專利名稱：含干擾素α－1b的注射用緩釋微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干擾素α-1b的注射用緩釋微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，干擾素α-1b或其衍生物或鹽的制劑有口含片、溶液劑、注射劑、貼劑、軟膏劑等，這些劑型或由于干擾素α-1b的半衰期較短，導(dǎo)致消除較快，或由于非局部使用而使得藥物在局部的藥量偏低且全身毒副作用大，臨床應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，即本發(fā)明的目的，是提供一種干擾素α-1b或其衍生物的注射用緩釋微球。
經(jīng)過長時(shí)間的研究，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將占微球重量的0.1～10％(w/w)的干擾素α-1b或其衍生物和50～99.9％(w/w)分子量在5,000～70,000道爾頓之間的可生物降解和生物可相容性的藥用高分子材料通過適合方法制成注射用緩釋微球，能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的上述目的。
因此，本發(fā)明提供了一種注射用緩釋微球，其特征在于它包括以微球重量計(jì)，0.1～10％(w/w)的干擾素α-1b或其衍生物和50～99.9％(w/w)分子量在5,000～70,000道爾頓之間的可生物降解且具有生物相容性的藥用高分子材料，所述微球的平均粒徑在10～100μm之間。
本發(fā)明的注射用緩釋微球可通過下述方法中的任一方法制備。
復(fù)乳法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物和穩(wěn)定劑溶解或混懸于含非離子型乳化劑的水溶液中后，加入到含所述藥用高分子材料的有機(jī)溶液中，經(jīng)處理后，再加入到含非離子型乳化劑的外水相中形成微球。
無水法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物及其穩(wěn)定劑的微粉加入到含高分子材料的有機(jī)溶劑中，經(jīng)水浴超聲混懸后再加入到一定量的棉子油中，用分散相萃取使其固化成微球，然后加入輕質(zhì)石油醚，使微球固化完全。
低溫噴霧提取法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物粉末懸浮在溶有高分子材料的有機(jī)溶劑中，通過噴霧形成小液滴，在液氮中冷凍，用低溫有機(jī)共溶劑抽提溶解聚合物而制得。
相凝聚法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物分散于適用的高分子材料溶液后，往該溶液中加入凝聚劑，使高分子材料溶解度降低而析出，形成良好的微球。
本發(fā)明的緩釋微球還可通過先將干擾素α-1b或其衍生物制備成脂質(zhì)體后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球的方法制備。
本發(fā)明的緩釋微球還可通過先將干擾素α-1b或其衍生物制備成納米粒后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球的方法制備。
本發(fā)明的緩釋微球還可通過將干擾素α-1b或其衍生物溶液加入到微粉硅膠中，被微粉硅膠充分吸附后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球的方法制備。
本發(fā)明所述干擾素α-1b衍生物包括各種干擾素α-1b的鹽、PEG化、甲基化及用其它基團(tuán)進(jìn)行修飾的各種干擾素α-1b的衍生物。
本發(fā)明所述藥用高分子材料為明膠、白蛋白、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-3-羥基丁酸酯、聚鄰酯、聚酐、聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物、聚丙烯葡聚糖、聚內(nèi)酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚羥乙酸-聚乙二醇中的一種或其中的兩種或兩種以上的混合物。
優(yōu)選為聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、或聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物。
更優(yōu)選為分子量在5,000～70,000道爾頓之間的聚乳酸-羥基乙酸共聚物，其中乳酸與羥基乙酸的比例為20∶80～80∶20，或者分子量在5,000～70,000道爾頓之間的聚丙交酯-乙交酯，其中丙交酯和乙交酯的聚合比例為20∶80～80∶20。
本發(fā)明的注射用微球還可包括藥物上可接受的蛋白穩(wěn)定劑、表面活性劑和其他添加劑等。
所述蛋白穩(wěn)定劑選自HSA、甘露醇、海藻糖、EDTA、Zn鹽、Mg(OH)2、CaCO3、ZnCO3等。
所述表面活性劑選自泊洛沙姆、卵磷脂、聚乙二醇2000或聚乙二醇5000等。
所述其他添加劑選自微粉硅膠、攜帶陽性離子的物質(zhì)如氨基酸等。
本發(fā)明的微球制劑包封率大于75％，且可持續(xù)釋放15天、30天或60天左右，減少了用藥次數(shù)，提高了生物利用度，降低了全身的毒副作用，增加了患者順從性。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明所述干擾素α-1b或其衍生物的注射用緩釋微球的制備方法。
實(shí)施例1復(fù)乳法制備重組干擾素α-1b緩釋微球?qū)⒁欢康母蓴_素α-1b(約5mg，與Zn2+結(jié)合后)溶解于0.5ml20mg/ml明膠溶液(含EDTA、10％甘露醇或海藻糖、Mg(OH)2、CaCO3或ZnCO3微粉等)中，經(jīng)5000rpm攪拌30s后，加入到含150mgPLGA(分子量為5000～70,000)的二氯甲烷溶液1.25ml中，在5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌2分鐘，然后加入到20ml含6％PVA/PEG的水溶液中，以200rpm速度磁力攪拌5分鐘，然后再加入到含2％的PVA/PEG的500ml水溶液中，攪拌進(jìn)行溶劑揮發(fā)，然后洗滌、離心、冷凍干燥，收集即得。
實(shí)施例2無水法制備重組干擾素α-1b緩釋微球?qū)LGA約150mg溶于乙腈或乙酸乙酯1ml中，然后向其中加入干擾素α-1b或其衍生物及其穩(wěn)定劑的微粉，經(jīng)水浴超聲混懸后加入到20-30ml的棉子油(含卵磷脂或泊洛沙姆等作為乳化劑)中，攪拌乳化，用分散相不斷萃取乳滴中的乙腈溶液使其固化成微球，然后加入輕質(zhì)石油醚(沸點(diǎn)60-90℃)，繼續(xù)攪拌使微球固化完全，離心、石油醚洗滌、冷凍干燥即得。
實(shí)施例3低溫噴霧提取法制備重組干擾素α-1b緩釋微球?qū)⒏蓴_素α-1b或其衍生物粉末懸浮在溶有高分子材料的有機(jī)溶劑中，通過噴霧得方法形成小液滴，在液氮中冷凍，用一低溫有機(jī)共溶劑(例如乙醇)抽提溶解聚合物得溶劑即得。
實(shí)施例4先制成脂質(zhì)體后再包裹成微球采用薄膜分散法或冷凍干燥法等制備出干擾素α-1b脂質(zhì)體，然后將適量冷凍干燥后的脂質(zhì)體粉末加入到100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液1ml中，經(jīng)超聲/攪拌混懸后加入到PVA的水溶液15ml中，以約2000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌5min后加入到200ml的稀釋PVA溶液中，以低轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌4h后，洗滌、離心、冷凍干燥即得。
實(shí)施例5先制成納米粒后再包裹成微球采用天然高分子法和乳化聚合法制備成納米粒凍干粉后，加入到100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液1ml中，經(jīng)超聲/攪拌混懸后加入到PVA的水溶液15ml中，以約2000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌5min后加入到200ml的稀釋PVA溶液中，以低轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌4h后，洗滌、離心、冷凍干燥即得。
實(shí)施例6經(jīng)微粉硅膠吸附后再包裹成微球先將干擾素α-1b緩沖液加入到微粉硅膠中，被微粉硅膠充分吸附后，加入甘露醇等凍干保護(hù)劑，冷凍干燥制備成凍干粉后，加入到100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液中，超聲/攪拌混懸后加入到PVA水溶液15ml中，以約2000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌乳化后加入到稀釋的PVA溶液中，以低轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌4h，揮發(fā)溶劑，洗滌、離心、冷凍干燥后即得。
實(shí)施例7相凝聚法制備微球?qū)⒏蓴_素α-1b凍干粉或干擾素α-1b溶液適量加入到150mg/ml的PLGA二氯甲烷溶液中，以約2000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌1min后，降低轉(zhuǎn)速為200rpm，并注入硅油。相分離后，將混懸液轉(zhuǎn)入500ml的己烷中，恒溫20℃以約300rpm的轉(zhuǎn)速攪拌30min后，收集微球，500ml己烷洗滌，冷凍干燥即得。
微球粒徑的測(cè)定試驗(yàn)樣品根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7方法制備的微球。
實(shí)驗(yàn)儀器帶刻度目鏡的光學(xué)顯微鏡或激光粒度測(cè)定儀。
實(shí)驗(yàn)方法光學(xué)顯微鏡測(cè)定將微球粉末均勻分散后在顯微鏡(激光計(jì)數(shù)器)下觀察以上個(gè)實(shí)施例微球，并記下微球粒徑，微球總數(shù)不少于200個(gè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，考察微球的平均粒徑及粒徑分布情況。
激光粒度測(cè)定儀測(cè)定稱取適當(dāng)實(shí)驗(yàn)樣品，使用激光粒度測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。
微球載藥量和包封率的測(cè)定試驗(yàn)樣品根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2、3、4、5方法制備的微球。
實(shí)驗(yàn)試劑BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒、NaOH、SDS實(shí)驗(yàn)儀器紫外分光光度計(jì)、渦漩儀、離心機(jī)實(shí)驗(yàn)方法精密稱取實(shí)驗(yàn)樣品約10mg，加入5.0ml 0.1MNaOH/0.5SDS(w/v)的混合溶液中，37℃水浴振蕩24h，使微球完全溶解，加2MHCL約280μl調(diào)pH約7.0，進(jìn)行BCA法蛋白含量測(cè)定。
微球的突釋和釋放曲線的測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2、3所述的方法制備的微球。
實(shí)驗(yàn)試劑pH為7.4的磷酸緩沖液(含0.02％疊氮化鈉作為抑菌劑，0.02％F-68潤濕劑作為釋放介質(zhì))實(shí)驗(yàn)儀器恒溫振蕩儀、離心機(jī)、HPLC儀。
實(shí)驗(yàn)條件溫度37℃，轉(zhuǎn)速rpm。
實(shí)驗(yàn)方法精密稱取含藥微球10-30mg置10ml離心管中，加入1.5ml 10mM pH7.4緩沖液，置于恒溫水浴搖床中，在100rpm振蕩速度、37℃±0.5℃溫度條件下進(jìn)行微球的體外釋放度測(cè)定。
取樣方法分別在2h、1d、2d取出離心管，于2000rpm離心10min，將全部釋放介質(zhì)取出并更換新的釋放介質(zhì)，以后每隔3-4天同以上操作方法取樣一次，并用BCA法測(cè)定IFN的含量。
微球在小鼠體內(nèi)的緩釋性質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2、3所述的方法制備的微球。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠實(shí)驗(yàn)方法取健康昆明種小鼠，隨機(jī)分組后，靜脈給予rIFNα的微球溶液，劑量為1.5×104kU rIFNα/kg，于給藥后0、1、2、5、8、10、12、15天眼眶取血，血樣經(jīng)3000rpm離心15min后，取上清夜測(cè)定其中IFN-α生物活性。
干擾素α-1b生物活性的測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)樣品血漿樣品。
實(shí)驗(yàn)儀器冷凍干燥機(jī)、離心機(jī)。
實(shí)驗(yàn)方法干擾素α-1b生物活性的測(cè)定將WISH細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶消化，用完全培養(yǎng)液配成2.5×105-3.5×105個(gè)細(xì)胞/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)，棄去上清，將擾素α-1b樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行倍比稀釋后按濃度從高到低加入1-12孔(濃度高的樣品溶液進(jìn)行預(yù)稀釋)，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照以及樣品空白對(duì)照。同樣條件培養(yǎng)18-24小時(shí)，棄去上清，加入VSV攻毒培養(yǎng)液(劑量100TCID50)100μl，攻毒24小時(shí)，倒置顯微鏡下鏡檢細(xì)胞50％病變點(diǎn)，計(jì)算擾素α-1b效價(jià)。
權(quán)利要求
1.一種注射用緩釋微球，其特征在于它包括以微球重量計(jì)，0.1～10％(w/w)的干擾素α-1b或其衍生物和50～99.9％(w/w)分子量在5,000～70,000道爾頓之間的可生物降解且具有生物相容性的藥用高分子材料，所述微球的平均粒徑在10～100μm之間。
2.按照權(quán)利要求1的注射用緩釋微球，其中所述藥用高分子材料選自明膠、白蛋白、聚丙交酯-乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚-3-羥基丁酸酯、聚鄰酯、聚酐、聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物、聚丙烯葡聚糖、聚內(nèi)酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚羥乙酸-聚乙二醇的一種或其中的兩種或兩種以上混合物。
3.按照權(quán)利要求2的注射用緩釋微球，其中所述藥用高分子材料為聚乳酸-羥基乙酸共聚物，其中分子量在5,000～70,000道爾頓之間，乳酸與羥基乙酸的比例為20∶80～80∶20；或聚丙交酯-乙交酯，其中分子量在5,000～70,000道爾頓之間，丙交酯與乙交酯的比例為20∶80～80∶20。
4.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物和穩(wěn)定劑溶解或混懸于含非離子型乳化劑的水溶液中后，加入到含所述藥用高分子材料的有機(jī)溶液中，經(jīng)處理后，再加入到含非離子型乳化劑的外水相中形成微球。
5.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物及其穩(wěn)定劑的微粉加入到含高分子材料的有機(jī)溶劑中，經(jīng)水浴超聲混懸后再加入到一定量的棉子油中，用分散相萃取使其固化成微球，然后加入輕質(zhì)石油醚，使微球固化完全。
6.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物粉末懸浮在溶有高分子材料的有機(jī)溶劑中，通過噴霧形成小液滴，在液氮中冷凍，用低溫有機(jī)共溶劑抽提溶解聚合物而制得。
7.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于先將干擾素α-1b或其衍生物制備成脂質(zhì)體后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球。
8.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于先將干擾素α-1b或其衍生物制備成納米粒后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球。
9.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將干擾素α-1b或其衍生物溶液加入到微粉硅膠中，被微粉硅膠充分吸附后，再用適合的所述藥用高分子材料包裹成微球。
10.一種制備權(quán)利要求1的注射用緩釋微球的方法，其特征在于將適量的干擾素α-1b或其衍生物分散于適用的高分子材料溶液后，往該溶液中加入凝聚劑，使高分子材料溶解度降低而析出，形成良好的微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及干擾素α－1b的注射用緩釋微球及其制備方法。該緩釋微球包括以微球重量計(jì)，0.1～10％(w/w)的干擾素α－1b或其衍生物和50～99.9％(w/w)可生物降解和分子量在5,000～70,000道爾頓之間的生物可相容性的藥用高分子材料。它可以采用W/O/W法、S/O/O法、噴霧干燥法等方法制備。本發(fā)明的微球制劑包封率大于75％，且可持續(xù)釋放15天、30天或60天左右，減少了用藥次數(shù)，提高了生物利用度，降低了全身的毒副作用，增加了患者順從性。
文檔編號(hào)A61K9/16GK1754572SQ20041008269
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者梅興國, 李志平 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所