心、腎組織中RAGEmRNA的表達(RAGE的抑制劑)。
三，黃精多糖對老年糖尿病鼠腦組織糖基化終產(chǎn)物受體mRNA表達的影響糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)見于糖尿病發(fā)生氧化應激的組織(如心、腎組織等)，它還起到了淀粉-肽受體信號傳導作用，是Alzheimer病(老年性癡呆癥)和腦血管病時腦組織損傷的又一介導物質(zhì)。因此，抑制RAGE受體的表達是防治糖尿病慢性并發(fā)癥及其腦組織損傷的主要措施之一。本研究擬通過糖尿病老齡動物模型，研究黃精多糖對老年糖尿病鼠腦組織RAGEmRNA表達的調(diào)節(jié)作用，為開發(fā)新的腦保護劑提供理論依據(jù)。
1，材料與方法1.1實驗動物BALB/C小鼠(購自中南大學湘雅二院動物實驗室)30只，18月齡，雌雄各半，體重(26±2)g，隨機分3組正常對照組、糖尿病模型組和治療組，每組10只。
1.2實驗藥物黃精多糖由中南大學湘雅二醫(yī)院臨床藥學研究室提供(每毫升相當于黃精生藥10g)，鏈脲佐菌素購自Sigma公司。
1.3實驗方法(1).糖尿病模型的建立實驗期間動物按組分籠飼養(yǎng)，自由飲水及進食標準飼料。模型組及治療組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素40mg·kg-1·d-1(臨用前用0.1mmol/l緩沖液配成2％濃度)，連續(xù)5天；7天后禁食6小時剪尾檢測血糖變化。凡血糖≥8.0mmol/L者視為糖尿病鼠，血糖測定方法為葡萄糖氧化酶法。(2).給藥方法治療組予以2ml·kg-1·d-1(相當于生藥20g·kg-1·d-1)的黃精多糖，每日一次灌胃給藥(臨用前溶于注射用水0.5ml)，給藥時間為12周；模型組以注射用水0.5ml每日一次灌胃給予，時間為12周。
1.4小鼠腦組織RAGE mRNA表達的測定(1).樣本制備實驗結(jié)束后斷頭處死小鼠，取其腦組織置于經(jīng)消毒的chaps管，液氮速凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?br> (2).RT-PCR測定①引物合成根據(jù)小鼠RAGE cDNA序列(Accession；NM_007425，1348bp)用計算機在線設計，由上海生物工程技術(shù)服務有限化司合成(Sensetct tgc tct atg ggg agc tg，Antisensectt ccc tcg cct qtt agt tg)，擴增片段長度為280bp；Mouse Beta actin引物(senseatg gat gac gat atc gct，Antisenseatg agg tag tct gtc agg t)，擴增片段長度為569bp。②總RNA提取用一步法總RNA提取試劑盒(GIBCO公司)提取動物腦組織中的總RNA，用全自動紫外分光光度計(美國Beckman Du-70)測OD值定量(A260/280比值均大于1.8)，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。③逆轉(zhuǎn)錄(RT)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bebco公司)以總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物合成cDNA。反應條件42℃保溫1小時，90℃變性5分鐘；冰上冷卻5分鐘。用全自動紫外分光光度計測OD值定量，產(chǎn)物置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。④PCR擴增在0.2ml PCR反應管中分別加入10mM dnTP 1μl，Taq酶(2U/μl)0.25μl，10×PCR Buffer 2μl，MgCl2(25Mm)1.25μl，小鼠RAGE上、下游引物(20pmol/μl)及β-actin上、下游引物(20pmol/μl)各0.5μl，cDNA2μl，并加去離子雙蒸水至終體積20μl，按下述反應條件在PTC220型PCR熱循環(huán)儀上進行擴增。95℃ 5′，[95℃ 60″-58℃ 60″-72℃ 60″]×30，72℃ 7′。⑤定量將RAGE和β-actin PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，在Eagle Eye II型圖像處理系統(tǒng)上測量出RAGE及β-actin電泳帶的光密度，用β-actin作為參照，求出RAGE的相對值(RAGE/β-actin)。
1.5統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計分析為配對t檢驗，組間兩兩比較用q檢驗。
2，結(jié)果2.1各組實驗前后一般情況變化治療前各組體重無明顯差異，12周末，正常組小鼠體重增加，活動自如；模型組有消瘦、多尿、精神萎靡不振、反應遲鈍等表現(xiàn)；治療組小鼠多尿癥狀較輕，反應動作較模型組靈敏。
2.2各組實驗前后血糖變化(表1)正常對照組和模型組小鼠實驗前后血糖無顯著變化(p＞0.05)，治療組小鼠實驗后血糖顯著降低(p＜0.05)。
表1 各細小鼠實驗前后血糖變化(mmol/L)組 別 n實驗前 實驗后 P值正常對照組105.26±1.08 5.34±1.19 ＞0.05模型組109.68±1.09 10.30±1.35＞0.05治療組1010.75±1.057.06±0.60 ＜0.052.3黃精多糖對小鼠腦組織RAGE mRNA表達的影響(1).各組實驗小鼠腦組織RAGE mRNA凝膠電泳圖譜(圖3)。從以上圖譜可看出，模型組小鼠腦組織RAGE mRNA的表達較正常對照組增高，經(jīng)黃精多糖治療后，其表達較模型組降低；(2)各組實驗小鼠腦組織RAGE的半定量測定(表2)RAGE及β-actin電泳帶光密度的圖像處理分析結(jié)果示模型組腦組織RAGE/β-actin相對值顯著高于正常對照組(p＜0.01)；經(jīng)黃精多糖治療后，其相對值較模型組顯著降低(p＜0.01)；說明黃精多糖可顯著減少RAGE mRNA在糖尿病小鼠腦組織的高表達。
表2各組小鼠腦組織RAGE/β-actin相對值組別 nRAGE/β-actin正常對照組10 0.000±0.000模型組10 0.146±0.052治療組10 0.089±0.033*與模型組比較*P＜0.01RAGE是細胞表面分子的免疫球蛋白超家族成員之一，它可與其糖氧化物配體(AGE)結(jié)合，強化受體的表達，使血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)元等持續(xù)活化而造成相關(guān)組織損傷。目前，RAGE與神經(jīng)系統(tǒng)病變的研究已引起人們的關(guān)注。已有的報道提示，Alzheimer病腦組織中RAGE高表達，它與β-淀粉肽結(jié)合，而導致神經(jīng)細胞功能失調(diào)和細胞凋亡。淀粉樣腦血管病、帕金森病、老年腦組織中亦存在AGE的沉積。在缺血缺氧72小時后，壞死的神經(jīng)元和缺血半暗帶的損傷腦組織中發(fā)現(xiàn)有RAGE mRNA的高表達，提示RAGE及AGE在缺血應激介導的神經(jīng)元死亡中起重要作用。腦組織RAGE mRNA的過度表達可激發(fā)AGE結(jié)合位點及β-淀粉肽與RAGE結(jié)合后的一系列細胞生物反應(如氧化應激反應和活化NFκB誘導的各種細胞因子產(chǎn)生)，促發(fā)RAGE介導的β-淀粉肽對神經(jīng)元和腦組織中巨噬細胞、星形膠質(zhì)細胞的氧化應激損傷。由于AGE及RAGE與腦組織損傷密切相關(guān)，從阻斷RAGE的介導途徑著手研究抑制AGE病理作用的藥物也引起了人們的重視。本課題前期研究證明黃精多糖具有降低實驗性糖尿病鼠血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c)的作用。HbA1c是體內(nèi)AGE的主要存在形式。本實驗研究結(jié)果顯示，黃精多糖可顯著下調(diào)老年糖尿病鼠腦組織中RAGE mRNA的表達，并再次證實其降低血糖的作用。綜上所述，黃精多糖可降低糖尿病鼠的血糖、抑制AGE形成及下調(diào)腦組織中RAGE mRNA表達，起到了保護高血糖狀態(tài)下及RAGE介導的應激反應所致的缺血缺氧狀態(tài)下受損腦組織的作用。也為該藥作為預防和治療老年性癡呆癥(Alzheimer病)提供了理論依據(jù)。
權(quán)利要求
1，根據(jù)說明書一、二所述內(nèi)容，黃精多糖的用途，其特點在于黃精多糖是(1)制備治療動脈內(nèi)血栓形成和動脈粥樣硬化的藥物；(2)制備治療脂肪肝的藥物。
2，根據(jù)說明書二、三所述內(nèi)容，黃精多糖的用途，其特點在于黃精多糖是制備預防或治療老年性癡呆(Alzheimer病)的藥物。
全文摘要
本發(fā)明黃精多糖的用途，其特征在于1.黃精多糖是(1)制備治療動脈內(nèi)血栓形成和動脈粥樣硬化的藥物；(2)制備治療脂肪肝的藥物。2.黃精多糖是制備預防或治療老年性癡呆(Alzheimer病)的藥物。黃精多糖能抑制人體不同部位脂肪組織分泌的生物活性物質(zhì)致肝細胞HepG2分泌CRP；能降低糖尿病鼠的糖基化終產(chǎn)物、下調(diào)心、腎、腦組織中糖基化終產(chǎn)物受體。從而是制備抑制動脈內(nèi)血栓形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生，加速肝內(nèi)膽固醇、甘油三酯的降解與轉(zhuǎn)運，預防或治療老年性癡呆(Alzheimer病)的藥物。
文檔編號A61P7/02GK1628694SQ200410064400
公開日2005年6月22日 申請日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者吳燊榮 申請人:吳燊榮