專利名稱：天然抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)及其用途的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?8806532.0、申請(qǐng)日1998年6月2日、發(fā)明名稱為“天然抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)及其用途”的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及到在醫(yī)藥領(lǐng)域有用的、抑制腫瘤細(xì)胞和病毒增殖的、發(fā)揮抗腫瘤效果以及抗病毒效果的來自天然的新的化合物，以及該化合物的制造方法、用途和產(chǎn)生它的細(xì)胞。
更詳細(xì)地說本發(fā)明涉及到從取自人胎盤蛻膜的細(xì)胞株，代表性的是從TTK-1細(xì)胞進(jìn)一步克隆的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制(NS)細(xì)胞(CD57+HLA-DRbrightNS細(xì)胞株(TTK-1))(以下略記為[NS細(xì)胞])的培養(yǎng)產(chǎn)物、其制造方法、其用途以及該NS細(xì)胞。
在癌化療領(lǐng)域中，人們嘗試著將博萊霉素(Bleomycin)以及阿霉素(Adriamycin)等許多微生物的代謝產(chǎn)物應(yīng)用于臨床，而實(shí)際上臨床上正在使用這些代謝物。
然而，這些代謝物對(duì)各種腫瘤的療效未必充分，隨著腫瘤細(xì)胞對(duì)臨床上這些藥劑的耐藥性現(xiàn)象被弄清楚，它們臨床上的應(yīng)用性正變得復(fù)雜化[參照第47次日本癌學(xué)會(huì)總會(huì)記事，12頁(yè)～15頁(yè)(1988年)]。
另外，人們已經(jīng)弄清楚母系對(duì)胎兒的免疫反應(yīng)最初是在蛻膜組織被調(diào)節(jié)的，屬于帶有NK標(biāo)記的大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的大群細(xì)胞集積于包括初期妊娠的人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的蛻膜層中(森等，哺乳綱植入法中的免疫分子機(jī)制。內(nèi)分泌，J.41(增刊)S17[Mori，T et.al，Immunlmolecular mechanisms in mammalian implantation.Endocrine.J.41(Suppl)S17.])。
由于小鼠中的NS細(xì)胞含有WGA凝集素的受體，人體中的NS細(xì)胞含有CD57的糖鏈標(biāo)記，所以屬于LGL的NS細(xì)胞是與免疫T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞不同的細(xì)胞群。
有報(bào)道說由于NS具有能強(qiáng)烈抑制因MHC-非限制性分裂素引起的淋巴細(xì)胞的分裂反應(yīng)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等淋巴細(xì)胞分裂反應(yīng)的功能，所以NS細(xì)胞還有抑制癌細(xì)胞分裂的功能(Tilden等，免疫學(xué)雜志130卷，1171頁(yè))。
然而有關(guān)擔(dān)任NS細(xì)胞的免疫抑制作用、癌細(xì)胞的增殖抑制作用的物質(zhì)，雖然有人指出是TGF-β族的蛋白質(zhì)和分子量1萬以下的核糖醇那樣的物質(zhì)(Clark等人，免疫學(xué)雜志，144卷，3008頁(yè)(Clarket.al.，J.Immunol)以及(Mortari等人，免疫學(xué)雜志，144卷，3037頁(yè)(Mortari et.al.，J.Immunol))，但現(xiàn)在正確的結(jié)構(gòu)和功能完全不清楚，人們一直期待著給予闡明。
作為與本發(fā)明化合物化學(xué)構(gòu)造近似的已知的具有抗腫瘤和抗病毒效果的化合物有氟尿嘧啶(Fluorouracil)(美國(guó)專利第2802005號(hào)和2885396號(hào))、脫氧氟尿苷(Doxifluridine)(美國(guó)專利第4071680號(hào))、喃氟啶(Tegafur)(英國(guó)專利第1168391號(hào))、疊氮胸苷(zidovudine；AZT)(德國(guó)專利第3608606號(hào))、雙脫氧腺苷(Didanosine；ddI)(歐州專利公開第206497號(hào)公報(bào))等。
雖然這些核酸系抗癌制劑、抗病毒制劑不只限于用于預(yù)料有效果的腫瘤細(xì)胞和病毒類，對(duì)人的正常細(xì)胞也有作用，但存在的細(xì)胞毒性高的副作用正成為社會(huì)化問題。
本發(fā)明是借鑒含有上述以前技術(shù)的課題后完成的發(fā)明，其目的在于從人細(xì)胞代謝產(chǎn)物中探索對(duì)已有抗腫瘤制劑和抗病毒制劑不能充分發(fā)揮效果的癌類以及病毒具有效果的物質(zhì)，提供對(duì)各種耐藥性癌具有治癌作用和抗病毒作用，對(duì)人正常細(xì)胞沒有傷害，副作用低的物質(zhì)。
本發(fā)明人為達(dá)到上述目的，進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了NS細(xì)胞株誘導(dǎo)K562、Molt4、U937、BeWo、GCIY人癌細(xì)胞程序死亡，抑制癌細(xì)胞的分裂反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株分泌的誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序化死亡的核酸系物質(zhì)(命名為AIF)，并進(jìn)行了分離、純化和確定其結(jié)構(gòu)。我們認(rèn)為這些物質(zhì)作為按照全新的設(shè)想作成副作用小的天然型抗癌制劑、抗病毒制劑以及其它藥品開發(fā)應(yīng)用是有可能。
本發(fā)明人通過培養(yǎng)取自具有產(chǎn)生式(1)化合物能力的人胎盤蛻膜的NS細(xì)胞，從其培養(yǎng)液(上清和細(xì)胞，特別是上清)提取式(1)化合物，根據(jù)需要作成醫(yī)藥上允許的鹽，得到式(1)
(式中R1是用 或 表示的基團(tuán)，R2代表氫原子、羥基或甲氧基)表示的化合物或其醫(yī)藥上允許的鹽，發(fā)現(xiàn)式(1)表示的化合物或其醫(yī)藥上允許的鹽具有誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序死亡，抑制癌細(xì)胞增殖反應(yīng)，具有抗腫瘤效果以及抗病毒效果，直至本發(fā)明完成。
即本發(fā)明涉及到上述式(1)(式中的R1和R2與上述定義相同)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或醫(yī)藥上允許的鹽、其制造方法、以上述式(1)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或醫(yī)藥上允許的鹽作為有效成分的醫(yī)藥，上述化合物的醫(yī)藥制造和治療上的使用，以及取自CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的來自人胎盤蛻膜的NS細(xì)胞。
附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1是化合物P1的NMR圖。
圖2是化合物P2的NMR圖。
圖3是化合物P3的NMR圖。
圖4是化合物P4的NMR圖。
圖5是化合物P5的NMR圖。
圖6是化合物P6的NMR圖。
圖7給出了AIF(P1)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。
圖8給出了AIF(P2)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。
圖9給出了AIF(P3)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。
圖10給出了AIF(P4)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。
圖11給出了AIF(P5)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。
圖12給出了AIF(P6)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。
圖13是本發(fā)明的NS細(xì)胞株的相差顯微鏡照片。
圖14(A～G)是表示DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。
圖15是表示NS細(xì)胞與靶細(xì)胞的間接共培養(yǎng)結(jié)果的曲線。
圖16(A，B)是表示AIF引起的靶細(xì)胞3H-胸腺嘧啶攝入抑制結(jié)果的曲線。
圖17(A，B)是表示由AIF引起的靶細(xì)胞DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。
圖18(A～C)是AIF的HPLC圖。
圖19是表示3H-胸腺嘧啶攝入抑制結(jié)果的曲線。
圖20是表示由AIF引起的靶細(xì)胞DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。
圖21(A～D)是表示由AIF引起的靶細(xì)胞DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。
圖22是表示由AIF對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑制效果的曲線。
圖23是表示由AIF引起的人胃組織萎縮的效果(A～B)以及DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果(C)的照片。
圖24是表示AIF對(duì)人T細(xì)胞白血病細(xì)胞的抑制效果的曲線。
以下就本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
首先就本說明書中涉及到的各種用語(yǔ)以及定義進(jìn)行說明。
式(1)化合物是通過物理和化學(xué)的方法從NS細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中分離、純化得到的程序化死亡誘導(dǎo)因子(AIF)，是用下式(1) (式中R1是用 或 表示的基團(tuán)，R2代表氫原子、羥基或甲氧基)表示的化合物，這些化合物由于是通過反相高速液相色譜進(jìn)行活性分級(jí)，所以被分別命名為P1、P2、P3、P4、P5和P6。
這里，所謂[P1、P2、P3、P4、P5和P6]，具體來說是分別指2′-O-脫氧尿苷、核糖胸腺嘧啶核苷、2′-O-甲基尿苷、脫氧胸腺嘧啶核苷、2′-O-次黃苷和2′-O-甲基鳥苷。
即在式(1)中，R1和R2分別為
和氫原子的化合物P1，分別為 和羥基的化合物P2，分別為 和甲氧基的化合物P3，分別為 和氫原子的化合物P4，分別為 和甲氧基的化合物P5，
分別為 和甲氧基的化合物P6。
以下給出了本發(fā)明代表性化合物的理化性狀。
a)P1的理化性狀性狀無色結(jié)晶分子式C9H12N2O5mp165℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 229[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7.2)，max，258.5nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖1中給出了P1的NMR譜。
溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。
酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.64[展開溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。
流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間20分鐘b)P2的理化性狀性狀無色結(jié)晶分子式C10H14N2O6mp183～185℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 259[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，267nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖2中給出了P2的NMR譜。
溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。
酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.66[展開溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。
流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間29分鐘c)P3的理化性狀性狀無色結(jié)晶分子式C10H14N2O6mp159℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 259[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，263nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖3中給出了P3的NMR譜。
溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。
酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)
Rf值0.72[展開溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。
流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間40分鐘d)P4的理化性狀性狀無色結(jié)晶分子式C10H14N2O5mp185℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 243[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，267nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖4中給出了P4的NMR譜。
溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。
酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制，Kieselgel60F254)Rf值0.69[展開溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。
流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間50分鐘e)P5的理化性狀性狀無色結(jié)晶分子式C11H14N4O5mp210～212℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 283[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，283nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖5中給出了P5的NMR譜。
溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。
酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.67[展開溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。
流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間64分鐘f)P6的理化性狀性狀無色結(jié)晶分子式C11H15N5O5mp218～220℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 298[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，pH11時(shí)258nm，pH1時(shí)256nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖6中給出了P6的NMR譜。
溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。
酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.59[展開溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]
高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。
流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間83分鐘以下給出了本發(fā)明細(xì)胞株的細(xì)胞學(xué)的性質(zhì)。
(1)細(xì)胞的形態(tài)大顆粒性淋巴細(xì)胞(LGL)(2)細(xì)胞的來源從妊娠7周令的人胎盤分離的蛻膜組織細(xì)胞(3)繼代培養(yǎng)能永久增殖(4)生長(zhǎng)因子需求性在不含有人正常子宮內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和肝素的培養(yǎng)基中是能夠增殖的。
(5)細(xì)胞維持、增殖條件、增殖依賴性本細(xì)胞株一般是在36～38℃、最好是在37℃的溫度條件下以及pH6.5～7.5，最好是7.0的條件下能良好地維持增殖。
(6)細(xì)胞增殖能力如果將本細(xì)胞的2×105個(gè)細(xì)胞/ml在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，3日后至少達(dá)到5×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度。
(7)功能從沒有雌激素和孕酮受體以及不分泌催乳激素可知不是蛻膜間質(zhì)細(xì)胞。產(chǎn)生核酸系功能物質(zhì)，抑制由MLR和分裂素刺激引起的淋巴細(xì)胞分裂反應(yīng)。
(8)菌落形式在平皿上形成菌落，但在瓊脂中不能形成菌落。
(9)冷凍保存于-70℃～-196℃下可以保存非常長(zhǎng)的時(shí)間。
(10)染色體的性狀著絲點(diǎn)位于染色體中央部位(11)通過染色體分析確認(rèn)來自人組織的細(xì)胞(12)染色體數(shù)99～100、107～108(13)細(xì)胞表面標(biāo)記由CD57陽(yáng)性、HLA-DR強(qiáng)陽(yáng)性看是免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
(14)維持和增殖用培養(yǎng)基于10％FCS+RPMI-1640培養(yǎng)液或除去脫氧胸腺嘧啶核苷的無血清培養(yǎng)基能良好地維持增殖。
為了得到本發(fā)明的細(xì)胞株，例如可以采用如下方法，即為了取得人胎盤蛻膜細(xì)胞，可以按照臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)第52卷、2745頁(yè)-2756頁(yè)(1973年)記載的方法進(jìn)行。方法的概要如下首先盡可能地?zé)o菌條件下采取人子宮內(nèi)膜或胎盤蛻膜(只要是人子宮內(nèi)組織哪種組織都可以，例如能很容易得到胎盤蛻膜部位是最好。)，洗凈后，用胰蛋白酶處理將細(xì)胞從結(jié)合組織上分離下來，收集獲得人胎盤蛻膜細(xì)胞。
本發(fā)明使用的細(xì)胞是來自CD57陽(yáng)性、HLA-DR強(qiáng)陽(yáng)性的人胎盤蛻膜細(xì)胞，只要是有產(chǎn)生式(1)化合物能力的細(xì)胞無論哪種細(xì)胞都可以，但最好是NS細(xì)胞或其克隆株、亞克隆株。本細(xì)胞株(NS)可以通過常規(guī)方法經(jīng)有選擇性地克隆得到。
例如在利用常規(guī)方法對(duì)NS細(xì)胞進(jìn)行克隆時(shí)，通過檢測(cè)式(1)化合物的產(chǎn)生量，就可以獲得式(1)化合物產(chǎn)生能力高的克隆株。具體來說，首先按照有限稀釋方法將1×105個(gè)TTK-1細(xì)胞稀釋到0～1個(gè)細(xì)胞/孔，于37℃、5％二氧化碳?xì)獯嬖谙逻M(jìn)行培養(yǎng)，選擇式(1)化合物產(chǎn)生能力高的克隆株。
另外本發(fā)明的細(xì)胞株保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào))，其生命研保藏號(hào)是FERM BP6350(原保藏日平成9年5月19日)(由國(guó)內(nèi)保藏FERMP-16233號(hào)移管(移管日平成10年5月13日))。
圖13給出了本發(fā)明的NS細(xì)胞株(TTK-1)的相差顯微鏡照片(400倍)。NS細(xì)胞株自身分泌昆布氨酸，附著于培養(yǎng)基，表現(xiàn)出LGL細(xì)胞株形態(tài)。
以下說明本發(fā)明化合物的制造方法。
將取自人胎盤蛻膜的細(xì)胞，有代表性的NS細(xì)胞接種于含有營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基上，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行有氧培養(yǎng)，從其培養(yǎng)液(上清和細(xì)胞，最好是上清)提取本發(fā)明的式(1)化合物，如果需要，可以作成醫(yī)藥上允許的鹽。
象上述那樣得到的取自人胎盤蛻膜的NS細(xì)胞可以在一般動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中按需要添加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具體來說是可以在含有20％的胎牛血清的通常的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
作為該細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基有BME培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基(Earle.Dulbecco，High-GEM)、Ham培養(yǎng)基(F-10、F-12)、ISKOF培養(yǎng)基、119培養(yǎng)基、L-15培養(yǎng)基、Mccoy5A培養(yǎng)基、NCTC135培養(yǎng)基、WilliamsE培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基等，只要是可培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基無論哪一種都可以，最好是RPMI-1640。
培養(yǎng)方法可以與一般的細(xì)胞株代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方法一樣進(jìn)行，無論是固體還是液體培養(yǎng)都可以。在液體培養(yǎng)時(shí)，使用靜置培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)等哪一種培養(yǎng)方法都可以，但振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等更好。在培養(yǎng)該細(xì)胞時(shí)，最好是使上述的培養(yǎng)基中的CO2的百分含量為5％左右。
有關(guān)培養(yǎng)基的pH是6～8，尤其是在中性附近更合適。培養(yǎng)可在30～40℃下進(jìn)行，最好是在37℃附近。培養(yǎng)時(shí)間因使用的培養(yǎng)基、pH、溫度條件等不同不能一概而論，通常是培養(yǎng)4～5日就可進(jìn)行該細(xì)胞的繼代。
為了從培養(yǎng)液中提取目的物質(zhì)式(1)化合物，可以適當(dāng)?shù)乩脧呐囵B(yǎng)物中提取微生物生產(chǎn)的代謝物中常用的分離手段。
通過單獨(dú)或聯(lián)合使用眾所周知的分離純化方法，例如溶劑萃取法、離子交換樹脂法、吸附或分配層析法、凝膠過濾法等可以純化生成的式(1)化合物。
從培養(yǎng)濾液進(jìn)行萃取純化時(shí)也可以適當(dāng)利用反相高速液相色譜和薄層色譜等。例如通過將硅膠柱層析、離子交換層析、親和層析、反相高速液相層析適當(dāng)?shù)亟M合能進(jìn)行高度地純化。
就象后面敘述的那樣(“本發(fā)明的可用性的確認(rèn)”一項(xiàng))，人們期待著本發(fā)明化合物能作為包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的腫瘤以及病毒性疾病的治療劑等醫(yī)藥。
另外本發(fā)明化合物雖然在生物體內(nèi)有被磷酸化后表現(xiàn)出藥理作用的可能性，不用說有關(guān)的磷酸化合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
適合本發(fā)明化合物，預(yù)期有治療效果的腫瘤不只是人的血癌、還有一般的胃癌、大腸癌等消化系統(tǒng)癌、肺癌等呼吸系統(tǒng)癌、卵巢癌、絨毛癌等生殖系癌等上皮性癌。
適合本發(fā)明化合物，預(yù)期有治療效果的病毒有人逆轉(zhuǎn)病毒系的HTLV、HIV等。
本發(fā)明的式(1)化合物在作為抗腫瘤制劑或抗病毒制劑可以使用時(shí)，其醫(yī)藥上允許的鹽也可以使用。
作為用式(1)表示的本發(fā)明化合物的無毒性鹽，有與鹽酸、硝酸、硫酸或磷酸等無機(jī)酸形成的鹽，與醋酸、檸檬酸或酒石酸等有機(jī)酸形成的鹽，與甲磺酸或p-甲苯磺酸等有機(jī)磺酸形成的鹽或與天冬氨酸、谷氨酸或賴氨酸等形成的鹽。
本發(fā)明化合物的醫(yī)藥上允許的鹽的制造方法可以使用將在有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域中通常使用的方法進(jìn)行適當(dāng)組合后形成的方法。具體講，如可以用酸性溶液對(duì)含有游離的本發(fā)明化合物的溶液進(jìn)行中和滴定等。
將本發(fā)明化合物作為抗腫瘤制劑或抗病毒制劑使用時(shí)的藥劑形態(tài)可以選擇各種形態(tài)，例如片劑、膠囊、散劑、顆粒制劑、液體制劑等口服制劑，以及將溶液、懸濁液等滅菌的液體狀非口服制劑等。本發(fā)明的制劑其有效成分含有本發(fā)明化合物(一種或數(shù)種)，根據(jù)需要可以含有載體、稀釋劑或成型劑等通常的各種添加物(醫(yī)藥組合物)。
固體制劑雖然可以直接作成片劑、膠囊、顆粒劑或粉末形態(tài)，但也可以使用適當(dāng)?shù)奶砑游镏圃臁?br> 作為添加物有乳糖、葡萄糖等糖類，例如玉米、小麥、大米等淀粉類，例如硬脂酸等脂肪酸，例如硅酸鈉、鋁酸鎂、無水磷酸鈣等無機(jī)鹽，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚(亞烷基)二醇等合成的高分子，例如硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等脂肪酸鹽、例如十八烷醇、苯甲醇等醇類，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙甲基纖維素等合成的纖維素衍生物，此外水、明膠、滑石、植物油、阿拉伯樹膠等通常用的添加物等。
這些片劑、膠囊、顆粒制劑、粉末等固體形制劑一般含有0.1～100重量％、最好含有5～100重量％的有效成分。
液體制劑在水、醇類或來自大豆油、花生油、芝麻油等植物油的油等液體狀制劑中使用通常用的適當(dāng)?shù)奶砑游?，可以制造成懸濁液、糖漿制劑、注射制劑等形態(tài)。
以非口服方式經(jīng)肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腫瘤內(nèi)注射給藥時(shí)所用的溶劑有注射用的蒸餾水、鹽酸利多卡因水溶液(肌肉內(nèi)注射用)、生理鹽水、葡萄糖水溶液、乙醇、靜脈內(nèi)注射用液體(例如檸檬酸、檸檬酸鈉等水溶液)、電解質(zhì)溶液(例如點(diǎn)滴靜脈輸入、靜脈內(nèi)注射用)等或它們的混合溶液。
這些注射制劑除了預(yù)先溶解的制劑以外，也可以采用用時(shí)溶解粉末或添加了適當(dāng)添加物的制劑形態(tài)。這些注射液通常含有0.1～10重量％、最好含有1～5重量％的有效成分。
口服的懸濁液制劑或糖漿制劑可以含有0.5～10重量％的有效成分。
本發(fā)明的制劑可以含有作為有效成分的本發(fā)明化合物的1種或數(shù)種，理想的有效成分的例子可以是本發(fā)明代表性的化合物P1～P6中的1種，最好是2～6種的組合。
本發(fā)明化合物的實(shí)際理想的給藥量可以根據(jù)使用的化合物的種類、配合的組合物的種類、適用的頻度以及可以治療的疾病的部位和患者的病狀適當(dāng)?shù)卦鰷p。
例如，每天每一個(gè)成年人的給藥量口服是10至500mg，非口服給藥最好是靜脈注射，每天是10至100mg。而給藥次數(shù)可因給藥方法和病狀不同而不同，可以一次或分成2至5次給藥。
確認(rèn)本發(fā)明的有用性取自人胎盤蛻膜組織的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性自然抑制(NS)細(xì)胞株誘導(dǎo)K562、Molt4、U937、GCIY、BeWo等人癌細(xì)胞程序死亡，抑制這些細(xì)胞的增殖。使用物理、化學(xué)方法對(duì)NS細(xì)胞產(chǎn)生的AIF進(jìn)行了分離和純化。AIF的活性測(cè)定是通過細(xì)胞攝入3H脫氧胸腺嘧啶核苷的能力和DNA片段化方法進(jìn)行的。首先NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清中的AIF的分離是通過使上清吸附于C18柱，然后再進(jìn)行洗脫。該粗提取物在薄層層析(TLC)展開，活性級(jí)分用反相高速液相色譜(HPLC)純化。
從HPLC得到的六個(gè)峰的成分(P1～P6)可以誘導(dǎo)K562、Molt4、U937、GCIY、BeWo癌細(xì)胞的死亡和抑制增殖，但來自人胎兒肺的正常WI-38細(xì)胞對(duì)這些癌細(xì)胞完全沒有傷害。這六個(gè)AIF的物理、化學(xué)的性質(zhì)表明是核酸或其衍生物，實(shí)際上通過FAB-MS、NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析確認(rèn)P1是2′-O-脫氧尿苷、P2是核糖胸腺嘧啶核苷、P3是2′-O-甲基尿苷、P4是脫氧胸腺嘧啶核苷、P5是2′-O-次黃苷，P6是2′-O-甲基鳥苷。在將這六種AIF給移植了人癌組織的鼠服用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也可確認(rèn)顯著的腫瘤萎縮效果。
將經(jīng)HPLC最后分離純化的AIF添加到靶癌細(xì)胞中，在研究試管內(nèi)的程序化死亡誘導(dǎo)能力的同時(shí)，研究AIF在接種了癌細(xì)胞的SCID小鼠的治療效果(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))。試管內(nèi)的實(shí)驗(yàn)下面為了顯示本發(fā)明的有用性，首先將與本發(fā)明有關(guān)的代表例NS細(xì)胞株和來自有代表性的各種人的癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞使用，測(cè)定由于直接或間接的共培養(yǎng)引起的相互作用。使用的細(xì)胞如下所示。
NS細(xì)胞株(TTK-1)(取自人胎盤蛻膜的細(xì)胞株)是從妊娠7周令的人胎盤蛻膜組織細(xì)胞的培養(yǎng)的細(xì)胞，是CD57陽(yáng)性、HLA-DR強(qiáng)陽(yáng)性的來自骨髓淋巴系組織的自然免疫抑制細(xì)胞。
Molt4(人T細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)K562(人成紅細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)U937(人組織性白血病細(xì)胞株)GcIY(人胃癌細(xì)胞株)BeWo(人絨毛癌細(xì)胞株)WI-38(來自人胎兒肺組織的正常細(xì)胞株)以上細(xì)胞是在10％FCS+RPMI-1640培養(yǎng)液或除去脫氧胸腺嘧啶核苷的無血清培養(yǎng)基上于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行繼代培養(yǎng)的細(xì)胞。
試驗(yàn)例1NS細(xì)胞株與Molt4/K562/U937/GcIY/BeWo/WI-38靶細(xì)胞直接共培養(yǎng)試驗(yàn)(直接反應(yīng))直接共培養(yǎng)試驗(yàn)使用NS、Molt4(人T細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、K562(人成紅細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、U937(人組織性白血病細(xì)胞株)、GcIY(人胃癌細(xì)胞株)、BeWo(人絨毛癌細(xì)胞株)和WI-38，于24孔板中各加入2ml培養(yǎng)液對(duì)NS(104、105、106)與Molt4/K562/U937/GcIY/BeWo/WI-38細(xì)胞(106)直接共培養(yǎng)24小時(shí)到48小時(shí)。
NS細(xì)胞株與靶細(xì)胞間的直接相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，提取細(xì)胞的DNA，在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。
其結(jié)果就象圖14A所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與Molt4 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶4中只有NS 106/孔，帶5中只有Molt4 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M帶是表示DNA大小的標(biāo)記物。
象圖14B所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與K562 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶4中只有K562 106/孔，帶5中只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。
象圖14C所示的那樣，帶1、2、3分別是K562細(xì)胞和細(xì)胞數(shù)為106、105、104/孔的Molt4共培養(yǎng)，帶4中只有Molt4 106/孔、帶5中只有K562 106/孔時(shí)，無論那種情況都沒引起DNA片段化。
象圖14D所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與BeWo 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶4只有NS 106/孔，帶5只有BeWo 106/孔，帶6是BeWo 106/孔與GcIY106/孔間共培養(yǎng)，帶7只有GcIY106/孔時(shí)，無論那種情況都看不到DNA片段化。
象圖14E所示的那樣，帶1、2、3、4分別是NS細(xì)胞數(shù)為103、104、105、106/孔與U937 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶7是Molt4 106/孔與U937106/孔間的共培養(yǎng)，帶8是只有Molt4 106/孔，帶6是只有U937106/孔，帶5是只有NS 106/孔時(shí)，都不會(huì)引起DNA片段化。
象圖14F所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與GcIY106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而在帶4只有GcIY106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。
象圖14G所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與WI-38 106/孔間的共培養(yǎng)，盡管接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，在靶細(xì)胞中也看不到DNA片段化。帶4只有WI-38106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)都不會(huì)引起DNA片段化。
即NS細(xì)胞株與Molt4、K562、BeWo、U937、GcIY細(xì)胞間的相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果是在培養(yǎng)24小時(shí)后能看到靶細(xì)胞的DNA片段化。另外靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
另外DNA片段化在K562與Molt4細(xì)胞間共培養(yǎng)，或是在Molt4與U937細(xì)胞間，以及BeWo與GcIY細(xì)胞間共培養(yǎng)，無論那種情況都不會(huì)發(fā)生。而即使NS細(xì)胞與WI-38正常細(xì)胞間的共培養(yǎng)也看不到DNA片段化。這表明NS細(xì)胞不會(huì)傷害人正常細(xì)胞。就是說NS細(xì)胞株能引起由于人癌細(xì)胞的特異的細(xì)胞程序死亡(DNA片段化)。
試驗(yàn)例2將NS細(xì)胞與靶細(xì)胞K562/Molt細(xì)胞加入到容器內(nèi)進(jìn)行的間接相互作用(間接共培養(yǎng))間接共培養(yǎng)安裝一個(gè)孔中底部成濾膜狀(直徑0.45μm)的細(xì)胞反應(yīng)用培養(yǎng)室，然后分別注入Molt4/K562(104)細(xì)胞。
于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)三天后，收集靶細(xì)胞，進(jìn)行3H脫氧胸腺嘧啶核苷攝入放射能法、臺(tái)盼藍(lán)攝入染色法、DNA片段化法，測(cè)定細(xì)胞間相互作用的結(jié)果。
在這個(gè)系統(tǒng)中，隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，72小時(shí)后可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞數(shù)的減少(圖15)。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示能通過容器室的微孔膜，低分子量的可溶性的引起靶癌細(xì)胞死亡的物質(zhì)是由NS細(xì)胞株產(chǎn)生的。
試驗(yàn)例3通過薄層層析(TLC)確認(rèn)由粗提取的AIF引起的3H脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入抑制以及DNA片段化試驗(yàn)將由NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上(BONDELUTE)，用乙腈和甲醇分離、洗脫保留在柱子上的物質(zhì)，利用氮?dú)馐谷軇]發(fā)，進(jìn)行濃縮干燥。柱子中保留的級(jí)分抑制K562/Molt4細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)DNA片段化。
利用TLC將該級(jí)分展開，即將用C18柱分離的物質(zhì)溶解在三氯甲烷∶甲醇(1∶1)溶液中之后，點(diǎn)到薄層板上，通過三氯甲烷∶甲醇∶蒸餾水(60∶40∶8)展開。展開后，在培養(yǎng)基中含有的級(jí)分被酚紅試劑的帶(Rf＝0.5)分為下級(jí)分部(Rf＜0.5，TLC-A)和上級(jí)分部(Rf＞0.5，TLC-B)，挑取相應(yīng)凝膠，利用三氯甲烷/甲醇分別萃取回收，用氮?dú)飧稍铩４_認(rèn)在TLC上酚紅(Rf＝0.5)位置上部存在的級(jí)分中存在抑制K562/Molt4細(xì)胞增殖(圖16A～B)，誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)(圖17A～B)。
作為對(duì)照，在所用的新鮮培養(yǎng)基、或靶細(xì)胞K562/Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清中看不到抑制靶細(xì)胞的增殖，或誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)的產(chǎn)生。然而在NS細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中能產(chǎn)生可以誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序化死亡(細(xì)胞死亡)的物質(zhì)(AIF)，通過TLC可以確認(rèn)在比酚紅移動(dòng)更快的級(jí)分中(酚紅Rf＝0.5)中存在AIF。
試驗(yàn)4用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷的抑制試驗(yàn)利用ODS-80TM柱(TOSOH)，通過在360分鐘內(nèi)使含有0.1％三氟乙酸的乙腈從0達(dá)到5％的濃度，以流速0.5ml/分進(jìn)行分離純化，同時(shí)通過OD214nm吸光度進(jìn)行測(cè)定。
來自得到的主要六個(gè)峰(1-6)(圖18A、HPLC圖)的樣品(7μg/ml)無論哪一種都抑制Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷。特別是取自峰1和峰4的樣品表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，各個(gè)峰稀釋到1/10濃度的混合樣品(0.7μg/ml)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性(圖19)。
就象圖19的柱M表示的那樣，它表現(xiàn)出了各個(gè)峰(AIF)的協(xié)同效果。
試驗(yàn)例5能夠誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化的AIF的界限量就象圖20A、20B表示的那樣，使取自通過HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(A7μg/ml、B7×3-2μg/ml)作用于5×105個(gè)Molt4細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，然后提取靶細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。雖然在7μg/ml和7×3-2μg/ml的濃度下能看到Molt4細(xì)胞的DNA片段化，但就象圖20C表示的那樣，在7×3-5μg/ml的低濃度下其作用已經(jīng)消失了。
試驗(yàn)例6用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞BeWo細(xì)胞的DNA片段化試驗(yàn)就象圖21A表示的那樣，使取自通過HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(21μg/ml)作用于BeWo細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，然后提取BeWo細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。無論那一個(gè)峰都能誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞的DNA片段化(圖21A)。
試驗(yàn)例7用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞U937細(xì)胞的DNA片段化試驗(yàn)就象圖21B表示的那樣，使取自通過HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(21μg/ml)作用于U937細(xì)胞48個(gè)小時(shí)后，然后提取U937細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。無論那一個(gè)峰都能誘導(dǎo)U937細(xì)胞的DNA片段化(圖21B)。
試驗(yàn)例8用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞GCIY細(xì)胞的DNA片段化試驗(yàn)就象圖21C表示的那樣，使取自通過HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(21μg/ml)作用于GCIY細(xì)胞48個(gè)小時(shí)后，然后提取GCIY細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。無論那一個(gè)峰都能誘導(dǎo)GCIY細(xì)胞的DNA片段化(圖21C)。
試驗(yàn)例9用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)人正常細(xì)胞WI-38的DNA片段化試驗(yàn)以人正常細(xì)胞WI-38作為靶細(xì)胞時(shí)，即使用3倍來自各個(gè)活性峰(1-6)的樣品量(63μg/ml)作用于該細(xì)胞，也看不到細(xì)胞增殖的抑制和DNA片段化(圖21D)。就象圖14G表示的那樣，這種現(xiàn)象與即使使NS細(xì)胞與WI-38細(xì)胞直接作用也不會(huì)傷害正常細(xì)胞的結(jié)果對(duì)應(yīng)。
這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重大的意義。即本發(fā)明人分離純化的AIF會(huì)引起癌細(xì)胞特異地程序化死亡(DNA片段化)，但對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有傷害，就是說患者服用后沒表現(xiàn)出副作用，表明可以作為理想的抗癌制劑進(jìn)行開發(fā)。
而以前的免疫抑制制劑是用阻礙淋巴細(xì)胞分裂的藥理作用表現(xiàn)其效果的，本發(fā)明化合物也是有可能作為免疫抑制制劑進(jìn)行開發(fā)的。
作為用HPLC的最終分離對(duì)照，對(duì)Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清或新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行與NS細(xì)胞株培養(yǎng)基完全相同的處理，最終加到HPLC上比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)從TTK-1培養(yǎng)基得到的那樣的活性峰(1-6)在對(duì)照的HPLC圖上不存在(圖18B、C)。
另外破壞NS細(xì)胞株本身提取的樣品的HPLC圖與NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清的圖相同。這表明NS細(xì)胞本身也含有與上清相同的活性峰(1-6)。
以上試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納如下。
(1)[NS細(xì)胞株誘導(dǎo)靶癌細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡]NS細(xì)胞株與Molt4、K562、BeWo、U937、GCIY細(xì)胞間的直接相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果，在培養(yǎng)24小時(shí)后能看到靶細(xì)胞的DNA片段化(圖14A.B.C.D.E.F)。
靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。另外DNA片段化在K562與Molt4細(xì)胞間共培養(yǎng)(圖14C)，或是在Molt4與U937細(xì)胞間，以及BeWo與GcIY細(xì)胞間共培養(yǎng)，無論那種情況都不會(huì)發(fā)生。而即使NS細(xì)胞與WI-38正常細(xì)胞間的共培養(yǎng)也看不到DNA片段化(圖14G)。這表明NS細(xì)胞不會(huì)傷害人正常細(xì)胞。就是說只有NS細(xì)胞株具有誘導(dǎo)人癌細(xì)胞特異程序死亡的能力。
(2)[NS細(xì)胞株將AIF釋放到培養(yǎng)上清中]在將NS細(xì)胞與K562/Molt細(xì)胞加入到培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行間接相互作用(間接共培養(yǎng))的系統(tǒng)中，隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，72小時(shí)后可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞數(shù)的減少(圖15)。另外也可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞的DNA片段化。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明能通過容器室的微孔膜的，低分子量的可溶性的能引起靶癌細(xì)胞死亡的物質(zhì)是由NS細(xì)胞株產(chǎn)生的。
(3)[通過薄層層析(TLC)確認(rèn)由粗提取的AIF引起的3H脫氧胸腺嘧啶核苷攝入抑制、誘導(dǎo)DNA片段化]將由NS(TTK-1)細(xì)胞株培養(yǎng)上清約50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上，用乙腈和甲醇對(duì)保留在柱子上的物質(zhì)進(jìn)行洗脫、濃縮干燥，得到的級(jí)分抑制K562/Molt4細(xì)胞的分裂、誘導(dǎo)DNA片段化。
再將該級(jí)分加到TLC上，在培養(yǎng)基中含有的處于酚紅試劑的帶(Rf＝0.5)以上的級(jí)分(Rf＞0.5，TLC-B)中存在抑制K562/Molt4細(xì)胞增殖(圖16A，B)，誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)(圖17A，B)。
作為對(duì)照，在所用的新鮮培養(yǎng)基(SFM)、既看不到靶細(xì)胞K562/Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清中抑制靶細(xì)胞的增殖，也沒有誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)的產(chǎn)生。
進(jìn)而在NS細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中能產(chǎn)生可以誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序死亡(細(xì)胞死亡)的物質(zhì)(AIF)，通過TLC可以確認(rèn)在比酚紅移動(dòng)更快的級(jí)分中(酚紅Rf＞0.5)中存在AIF。
(4)[用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞DNA片段化的誘導(dǎo)]由NS細(xì)胞培養(yǎng)上清500ml經(jīng)TLC粗純化的總的活性級(jí)分(TLC-B)再經(jīng)TSKgelODS-80TM柱(東曹)、反相HPLC分離提取。
得到主要的六個(gè)峰(1-6)(圖18A、HPLC圖)。當(dāng)測(cè)定3H-脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入能力時(shí)，來自(1-6)六個(gè)峰的樣品(7μg/ml)無論那一種都抑制Molt4細(xì)胞攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷(圖19)。就是說抑制Molt4細(xì)胞的分裂。特別是取自峰1和峰4的樣品表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，各個(gè)峰稀釋到1/10濃度的混合樣品(0.7μg/ml)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性。就象圖19的柱M表示的那樣，它表現(xiàn)出了各個(gè)峰(AIF)的協(xié)同效果。
(5)[能夠誘導(dǎo)靶細(xì)胞的DNA片段化能的AIF界限量]與各個(gè)活性峰(1-6)的抑制Molt4細(xì)胞分裂效果相對(duì)應(yīng)，取自各個(gè)峰(1-6)的樣品(7μg/ml)無論那一個(gè)都可誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化(圖20A)。
用經(jīng)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品7×3-2μg/ml作用于Molt4細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，確認(rèn)靶細(xì)胞的DNA片段化(圖20B)，但在7×3-5μg/ml的低濃度下其作用已經(jīng)消失了(圖20C)。
(6)如果使用BeWo、U937、和GCIY作為靶細(xì)胞，無論來自那個(gè)峰(1-6)的樣品(21μg/ml)以及稀釋到1/10的混合樣品(各2.1μg/ml)都可誘導(dǎo)靶細(xì)胞的DNA的片段化(圖21A、B、C)以人正常細(xì)胞WI-38作為靶細(xì)胞時(shí)，即使用3倍來自各個(gè)活性峰(1-6)的樣品量(63μg/ml)作用于該細(xì)胞，也看不到細(xì)胞增殖的抑制和DNA片段化(圖21D)。就象圖14G表示的那樣，這種現(xiàn)象與即使使NS細(xì)胞與WI-38細(xì)胞直接作用也不會(huì)傷害正常細(xì)胞的結(jié)果對(duì)應(yīng)。
這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重大的意義。即本發(fā)明人分離純化的AIF會(huì)引起癌細(xì)胞特異地程序化死亡(DNA片段化)，但對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有傷害，就是說患者服用后沒表現(xiàn)出副作用，表明可以作為理想的抗癌制劑進(jìn)行開發(fā)。對(duì)Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清或新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行與TTK-1培養(yǎng)基完全相同的處理，最終加到HPLC上比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)從TTK-1培養(yǎng)基得到的那樣的活性峰(1-6)在其HPLC圖上不存在(圖18B、C)。
另外破壞NS細(xì)胞株本身提取的樣品的HPLC圖與NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清的圖相同。這表明NS細(xì)胞本身也含有與上清相同的活性峰(1-6)。
如果歸納以上結(jié)果，可以得出AIF是由NS細(xì)胞株產(chǎn)生的、釋放到培養(yǎng)基中的物質(zhì)的結(jié)論。
(7)AIF的物理化學(xué)特性的研究和構(gòu)造確定用HPLC最終分離純化的AIF中的氨基酸或六碳糖的有無可以通過地衣酚硫酸反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)定性地研究。由于進(jìn)一步從UV光譜解析可以看到最大吸收值出現(xiàn)在260nm前后，所以判斷是核酸系物質(zhì)。分子量通過質(zhì)譜(FAB-MASS)推定。利用質(zhì)子核磁共振(NMR)法可以確定最終的構(gòu)造。
通過HPLC分離的AIF的各個(gè)活性峰(1-6)耐熱，茚三酮、地衣酚反應(yīng)呈陰性，表明是非蛋白質(zhì)類、非六碳糖類的物質(zhì)。
由于進(jìn)一步從UV光譜解析可以看到最大吸收值出現(xiàn)在260nm前后，所以判斷是核酸系物質(zhì)(圖7～12左上圖)。
因?yàn)榇_定了構(gòu)造解析的方向，所以進(jìn)行NS細(xì)胞的大量培養(yǎng)(約300L)，從最終的HPLC分離純化的各個(gè)峰(1-6)制備樣品。通過質(zhì)量分析(FAB-MASS)和核磁共振(NMR)法確定最終的構(gòu)造。AIF的活性峰1-6中，P1是2′-O-脫氧尿苷、P2是核糖胸腺嘧啶核苷、P3是2′-O-甲基尿苷、P4是脫氧胸腺嘧啶核苷、P5是2′-O-次黃苷，P6是2′-O-甲基鳥苷(圖右上畫面)。
AIF的各個(gè)活性峰(1-6)的分子量(+H)表示在質(zhì)量分析圖(圖7～12下的畫面)的箭頭的下方。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作為試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)已確認(rèn)AIF效果的血液癌細(xì)胞的代表，使用Molt4，而作為上皮性癌細(xì)胞的代表使用GCIY。
(1)向SCID鼠各20只接種大約108個(gè)人胃癌細(xì)胞(GCIY)，在腫瘤的直徑達(dá)到0.5cm(0.25cm2)時(shí)(約2周后)，分成4組，使用AIF在荷瘤鼠中進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，每組各有荷瘤鼠5只。
試驗(yàn)例1.
將含有上述經(jīng)TLC分級(jí)的6種核苷(AIF)樣品(TLC-B級(jí)分)溶解于磷酸緩沖液(PBS)后，每次將總量1mg(相當(dāng)于2′-O-脫氧尿苷90μg、胸腺嘧啶核苷110μg、2′-O-甲基尿苷135μg、脫氧胸腺嘧啶核苷322μg、2′-O-次黃苷226μg， 2′-O-甲基鳥苷116μg)溶解于0.5ml的PBS后，對(duì)荷瘤鼠各5只由靜脈(尾部靜脈)共18次(總量18mg)給藥。
作為對(duì)照，使用用TLC分級(jí)時(shí)得到的TLC上酚紅以下的級(jí)分，即不含6種核苷的樣品(TLC-A級(jí)分)，仍然是經(jīng)靜脈(尾部靜脈)共18次給藥。腫瘤的大小用長(zhǎng)徑×短徑的面積(面積)計(jì)量。圖22給出了第1周、第2周、第3周各5只鼠的腫瘤的平均大小。就象曲線表明的那樣，可以看出注入AIF組與對(duì)照組兩組的差異，注入AIF組與對(duì)照組相比，表現(xiàn)出有意義的很強(qiáng)的抑制腫瘤效果(在t檢測(cè)中P＜C.01)。
試驗(yàn)例2.
與試驗(yàn)例1一樣，將TLC-A、B各1mg溶解在0.3ml的PBS后，分3次(0.1ml/次)3天內(nèi)直接注入各5只荷瘤鼠的腫瘤內(nèi)，若是用含有TLC-B級(jí)分的6種核苷的樣品(組成量與實(shí)驗(yàn)1一樣)，結(jié)果使得腫瘤完全萎縮。若是用作為對(duì)照不含有AIF的TLC-A級(jí)分，完全不能誘導(dǎo)腫瘤的萎縮。(作為代表性的例子，圖23A、B給出了對(duì)照荷瘤鼠與治療鼠各一只以及切除腫瘤的AIF給藥組3例和對(duì)照組3例)。AIF引起腫瘤萎縮的機(jī)制就象圖23C表示的那樣AIF誘導(dǎo)DNA片段化，即經(jīng)細(xì)胞程序死亡使腫瘤死亡。
(2)向SCID鼠各30只接種大約108個(gè)人T細(xì)胞白血病(Molt4)，在腫瘤的直徑達(dá)到0.3cm(0.09cm2)時(shí)(約2周后)，分成2組，使用AIF在荷瘤鼠中進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)。
將3種AIF核苷(2′-O-脫氧尿苷、胸腺嘧啶核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷各400μg，三者合計(jì)1.2mg)溶解于0.5ml的PBS后，反復(fù)交替經(jīng)靜脈和直接向5只荷瘤鼠腫瘤內(nèi)給藥，共18次(總量21.6mg)。腫瘤的大小用長(zhǎng)徑×短徑的面積(面積)計(jì)量，追蹤3周。5只鼠中有3只鼠的腫瘤完全萎縮，其余的2只的腫瘤也被抑制到非常小。圖24的曲線給出了第1周、第2周、第3周各5只鼠的腫瘤的平均大小。而就象對(duì)照組曲線表示的那樣在注PBS的對(duì)照組中會(huì)引起腫瘤的增大，可以看出兩者之間完全有意義的差別(在t檢測(cè)中P＜0.001)。考察母系對(duì)胎兒的免疫反應(yīng)最初是在蛻膜組織被調(diào)節(jié)的。
認(rèn)為含有NK細(xì)胞標(biāo)記的LGL細(xì)胞的大群細(xì)胞團(tuán)集積在包括初期妊娠的人在內(nèi)的哺乳類的蛻膜層的現(xiàn)象通過本發(fā)明人的研究已經(jīng)被搞清楚了。大概這些NK細(xì)胞團(tuán)在胚盤胞的著床的局面起著重要的作用。就是說NK細(xì)胞在妊娠時(shí)不斷增殖，控制處于發(fā)育過程中的胎兒胎盤的形成。換句話說天然的癌免疫反應(yīng)在妊娠時(shí)就進(jìn)行著。
本發(fā)明人擁有的NS細(xì)胞株是本發(fā)明人從人妊娠3個(gè)月的蛻膜層克隆、建立的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制細(xì)胞。該細(xì)胞株不具有作為蛻膜間質(zhì)細(xì)胞特征的雌性激素和黃體酮受體，由于也不分泌催乳激素，可以認(rèn)為是從骨髓或淋巴系組織游離出來的細(xì)胞系譜。
作為NS細(xì)胞的具體的功能不只是抑制由MLR或分裂素刺激引起的淋巴細(xì)胞分裂反應(yīng)，最近抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用也有報(bào)道(Sugiura，K.，M.Inaba.，H.Ogata.，R.Yasumuzu.，E.E.Sardin.，K.Inaba.，S.Kuma，.R.A.Good.，and S.Ikehara.1990.Inhibition oftumor cell proliferation by natural suppressor cells present inmurine bone marrow.Canser.Res..502582)。該NS細(xì)胞基本上作為參與細(xì)胞分裂調(diào)控的效應(yīng)物質(zhì)雖然一直被認(rèn)為是TGF-β家族的蛋白質(zhì)(Clark，D.A.，K.C.Flanders.，D.Banwatt.，W.Millar-Book.，J.Manuel.，J.Stedronska-Clark.，and B.Rowley，1990.Murinepregnancy decidua produces a unique immunosuppressive moleculerelated to transforming grwth factor beta-2.J.Immunol.1443008)或分子量1萬以下的核糖醇那樣的物質(zhì)(Mortari，F(xiàn).，andS.K.Singhal.1988.Production of human bone marrow-derivedsuppressor factor Effect on antibody synthesis and lectin-activated cell prliferation.J.Immunol.1413037)，但其實(shí)體還不清楚。作為由NS細(xì)胞引起的免疫抑制作用機(jī)制，就象本發(fā)明人的以前的研究(Tatsumi，K，T.Mori.，E.Mori.，H.Kanzaki.，andT.Mori.1987.Immunoregulatory factor released form a cell linederived from human decidual tissue.Am.J.Reprod. Immunol.Microbiol.1387)就以指出的那樣，NS細(xì)胞株的上清中的蛋白類物質(zhì)抑制通過IL-2進(jìn)行的T細(xì)胞分裂反應(yīng)。
在本發(fā)明中可能使人驚奇的是我們已經(jīng)搞清楚該NS細(xì)胞株通過細(xì)胞程序死亡(DNA片段化)作用不只是誘導(dǎo)人血液癌細(xì)胞K562/Molt4/U937，也誘導(dǎo)惡性度極高的人胃癌細(xì)胞GCIY和人絨毛癌細(xì)胞BeWo死亡和抑制其增殖。
另外從該細(xì)胞株的培養(yǎng)上清進(jìn)行了誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序死亡的物質(zhì)(AIF)的分離、純化、構(gòu)造確定。其過程首先是將NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清的冷凍干燥樣品上C18-柱，然后用乙腈將與柱子疏水性結(jié)合的物質(zhì)洗脫出來。洗脫出來的活性因子再經(jīng)TLC粗純化。活性級(jí)分表現(xiàn)出來的Rf值比酚紅大，年抑制K562/Molt4細(xì)胞分裂、引起DNA片段化。最終通過C18反相柱經(jīng)HPLC將活性分子作為6個(gè)主要的峰分離純化。由這6個(gè)峰獲得的樣品無論那一個(gè)都抑制靶癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)DNA片段化，可以確認(rèn)就是當(dāng)初的目的物即AIF。而這6種AIF混合后作為混合物使用時(shí)(現(xiàn)在癌化療法進(jìn)行的多制劑并用，這里是天然的多制劑并用)發(fā)現(xiàn)最有效。由于這6種AIF的物理化學(xué)的性質(zhì)是地衣酚反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)陰性，所以它們是非蛋白性的不含六碳糖的物質(zhì)。其分子量推定為100～500。
象圖7～12左上表示的那樣經(jīng)HPLC分級(jí)的各活性峰在UV光譜中顯示出的最大吸收值處于245nm到265nm范圍。就是說強(qiáng)烈地暗示出AIF是核酸或與其衍生物有關(guān)的物質(zhì)。
從大量的NS細(xì)胞培養(yǎng)上清最終分離純化AIF，制備可以進(jìn)行構(gòu)造解析的樣品，通過FAB-MS確定分子量，用NMR最終確定它們的構(gòu)造(圖1～12)。6種AIF屬于含有堿基或核糖的一部分被脫氧，或是被甲基化的唯一構(gòu)造的核苷系列。
象本發(fā)明人那樣發(fā)現(xiàn)NS細(xì)胞分泌一系列的核酸系物質(zhì)，誘導(dǎo)人的所有癌細(xì)胞的程序死亡一事僅限于本發(fā)明人了解，即使在世界也是首次。
現(xiàn)在臨床上使用的核酸系抗癌制劑、抗病毒制劑(例如5-FU)、Futraful(FT)、Furtulon、AZT、DDI、Ara-c)細(xì)胞毒性高，其效果也就差些，用于人時(shí)副作用大，正成為社會(huì)化問題。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的AIF雖說是是試管和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所見(這些實(shí)驗(yàn)體系是以人用的抗癌制劑、抗病毒制劑的評(píng)價(jià)作為目的，在該領(lǐng)域中確立的一直用的試管內(nèi)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體系(例如參照?qǐng)D22、23、24))，但對(duì)人正常細(xì)胞完全沒有傷害，就是說將來用于人時(shí)副作用減輕，由于誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異的細(xì)胞程序死亡(DNA片段化)這一自然的藥理作用機(jī)制開拓了可能開發(fā)引起癌細(xì)胞死亡的天然型理想的制癌劑。圖的補(bǔ)充說明圖14表示NS細(xì)胞株誘導(dǎo)靶癌細(xì)胞的程序死亡，但不誘導(dǎo)正常細(xì)胞的程序死亡。
NS細(xì)胞株與靶細(xì)胞間的直接相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，提取細(xì)胞的DNA，在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
其結(jié)果就象圖14A所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與Molt4 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶5中只有Molt4 106/孔，帶4中只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14B所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與K562 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶4中只有K562的106/孔，帶5中只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14C所示的那樣，帶1、2、3分別是K562細(xì)胞和Molt細(xì)胞數(shù)分別為106、105、104/孔間共培養(yǎng)，帶4中只有Molt4 106/孔、帶5中只有K562 106/孔時(shí)，無論那種情況都沒引起DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14D所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與BeWo 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶4只有NS 106/孔，帶5只有BeWo 106/孔，帶6是BeWo 106/孔與GcIY106/孔間共培養(yǎng)，帶7只有GcIY106/孔時(shí)，無論那種情況都看不到DNA片段化。
象圖14E所示的那樣，帶1、2、3、4分別是NS細(xì)胞數(shù)為103、104、105、106/孔與U937 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶7是Molt4 106/孔與U937106/孔間的共培養(yǎng)，帶8是只有Molt4 106/孔，帶6是只有U937106/孔，帶5是只有NS 106/孔時(shí)，都不會(huì)引起DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14F所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與GcIY106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶4只有GcIY106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14G所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與WI-38 106/孔間的共培養(yǎng)，即使接種的NS細(xì)胞數(shù)增加，在靶細(xì)胞中也看不到DNA片段化。帶4只有WI-38106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)都不會(huì)引起DNA片段化。M是標(biāo)記物。
圖15表示NS細(xì)胞與K562/Molt4細(xì)胞間接共培養(yǎng)中抑制靶細(xì)胞增殖。
象圖15表示的那樣在將NS(TTK-1)細(xì)胞與K562/Molt細(xì)胞加入到培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行間接相互作用(間接共培養(yǎng))的系統(tǒng)中，隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，72小時(shí)后可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞數(shù)的減少。
圖16～17表示通過薄層層析(TLC)的粗提取的AIF抑制靶細(xì)胞攝入3H脫氧胸腺嘧啶核苷、誘導(dǎo)DNA片段化。
將由NS(TTK-1)細(xì)胞株培養(yǎng)上清(TTK-1 Sup)50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上，用乙腈和甲醇對(duì)保留在柱子上的物質(zhì)進(jìn)行洗脫、濃縮干燥，得到的級(jí)分抑制K562/Molt4細(xì)胞的分裂。
象圖16A表示的那樣，將該級(jí)分加到TLC上，在培養(yǎng)基中含有的處于酚紅試劑的帶(Rf＝0.5)上部的級(jí)分(U)與無血清的培養(yǎng)基(SFM)、對(duì)照組(C)以及存在于TLC上的下部的級(jí)分(L)相比，可以看出抑制K562的分裂。
另外象圖16B表示的那樣，進(jìn)一步將該級(jí)分加到TLC上展開，培養(yǎng)基中存在的處于酚紅(Rf＝0.5)位置的上部(U)的級(jí)分與存在于酚紅位置下部的級(jí)分相比，能看出有意義的抑制Molt4細(xì)胞分裂。
對(duì)照組(C)和使用新鮮無血清培養(yǎng)基(SFM)都看不到抑制靶細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。
象圖17A，B所表示的那樣，將由NS(TTK-1)細(xì)胞培養(yǎng)上清約50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上，用乙腈洗脫保留在柱子上的物質(zhì)，然后濃縮，濃縮的級(jí)分利加到TLC上展開，然后將處于酚紅位置(Rf值0.5)上部(U，帶1，3)和下部(L，帶2，4)的級(jí)分分別提取出來，研究是否存在誘導(dǎo)K562細(xì)胞(A)/Molt4細(xì)胞(B)的DNA片段化。
用這些提取物與K562/Molt4細(xì)胞反應(yīng)24小時(shí)(帶1，2)、48小時(shí)(帶3，4)后提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。就象該圖所表示的那樣，NS細(xì)胞培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序死亡的物質(zhì)(AIF)，確認(rèn)在TLC上比酚紅移動(dòng)快的級(jí)分(Rf＞0.5)中存在AIF。圖18用HPLC最終分離的AIF的HPLC曲線象圖18A所表示的那樣，由NS(TTK-1)培養(yǎng)上清500ml經(jīng)TLC粗純化的總的活性級(jí)分經(jīng)TSKgelODS-80TM柱(東曹)、反相HPLC分離提取。得到了主要的六個(gè)峰(1-6)。
象圖18B，C所表示的那樣，對(duì)Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清(B)或新鮮的培養(yǎng)基(C)進(jìn)行與NS(TTK-1)細(xì)胞培養(yǎng)基完全相同的處理，最終加到HPLC上比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)從NS細(xì)胞株培養(yǎng)基得到的那樣的活性峰(1-6)在其HPLC圖上不存在。
圖19，20表示了用HPLC最終分離純化的AIF能夠抑制Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷，誘導(dǎo)DNA片段化，以及能夠誘導(dǎo)DNA片段化的AIF的有效量。
象圖19所表示的那樣，來自用HPLC分離的主要的(1-6)六個(gè)峰的樣品(7μg/ml)無論那一種都抑制Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷，就是說抑制Molt4細(xì)胞的分裂。特別是取自峰1和峰4的樣品表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，各個(gè)峰稀釋到1/10濃度的混合樣品(各0.7μg/ml)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性。就象圖19的柱M表示的那樣，它表現(xiàn)出了各個(gè)峰(AIF)的協(xié)同效果。
象圖20A所表示的那樣，用從各個(gè)活性峰(1-6)制備的樣品作用于Molt4細(xì)胞48小時(shí)后，提取Molt4細(xì)胞的DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。與各個(gè)活性峰(1-6)的抑制Molt4細(xì)胞分裂效果相對(duì)應(yīng)，取自各個(gè)峰(1-6)的樣品(7μg/ml)和取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10濃度的樣品(0.7μg/ml)的混合物無論那一個(gè)都可誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化(圖20A，帶1-7)。
象圖20B，C所表示的那樣，用經(jīng)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(B；7×3-2μg/ml，C；7×3-5μg/ml)作用于Molt4細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。就象圖20B表示的那樣，取自各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(7×3-2μg/ml)和取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10濃度的樣品(0.7×3-2μg/ml)的混合物無論那一個(gè)都可誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化(帶1-7)。象圖20C表示的那樣，單獨(dú)7×3-5μg/ml，還是1/10稀釋的混合物，在0.7×3-5μg/ml的低濃度下其作用已經(jīng)消失了(帶1-7)。
圖21經(jīng)HPLC最終分離的AIF雖然可以誘導(dǎo)人癌細(xì)胞BeWo/U937/GCIY的DNA片段化，但不能誘導(dǎo)人正常細(xì)胞WI-38的DNA片段化。
象圖21A、B、C所表示的那樣，用來自各個(gè)峰(1-6)的樣品(21μg/ml)以及取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10的混合樣品(各2.1μg/ml)與BeWo(A)/U937(B)/GCIY(C)細(xì)胞反應(yīng)48小時(shí)后，然后提取各個(gè)靶細(xì)胞的DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。與各個(gè)活性峰(1-6)的抑制靶細(xì)胞分裂效果相對(duì)應(yīng)，取自各個(gè)峰(1-6)的樣品以及取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10的混合樣品無論那個(gè)樣品都可誘導(dǎo)靶細(xì)胞的DNA片段化(帶1-7)。
象圖21D所表示的那樣，用取自各個(gè)峰(1-6)樣品(用量是與靶癌細(xì)胞反應(yīng)的3倍(63μg/ml))與人正常細(xì)胞WI-38反應(yīng)48小時(shí)后，提取WI-38細(xì)胞的DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。無論那一種AIF都不能抑制正常細(xì)胞的分裂和誘導(dǎo)DNA片段化。
圖7～12經(jīng)HPLC分離的各活性峰1-6(AIF)的物理化學(xué)特性和構(gòu)造確定進(jìn)行NS細(xì)胞的大量培養(yǎng)(約300L)，從最終的HPLC分離純化的各個(gè)峰(1-6)制備樣品。
象圖7～12各P1-P6的左上圖表示的那樣，由于從UV光譜解析可以看到最大吸收值出現(xiàn)在260nm前后，所以判斷是核酸系物質(zhì)。
因?yàn)橥ㄟ^UV光譜解析確定了構(gòu)造解析的方向，所以通過質(zhì)量分析(FAB-MASS)確定分子量(下圖箭頭)。又象圖7～12(右上)表示的那樣，利用核磁共振(NMR)法確定了AIF的最終構(gòu)造。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
(實(shí)施例1)(說明培養(yǎng)基、培養(yǎng)液)于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)3天，將NS細(xì)胞培養(yǎng)上清(500ml)冷凍干燥，通過C18柱進(jìn)行分離。由于活性物質(zhì)結(jié)合在柱子上，所以利用乙腈、甲醇從柱子上分離、洗脫，再利用氮?dú)馐谷軇]發(fā)，最后使溶質(zhì)濃縮干燥。
將用C18柱分離的物質(zhì)溶解在三氯甲烷∶甲醇(1∶1)溶液中之后，點(diǎn)到薄層(kieselgel)板上，通過三氯甲烷∶甲醇∶蒸餾水(60∶40∶8)展開。展開后，被酚紅試劑的帶分為下級(jí)分部(L)和上級(jí)分部(U)，挑取相應(yīng)凝膠，利用三氯甲烷/甲醇(1∶1)分別萃取回收，用氮?dú)飧稍铩?br> 利用ODS-80TM柱(TOSOH)，通過乙腈、0.1％三氟乙酸從0到5％的直線濃度梯度洗脫，時(shí)間為360分鐘，流速0.5ml/分，用OD214nm吸光度檢測(cè)，對(duì)具有活性的TLC中的u級(jí)分進(jìn)行分離純化，得到的主要的六個(gè)峰(1-6)(圖18A、HPLC圖)。
得到的目的物P1、P2、P3、P4、P5和P6分別有0.014mg、0.017mg、0.021mg、0.050mg、0.035mg、0.018mg。
以下雖然給出了本發(fā)明的化合物的制劑化例子，但本發(fā)明的化合物制劑化并不限于本制劑化例子。
制劑化例1本物質(zhì)(P1)10(份)(以下相同，表示重量比例)碳酸氫鎂15乳糖75將上述化合物均勻混合，作成350μm以下的粉末狀的或細(xì)粒狀的散劑。將該散劑放入膠囊容器內(nèi)作成膠囊制劑。
制劑化例2本物質(zhì)(P2)45(份)淀粉15乳糖16結(jié)晶纖維素21聚乙烯醇3蒸餾水30將上述成分均一混合，破碎造粒，干燥，然后篩選，作成177～1410μm大小的顆粒制劑。
制劑化例3使用與制劑化例2同樣的方法作成顆粒制劑后，相對(duì)于該顆粒制劑96份加硬脂酸鈣4份，壓縮成形，作成直徑10mm的片劑。
制劑化例4相對(duì)于用制劑化例2的方法作成的顆粒制劑90份，加入結(jié)晶纖維素10份和硬脂酸鈣3份，壓縮成形，作成直徑8mm的片劑后，然后再加入糖水明膠、沉淀性的碳酸鈣混合懸濁液，作成糖衣狀。
制劑化例5本物質(zhì)(P3)0.6(份)
非離子系表面活性劑2.4生理鹽水97將上述成分加溫混合后，加入到安瓶中，滅菌后作成注射劑。
本發(fā)明的式(1)化合物或醫(yī)藥上允許的鹽對(duì)人正常細(xì)胞完全沒有傷害，用于人體時(shí)預(yù)計(jì)副作用會(huì)很輕，所以因其通過特異的細(xì)胞程序死亡引起癌細(xì)胞的死亡這一自然的作用機(jī)制，人們期待著用它治療人癌癥以及病毒疾病，在醫(yī)藥領(lǐng)域中作為抗腫瘤制劑和抗病毒制劑是有用的。
權(quán)利要求
1.下式(1)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽的制造方法，其特征是培養(yǎng)具有產(chǎn)生式(1)的化合物能力的取自人胎盤蛻膜細(xì)胞，從其培養(yǎng)液中提取式(1)的化合物，根據(jù)需要作成醫(yī)藥上允許的鹽。 式中的R是用
2.保藏號(hào)為FERM BP 6350的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供對(duì)現(xiàn)有的抗腫瘤制劑和抗病毒制劑不能充分發(fā)揮效果的癌和病毒具有效果，對(duì)各種耐性癌具有制癌和抗病毒作用的，對(duì)人正常細(xì)胞沒有傷害的副作用小的物質(zhì)。本發(fā)明涉及到用式(1)，(式中的R1是用特定的式表示的核酸堿基，R2代表氫原子、羥基或甲氧基)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽。本發(fā)明也涉及到式(1)的物質(zhì)或醫(yī)藥上允許的鹽的制備方法，該方法是培養(yǎng)具有產(chǎn)生式(1)的化合物能力的NS細(xì)胞，從其培養(yǎng)液中提取式(1)的化合物，根據(jù)需要作成醫(yī)藥上允許的鹽。另外本發(fā)明也公開了以上述化合物為有效成分的醫(yī)藥，以及CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K31/7052GK1616671SQ20041007896
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期1998年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月3日
發(fā)明者森庸厚, 郭卯戊, 森悅子 申請(qǐng)人:森庸厚, 森崇英, 伊藤忠高科技化工株式會(huì)社