專利名稱：接種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)合支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療軟組織或硬組織中的疾病或結(jié)構(gòu)缺陷的接種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)合組織支架。
背景技術(shù)：
存在用于治療三種折磨病人疾病的臨床需求，第一種疾病涉及例如軟骨、骨、半月板或肌肉的病患/損傷的肌骨骼組織。通常，修復(fù)例如骨、軟骨或肌肉等損傷或病患的肌骨骼組織的臨床方法不能充分恢復(fù)這些組織的原始功能。假體關(guān)節(jié)/裝置經(jīng)常用于治療帶有由周?chē)M織的松散、耐久力降低和功能喪失引起的混合缺陷的疾病。
第二種疾病涉及器官功能的喪失，例如糖尿病(DM)。DM是由胰腺中β細(xì)胞被破壞或者肌肉或脂肪組織對(duì)胰島素敏感而引起的。目前對(duì)糖尿病的治療在防止例如失明、腎衰竭和潰爛主要的并發(fā)癥方面仍然不足。
第三種疾病涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的損傷或受損。脊髓的損傷可以導(dǎo)致除了血管之外的白質(zhì)和灰質(zhì)的破壞。外傷或變質(zhì)過(guò)程往往引起脊髓的損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)不像其他許多組織那樣擁有有限的自身修復(fù)能力，因?yàn)槌墒斓纳窠?jīng)缺乏再生的能力。早先再生中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的嘗試包括移植阻斷抑制蛋白的抗體；移植神經(jīng)膠質(zhì)、巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞；使用例如甲強(qiáng)龍等類(lèi)固醇藥來(lái)減少伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的膨脹；和使用一種聯(lián)合了細(xì)胞或生物活性信號(hào)的支撐結(jié)構(gòu)來(lái)觸發(fā)神經(jīng)再生。這些方法沒(méi)有給外傷或疾病后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)帶來(lái)充足的修復(fù)。因此，仍然強(qiáng)烈需要一種可以避免目前臨床方法常見(jiàn)問(wèn)題的組織修復(fù)/再生的可供選擇的方法。
新近出現(xiàn)的組織工程學(xué)可以提供可選擇的修復(fù)和再生損傷/病患組織的方法。組織工程學(xué)方法已經(jīng)探究了生物材料聯(lián)合細(xì)胞和/或生長(zhǎng)因子來(lái)發(fā)展可以極大恢復(fù)或改善組織功能的生物體代品的用法。支架材料已經(jīng)在作為對(duì)組織修復(fù)有用的組織模板、導(dǎo)管、屏障和存儲(chǔ)器等方面得到廣泛的研究。尤其，以泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織品和無(wú)紡品形式的合成和天然材料已經(jīng)應(yīng)用于體外和體內(nèi)來(lái)重建/再生生物組織，也用于傳輸引導(dǎo)組織生長(zhǎng)的趨化劑。
不管支架和靶組織的成分是什么，支架必須擁有一些基礎(chǔ)的特征。支架必須是生物相容的，擁有充足的抵抗手術(shù)期間經(jīng)歷負(fù)荷的機(jī)械性質(zhì)；是柔韌的、高度多孔的以允許細(xì)胞的進(jìn)入或生長(zhǎng)，允許支架內(nèi)細(xì)胞潴留的增加；易于消毒滅菌；可以通過(guò)滲入組織而重建，并且當(dāng)新組織生成后是可以降解的。支架可以通過(guò)機(jī)械方式、固定裝置、縫合或粘合等方式固定到周?chē)M織。到目前為止，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用組織支架的常規(guī)材料已經(jīng)證實(shí)對(duì)植入后的接種細(xì)胞的潴留是無(wú)效的。
因此，存在一種能夠解決常規(guī)材料局限性的接種細(xì)胞的支架的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及可移植的、生物可相容的支架，該支架包含生物可相容的、多孔的聚合物基質(zhì)，聚合物基質(zhì)包封且布置其中的生物可相容的、多孔、纖維墊(mat)；以及，在將支架植入到哺乳動(dòng)物缺陷部位或異位部位之前接種到所述組織支架上的多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明也涉及利用本發(fā)明的支架治療哺乳動(dòng)物疾病的方法。該纖維墊優(yōu)選是無(wú)紡墊。包封了纖維墊的多孔的、生物相容的基質(zhì)優(yōu)選是多孔的聚合泡沫，優(yōu)選使用凍干過(guò)程形成的聚合泡沫。
本發(fā)明可在復(fù)合支架內(nèi)使得哺乳動(dòng)物細(xì)胞的潴留增加以及期望的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成增多。
除此之外，接種了細(xì)胞的復(fù)合支架可以作為運(yùn)載工具以運(yùn)送細(xì)胞分泌生物因子。這樣的生物因子可以直接正向調(diào)節(jié)或反向調(diào)節(jié)其他生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)，細(xì)胞活素或其他細(xì)胞類(lèi)型的增殖。許多細(xì)胞可以在復(fù)合支架植入缺陷部位或病變組織之前或之后接種于此復(fù)合支架上。


圖1是含有包封了90/10 PGA/PLA無(wú)紡墊的60/40 PGA/PCL泡沫的復(fù)合支架一部分的電子掃描顯微照片。
圖2是接種了小鼠支持細(xì)胞(Stertoli cells)的本發(fā)明組織支架的H&E部分。
圖3是實(shí)施例12中所述復(fù)合支架的一部分的電子掃描顯微照片。
圖4是實(shí)施例13中所述復(fù)合支架的一部分的電子掃描顯微照片。
圖5是實(shí)施例14中所述復(fù)合支架的一部分的電子掃描顯微照片。
圖6是實(shí)施例15所述的接種了胰島的復(fù)合支架的熒光圖象。
本發(fā)明涉及生物相容的復(fù)合組織支架，該支架包含多孔的生物可相容的纖維墊，該纖維墊由多孔的、生物可相容的聚合物基質(zhì)包封，并置于其中。哺乳動(dòng)物細(xì)胞被給予方式可以是，即接種在該復(fù)合支架中，優(yōu)選在復(fù)合支架植入哺乳動(dòng)物缺陷部位和異位部位之前。
本發(fā)明的接種細(xì)胞的復(fù)合支架提供了一種環(huán)境，借此，給予的(即接種)細(xì)胞可以同時(shí)粘附到多孔纖維墊上，也可以粘附到包封纖維墊的多孔的聚合物基質(zhì)的孔壁上。這種獨(dú)特的設(shè)計(jì)，纖維墊和多孔的聚合物基質(zhì)相聯(lián)合，與單獨(dú)使用多孔纖維墊或多孔聚合物基質(zhì)相比，可增大所給予細(xì)胞在支架中的潴留。
圖1中顯示了本發(fā)明的一個(gè)多孔復(fù)合支架的實(shí)施方案。該圖顯示復(fù)合支架10，該支架含有置于多孔聚合物基質(zhì)30中并由多孔聚合物基質(zhì)30包封的纖維墊20。支架10包含大孔25和微孔35。此處所說(shuō)的微孔包括平均直徑小于約50μm的孔。此處所說(shuō)的大孔包括平均直徑大于約50μm的孔。
制備好支架10以后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在植入前或植入當(dāng)時(shí)被給予或接種到支架中。根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用或正在治療的疾病的狀況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可分離自無(wú)血管和有血管的組織。這些細(xì)胞在接種到支架之前要在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)，以增加細(xì)胞的數(shù)量或誘導(dǎo)其分化成所需的表型?？晒┻x擇地，分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以直接注射到支架10中然后在植入前在促進(jìn)適宜的生物基質(zhì)增殖和沉積的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。有了本發(fā)明所帶來(lái)的啟示本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易的發(fā)現(xiàn)這種條件。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在植入體內(nèi)前被分離的細(xì)胞被直接注射到支架10中而沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的體外培養(yǎng)。
本發(fā)明的支架可以是非-生物可降解的，即不能在體內(nèi)輕易降解，由此降解的成分被吸收或被排除體外，其中所述的纖維墊的纖維20和/或多孔的、聚合物基質(zhì)30都可以包含非-生物可降解的材料。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的支架可以是生物可降解的，即能夠被身體輕易降解，其中生物降解的成分被身體吸收或排出體外，其中的纖維墊和聚合物基質(zhì)都包含生物可降解材料。
纖維墊可以包含生物可相容金屬的非生物可降解纖維，包括但不限于，不銹鋼、鈷鉻、鈦和鈦合金；或生物惰性的陶瓷，包括但不限于氧化鋁、氧化鋯和硫酸鈣；或生物可降解的玻璃或陶瓷包括磷酸鈣；或生物可降解的自體移植物、同種異體移植物或異體移植骨組織。
多孔的、聚合物基質(zhì)或纖維墊可以含有非-生物可降解聚合物，包括但不限于聚乙烯、聚乙烯醇(PVA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅樹(shù)脂、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚乙二醇(PEG)、和聚氨酯。
聚合物基質(zhì)可以包含生物可降解的生物聚合物。此處所用的術(shù)語(yǔ)“生物聚合物”應(yīng)理解為包括了天然存在的聚合物和它們的合成改性物或衍生物。這樣的生物聚合物包括但不限于透明質(zhì)酸、膠原質(zhì)、重組膠原質(zhì)、纖維素、彈性蛋白、藻酸鹽、硫酸軟骨素、殼聚糖、殼多糖、角蛋白、絲、小腸粘膜下層(SIS)和它們的混合。這些生物聚合物可以通過(guò)引入交聯(lián)劑或改變側(cè)鏈殘基的疏水性被進(jìn)一步改性來(lái)增強(qiáng)其機(jī)械或降解性質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維20和多孔的基質(zhì)30優(yōu)選包含生物可降解的聚合物。由此得到一個(gè)可完全被身體所降解的復(fù)合支架植入裝置。
在這樣的生物可降解支架中，各種生物降解聚合物可以用來(lái)制作纖維墊和多孔的聚合物基質(zhì)，這些纖維墊和多孔的聚合物基質(zhì)包括根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合支架植入裝置并用哺乳動(dòng)物的細(xì)胞進(jìn)行接種。合適的生物可相容的、生物可降解的聚合物的實(shí)例包括選自下述聚合物脂族聚酯、聚亞烷基草酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚草酸酯(polyoxaester)、聚酰胺酯(polyamidoester)、聚酐和聚膦腈。
通常，脂族聚酯是用于制備本發(fā)明復(fù)合支架的優(yōu)選的生物可降解聚合物。脂族聚酯可以是具有直鏈、支鏈或星型結(jié)構(gòu)的均聚物和共聚物(無(wú)規(guī)、嵌段、多嵌段(segmented)、遞變嵌段、接枝、三嵌段等)。合成脂族均聚物和共聚物的合適的單體可選自包括但不限于，乳酸、丙交酯(包括L-、D-、內(nèi)消旋和L，D混合物)、羥基乙酸、乙交酯、ε-己內(nèi)酯、p-二噁烷酮、三亞甲基碳酸酯、δ-戊內(nèi)酯、β-丁內(nèi)酯、ε-癸內(nèi)酯(ε-decalactone)、2，5-二酮基嗎呤、新戊內(nèi)酯，α，α-二乙基丙內(nèi)酯、碳酸亞乙酯、草酸亞乙酯、3-甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮、3，3-二乙基-1，4-二噁烷-2，5-二酮、γ-丁內(nèi)酯，1，4-dioxepan-2-酮、1，5-dioxepan-2-酮、6，6-二甲基-dioxepan-2-酮和6，8-二氧雜二環(huán)辛烷-7-酮。
彈性共聚物也特別適用于本發(fā)明。合適的彈性共聚物包括那些具有特性粘度在大約1.2dL/g到大約4dL/g的范圍內(nèi)的彈性共聚物。更優(yōu)選大約1.2dL/g到大約2dL/g，最優(yōu)選大約1.4dL/g到大約2dL/g，這些數(shù)據(jù)均在25℃下將0.1g/dL聚合物的六氟異丙醇(HFIP)中測(cè)定。而且，合適的彈性體顯示出高的延長(zhǎng)百分率和低的模量，擁有好的抗張強(qiáng)度和好的回復(fù)特性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，形成復(fù)合支架的彈性體顯示出超過(guò)大約200％的延長(zhǎng)百分率且優(yōu)選超過(guò)大約500％。除了這些延長(zhǎng)和模量性質(zhì)之外，合適的彈性體也應(yīng)當(dāng)具有超過(guò)大約500psi的抗張強(qiáng)度，優(yōu)選超過(guò)大約1000psi，和超過(guò)大約50磅/英寸的撕裂強(qiáng)度，優(yōu)選超過(guò)大約80磅/英寸。
示例性的生物可降解、生物可相容的彈性體包括但不限于，帶有ε-己內(nèi)酯和乙交酯摩爾比率在大約35/65到大約65/35范圍的ε-己內(nèi)酯和乙交酯的彈性共聚物，更優(yōu)選35/65到45/55；ε-己內(nèi)酯和丙交酯的摩爾比率在大約35/65到65/35的范圍，且更優(yōu)選35/65到45/55的ε-己內(nèi)酯和丙交酯的彈性共聚物；丙交酯和乙交酯的摩爾比率在大約95/5到大約85/15的丙交酯和乙交酯的彈性共聚物；對(duì)-二噁烷酮和丙交酯的摩爾比率在大約40/60到大約60/40的對(duì)-二噁烷酮和丙交酯的彈性共聚物；ε-己內(nèi)酯和對(duì)-二噁烷酮的摩爾比率是大約30/70到大約70/30的ε-己內(nèi)酯和對(duì)-二噁烷酮的彈性共聚物；對(duì)-二噁烷酮和三亞甲基碳酸酯的摩爾比率是大約30/70到大約70/30的對(duì)-二噁烷酮和三亞甲基碳酸酯的彈性共聚物；三亞甲基碳酸酯和乙交酯的摩爾比率是大約30/70到大約70/30的三亞甲基碳酸酯和乙交酯的彈性共聚物；三亞甲基碳酸酯和丙交酯的摩爾比率是大約30/70到大約70/30的三亞甲基碳酸酯和丙交酯的彈性共聚物，或者它們的混合物。
脂族聚酯是典型地以開(kāi)環(huán)聚合合成的。單體通常是高溫下在有機(jī)金屬催化劑和引發(fā)劑的存在下進(jìn)行聚合。有機(jī)金屬催化劑優(yōu)選基于錫，即辛酸亞錫，以單體對(duì)催化劑的摩爾比率為從約10000/1到約100000/1的范圍內(nèi)存在于單體混合物中。引發(fā)劑通常為鏈烷醇(包括二元醇和多元醇)、乙二醇、羥基酸、或者胺，以單體對(duì)引發(fā)劑的摩爾比率從約100/1到約5000/1的范圍內(nèi)存在于單體混合物中。聚合反應(yīng)典型地在大約80℃到大約240℃，優(yōu)選約100℃至約220℃的溫度下進(jìn)行，直到得到了所需的分子量和粘度。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，形成復(fù)合支架的合適的聚合物或共聚物的選擇依賴數(shù)個(gè)因素。選擇合適的用于制造支架的一個(gè)或多個(gè)聚合物的多個(gè)相關(guān)因素包括生物降解(或生物降解)動(dòng)力學(xué)參數(shù)；體內(nèi)機(jī)械性能；細(xì)胞對(duì)細(xì)胞附屬物質(zhì)的材料的反應(yīng)，增殖、遷移和分化；以及生物相容性。在某種程度上指示聚合物體外和體內(nèi)行為的其他相關(guān)因素包括化學(xué)組成、組成物的空間分布、聚合物分子量和結(jié)晶度。
材料基材具有能在體內(nèi)環(huán)境中被及時(shí)再吸收的能力是很關(guān)鍵的。然而，體內(nèi)條件下降解時(shí)間的差異也可以作為聯(lián)合應(yīng)用兩種不同共聚物的基礎(chǔ)。例如比例為35/65的ε-己內(nèi)酯和乙交酯的共聚物(一個(gè)降解相對(duì)快的聚合物)和一個(gè)比例為40/60的ε-己內(nèi)酯和丙交酯共聚物(一個(gè)降解相對(duì)較慢的聚合物)相混合以形成復(fù)合支架。優(yōu)選地，復(fù)合支架被機(jī)體再吸收的速度近似于組織替代復(fù)合支架的速度。就是說(shuō)，與組織替代復(fù)合支架速度相關(guān)的復(fù)合支架的再吸收速度必須是這樣的在所需的時(shí)間內(nèi)得以維持支架在結(jié)構(gòu)上的完整性。因此，本發(fā)明的裝置有利地平衡了生物降解能力、長(zhǎng)時(shí)間的重吸收和結(jié)構(gòu)完整性、促使組織生長(zhǎng)的能力之間特性的關(guān)系，所有這些性質(zhì)中的每一個(gè)在組織再生或修復(fù)中都是所希望的、有用的和必需的。
在另一個(gè)實(shí)施例中，希望通過(guò)使用聚合物混合物來(lái)形成能以梯度類(lèi)(gradient-like)結(jié)構(gòu)從一個(gè)組合物轉(zhuǎn)變成另一個(gè)組合物的構(gòu)造。有該梯度類(lèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架特別有利的在組織工程學(xué)應(yīng)用中用于修復(fù)或再生自然存在的組織的結(jié)構(gòu)，例如軟骨，如關(guān)節(jié)、半月板、隔膜、氣管等的軟骨。例如通過(guò)混合ε-己內(nèi)酯和乙交酯的彈性共聚物和由ε-己內(nèi)酯和丙交酯(即以大約5/95的摩爾比率)的彈性共聚物，可以形成可從較軟的海綿樣材料轉(zhuǎn)化到較堅(jiān)硬的硬質(zhì)材料的復(fù)合支架，以與從軟骨到骨的轉(zhuǎn)化相似的方式。顯然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員有了本發(fā)明的啟示后可以預(yù)見(jiàn)聚合物混合物可用作相似的梯度效應(yīng)、或者以提供不同的梯度，例如不同降解、應(yīng)力反應(yīng)或不同彈性的分布圖。
本發(fā)明被多孔基質(zhì)30包封的纖維20包括了選自以線、紗、網(wǎng)、帶、氈和無(wú)紡物形式的纖維。優(yōu)選地，纖維20是無(wú)紡纖維墊的形式。已知的濕-鋪(wet-lay)或干-鋪(dry-lay)的制備技術(shù)可以用于制備本發(fā)明復(fù)合支架的無(wú)紡纖維墊。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于形成復(fù)合支架的無(wú)紡纖維墊的纖維是由生物可降解的玻璃制成的。生物玻璃，一種含有磷酸鈣玻璃的硅酸鹽、或含有加入了不同量的鐵顆粒以控制降解時(shí)間的磷酸鈣玻璃，是可以被拉制成玻璃纖維并且用于制備纖維墊的例子。
優(yōu)選地，形成復(fù)合支架無(wú)紡纖維墊的纖維包括生物可降解聚合物、共聚物、或它們的混合物。生物可降解的聚合物可以選自聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、ε-聚己內(nèi)酯(PCL)、聚二噁烷酮(PDO)、或它們的共聚物和混合物。
采用一種加熱過(guò)程將復(fù)合支架的無(wú)紡墊的纖維和另一個(gè)聚合物一同熔化，可進(jìn)一步的增強(qiáng)復(fù)合支架的無(wú)紡墊的結(jié)構(gòu)完整性。例如生物可降解的熱塑聚合物或共聚物，諸如粉末形式的ε-聚己內(nèi)酯(PCL)，可以加入到無(wú)紡纖維墊中，然后在不影響纖維結(jié)構(gòu)的情況下適度熱處理熔化PCL顆粒。該粉末擁有低熔化溫度且在隨后的增加無(wú)紡纖維墊的抗張強(qiáng)度和切變強(qiáng)度的處理過(guò)程充當(dāng)粘合劑的角色。優(yōu)選的PCL顆粒粉末直徑在10-500μm的范圍內(nèi)，并優(yōu)選在10-150μm內(nèi)。附加粘合劑包括生物可降解的聚合物粘合劑，其選自聚乳酸(PLA)、聚二噁烷酮(PDO)和聚羥基乙酸(PGA)。
可選擇地，可以通過(guò)在另一生物可降解聚合物溶液中噴霧或浸漬涂布無(wú)紡纖維墊將纖維熔和到一起。
在一個(gè)實(shí)施方案中，形成無(wú)紡墊的細(xì)絲可以被共擠出以生成帶有鞘/核構(gòu)造的細(xì)絲。這些細(xì)絲包含生物可降解聚合物的鞘，這個(gè)鞘圍繞在含有另一種生物可降解聚合物的一個(gè)或多個(gè)核的周?chē)?。圍繞慢速降解核的快速降解鞘的細(xì)絲在例如組織生長(zhǎng)需要額外支撐的情況下是需要的。
本發(fā)明的多孔基質(zhì)30優(yōu)選是聚合物泡沫的形式。復(fù)合支架植入裝置的聚合泡沫可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的多種方法制備。例如聚合的起始材料可以通過(guò)凍干、超臨界溶劑發(fā)泡、注氣噴出、注氣成型或采用可提取材料(例如鹽，糖或其適宜的相似物)鑄模的方法形成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明復(fù)合支架裝置的聚合泡沫基質(zhì)可以由諸如凍干法的聚合物-溶劑相分離技術(shù)制得。然而，一種聚合物溶劑通?？梢杂靡韵滤姆N技術(shù)中的任何一種分離為兩相(a)熱誘導(dǎo)的凝膠/結(jié)晶作用；(b)非溶劑誘導(dǎo)的溶劑相和聚合物相分離；(c)化學(xué)誘導(dǎo)的相分離，和(d)熱誘導(dǎo)的旋節(jié)線分解。聚合物溶液以控制的方式被分離成兩個(gè)截然不同的相或者兩個(gè)雙連續(xù)相中。隨后溶劑相的移除通常會(huì)留下密度低于本體且孔為μm級(jí)的聚合物的多孔基質(zhì)。
制備這些泡沫所涉及的步驟包括為用于凍干的聚合物選擇適宜的溶劑，以及在溶液中制備均勻的聚合物溶液。然后將聚合物溶液進(jìn)行冷凍和真空干燥循環(huán)處理。冷凍步驟對(duì)聚合物溶液進(jìn)行相分離，而真空干燥步驟通過(guò)升華和/或干燥移除溶劑，這樣就留下了多孔的聚合物基質(zhì)，或者是相互連接的、開(kāi)室的(open-cell)、多孔的泡沫。
可以用于制備泡沫支架組分的適宜的溶劑包括但不限于，六氟異丙醇(HFTP)、環(huán)醚(例如四氫呋喃(THF)和二亞甲基氟化物(DMF))、丙酮、甲基乙基酮(MEK)、1，4-二噁烷、二甲基碳酸酯、苯、甲苯、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、氯仿和它們的混合物。在這些溶劑當(dāng)中，優(yōu)選的溶劑是1，4-二噁烷。聚合物在溶劑中的均勻溶液是用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道，優(yōu)選的溶劑系統(tǒng)僅僅溶解聚合物泡沫的生物可降解聚合物而不溶解復(fù)合支架無(wú)紡墊的纖維。
可實(shí)施的聚合物濃度和要用到的溶劑的量將根據(jù)每個(gè)系統(tǒng)而變化。通常，溶劑中聚合物的量以重量計(jì)算可以大約0.01％到大約90％變化，優(yōu)選按重量計(jì)算從大約0.1％到到約30％，根據(jù)諸如聚合物在給定溶劑中的溶解度和泡沫支架所需的最終性質(zhì)等因素而變化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以向聚合物-溶劑系統(tǒng)中加入一些固體以改變所得泡沫表面的組成。因?yàn)榧尤氲念w粒沒(méi)有在溶劑中而到了底部表面，就產(chǎn)生了含有加入固體成分但不含有泡沫聚合物材料的的區(qū)域。可選擇地，在所得復(fù)合支架中，所需區(qū)域(即臨近頂端、側(cè)面或者底部)中的加入固體的濃度可以更高，這樣，引起所有這些區(qū)域組成的改變。例如在選定位置固體物質(zhì)的濃度可以通過(guò)向裝在由磁性材料制成的模子中的溶劑中加入金屬固體來(lái)完成(或反過(guò)來(lái))。
許多類(lèi)型的固體可以加入到該聚合物-溶劑系統(tǒng)中來(lái)。優(yōu)選地，固體是一種不與聚合物或溶劑發(fā)生反應(yīng)的類(lèi)型。通常地，加入的固體平均直徑小于約1mm，優(yōu)選在約50到500微米之間。優(yōu)選地固體以占顆粒和聚合物-溶劑混合物總體積的大約1％到大約50％的百分體積的量存在(其中的總體積相當(dāng)于100體積％)。
示例性的固體包括但不限于用于骨修復(fù)的去除了礦物質(zhì)的骨頭顆粒、磷酸鈣顆粒、生物玻璃顆粒或碳酸鈣顆粒；用于產(chǎn)生孔的可濾去固體；和可以作為增強(qiáng)材料或者當(dāng)降解時(shí)可以產(chǎn)生孔的不溶于溶劑系統(tǒng)的生物可降解的聚合物顆粒、非-生物可降解材料、和生物學(xué)衍生的生物可降解材料。
合適的可濾去的固體包括無(wú)毒的可濾去材料，諸如鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、酒石酸鈉、檸檬酸鈉等等)、生物相容的單糖和二糖(例如葡萄糖、果糖、右旋葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖)、多糖(例如淀粉、藻酸鹽、殼聚糖)、水溶性蛋白質(zhì)(例如膠和瓊脂糖)?？蔀V去材料可以通過(guò)以下方法除去將可濾去材料與泡沫一起浸泡在溶劑中足夠長(zhǎng)的時(shí)間以充分除去所有這些顆粒，該溶劑能夠溶解該可濾去材料的顆粒，但不溶解或有害地改變泡沫。優(yōu)選的萃取溶劑是水，最優(yōu)選蒸餾-去離子水。優(yōu)選地，除非期望加速泡沫的降解，一般在濾去過(guò)程結(jié)束后在低溫和/或真空條件下干燥以使泡沫的水解降到最低。
合適的非-生物可降解材料包括生物可相容金屬，諸如不銹鋼、鈷鉻(coblaltchrome)、鈦和鈦合金；和生物惰性陶瓷顆粒(例如氧化鋁和氧化鋯顆粒)。進(jìn)而，非-生物可降解材料可以包括聚合物，諸如聚乙烯、聚乙烯醋酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅樹(shù)脂、聚環(huán)氧乙烷、聚乙二醇、聚氨酯；和天然生物聚合物(例如纖維素顆粒、殼多糖、角蛋白、絲和膠原質(zhì)顆粒)；以及氟化聚合物和共聚物(例如聚偏二氟乙烯)。
也可以加入能使復(fù)合支架對(duì)無(wú)線電不傳導(dǎo)的固體(例如硫酸鋇)。這些可加入的固體還包括那些可以促進(jìn)組織再生和再生長(zhǎng)的固體，還包括那些充當(dāng)緩沖劑、增強(qiáng)材料或孔隙改性劑的固體。
合適的生物材料包括小腸粘膜下層固體(SIS)顆粒、透明質(zhì)酸、膠原質(zhì)、藻酸鹽、硫酸軟骨素、殼聚糖和它們的混合物。這些固體可能包含生物材料的完整結(jié)構(gòu)或存在于完整結(jié)構(gòu)中的生物活性片段。
在植入到靶組織前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被接種或培植到本發(fā)明的復(fù)合支架上?？稍趶?fù)合支架上接種或培養(yǎng)的細(xì)胞包括但不限于，骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、滑膜衍生干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、臍帶沃頓膠質(zhì)細(xì)胞(umbilical Wharton’sjelly cell)、血管細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、源自脂肪組織的前體細(xì)胞、骨髓衍生祖細(xì)胞、腎細(xì)胞、腸細(xì)胞、胰島、β細(xì)胞、胰管祖細(xì)胞、支持細(xì)胞(Sertoli cell)、外周血祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、球細(xì)胞、角化細(xì)胞、髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞(fibrochondrocyte)、成熟組織源干細(xì)胞、卵形細(xì)胞(oval cell)、神經(jīng)原干細(xì)胞(neuronal stem cell)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬和遺傳轉(zhuǎn)移細(xì)胞或上述細(xì)胞的組合。在植入前，細(xì)胞可以接種到支架上經(jīng)歷較短的時(shí)間(＜1天)；或者培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(＞1天)以使得在植入之前，在接種了的支架內(nèi)能完成細(xì)胞繁殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
植入的部位依照需要治療的病患/受損的組織而定。例如為了治療關(guān)節(jié)軟骨、半月板和骨頭的結(jié)構(gòu)損傷，接種了細(xì)胞的復(fù)合支架被置于損傷部位以促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。
可選擇地，為了治療某種疾病，諸如糖尿病，接種細(xì)胞的支架可被置于便于臨床的部位，諸如皮下、腸系膜或網(wǎng)膜。在這種特殊情況中，復(fù)合支架作為運(yùn)載工具在體內(nèi)移植到異位部位后截留給予的胰島。
由于本發(fā)明的接種了細(xì)胞的復(fù)合支架在提供一種對(duì)于胰島長(zhǎng)期正常運(yùn)作所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和移植物血管的形成起作用的多孔結(jié)構(gòu)的同時(shí)，推動(dòng)了細(xì)胞—對(duì)—細(xì)胞的聯(lián)系，因此所給予細(xì)胞的定位為糖尿病的治療提供了很大的益處。
之前的在通過(guò)注射入門(mén)脈循環(huán)的直接的胰島移植的努力被證實(shí)對(duì)長(zhǎng)期治療糖尿病是不夠的。而且，多種包封有同基因的和異基因的胰島的生物可降解和非可降解微球的方法沒(méi)能長(zhǎng)期控制血液葡萄糖水平。這些失敗歸咎于由于移植的胰島的不充足的脈管和/或免疫排斥。
異基因的或同基因的胰島與異基因或同基因的支持細(xì)胞相結(jié)合的給藥可能可以避開(kāi)上述失敗。支持細(xì)胞可以幫助胰島存活和阻止對(duì)移植胰島的免疫應(yīng)答。在腎臟內(nèi)，異基因的、同基因的、或移植的支持細(xì)胞在免疫保護(hù)同基因的、異基因的胰島的同時(shí)，也可以保護(hù)它們自己。本發(fā)明接種了細(xì)胞的復(fù)合支架，在與支持細(xì)胞和胰島同時(shí)接種并進(jìn)行皮下植入，避免了腎臟(一個(gè)非常難達(dá)到的臨床部位)的使用。復(fù)合支架可以在提供形成血管生成床的條件的同時(shí)可共同定位兩種細(xì)胞以便支持細(xì)胞可以免疫保護(hù)臨近的胰島。
可選擇地，在植入異位部位之前，支持細(xì)胞可與復(fù)合支架一起培養(yǎng)，隨后的某一時(shí)間點(diǎn)將胰島給予到植入部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在植入體內(nèi)之前，胰島和支持細(xì)胞可以同時(shí)注射到復(fù)合支架上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在注射到支架上之前，胰島或支持細(xì)胞可以懸浮在生物聚合物之中，諸如透明質(zhì)酸、膠原質(zhì)、或藻酸鹽、或以商品名MARIGEL出售的膠原質(zhì)/層粘蛋白材料(Collaborative Biomedical Products，Inc.，Bedford，MA)；或者懸浮在合成的聚合物中，例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物，醇酸樹(shù)脂聚酯的水凝膠或者它們的聯(lián)合。
對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的情況，復(fù)合支架可以與成熟神經(jīng)干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的結(jié)合體一同接種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合支架可以與源自轉(zhuǎn)細(xì)胞體系，異種或異源組織的支持細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行接種。在加入神經(jīng)干細(xì)胞并植入到損傷部位之前，支持細(xì)胞可以在復(fù)合支架中進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法可以避免細(xì)胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用的一個(gè)主要障礙，也就是移植后干細(xì)胞的存活問(wèn)題。帶有大量支持細(xì)胞的復(fù)合支架可以提供一種更能適合于干細(xì)胞存活的環(huán)境。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，接種了細(xì)胞的復(fù)合支架可以通過(guò)物理或化學(xué)的方法改性，以使其含有可以促進(jìn)靶細(xì)胞類(lèi)型的粘附、增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的生物或人造因子。而且，生物因子也可以包含部分復(fù)合支架來(lái)控制這些因子的釋放，以誘導(dǎo)所需的生物學(xué)功能。另一個(gè)實(shí)施方案包括對(duì)可影響內(nèi)源性生長(zhǎng)因子正向調(diào)節(jié)的小分子的傳送。可以和當(dāng)前發(fā)明基質(zhì)一起使用的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、和生物活性相關(guān)的肽片斷，包括但不限于，TGF-β族成員，包括TGF-β1、2和3；骨形成蛋白質(zhì)(BMP-2、-4、6、-12和-13)；纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子1和2、血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA和-BB；富含血小板的血漿；胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、II)；生長(zhǎng)分化因子(GDF-5、-6、-8、-10)；血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子(VEGF)；多效蛋白(pleiotrophin)；內(nèi)皮素；煙堿；胰高血糖素樣肽-I和II；Exendin-4；視黃酸；甲狀旁腺激素；替拿素(tenascin)-C；彈性蛋白原；凝血酶衍生肽；層粘蛋白；包含粘附性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞連接區(qū)域和肝磷脂連接區(qū)域的生物肽，諸如纖維蛋白和玻連蛋白；和它們的組合。
生物活性因子可以通過(guò)商業(yè)途徑或從組織分離和純化得到。
而且，接種細(xì)胞的復(fù)合支架的聚合物和混合物可以當(dāng)作治療劑，或者藥物，釋放槽使用?？梢耘c本發(fā)明聯(lián)合使用的治療劑的種類(lèi)是多種的。通常，可以通過(guò)本發(fā)明組合物給藥的治療劑包括但不限于抗排斥藥；止痛劑；抗氧化劑；抗凋亡劑(anti-apoptotic agent)，例如促紅細(xì)胞生成素；抗炎藥，例如抗腫瘤壞疽因子α；抗-CD44；抗-CD3；抗-CD154；p38激酶抑制劑；JAK-STAT抑制劑；抗-CD28；acetoaminophen；曲尼斯特；細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，例如雷帕霉素；抗-IL2劑和它們的組合。
為了制得釋放槽，在形成復(fù)合物前，聚合物可以與一種治療劑混合。可選擇地，治療劑包衣到聚合物上，優(yōu)選使用藥用可接受的載體一起包衣。任何不溶解聚合物的藥用載體都可以使用。治療劑可以是液體、細(xì)分散固體或其他任一合適的物理形態(tài)。典型地，但不是任選地，釋放槽包括一種或多種添加劑，諸如稀釋液、載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等等。
治療劑的量依據(jù)具體使用的特定試劑和正在治療的醫(yī)學(xué)條件而定。有代表性的，治療劑的量占槽重量百分比的大約0.001％到大約70％，更典型地大約0.001％到大約50％，最典型地大約0.001％到大約20％。治療劑遞送槽使用的聚合物的量和類(lèi)型根據(jù)期望的釋放性質(zhì)和使用治療劑的量而變化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明細(xì)胞接種的復(fù)合支架可以經(jīng)受住在持續(xù)期和延長(zhǎng)期伴隨著治療劑釋放的逐漸降解(主要通過(guò)水解)。這將導(dǎo)致治療劑的傳送時(shí)間延長(zhǎng)，例如1到5000小時(shí)，優(yōu)選2到800小時(shí)，傳送的有效量為，例如0.0001毫克/千克/小時(shí)到10毫克/千克/小時(shí)。根據(jù)治療的病人、病情的嚴(yán)重程度、醫(yī)生的判斷等，如有需要可以給予這樣的劑型。根據(jù)相同或相似的方法，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備多種劑型。
移植物的結(jié)構(gòu)必須是對(duì)促進(jìn)組織生長(zhǎng)有效的。優(yōu)選的促進(jìn)組織生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)是這樣的一種結(jié)構(gòu)，復(fù)合支架組分的孔是開(kāi)放且具有足夠大的尺寸以允許細(xì)胞在此生長(zhǎng)。有效的孔尺寸是大約50到大約1000μm的平均直徑，更優(yōu)選大約50到大約500μm。
下面的實(shí)施例都是為了演示本發(fā)明的原理和實(shí)踐，但不限定本發(fā)明的范圍。許多本發(fā)明范圍和精神之內(nèi)的實(shí)施方案對(duì)所述領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
在實(shí)施例中，使用常規(guī)分析技術(shù)，聚合物和單體都按照化學(xué)組成、純度(NMR，F(xiàn)TIR)、熱量分析(DSC)和分子量予以定性。
聚合物或共聚物的固有粘度(I.V.，dL/g)的測(cè)定，是在30℃恒溫水浴中，使用0.1g/dL濃度的氯仿或六氟異丙醇作溶劑，將50孔的Cannon-Ubbelhode稀釋粘度計(jì)浸泡于其中而測(cè)定的。
在這些實(shí)施例中使用了某些縮寫(xiě)。包括用PCL代表聚ε-己內(nèi)酯；PGA代表聚乙交酯；PLA代表聚合的(L)丙交酯；PDO代表聚對(duì)-二噁烷酮。此外，共聚物前面的比率代表各個(gè)組成的摩爾百分率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備復(fù)合支架按照下述方法制備由90/10PGA/PLA纖維組成的針孔無(wú)紡墊(2mm厚)。90/10的PGA/PLA共聚物以紡紗的常規(guī)方法熔化—擠壓成連續(xù)的多絲紗，然后增加使其斷裂需要的力度、延長(zhǎng)性和能量。這些包含絲的紗的直徑大約是20μm。然后將紗剪斷并卷成均勻的的2英寸的長(zhǎng)度以形成2英寸的定長(zhǎng)纖維。
然后使用90/10的PGA/PLA共聚物定長(zhǎng)纖維制備一個(gè)干鋪的針孔無(wú)紡墊。這些定長(zhǎng)纖維都經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)紡機(jī)器打開(kāi)和梳毛處理。所得的墊子是蜘蛛網(wǎng)狀的定長(zhǎng)纖維的形式。這些蜘蛛網(wǎng)狀的定長(zhǎng)纖維都用針打孔來(lái)形成干鋪針孔無(wú)紡纖維墊。
墊子用乙酸乙酯沖洗60分鐘，然后在真空下干燥。
制備一種用以凍干成泡沫的聚合物溶液。用以制造泡沫組成的聚合物是由Birmingham Polymers Inc(Birminghan，AL)生產(chǎn)的35/65的PCL/PGA共聚物，固有粘度為1.45dL/g。稱出35/65的PCL/PGA，以5/95重量比存在于1，4-二氧雜環(huán)乙烷溶劑中。將聚合物和溶劑都放到一個(gè)燒杯中，將燒杯放到70℃的水浴中攪拌5小時(shí)形成溶液。然后使用抽提套管(特別粗糙、多孔的，ASTM170-220(EC)型號(hào))過(guò)濾溶液，保存濾液到燒杯中。
使用實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的冷凍干燥機(jī)，或凍干機(jī)(Model Duradry，F(xiàn)TS Kinetics，StoneRidge，NY)來(lái)制備復(fù)合支架。針孔無(wú)紡墊通過(guò)4英寸的鋁模制成4英寸長(zhǎng)。將聚合物溶液加入到模子中一時(shí)溶液覆蓋無(wú)紡墊，并在模子中達(dá)到2mm的。
組合模子放到凍干機(jī)器的架子上然后開(kāi)始冷凍干燥。本實(shí)施例使用的冷凍干燥的順序是1)-17℃下60分鐘，2)100mT真空下-5℃60分鐘，3)20mT真空下5℃60分鐘，4)20mT真空下20℃60分鐘。
循環(huán)結(jié)束后，從凍干機(jī)器中取出組合模子在真空條件下脫氣3到3小時(shí)。然后在氮?dú)鈼l件下保存該復(fù)合支架。
所得含無(wú)紡墊的復(fù)合支架被包封在聚合泡沫基質(zhì)中，并分布在其中。支架的厚度大約是1.5mm。
實(shí)施例2制備復(fù)合支架除凍干成泡沫的聚合物是購(gòu)自Birmingham Polymers Inc.，Birmingham，AL，固有粘度為1.45 dL/g的60/40PLA/PCL共聚物外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制造生物可降解的復(fù)合支架。。復(fù)合支架孔的大小通過(guò)水銀測(cè)孔計(jì)分析確定?？状笮?-300μm，平均大小為45μm。圖1是復(fù)合支架橫截面的電子掃描顯微照片(SEM)。此掃描顯微照片清楚的顯示凍干泡沫支架環(huán)繞并包封著無(wú)紡墊。
實(shí)施例3制備復(fù)合支架除凍干成泡沫的聚合物是購(gòu)自Birmingham Polymers Inc.Birmingham，AL，的固有粘度1.50dL/g的60/40PLA/PCL共聚物和固有粘度為1.45dL/g的35/65PLA/PGA共聚物的50∶50的混合物外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制造生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例4制備復(fù)合支架除凍干成泡沫的聚合物是固有粘度為1.50dL/g的60/40PLA/PCL的共聚物(購(gòu)自Birmingham Polymers Inc Birmingham，AL)，和固有粘度1.78dL/g的85/15PLA/PGA的共聚物(購(gòu)自Purac，lincolshine，IL)以70∶30混合的混合物外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制備生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例5制備復(fù)合支架除凍干成泡沫的聚合物是固有粘度為1.50dL/g的60/40PLA/PCL的共聚物(購(gòu)自Birmingham Polymers Inc Birmingham，AL)，和固有粘度為1.78dL/g的85/15PLA/PGA的共聚物(購(gòu)自Purac，lincolshine，IL)以30∶70混合的混合物外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制備生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例6制備復(fù)合支架除凍干成泡沫的聚合物是固有粘度為1.5dL的60/40PLA/PCL的共聚物(購(gòu)自Birmingham Polymers Inc Birmingham，AL)，和固有粘度1.78dL/g的85/15PLA/PGA的共聚物(購(gòu)自Purac，lincolshine，IL)以50∶50混合的混合物外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制備生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例7制備復(fù)合支架除干鋪針孔無(wú)紡墊由PDO纖維組成外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制備生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例8制備復(fù)合支架除干鋪針孔無(wú)紡墊由PGA纖維組成外，其余均依照實(shí)施例1的過(guò)程制備生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例9制備復(fù)合支架除干鋪針孔無(wú)紡墊由PGA纖維組成外，其余均依照實(shí)施例4的過(guò)程制備生物可降解的復(fù)合支架。
實(shí)施例10制備接種了細(xì)胞的復(fù)合支架本實(shí)施例演示了復(fù)合支架中的聚合物泡沫或干鋪針孔無(wú)紡墊對(duì)軟骨細(xì)胞體外反應(yīng)的影響。
如Buschmann等人在J.Orthop.Res.10，745，(1992)中敘述的那樣，原始軟骨細(xì)胞從牛肩分離制得。牛軟骨細(xì)胞在用10％胎牛血清(FCS)、10mM HEPES、0.1mM非必需氨基酸、20μg/ml的脯氨酸、50μg/ml的抗壞血酸維生素C、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和0.25μg/ml的兩性霉素B(生長(zhǎng)介質(zhì))進(jìn)行補(bǔ)充供給的Dulbecoo′s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM-高含量葡萄糖)中培養(yǎng)。每隔一天補(bǔ)充一半的介質(zhì)。
如實(shí)施例1，4，8和9所述制備復(fù)合支架。直徑長(zhǎng)5mm，厚1.5mm的復(fù)合支架，在70％的乙醇溶液中消毒20分鐘后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗5次。
通過(guò)在每個(gè)支架上加入細(xì)胞懸浮液(15微升)，剛分離的牛軟骨細(xì)胞以5×106細(xì)胞/支架的密度接種在24孔的低簇培養(yǎng)皿上。在加入1.5毫升的介質(zhì)前允許細(xì)胞放在支架上3個(gè)小時(shí)。在將一半樣品轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)堆以及將剩余的支架在靜態(tài)條件下培養(yǎng)之前，所有支架都在細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)7天。由NASA-所開(kāi)發(fā)的模擬微重力狀態(tài)的Slow Turning Lateral Vessel(STLV)旋轉(zhuǎn)生物-反應(yīng)器(Synthecon，Inc.，Houston，TX)在此項(xiàng)研究中應(yīng)用。每個(gè)生物—反應(yīng)器加載4個(gè)包含細(xì)胞的支架，且容器旋轉(zhuǎn)速度調(diào)整到與接種了細(xì)胞的支架重量增加相適應(yīng)。支架保持在一個(gè)連續(xù)的自由下落的階段。支架在37℃、5％CO2和95％空氣的氣體條件下在增濕溫育器中溫育6周。為了生物-反應(yīng)堆的培養(yǎng)，每隔一天更換一般的介質(zhì)(～50毫升)。每隔一天給六孔器皿中的靜置培養(yǎng)物添加介質(zhì)(5毫升)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)3個(gè)樣品通過(guò)組織學(xué)染色進(jìn)行評(píng)價(jià)。將不同時(shí)間點(diǎn)(第1、7、21和42天)所得到的支架都浸泡入10％的福爾馬林溶液中、植入石蠟中和使用ZEISSMICROSTONE進(jìn)行切面。聚合物支架中的細(xì)胞分布通過(guò)接種細(xì)胞24小時(shí)后的支架橫界面的蘇木精染色來(lái)測(cè)定。進(jìn)而，在硫酸鹽化的蛋白多糖存在下使用番紅-O(SO；硫酸鹽化的GAG’s)給截面染色，I型和II型膠原質(zhì)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。對(duì)原生牛的軟骨和皮膚也進(jìn)行I型和II型膠原質(zhì)染色以驗(yàn)證免疫染色的特異性。II型膠原質(zhì)用作軟骨-樣基質(zhì)的指針而I型膠原質(zhì)用作纖維樣基質(zhì)的指示。使用帶有Nikon CCD攝影機(jī)(Nikon，Japan)的Nikon Microphot-FXA顯微鏡得到電腦圖象。
實(shí)施例1，4，8和9中形成的復(fù)合支架，在生物反應(yīng)堆條件下培養(yǎng)了6周后得到其組織學(xué)切片(100X)。實(shí)施例4的包含了90/10的PGA/PLA無(wú)紡墊的復(fù)合支架，與實(shí)施例9的包含了100％PGA無(wú)紡墊的復(fù)合支架相比，顯示了均勻的細(xì)胞分布和蛋白多糖構(gòu)成。然而，在生物反應(yīng)堆條件下培養(yǎng)了6周的實(shí)施例1和8的復(fù)合支架的在GAG產(chǎn)品和細(xì)胞分布上沒(méi)有明顯的分化。這就意味著泡沫的成分和復(fù)合支架無(wú)紡墊的組成可以影響細(xì)胞的分布和細(xì)胞外基質(zhì)的組成。
總之，包封了無(wú)紡纖維墊的泡沫支架的結(jié)構(gòu)可支撐細(xì)胞遷移以及硫酸鹽化的蛋白多糖基質(zhì)的沉積。
實(shí)施例11制備細(xì)胞接種的復(fù)合支架本實(shí)施例演示了聚合物泡沫或復(fù)合支架的干鋪針孔無(wú)紡墊的成分影響體外的支持細(xì)胞反應(yīng)。
支持細(xì)胞獲自于9-12天大的雄性Balb/c鼠的睪丸。所有的睪丸都被收集到Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中，切成1mm的細(xì)片，然后37℃下在HBSS中使用膠原酶(2.5毫克/毫升；Sigma V型)消化10分鐘。使用包含1mmol/l EDTA和0.5％牛血清蛋白(BSA)且不含Ca2+/Mg2+的HBSS沖洗3次。37℃下在HBSS中使用胰島素(25μg/ml，Boehringer Mannheim)和脫氧核糖核酸酶Dnase(4μg/ml，BoehringerMannheim)消化10分鐘，隨后用HBSS沖洗四次。最后的細(xì)胞球重新懸浮在補(bǔ)充有10％熱-鈍化馬血清的M199介質(zhì)(Gibco Life Technologies，Rockville，MD)中，用500μm的過(guò)濾器過(guò)濾后在超低簇培養(yǎng)皿(Corning Inc，Corning，NY)中培養(yǎng)2天以允許支持細(xì)胞的聚集。
依照實(shí)施例1制備復(fù)合支架，接種120萬(wàn)小鼠支持細(xì)胞，在填充有10％熱鈍化馬血清、青霉素和鏈霉素的M199介質(zhì)中培養(yǎng)3周。3周后，裝置都用10％的緩沖福爾馬林浸泡，嵌入石蠟，使用Zeiss Microtome進(jìn)行切片。通過(guò)蘇木精和曙紅(H & E)染色來(lái)評(píng)定構(gòu)造中細(xì)胞的分布。圖2顯示了含有支持細(xì)胞復(fù)合支架的H & E切面。
實(shí)施例12制備復(fù)合支架依照下述制備由90/10的PGA/PLA纖維組成的針孔無(wú)紡墊(2mm厚)。使用常規(guī)紡紗方法將PGA/PLA(90/10)的共聚物熔化擠壓成連續(xù)的復(fù)絲紗然后增加斷裂所需的力度、延展性和能量。這些紗包含了直徑大約20μm的細(xì)絲。然后剪斷卷曲這些紗成均勻的2英寸長(zhǎng)，以形成2英寸的定長(zhǎng)纖維。
然后由90/10的PGA/PLA共聚物定長(zhǎng)纖維制成一個(gè)干鋪針孔無(wú)紡墊。定長(zhǎng)纖維在標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)紡機(jī)器上打開(kāi)和梳毛處理。所得的墊子是蜘蛛網(wǎng)狀的定長(zhǎng)纖維。蜘蛛網(wǎng)狀的定長(zhǎng)纖維都用針打孔以形成干鋪針孔、纖維性無(wú)紡墊。
用乙酸乙酯沖洗墊子60分鐘，然后在真空下干燥。
然后制備用于凍干成泡沫的60毫升的聚合物溶液。用于制造泡沫組分的聚合物是Birmingham Polymer Inc(Birmingham，AL)生產(chǎn)的固有粘度為1.45dL/g的35/65的PCL/PGA的共聚物。稱出重量比為0.25/99.25的35/65PCL/PGA在1，4-二氧雜環(huán)乙烷中的混合物。聚合物和溶液都放入燒杯中，然后將燒杯放入水浴中在70℃下攪拌5小時(shí)成溶液。然后使用抽提套管(特別粗糙、多孔的，ASTM170-220(EC)型號(hào))過(guò)濾溶液，保存濾液到燒杯中。
實(shí)驗(yàn)用的凍干機(jī)器，或冷凍干燥機(jī)器(Model Duradry，F(xiàn)TS Kinetics，StoneRidge，NY)，用來(lái)制備復(fù)合支架。大約10毫升的聚合物溶液加入到4英寸見(jiàn)方的鋁模中均勻地覆蓋模子的表面。針孔無(wú)紡墊浸泡在盛有剩余溶液的燒杯中直到完全浸透，然后將其放到鋁模中。剩余的聚合物溶液倒入模中以使溶液覆蓋無(wú)紡墊，并在模子中深度達(dá)到2mm。
將組合模具放到冷凍干燥機(jī)的架子上開(kāi)始冷凍干燥步驟。本實(shí)施例中使用的冷凍干燥步驟是1)-17℃下60分鐘，2)100mT真空-5℃下60分鐘，3)20mT真空5℃下60分鐘，4)20mT真空20℃下60分鐘。
循環(huán)結(jié)束后，從凍干機(jī)器中取出組合模具，在真空條件下脫氣2到3小時(shí)。復(fù)合支架然后在氮?dú)鈼l件下保存。圖3是復(fù)合支架橫界面的電子掃描顯微照片(SEM)。SEM清晰顯示了凍干泡沫支架?chē)@并包封著無(wú)紡纖維。
實(shí)施例13除了用于凍干制造復(fù)合支架泡沫部分的是重量比為0.5/99.50的35/65PCL/PGA(Birmingham，AL，固有粘度1.45dL/g)溶于1，4-二氧雜環(huán)乙烷溶液之外，其余均依照實(shí)施例12的過(guò)程制造一個(gè)生物可降解的復(fù)合支架。圖4是復(fù)合支架的橫界面的電子掃描顯微照片(SEM)。SEM清晰地顯示了凍干泡沫支架?chē)@和包封著無(wú)紡纖維。
實(shí)施例14除了用于凍干制造復(fù)合支架泡沫部分的是重量比為1/99的35/65PCL/PGA(Birmingham，AL，固有粘度1.45dL/g)溶于1，4-二氧雜環(huán)乙烷溶液之外，其余均依照實(shí)施例12的過(guò)程制造一個(gè)生物可降解的復(fù)合支架。圖5是復(fù)合支架的橫界面的電子掃描顯微照片(SEM)。SEM清晰地顯示了凍干了的泡沫支架?chē)@和包封著無(wú)紡纖維。
實(shí)施例15制備細(xì)胞接種的復(fù)合支架本實(shí)施例演示了接種鼠科動(dòng)物胰島到按照實(shí)施例12制備的復(fù)合支架上。
鼠科動(dòng)物胰島都是通過(guò)膠原酶消化胰島和采摘胰島后密度梯度離心方法分離自Balb/c小鼠。復(fù)合支架(直徑8mm，厚2mm)放在包含多個(gè)直徑大小為7.75mm孔的特制的聚四氟乙烯模具中。500個(gè)新鮮的胰島作為覆蓋支架表面的細(xì)胞懸浮液(100微升體積)加入。含有細(xì)胞接種結(jié)構(gòu)的模子在300RPM下離心1分鐘。將這些結(jié)構(gòu)從孔中移除。置于規(guī)則的細(xì)胞培養(yǎng)平板上，在含有由牛血清蛋白(0.5％)、煙堿(10mM)、D-葡萄糖(10mM)、L-谷氨酸鹽(2mM)、IBMX(3-異丁基-甲基黃嘌呤，50mM)和青霉素/鏈霉素補(bǔ)給的Hams-F10(Gibco LifeTechologies，Rockville，MD)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。使用Live/Dead化驗(yàn)工具(Molecular Probes，Oregon)對(duì)細(xì)胞接種的結(jié)構(gòu)染色來(lái)促進(jìn)生存能力。如圖6所示，多數(shù)的胰島存活并均勻地分布在整個(gè)支架中。
權(quán)利要求
1.可植入地，生物可相容的支架，包括生物相容的、多孔的聚合物基質(zhì)；被包封且裝在所述聚合物基質(zhì)中的生物相容的、多孔的纖維墊；和植入到所述組織支架中的多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1支架，其中所述支架是生物可降解的。
3.權(quán)利要求1的支架，其中所述的聚合物基質(zhì)包含選自生物可降解的聚合物的聚合物，所述纖維墊包含選自包括生物可降解玻璃和含有磷酸鈣的陶瓷和生物可降解聚合物的材料的纖維。
4.權(quán)利要求3的支架，其中所述的聚合物基質(zhì)和所述纖維墊包含生物可降解聚合物。
5.權(quán)利要求4的支架，其中所述生物可降解聚合物選自包含脂肪族聚酯、聚亞烷基草酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚草酸酯、聚酰胺酯、聚酐和聚膦腈的均聚物和共聚物。
6.權(quán)利要求5的支架，其中所述纖維墊包含90/10的聚乙交酯/聚丙交酯的共聚物。
7.權(quán)利要求5的支架，其中所述的纖維墊包含聚二噁烷酮，必需對(duì)制備基質(zhì)的聚合物溶液的重量百分比加以限定0.1-10wt％，優(yōu)選0.1-5wt％。
8.權(quán)利要求5的支架，其中所述的聚合物基質(zhì)包含摩爾比率范圍在大約95/5到大約85/15的聚丙交酯/聚乙交酯的共聚物。
9.權(quán)利要求6的支架，其中所述的多孔的、聚合物基質(zhì)包含摩爾比率為大約35/65到大約45/55的聚己內(nèi)酯/聚乙交酯的共聚物。
10.權(quán)利要求9的支架，其中所述的多孔的聚合物基質(zhì)包含泡沫。
11.權(quán)利要求5的支架，其中所述的多孔的聚合物基質(zhì)包含摩爾比率范圍在大約35/65到大約65/35的聚丙交酯/聚己內(nèi)酯的共聚物。
12.權(quán)利要求1的支架，其中所述的纖維墊包含以選自包括線、紗、網(wǎng)、帶、氈和無(wú)紡品形式的纖維。
13.權(quán)利要求1的支架，其中所述的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、滑膜衍生干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、血管細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、源自脂肪組織的前體細(xì)胞、骨髓衍生祖細(xì)胞、腎細(xì)胞、腸細(xì)胞、胰島、β細(xì)胞、支持細(xì)胞、外周血祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、球細(xì)胞、角化細(xì)胞、髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞、成熟組織源干細(xì)胞、卵形細(xì)胞、神經(jīng)原干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬和遺傳轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的支架，其中所述的細(xì)胞選自胰島和支持細(xì)胞。
15.權(quán)利要求13的支架，其中所述的細(xì)胞選自成熟的神經(jīng)原干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的支架，進(jìn)一步包括生物因子。
17.權(quán)利要求16的支架，其中所述的生物因子是選自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-12和BMP-13、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、血小板衍生的生長(zhǎng)因子-AA、血小板衍生的生長(zhǎng)因子-BB、富含血小板的血漿、IGF-I、IGF-II、GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子、多效蛋白、內(nèi)皮素、煙堿、胰高血糖素樣肽-I和胰高血糖素樣肽-II、Exendin-4、視黃酸、甲狀旁腺激素、替拿素-C、彈性蛋白原、凝血酶衍生肽、層粘蛋白、包含細(xì)胞連接區(qū)域的生物肽和包含肝磷脂連接區(qū)域的生物肽。
18.權(quán)利要求1的支架，進(jìn)一步包含治療劑。
19.權(quán)利要求18的支架，其中所述的治療劑選自抗排斥藥、止痛劑、抗氧化劑、抗凋亡劑、促紅細(xì)胞生成素、抗炎藥、抗腫瘤壞疽因子α、抗-CD44、抗-CD3、抗-CD154、p38激酶抑制劑、JAK-STAT抑制劑、抗-CD28、acetoaminophen、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、雷帕霉素和抗-IL2劑。
20.治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括給所述動(dòng)物植入生物可降解的支架，所述支架包括生物相容的、多孔的聚合物基質(zhì)，被包封和裝在所述聚合物基質(zhì)中的生物相容的、多孔的纖維墊；和接種在所述組織支架上的多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的支架是生物可降解的。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述的聚合物基質(zhì)包含選自生物可降解的聚合物的聚合物，所述纖維墊包含選自含有生物可降解玻璃和含有磷酸鈣的陶瓷和生物可降解聚合物的材料制成的纖維。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述的聚合物基質(zhì)和纖維墊包含生物可降解聚合物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物可降解聚合物選自包含脂肪族聚酯、聚亞烷基草酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚草酸酯、聚酰胺酯、聚酐和聚膦腈的均聚物和共聚物。
25.權(quán)利要求24的支架，其中所述纖維墊包含90/10的聚乙交酯/聚丙交酯的共聚物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述聚合基質(zhì)包含摩爾比率為大約35/65到大約45/55的聚己內(nèi)酯/聚乙交酯的共聚物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的聚合物基質(zhì)包含泡沫。
28.權(quán)利要求20的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、滑膜衍生干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、臍帶沃頓膠質(zhì)細(xì)胞、血管細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、源自脂肪組織的前體細(xì)胞、骨髓衍生祖細(xì)胞、腎細(xì)胞、腸細(xì)胞、胰島、β細(xì)胞、胰管祖細(xì)胞、支持細(xì)胞、外周血祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、球細(xì)胞、角化細(xì)胞、髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞、成熟組織源干細(xì)胞、卵形細(xì)胞、神經(jīng)原干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬和遺傳轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
29.權(quán)利要求20的方法，其中所述的疾病是糖尿病。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的支架接種了支持細(xì)胞和胰島。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述的裝置進(jìn)一步包含生物因子。
32.治療哺乳動(dòng)物結(jié)構(gòu)缺陷的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物植入生物相容的支架，所述支架包括生物相容的多孔的聚合物基質(zhì)，被包封和裝在所述聚合物基質(zhì)中的生物相容的、多孔的纖維墊；和接種在所述組織支架上的多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的支架是生物可降解的。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞選自包括骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、滑膜衍生干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、臍帶沃頓膠質(zhì)細(xì)胞、血管細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、源自脂肪組織的前體細(xì)胞、骨髓衍生祖細(xì)胞、腎細(xì)胞、腸細(xì)胞、胰島、β細(xì)胞、胰管祖細(xì)胞、支持細(xì)胞、外周血祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、球細(xì)胞、角化細(xì)胞、髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞、成熟組織源干細(xì)胞、卵形細(xì)胞、神經(jīng)原干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬和遺傳轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)缺陷是在選自包括關(guān)節(jié)軟骨、半月板和骨的組織中的。
全文摘要
可植入的、生物相容的、包含生物相容的、多孔的、聚合物基質(zhì)的支架，被包封和裝在所述聚合物基質(zhì)中的生物相容的、多孔的纖維墊和接種到所述組織支架上的多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明也涉及利用本發(fā)明支架治療疾病或結(jié)構(gòu)缺陷的方法。
文檔編號(hào)A61L27/56GK1568903SQ200410071480
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者A·列扎尼亞, M·齊默曼 申請(qǐng)人:生命掃描有限公司