用于蛋白質(zhì)沉淀的共聚物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于蛋白質(zhì)沉淀的共聚物
[0001] 本發(fā)明涉及使用共聚物從細(xì)胞培養(yǎng)液中提純目標(biāo)分子，如重組和/或生物治療蛋 白質(zhì)以便捕獲或澄清化。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的共聚物包含疏水殘基和陰離子殘基。
[0002] 發(fā)明背景 單克隆抗體(mAb)廣泛用于臨床用途、診斷系統(tǒng)和不同的研宄領(lǐng)域。自1986年生產(chǎn)首 個(gè)獲批的mAb以來(lái)，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)已獲得巨大發(fā)展。迄今，用 于mAb生產(chǎn)的主要是三種不同的細(xì)胞系：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CH0)、小鼠骨髓瘤（NS0)和Sp2/0 細(xì)胞，同時(shí)在5000至25000升的生物反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn)?？贵w和生物治療蛋白質(zhì)的下游 處理一般使用一系列提純步驟，以收獲發(fā)酵罐的產(chǎn)物(例如使用碟片式離心機(jī)（diskstack centrifuge))開(kāi)始，接著通過(guò)深度過(guò)濾系統(tǒng)和膜過(guò)濾系統(tǒng)澄清化。此后，使用幾個(gè)色譜分離 步驟，以最初使用親和色譜法用蛋白質(zhì)A捕獲開(kāi)始，接著是陰離子交換色譜法和陽(yáng)離子交 換色譜法。另外的色譜分離步驟可包括疏水或親水作用色譜法和尺寸排阻色譜法。通過(guò)低 ph洗脫實(shí)現(xiàn)病毒滅活，且附加的過(guò)濾除去殘余病毒粒子。但是，與25年前的igr1相比如 今提高到i〇-i3gr1的細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)水平以及提高的經(jīng)濟(jì)壓力需要與現(xiàn)有色譜基系統(tǒng)的性 能相比具有更高收率和吞吐量的增強(qiáng)的提純方法。可通過(guò)提高色譜柱材料容量、柱尺寸或 開(kāi)發(fā)對(duì)色譜法的替代提純方法來(lái)滿足這些需求，它們應(yīng)該獲得相當(dāng)?shù)氖章屎图兌?，但降?成本并且更好地規(guī)?；?。對(duì)于大規(guī)模面積，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出分批提純法，其中從收獲的細(xì)胞溶液 中沉淀出所需蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)沉淀的常用方法因此是硫酸按沉淀（AS) (Venkiteshwaran, Heider等人，2008)、聚乙二醇（PEG)沉淀或使用辛酸作為沉淀劑（Wang,Diehl等人， 2009;Temponi,Kageshita等人，1989)。但是，在大規(guī)模提純中使用PEG或AS需要大量 的這些沉淀劑和更高的蛋白質(zhì)濃度，僅產(chǎn)生中等純度級(jí)，生成高廢物負(fù)荷。現(xiàn)有提純方法昂 貴、非常費(fèi)力、具有大緩沖容積和低吞吐量(色譜法)或缺乏足夠的純度和收率(沉淀)。在低 pH下從蛋白質(zhì)A中洗脫結(jié)合的mAb可形成免疫原性聚集體，除去它們和瀝濾蛋白質(zhì)A進(jìn)一 步提高成本。因此，迫切需要對(duì)蛋白質(zhì)A色譜法的替代方法以及對(duì)蛋白質(zhì)和抗體提純的改 進(jìn)。另外，抗體的片段抗原結(jié)合區(qū)在診斷學(xué)和治療中的應(yīng)用越來(lái)越受關(guān)注。為了獲得這樣 的片段，可以使用內(nèi)肽酶。用木瓜蛋白酶處理單克隆抗體是制造抗原結(jié)合片段或片段抗原 結(jié)合的常見(jiàn)方式，也導(dǎo)致生成Fc片段，代表抗體的恒定區(qū)。可以使用蛋白質(zhì)A親和色譜法 分離Fab和Fc，但是，由于蛋白質(zhì)A與衍生自屬于VH3亞家族的mAb的Fab的結(jié)合親合力， 這種分離技術(shù)對(duì)這種類(lèi)型的Fab而言無(wú)法勝任。人源化mAb極大依賴(lài)于具有VH3豐度的基 因序列。另外，人噬菌體展示庫(kù)表現(xiàn)出VH3's的大量存在。因此，需要用于分離Fab和Fc片 段的替代策略。改性蛋白質(zhì)A是一種選項(xiàng)，但相當(dāng)成本密集。
[0003] 最近尋求的方法是使用聚合物作為沉淀劑，其可用于更大量的抗體而不需要定 制。
[0004] US6, 927, 282公開(kāi)了具有不同電荷密度的陰離子聚合物用于聚合物絮凝的用途。 US5, 922, 531涉及用聚合電解質(zhì)層處理的可控孔徑玻璃（controlledporeglass)用于蛋 白質(zhì)吸附的用途。WO2008/079280公開(kāi)了使用在某些條件下可溶并在條件改變時(shí)從溶液中 沉淀出來(lái)的聚合電解質(zhì)。
[0005] WO2008/091740公開(kāi)了聚陰離子或聚陽(yáng)離子聚合物用于蛋白質(zhì)沉淀的用途。
[0006] 這表明使用聚合物作為沉淀劑的方法受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而找出足夠有效以 適用于生物制藥生產(chǎn)的方法仍成問(wèn)題。此外，對(duì)不同目標(biāo)分子調(diào)節(jié)和優(yōu)化該程序仍成問(wèn)題。 [0007] 發(fā)明概沐 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有陰離子性質(zhì)和疏水性質(zhì)的聚合物-所謂的陰離子混合型聚合物_ 是用于蛋白質(zhì)沉淀的理想聚合物。通過(guò)使用包含疏水基團(tuán)和陰離子基團(tuán)的聚合物，可以以 高達(dá)90%的收率和更高的抗體回收率以良好純度從澄清的細(xì)胞培養(yǎng)基中沉淀出抗體。
[0008] 本發(fā)明因此涉及一種從樣品中分離或離析目標(biāo)分子的方法，其包括： a) 提供所述樣品 b) 將一種或多種包含疏水基團(tuán)和陰離子基團(tuán)的共聚物添加到所述樣品中，由此形成 目標(biāo)分子-共聚物沉淀物 c) 從步驟b)的混合物中分離沉淀物。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該共聚物包含35至65%陰離子基團(tuán)。
[0010] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該陰離子基團(tuán)包含磺酸、硫酸、羧酸和/或膦酸或磷酸。
[0011] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該疏水基團(tuán)包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、鹵素取代的烷 基、芳基、雜芳基和/或鹵素取代的芳基或雜芳基。
[0012] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該共聚物具有10. 000至120. 000g/mol的重均分子量和 /或1，05-2, 50的多分散性。
[0013] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該目標(biāo)分子是抗體。
[0014] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該目標(biāo)分子是抗體的Fc(片段恒定區(qū))部分或Fab(片段 抗原結(jié)合）區(qū)。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟a)中，將該樣品的pH調(diào)節(jié)到目標(biāo)分子的等電點(diǎn)以 下和如果適用，應(yīng)與其分離的該樣品的其它組分的等電點(diǎn)以上的pH。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟a)中，將該樣品的pH調(diào)節(jié)到4至5. 5之間的pH。
[0017] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將該樣品的離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)到在20°C下測(cè)得的類(lèi)似于 17mS/cm或更低的電導(dǎo)率。
[0018] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在附加步驟d)中，將來(lái)自步驟c)的沉淀物再溶解。
[0019] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，用二氧化硅或玻璃薄片處理步驟d)的再溶解混合物。
[0020] 在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該二氧化硅或玻璃薄片用DMAE和/或TMAE基團(tuán)官能化。
[0021] 附圖 圖1顯示用于本發(fā)明的方法的共聚物的不同類(lèi)型的合適結(jié)構(gòu)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0022] 圖2顯示作為光譜疊加的中紅外光譜以比較 a) 已用本發(fā)明的提純技術(shù)處理的單克隆抗體Cetuximab(西妥昔單抗） b) 未經(jīng)沉淀的單克隆抗體Cetuximab的二級(jí)結(jié)構(gòu) 并表明該抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)在沉淀后沒(méi)有明顯改變。
[0023] 圖3顯示 a) 未沉淀的單克隆抗體 b) 用本公開(kāi)的提純技術(shù)處理的沉淀和再溶解的單克隆抗體 在生物層干涉測(cè)量（BLI)后的傳感圖， 其表明沉淀和未沉淀抗體的結(jié)合親合力沒(méi)有差異。紅線代表將數(shù)據(jù)全局?jǐn)M合到1:1相 互作用模型。使用Octet Red. Kinetics收集在含相同抗原的孔（6、4、3、2和1 nM)中測(cè) 得的未沉淀和沉淀抗體的數(shù)據(jù)。
[0024] 定義 在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，要理解的是，本發(fā)明不限于具體組成或方法步驟，因?yàn)檫@些可 變。必須指出，除非上下文清楚地另行規(guī)定，本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用的單數(shù)形式 "一"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)對(duì)象。因此，例如，提到"一配體"包括許多配體，提到"一抗 體"包括許多抗體，諸如此類(lèi)。
[0025] 除非另行定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所涉領(lǐng)域中的普通 技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所述，為本發(fā)明的目的定義下列術(shù)語(yǔ)。
[0026] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"目標(biāo)分子"是指應(yīng)與樣品中的一種或多種其它組分，例如雜質(zhì)隔 離、分離或提純的任何分子、物質(zhì)或化合物。目標(biāo)分子的實(shí)例是抗體、抗原結(jié)合片段（Fab)、 片段恒定區(qū)（Fc)、蛋白質(zhì)、肽、重組蛋白質(zhì)、其它天然化合物、其它生物制藥化合物、疫苗或 生物制藥化合物的聚集體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該目標(biāo)分子是生物分子，優(yōu)選蛋白質(zhì)。 在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，該目標(biāo)分子是抗體。該目標(biāo)分子通常是應(yīng)通過(guò)采用本發(fā)明 的方法分離的產(chǎn)物，但也可以使用本發(fā)明的方法沉淀不是待分離的產(chǎn)物的目標(biāo)分子。在這 種情況中，該目標(biāo)分子是應(yīng)除去的組分，而最終產(chǎn)物留在上清液中并通過(guò)除去目標(biāo)分子來(lái) 提純。當(dāng)利用本發(fā)明提純和分離Fab和Fc片段時(shí)，沉淀的目標(biāo)分子例如可以是想要的產(chǎn)物， 但也可以