專利名稱：低分子化的激動劑抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及改變的抗體，其包含單克隆抗體的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)，該單克隆抗體通過交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子而顯示激動劑活性。該改變的抗體具有通過交聯(lián)細胞表面分子而將信號轉(zhuǎn)入細胞的激動劑活性，用作多種用途的藥物。
背景技術：
JP-A 9-295999公開了以脾基質(zhì)細胞系作為致敏抗原的特異性單克隆抗體的制備，其目的在于開發(fā)可識別上述脾基質(zhì)細胞的特異性抗體，并公開了將小鼠整合素相關蛋白質(zhì)(小鼠IAP)作為抗原識別的新型單克隆抗體的制備。JP-A.9-295999還公開了這些單克隆抗體能夠誘導骨髓細胞凋亡。
WO99/12973公開了其抗原是人整合素相關蛋白質(zhì)(此處引用為人IAP；其氨基酸序列和核苷酸序列描述于J.Cell Biol.，123，485-496，1993；也參見Journal of cell Science，108，3419-3425，1995)的單克隆抗體，其能夠誘導具有所述人IAP的人有核血細胞(骨髓細胞和淋巴細胞)凋亡。這些單克隆抗體被稱為抗體MABL-1和抗體MABL-2，產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤也分別稱為MABL-1(FERM BP-6100)和MABL-2(FERM BP-6101)。
日本專利申請11-63557描述了具有以人IAP為抗原的單克隆抗體的單鏈Fv區(qū)的單鏈Fv的制備。該單鏈Fv能夠誘導具有人IAP的有核血細胞凋亡。
識別IAP作為抗原的單克隆抗體，可誘導具有人IAP的有核血細胞凋亡，但也引起體外血細胞凝集反應。表明給予大量識別IAP為抗原的單克隆抗體可能產(chǎn)生副作用，例如血細胞凝集反應。
本發(fā)明人利用人IAP的單克隆抗體作為血液疾病的治療藥物進行深入研究，獲得了具有能夠誘導具有人IAP的有核血細胞凋亡的單鏈Fv區(qū)的單鏈Fv。
另一方面，改變的抗體，特別是分子大小降低的抗體，例如通過降低分子大小開發(fā)了提高進入組織和腫瘤通透性的單鏈Fv，并通過重組方法制備。最近，單鏈Fv的二聚體，特別是雙特異性二聚體已經(jīng)用于交聯(lián)細胞。該二聚體的典型例子是單鏈Fv的異源二聚體，其識別癌細胞抗原以及宿主細胞，如NK細胞和嗜中性粒細胞的抗原(Kipriyanov等人，Int.J.Cancer，77，9763-9772，1998)。它們利用單鏈Fv構(gòu)建技術制備為改變的抗體，通過誘導細胞間交聯(lián)而更有效治療癌癥。已經(jīng)認為細胞間交聯(lián)由抗體及其片段(例如Fab片段)、雙特異性改變的抗體乃至單特異性的單鏈Fv二聚體誘導。
對于能夠通過交聯(lián)細胞表面分子而轉(zhuǎn)導信號的抗體，已知有細胞分化和增殖涉及的EPO受體的抗體(JP-A 2000-95800)、MuSK受體的抗體(Xie等人，Nature Biotech.15，768-771，1997)及其它。但尚無降低分子大小的改變的抗體的報導。
注意到來自MABL-1抗體和MABL-2抗體的單鏈Fv單體不誘導細胞凋亡，而單鏈Fv二聚體誘導具有IAP的細胞凋亡，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其交聯(lián)(二聚體化)細胞表面上IAP受體，從而轉(zhuǎn)導信號進入細胞，導致誘導凋亡。這提示，單特異性單鏈Fv二聚體交聯(lián)細胞表面分子(例如受體)，像配基一樣轉(zhuǎn)導信號，從而用作激動劑。
研究細胞間交聯(lián)發(fā)現(xiàn)，上述單鏈Fv二聚體不引起血細胞凝集反應，而上述單克隆抗體則能。單鏈雙價抗體(包含兩個H鏈V區(qū)和兩個L鏈V區(qū)的單鏈多肽)也觀察到相同結(jié)果。這提示，單克隆抗體可能形成細胞間交聯(lián)，而改變的抗體，如單鏈Fv二聚體和單鏈雙價抗體，交聯(lián)細胞表面分子但不形成細胞間交聯(lián)。
基于這些觀察，發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)，改變的抗體，例如單鏈Fv二聚體和單鏈雙價抗體，除了已知的細胞間交聯(lián)以外，交聯(lián)細胞表面分子或相同細胞的細胞間分子，適合作為該分子的配基(特別是作為模擬天然配基作用的配基)。
通過進一步發(fā)現(xiàn)抗體分子(完全IgG)可以改變成為交聯(lián)細胞表面分子的單鏈Fv二聚體、單鏈雙價抗體等，從而降低細胞間交聯(lián)產(chǎn)生的副作用，并提供只誘導細胞目的效應的新藥，發(fā)明人完成了本發(fā)明。相比天然配基，例如TPO、EPO或G-CSF，或者具有與改變的抗體相同的V區(qū)的完全抗體(IgG)，本發(fā)明的改變的抗體具有非常高的活性。由于相比抗體分子，其分子大小降低，并缺少恒定區(qū)，其進入組織的通透性提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供低分子大小的激動劑改變的抗體，其包含單克隆抗體的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)，并通過交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子而具有激動劑作用。
因此，本發(fā)明涉及改變的抗體，其包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)，優(yōu)選每種2-6個，特別優(yōu)選每種2-4個，最優(yōu)選每種二個，并通過交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子而顯示激動劑活性。
本說明書中“改變的抗體”是指包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)的任何物質(zhì)，其中所述V區(qū)直接或通過接頭以共價鍵或非共價鍵連接。例如，通過肽接頭或化學交聯(lián)劑等連接抗體的每個V區(qū)而制備的多肽和化合物。本發(fā)明使用的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)可來自于相同抗體或不同抗體。
本發(fā)明改變的抗體的優(yōu)選實例為包含H鏈V區(qū)以及L鏈V區(qū)的單鏈Fv的多聚體，例如二聚體、三聚體或四聚體，或者包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)的單鏈多肽。如果本發(fā)明的改變的抗體是包含H鏈V區(qū)以及L鏈V區(qū)的單鏈Fv的多聚體，例如二聚體、三聚體或四聚體等，優(yōu)選處于同一鏈上的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)不結(jié)合形成抗原結(jié)合位點。
更優(yōu)選的實例為包含H鏈V區(qū)以及L鏈V區(qū)的單鏈Fv的二聚體，或者包含二個H鏈V區(qū)以及二個L鏈V區(qū)的單鏈多肽。改變的抗體中H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)優(yōu)選通過接頭相聯(lián)。
本說明書中“激動劑作用”是指通過交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子而轉(zhuǎn)入信號的細胞中發(fā)生的生物學作用，例如誘導凋亡、誘導細胞增殖、誘導細胞分化、誘導細胞分裂或細胞周期調(diào)節(jié)作用。
通過測定激動劑作用的已知方法，確定本發(fā)明激動劑作用的ED50。例如檢測激動劑特異的細胞死亡或細胞增殖，檢測細胞分化特異蛋白質(zhì)的表達(例如特異抗原)，或者測定細胞周期特異的激酶活性。ED50為達到最大活性(其在劑量-反應曲線中設為100％)的50％所需劑量。
本發(fā)明優(yōu)選的改變的抗體，其激動劑作用(ED50)等于或好于具有與改變的抗體相同的抗原結(jié)合區(qū)的抗體，即具有與形成改變的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)對相同的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)對的完全抗體，如IgG(以下“親代抗體”)。更優(yōu)選其激動劑作用(ED50)高于親代抗體二倍以上、進一步優(yōu)選5倍以上、最優(yōu)選10倍以上的改變的抗體。本發(fā)明包含具有激動劑作用的改變的抗體，其包含形成與親代抗體(可結(jié)合靶細胞表面分子或細胞內(nèi)分子，但對該分子沒有激動劑作用)相同的抗原結(jié)合區(qū)的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)。
本發(fā)明的包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)的化合物可以是包含抗體的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)、顯示的激動劑作用(ED50)等于或好于結(jié)合細胞表面分子或細胞內(nèi)分子的天然配基的任何化合物。優(yōu)選為激動劑作用(ED50)超過天然配基2倍以上、更優(yōu)選超過5倍以上、最優(yōu)選超過10倍以上的化合物。
此處所述“化合物”不僅包括本發(fā)明的改變的抗體，也包括包含二個或多個、優(yōu)選2-6個、更優(yōu)選2-4個、最優(yōu)選2個抗原結(jié)合區(qū)的任何化合物，例如完全抗體或F(ab’)2。
本發(fā)明包含抗體的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)的改變的抗體或化合物優(yōu)選不具有基本的細胞間粘附作用。當本發(fā)明改變的抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)來源于相同抗體時，其優(yōu)選具有的細胞間粘附作用(ED50)不超過相比原始抗體的1/10。
利用測定激動劑作用的已知方法確定本發(fā)明細胞間粘附作用的ED50，例如通過測定表達所述細胞表面分子的細胞的凝集作用，例如血細胞凝集測試。
本發(fā)明涉及編碼改變的抗體的DNA。
本發(fā)明涉及產(chǎn)生改變的抗體的動物細胞或微生物。
本發(fā)明涉及改變的抗體作為激動劑的用途。
本發(fā)明涉及通過使用改變的抗體交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子而轉(zhuǎn)導信號進入細胞、從而誘導細胞激動劑作用(例如誘導凋亡、誘導細胞增殖、誘導細胞分化、誘導細胞分裂或細胞周期調(diào)節(jié)作用)的方法。
本發(fā)明涉及包含改變的抗體的藥物。
本發(fā)明涉及改變的抗體作為藥物的用途。
本發(fā)明涉及包含抗體的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)、并通過交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子而顯示激動劑作用的改變的抗體的篩選或測定方法，其包含1)制備包含抗體的二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)、并特異性結(jié)合所述分子的改變的抗體，2)改變的抗體接觸表達所述分子的細胞以及3)測定由交聯(lián)所述分子引起細胞中發(fā)生的激動劑作用。測定方法用于制備本發(fā)明作為藥物和其它目的的改變的抗體中的質(zhì)量控制。
上述單鏈Fv二聚體包括非共價鍵二聚體、通過交聯(lián)基的共價鍵二聚體以及通過交聯(lián)劑的二聚體(抗體、抗體片段或雙價改變的抗體)。用于交聯(lián)肽的常規(guī)交聯(lián)基可以用作形成二聚體的交聯(lián)基。例如通過半胱氨酸殘基的二硫化物交聯(lián)，其它交聯(lián)基，如C4-C10亞烷基(例如四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、七亞甲基以及八亞甲基等)或C4-C10亞烯基(順/反-3-亞丁烯基、順/反-2-亞戊烯基、順/反-3-亞戊烯基、順/反-3-亞己烯基等)。
此外，能夠結(jié)合單鏈Fv的交聯(lián)劑有，例如可任意引入Fv的氨基酸序列，例如FLAG序列的抗體等、或其片段，或來源于抗體的改變的抗體，例如單鏈Fv。
本發(fā)明還涉及通過給予結(jié)合細胞表面分子或細胞內(nèi)分子的第一配基和第二配基，以及給予結(jié)合第一和第二配基以及交聯(lián)第一和第二配基的物質(zhì)，從而誘導對細胞激動劑作用的方法。第一配基和第二配基可以是包含對所述分子的結(jié)合位點、并能夠經(jīng)由交聯(lián)而誘導激動劑作用的任何物質(zhì)。優(yōu)選實例為單價改變的抗體，例如相同或不同的單鏈Fv單體、抗體片段等。交聯(lián)上述配基的物質(zhì)可以是通過交聯(lián)第一配基和第二配基而誘導對細胞激動劑作用的任何物質(zhì)。優(yōu)選實例為抗體、抗體片段、(Fab)2或雙價改變的抗體。雙價抗體的實例為(Fab)2、包含一個H鏈V區(qū)和一個L鏈V區(qū)的單鏈Fv二聚體、以及包含二個H鏈V區(qū)和二個L鏈V區(qū)的單鏈多肽。該方法可有效探索通過交聯(lián)而轉(zhuǎn)導信號進入細胞的受體，希望用于將藥物傳遞入靶細胞的DDS，還用作抑制副作用并使藥物在希望的時間和希望的時期內(nèi)有效的給藥系統(tǒng)。
本發(fā)明的改變的抗體可以是包含抗體(例如抗體MABL-1、抗體MABL-2、抗體12B5、抗體12E10等)的L鏈V區(qū)和H鏈V區(qū)的任何物質(zhì)，以及特異性識別細胞表面分子或細胞內(nèi)分子(例如蛋白質(zhì)(受體或參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì))、或者上述蛋白質(zhì)或細胞膜蛋白質(zhì)的糖鏈)以及交聯(lián)所述細胞表面分子、從而轉(zhuǎn)導信號進入細胞的任何物質(zhì)。包括其中V區(qū)的一部分氨基酸序列已經(jīng)改變的改變的抗體。
根據(jù)待結(jié)合的細胞表面分子或細胞內(nèi)分子的特性，例如分子結(jié)構(gòu)或作用機制，該改變的抗體可以是單特異性或多特異性的(如雙特異性)。如果改變的抗體結(jié)合可同源二聚體化并轉(zhuǎn)導信號進入細胞的受體分子(例如紅細胞生成素受體、血小板生成素受體、G-CSF受體、SCF受體、EGF受體、IAP(CD47)等)，優(yōu)選單特異性改變的抗體。如果其結(jié)合可異源二聚體化并轉(zhuǎn)導信號進入細胞的受體分子(例如IL-6受體、LIF受體、IL-11受體)，優(yōu)選雙特異性改變的抗體。如果其結(jié)合可異源三聚體化并轉(zhuǎn)導信號進入細胞的受體分子(例如IL-2受體、CNTF受體、OSM受體)，優(yōu)選三特異性改變的抗體。制備雙特異性單鏈Fv二聚體的方法如WO9413804等所述。
本發(fā)明還涉及H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)是來源于人抗體的H鏈V區(qū)和/或來源于的人抗體L鏈V區(qū)的改變的抗體。來源于人抗體的H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)可以通過篩選人單克隆抗體文庫獲得，如WO99/10494所述。也包括來源于人單克隆抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)。
本發(fā)明進一步涉及H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)是人源化的H鏈V區(qū)和/或人源化的L鏈V區(qū)的改變的抗體。具體地，該人源化改變的抗體由人源化的L鏈V區(qū)(其包含來源于人單克隆抗體L鏈V區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)以及來源于非人哺乳動物(例如小鼠、大鼠、牛、綿羊、猿)單克隆抗體L鏈V區(qū)的互補決定區(qū)(以下“CDR”))和/或人源化的H鏈V區(qū)(其包含來源于人單克隆抗體H鏈V區(qū)的FR以及來源于非人哺乳動物(例如小鼠、大鼠、牛、綿羊、猿)單克隆抗體H鏈V區(qū)的CDR)組成。在這種情況下，可部分改變CDR和FR的氨基酸序列，例如缺失、替換或添加。
本發(fā)明改變的抗體的H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)可以是來源于除人以外動物(例如小鼠、大鼠、牛、綿羊、猿、雞等)的單克隆抗體的H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)。在這種情況下，可部分改變CDR和FR的氨基酸序列，例如缺失、替換或添加。
本發(fā)明也涉及編碼上述各種改變的抗體的DNA，以及用于制備包含該DNA的重組載體的基因工程技術。
本發(fā)明還涉及用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。宿主細胞的例子為動物細胞，例如人細胞、小鼠細胞等，以及微生物，例如大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母等。
本發(fā)明涉及產(chǎn)生改變的抗體的方法，包括培養(yǎng)上述宿主，并從其培養(yǎng)物中提取該改變的抗體。
本發(fā)明另外涉及產(chǎn)生單鏈Fv二聚體的方法，包括在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)可產(chǎn)生該單鏈Fv的宿主動物細胞，以分泌單鏈Fv到培養(yǎng)基中，并分離培養(yǎng)基中形成的單鏈Fv二聚體。
本發(fā)明還涉及該改變的抗體作為激動劑的用途。也就是說，涉及信號轉(zhuǎn)導激動劑，其包含上述獲得的作為活性成分的改變的抗體。由于用于本發(fā)明的改變的抗體交聯(lián)細胞表面分子或細胞內(nèi)分子并誘導信號轉(zhuǎn)導，該分子可以是通過結(jié)合配基寡聚化(例如二聚體化)從而轉(zhuǎn)導信號進入細胞的任何分子。
此類細胞表面分子包括激素受體和細胞因子受體。激素受體包括，例如雌激素受體。細胞因子受體等包括造血因子受體、淋巴因子受體、生長因子受體、分化控制因子受體等。細胞因子受體的實例有紅細胞生成素(EPO)受體、血小板生成素(TPO)受體、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)受體、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)受體、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)受體、腫瘤壞死因子(TNF)受體、白細胞介素-1(IL-1)受體、白細胞介素-2(IL-2)受體、白細胞介素-3(IL-3)受體、白細胞介素-4(IL-4)受體、白細胞介素-5(IL-5)受體、白細胞介素-6(IL-6)受體、白細胞介素-7(IL-7)受體、白細胞介素-9(IL-9)受體、白細胞介素-10(IL-10)受體、白細胞介素-11(IL-11)受體、白細胞介素-12(IL-12)受體、白細胞介素-13(IL-13)受體、白細胞介素-15(IL-15)受體、干擾素-α(IFN-α)受體、干擾素-β(IFN-β)受體、干擾素-γ(IFN-γ)受體、生長激素(GH)受體、胰島素受體、血液干細胞增殖因子(SCF)受體、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)受體、上皮細胞生長因子(EGF)受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、成纖維細胞生長因子(FGF)受體、血小板源性生長因子(PDGF)受體、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)受體、白細胞遷移抑制因子(LIF)受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體、制瘤素M(OSM)受體、Notch家族受體等。
細胞內(nèi)表面分子包括TAK1、TAB1等。TAK1和TAB1作用于TGF-β的信號轉(zhuǎn)導途徑，通過形成異源二聚體活化MAP激酶，轉(zhuǎn)導一系列信號。許多癌細胞的抑制癌生長的TGF-β受體有突變，因此不能轉(zhuǎn)導TGF-β信號。可以交聯(lián)TAK1和TAB1而轉(zhuǎn)導信號的改變的抗體，能夠通過結(jié)合TAK1/TAB1的激動劑作用誘導TGF-β信號。本發(fā)明的這種改變的抗體能夠抑制TGF-β抗性癌細胞的生長，而提供了治療癌癥的新方法。細胞內(nèi)分子的其它實例為具有細胞增殖作用的轉(zhuǎn)錄因子E2F同源二聚體以及E2F/DP1異源二聚體。本發(fā)明的改變的抗體也能夠誘導對這些分子的激動劑作用，因此能夠用于治療各種細胞增殖相關的疾病。本發(fā)明的改變的抗體也能夠通過交聯(lián)在凋亡誘導相關的信號轉(zhuǎn)導中涉及的細胞內(nèi)因子而誘導激動劑作用，因此能夠誘導癌細胞或自身免疫疾病相關細胞的凋亡性細胞死亡。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的改變的抗體與細胞內(nèi)分子的相互作用，具有細胞膜通透能力的肽(例如Pegelin、Penetratin)可用于轉(zhuǎn)運該改變的抗體進入細胞(Martine Mazel等人，Doxorubicin-peptide conjugatesovercome multidrug resistance.Anti-Cancer Drugs 2001，12，DccrossiD.等人，The third helix of the antennapedia homeodomaintranslocates through biological membranes，J.Biol.Chem.1994，269，10444-10450)。
因此，包含激動劑改變的抗體為活性成分的藥物制劑用作各種疾病的預防和治療藥物等，例如癌癥、炎癥、激素紊亂、血液疾病以及自身免疫疾病。
可由受體蛋白質(zhì)形成的寡聚體可以是同源寡聚體或異源寡聚體，以及任何寡聚體，例如二聚體、三聚體和四聚體。例如，已知紅細胞生成素受體、血小板生成素受體、G-CSF受體、SCF受體、EGF受體等形成同源二聚體，IL-6受體、LIF受體和IL-11受體形成異源二聚體，而IL-2受體、CNTF受體、OSM受體形成異源三聚體。
本發(fā)明的改變的抗體包含源于單克隆抗體的2個或多個H鏈V區(qū)和2個或多個L鏈V區(qū)。該改變的抗體的結(jié)構(gòu)可以是包含1個H鏈V區(qū)和1個L鏈V區(qū)的單鏈Fv的二聚體，或者是包含2個H鏈V區(qū)和2個L鏈V區(qū)的多肽。在本發(fā)明的改變的抗體中，H鏈和L鏈的V區(qū)優(yōu)選通過一個或多個氨基酸組成的肽接頭相連。產(chǎn)生的改變的抗體包含抗體的可變區(qū)，以與原始單克隆抗體相同的特異性結(jié)合抗原。
H鏈V區(qū)本發(fā)明中，來源于抗體的H鏈V區(qū)識別細胞表面分子或細胞內(nèi)分子，例如蛋白質(zhì)(受體或信號轉(zhuǎn)導相關蛋白質(zhì))或者蛋白質(zhì)或細胞膜上的糖鏈，以及寡聚體，例如通過交聯(lián)所述分子而二聚體化，從而轉(zhuǎn)導信號進入細胞。本發(fā)明的H鏈V區(qū)包括來源于哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、牛、綿羊、猿等)的H鏈V區(qū)，以及具有部分改變的H鏈V區(qū)的氨基酸序列的H鏈V區(qū)。更優(yōu)選是人源化的H鏈V區(qū)，其包含人單克隆抗體H鏈V區(qū)的FR，以及小鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的CDR。還優(yōu)選具有源于人的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，其可以利用重組技術制備。本發(fā)明的H鏈V區(qū)可能是保留抗原結(jié)合能力的上述H鏈V區(qū)的片段。
L鏈V區(qū)本發(fā)明中，L鏈V區(qū)識別細胞表面分子或細胞內(nèi)分子，例如蛋白質(zhì)(受體或信號轉(zhuǎn)導相關蛋白質(zhì))或者蛋白質(zhì)或細胞膜上的糖鏈，以及寡聚體，例如通過交聯(lián)所述分子而二聚體化，從而轉(zhuǎn)導信號進入細胞。本發(fā)明的L鏈V區(qū)包括來源于哺乳動物(例如人、小鼠、大鼠、牛、綿羊、猿等)的L鏈V區(qū)，以及具有部分改變的L鏈V區(qū)的氨基酸序列的L鏈V區(qū)。更優(yōu)選是人源化的L鏈V區(qū)，其包含人單克隆抗體L鏈V區(qū)的FR，以及小鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)的CDR。還優(yōu)選具有源于人抗體的氨基酸序列的L鏈V區(qū)，其可以利用重組技術制備。本發(fā)明的L鏈V區(qū)可能是保留抗原結(jié)合能力的L鏈V區(qū)的片段。
互補決定區(qū)(CDR)L鏈和H鏈的每個V區(qū)形成抗原結(jié)合位點。L和H鏈的可變區(qū)由連接至3個高度可變區(qū)或互補決定區(qū)(CDR)的相當保守的4個共同構(gòu)架區(qū)組成(Kabat，E.A.等人，“Sequences of Protein ofImmunological Interest”，US Dept.Health and Human Services，1983)。
4個構(gòu)架區(qū)(FR)中的主要部分形成β-片層結(jié)構(gòu)，從而3個CDR形成環(huán)。某些情況下，CDR可能形成片層結(jié)構(gòu)的一部分。3個CDR在空間位置上通過FR互相接近，連同3個CDR形成抗原結(jié)合結(jié)點。
根據(jù)Kabat，E.A.等人“Sequences of Protein of ImmunologicalInterest”中的經(jīng)驗規(guī)則，將獲得的抗體V區(qū)氨基酸序列與已知抗體V區(qū)的已知氨基酸序列比較，來鑒定這些CDR。
單鏈Fv單鏈Fv是多肽單體，包含互相連接的源于單克隆抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)。產(chǎn)生的單鏈Fv包含親本單克隆抗體的可變區(qū)，并保留其互補決定區(qū)，因此該單鏈Fv通過與親本單克隆抗體相同的特異性結(jié)合抗原(JP-Appl.11-63557)。本發(fā)明單鏈Fv的一部分可變區(qū)和/或CDR，或其一部分氨基酸序列可能部分改變，例如缺失、替換或添加。前已述及構(gòu)成本發(fā)明單鏈Fv的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，它們可以直接連接或通過接頭相連，優(yōu)選肽接頭。單鏈Fv的結(jié)構(gòu)可以是[H鏈V區(qū)]-[L鏈V區(qū)]，或者[L鏈V區(qū)]-[H鏈V區(qū)]。本發(fā)明中，有可能使單鏈Fv形成二聚體、三聚體或四聚體，從中形成本發(fā)明的改變的抗體。
單鏈改變的抗體本發(fā)明包含兩個或多個H鏈V區(qū)以及兩個或多個L鏈V區(qū)(優(yōu)選每種2-4個，特別優(yōu)選每種2個)的單鏈改變的抗體，包含上述的兩個或多個H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)。應當排列肽的每個區(qū)，使改變的單鏈抗體形成特定的空間結(jié)構(gòu)，精確地模擬由單鏈Fv二聚體形成的空間結(jié)構(gòu)。例如，按下列方式的順序排列V區(qū)[H鏈V區(qū)]-[L鏈V區(qū)]-[H鏈V區(qū)]-[L鏈V區(qū)]；或者[L鏈V區(qū)]-[H鏈V區(qū)]-[L鏈V區(qū)]-[H鏈V區(qū)]，其中這些區(qū)分別通過肽接頭相連。
接頭本發(fā)明中，連接H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)之間的接頭可能是能通過基因工程方法引入的任何肽接頭，或者是化學合成的任何接頭。例如，本發(fā)明可以使用文獻中公開的接頭，如Protein Egineering，9(3)，299-305，1996。這些接頭在同一分子中可以相同或不同。如果需要肽接頭，以下為引用的接頭實例
SerGly-SerGly-Gly-SerSer-Gly-GlyGly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n以及(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n其中n是不小于1的整數(shù)。優(yōu)選的肽接頭長度根據(jù)作為抗原的受體而變化，對于單鏈Fv，通常優(yōu)選1-20個氨基酸范圍內(nèi)。對于包含兩個或多個H鏈V區(qū)以及兩個或多個L鏈V區(qū)的單鏈改變的抗體，與其連接形成包含[H鏈V區(qū)]-[L鏈V區(qū)](或[L鏈V區(qū)]-[H鏈V區(qū)])的相同抗原結(jié)合位點的肽接頭長度為1-30個氨基酸，優(yōu)選1-20個氨基酸，更優(yōu)選3-18個氨基酸。與其連接而不形成包含[H鏈V區(qū)]-[L鏈V區(qū)](或[L鏈V區(qū)]-[H鏈V區(qū)])的相同抗原結(jié)合位點的肽接頭長度為1-40個氨基酸，優(yōu)選3-30個氨基酸，更優(yōu)選5-20個氨基酸。在編碼本發(fā)明改變的抗體的DNA構(gòu)建體的說明中，將描述引入這些接頭的方法。
根據(jù)本發(fā)明，化學合成的接頭，即化學交聯(lián)劑，可以是常規(guī)用于連接肽的任何接頭。接頭的例子包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺酯)(BS3)、二硫代雙(丙酸琥珀亞胺酯)(DSP)、二硫代雙(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酸琥珀酰亞胺酯)(EGS)、乙二醇雙(琥珀酸磺基琥珀酰亞胺酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-DST)、雙[2-(琥珀酰亞胺基氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、雙[2-(磺基琥珀酰亞胺基氧羰基氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)等。這些都是商品化的。優(yōu)選與肽接頭長度相同的化學合成接頭。
為形成單鏈Fv的二聚體，優(yōu)選接頭適于在溶液中，例如培養(yǎng)基中使宿主細胞產(chǎn)生的單鏈Fv二聚體化超過20％，優(yōu)選超過50％，更優(yōu)選超過80％，最優(yōu)選超過90％。特別地，優(yōu)選接頭由2-12個氨基酸組成，優(yōu)選3-10個氨基酸，或其它相應接頭。
改變的抗體的制備通過用上述接頭連接來源于特異性結(jié)合細胞表面分子的已知或新型單克隆抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，可制備改變的抗體。涉及的單鏈Fv的例子有MABL1-scFv和MABL2-scFv，其包含分別來源于抗體MABL-1和抗體MABL-2的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)。涉及的包含兩個H鏈V區(qū)和兩個L鏈V區(qū)的單鏈多肽的例子有包含來源于上述抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的MABL1-sc(Fv)2和MABL2-sc(Fv)2。
為制備該多肽，如果希望該多肽是分泌肽，則可在多肽N端連接信號肽。為有效純化多肽，可以連接眾所周知的用于多肽純化的氨基酸序列，例如FLAG序列。在此情況下，利用抗FLAG抗體可以形成二聚體。
為制備本發(fā)明的改變的抗體，必須獲得DNA，即編碼單鏈Fv的DNA或者編碼重建的單鏈多肽的DNA。這些DNA，特別是MABL1-scFv、MABL2-scFv、MABL1-sc(Fv)2和/或MABL2-sc(Fv)2的DNA，可獲得自編碼來源于所述Fv的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的DNA。它們也可以通過PCR方法獲得，其利用這些DNA為模板，以及對應其兩末端的引物對，擴增其中包含目的氨基酸序列的DNA部分。
當需要每個V區(qū)具有部分改變的氨基酸序列時，可使用PCR，通過本領域已知的方法，獲得其中一個或一些氨基酸改變的V區(qū)，即缺失、替換或增加。為制備對特定抗原具有充分活性的改變的抗體，優(yōu)選地利用本領域已知的PCR方法，改變V區(qū)中的部分氨基酸序列。
為確定PCR擴增的引物，必須決定目的抗體的H鏈和L鏈的類型。然而抗體MABL-1和抗體MABL-2已有報道，抗體MABL-1為κ型L鏈和γ1型H鏈，抗體MABL-2為κ型L鏈和γ2a型H鏈(JP-Appl.11-63557)。為PCR擴增編碼抗體MABL-1和/或抗體MABL-2的H鏈和L鏈的DNA，可以使用Jones，S.T.等人，Bio/Technology，9，88-89，1991所述引物。
為PCR擴增抗體MABL-1和抗體MABL-2的L鏈V區(qū)，按上述方法確定5’端和3’端的寡核苷酸引物。以同樣方法確定擴增抗體MABL-1和抗體MABL-2的H鏈V區(qū)所用的5’端和3’端寡核苷酸引物。
本發(fā)明的實施方案中，使用的5’端引物包含“GANTC”序列，在其5’端附近提供限制性酶Hinf I識別位點，3’端引物包含核苷酸序列“CCCGGG”，在其5’端附近提供XmaI識別位點。只要可用于將目的DNA片段亞克隆到克隆載體中，可以使用其它限制性酶識別位點代替這些位點。
使用特別設計的PCR引物，在抗體MABL-1和MABL-2的V區(qū)編碼cDNA的5’端和3’端提供合適的核苷酸序列，從而使cDNA容易插入表達載體并在表達載體中具有適當?shù)墓δ?例如，本發(fā)明設計通過插入Kozak序列提高翻譯效率)。將利用這些引物進行PCR擴增獲得的抗體MABL-1和MABL-2的V區(qū)插入包含目的人C區(qū)的HEF表達載體(見WO92/19759)?？衫萌魏纬Ｒ?guī)方法測序克隆的DNA，例如利用自動DNA測序儀(Applied Biosystems)。
可按下列方法，將一接頭，例如肽接頭引入本發(fā)明的改變的抗體。設計具有上述H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)引物的部分互補序列，以及編碼接頭的N端或C端的引物。然后，利用這些引物進行PCR，制備具有目的氨基酸序列及長度的肽接頭的編碼DNA。利用得到的DNA連接H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的編碼DNA，制備編碼本發(fā)明具有目的肽接頭的改變的抗體的DNA。一旦制備了編碼一個改變的抗體的DNA，通過設計接頭的各種引物，利用引物以及上述DNA為模板進行PCR，可以很容易制備編碼有或沒有目的肽接頭的改變的抗體的DNA。
利用常規(guī)技術(例如，Sato K.等人，Cancer Res.，53，1-6(1993))，能夠?qū)Ρ景l(fā)明改變的抗體的每個V區(qū)進行人源化。一旦制備了編碼每個人源化Fv的DNA，按照常規(guī)方法，可很容易制備人源化單鏈Fv、人源化單鏈Fv的片段、人源化單克隆抗體以及人源化單克隆抗體的片段。優(yōu)選地，如果需要，可以對其V區(qū)氨基酸序列進行部分改變。
此外，利用上述常規(guī)方法，按制備編碼源于小鼠的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的DNA所用的同樣方式，可以制備源于其它哺乳動物的DNA，例如編碼人抗體的每個V區(qū)的DNA。得到的DNA可用于制備其它哺乳動物，特別是來源于人抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)、來源于人的單鏈Fv及其片段、以及人源單克隆抗體及其片段。
如果本發(fā)明的改變的抗體為雙特異性改變的抗體，則可以通過已知方法制備(例如WO9413804所述方法)。
如上所述，如果制備了編碼改變的抗體的V區(qū)以及人源化改變的抗體的V區(qū)的目的編碼DNA，就可以按照常規(guī)方法獲得包含它們的表達載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的宿主。此外，可按照常規(guī)方法培養(yǎng)宿主，以制備重建的單鏈Fv、重建的人源化單鏈Fv、人源化單克隆抗體及其片段。其可從細胞或培養(yǎng)基中分離，并純化為均一物質(zhì)。為此目的，可以聯(lián)合使用用于蛋白質(zhì)分離和純化的任何常規(guī)方法，例如，如果需要，但不局限于，層析、超濾、鹽析和透析。
當在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)動物細胞，例如COS7細胞或CHO細胞，優(yōu)選CHO細胞，制備本發(fā)明的重建單鏈Fv時，在培養(yǎng)基中形成的所述單鏈Fv的二聚體可以穩(wěn)定回收并高產(chǎn)量純化。這樣純化的二聚體能夠長期穩(wěn)定保存。本發(fā)明使用的無血清培養(yǎng)基可以是常規(guī)用于制備重組蛋白質(zhì)的任何培養(yǎng)基，但并不局限于此。
為制備本發(fā)明的改變的抗體，可以利用任何表達系統(tǒng)，例如，真核細胞如動物細胞，例如建立的哺乳動物細胞系、絲狀真菌和酵母，以及原核細胞如細菌細胞，例如E.coli。優(yōu)選地，在哺乳動物細胞中表達本發(fā)明的改變的抗體，例如COS7細胞或CHO細胞。
在這些情況下，可使用可用于哺乳動物細胞表達的常規(guī)啟動子。優(yōu)選使用人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期啟動子。包含HCMV啟動子的表達載體包括源于pSV2neo的HCMV-VH-HCγ1、HCMV-VL-HCK等(WO92/19759)。
此外，本發(fā)明可使用的可用于哺乳動物細胞基團表達的其它啟動子包括來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、多形瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)的病毒啟動子，以及來源于哺乳動物的啟動子，例如人多肽鏈延長因子1α(HEF-1α)。根據(jù)Mulligan R.C.等人的方法可容易使用SV40啟動子(Nature 277，108-114(1979))，也可根據(jù)Mizushima S.等人方法使用HEF-1α啟動子(Nucleic Acids Research，18，5322(1990))。
可用于本發(fā)明的復制起點(ori)包括來源于SV40、多形瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的起點。表達載體可包含磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3’)II或I(neo)基因、胸苷激酶(TK)基因、E.coli黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因或二氫葉酸還原酶(DHFR)基因作為選擇標志。
利用常規(guī)方法如放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或表面胞質(zhì)基因共振技術(surface plasmon resonance)，可以評價上述制備的改變的抗體的抗原結(jié)合活性。也可以利用原始抗體的結(jié)合-抑制能力為指標，例如就所述單克隆抗體與抗原的結(jié)合是否存在濃度依賴性抑制作用，來評價其活性。
更詳細地，培養(yǎng)用包含編碼本發(fā)明改變的抗體的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化的動物細胞，例如COS7細胞或CHO細胞。培養(yǎng)的細胞和/或培養(yǎng)基上清、或從中純化的改變的抗體，用于測定與抗原的結(jié)合。用培養(yǎng)只轉(zhuǎn)化表達載體的細胞的培養(yǎng)基上清作對照。對于抗原，例如抗體MABL-1和抗體MABL-2，將本發(fā)明改變的抗體的測試樣品或?qū)φ丈锨寮尤氡磉_人IAP的小鼠白血病L1210細胞系，然后進行例如流式細胞術測定，以評價抗原結(jié)合活性。
利用以下方法體外評價信號轉(zhuǎn)導效應(對抗體MABL-1和抗體MABL-2而言的凋亡誘導效應)將上述改變的抗體的測試樣品加入表達該抗體的細胞、或者已經(jīng)轉(zhuǎn)入該抗體基因的細胞中，利用常規(guī)方法，通過信號轉(zhuǎn)導所致變化進行評價，例如是否以人IAP-抗原特異性方式誘導細胞死亡。
利用以下方法體內(nèi)評價凋亡誘導效應，例如在改變的抗體識別人IAP的情況下(例如改變的抗體來源于抗體MABL-1和抗體MABL-2)制備人骨髓瘤的小鼠模型。對小鼠靜脈內(nèi)給予單克隆抗體或本發(fā)明的改變的抗體，誘導具有IAP的有核血細胞凋亡。對照組小鼠只給予PBS?；谛∈笱逯腥薎gG含量及其存活時間的變化，以抗腫瘤效應評價其凋亡誘導作用。
如上所述，通過制備包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)、并特異性結(jié)合靶細胞表面分子或細胞內(nèi)分子的改變的抗體，并通過上述體內(nèi)或體外評價篩選該改變的抗體，可以獲得本發(fā)明的改變的抗體。
本發(fā)明包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)、優(yōu)選每種2-4個、更優(yōu)選每種2個的改變的抗體，可能是包含一個H鏈V區(qū)和一個L鏈V區(qū)的單鏈Fv的二聚，或者是其中有二個或多個H鏈V區(qū)和二個或多個L鏈V區(qū)相連的單鏈多肽?？梢哉J為，由于這樣的構(gòu)造，使肽模擬天然配基的三維結(jié)構(gòu)，從而保持優(yōu)良的抗原結(jié)合特性和激動劑活性。
本發(fā)明的改變的抗體相比于抗體分子(完全IgG)具有顯著降低的分子大小，因而具有對組織或腫瘤的高通透性，比原始的激動劑單克隆抗體更高活性。因此，適當選擇親本抗體有可能轉(zhuǎn)導各種信號進入細胞，并誘導細胞的各種作用，例如誘導凋亡、誘導細胞增殖、誘導細胞分化、誘導細胞分裂或細胞周期調(diào)節(jié)作用。包含它們的藥物制劑用于治療可通過誘導信號轉(zhuǎn)導醫(yī)治的疾病，例如癌癥、炎癥、激素紊亂、自身免疫疾病以及血液病，例如白血病、惡性淋巴瘤、再生障礙性貧血、骨髓發(fā)育不良綜合癥以及真性紅細胞增多癥。還期望本發(fā)明的抗體經(jīng)過RI標記后可用作造影劑。通過連接RI化合物或毒素，可增強其效果。
本發(fā)明的最佳工作方式本發(fā)明將根據(jù)以下實施例具體闡明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
為闡明本發(fā)明改變的抗體的制備方法，制備單鏈Fv的實施例如下所示。制備改變的抗體的實施例中使用小鼠抗人IAP抗體，MABL-1和MABL-2。1997年9月11日，將產(chǎn)生這兩個抗體的雜交瘤MABL-1和MABL-2，分別以FERM BP-6100和FERM BP-6101國際性地保藏于微生物保藏機構(gòu)——國立生命科學和人類技術研究所，工業(yè)科學和技術所，國際貿(mào)易和工業(yè)部(National Institute of Bioscience andhuman Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Minister of International Trade and Industry)(1-3 Higasi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan)。
實施例實施例1(克隆小鼠抗人IAP單克隆抗體V區(qū)的編碼DNA)如下克隆小鼠抗人IAP單克隆抗體MABL-1和MABL-2的可變區(qū)的編碼DNA。
1.1制備信使RNA(mRNA)利用mRNA Purification試劑盒(Pharmacia Biotech)獲得雜交瘤MABL-1和MABL-2的mRNA。
1.2合成雙鏈cDNA利用Marathon cDNA Amplification試劑盒(CLONTECH)從大約1μgmRNA合成雙鏈cDNA，并連上一個接頭。
1.3 PCR擴增抗體可變區(qū)的編碼基團利用Thermal Cycler(PERKIN ELMER)進行PCR。
(1)擴增MABL-1L鏈V區(qū)編碼基因用于PCR方法的引物是SEQ ID No.1所示Adapter引物-1，(CLONTECH)，它與接頭的部分序列雜交，以及SEQ ID No.2所示MKC(鼠Kappa恒定)引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)，它與小鼠Kappa型L鏈V區(qū)雜交。
50μl PCR溶液包含5μl 10×PCR緩沖液II、2mM MgCl2、0.16mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、2.5單位DNA聚合酶AmpliTaqGold(PERKIN ELMER)、0.2μM SEQ ID No.1接頭引物、0.2μMSEQ ID No.2MKC引物以及0.1μg來源于MABL-1的雙鏈cDNA。溶液于起始溫度94℃預熱9分鐘，然后依次94℃加熱1分鐘、60℃ 1分鐘，72℃ 1分20秒。此溫度循環(huán)重復35次，然后72℃再加熱反應混合物10分鐘。
(2)擴增MABL-1H鏈V區(qū)的編碼cDNASEQ ID No.1所示Adapter引物-1以及SEQ ID No.3所示MHC-γ1(小鼠重鏈恒定)引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)用作PCR引物。
按照實施例1.3-(1)所述L鏈V區(qū)基因的擴增方法進行cDNA擴增，只是使用0.2μM MHC-γ1引物，而非0.2μM MKC引物。
(3)擴增MABL-2L鏈V區(qū)的編碼cDNASEQ ID No.1的Adapter引物-1以及SEQ ID No.2的MKC引物用作PCR引物。
按照實施例1.3-(1)所述MABL-1 L鏈V區(qū)基因的擴增方法進行cDNA擴增，只是使用0.1μg來源于MABL-2的雙鏈cDNA，而非0.1μg MABL-1的雙鏈cDNA。
(4)擴增MABL-2H鏈V區(qū)的編碼cDNASEQ ID No.1的Adapter引物-1以及SEQ ID No.4所示MHC-γ2a引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)用作PCR引物。
按照實施例1.3-(3)所述L鏈V區(qū)基因擴增方法進行cDNA擴增，只是使用0.2μM MHC-γ2a引物，而非0.2μM MKC引物。
1.4純化PCR產(chǎn)物利用QIAquick PCR Purification試劑盒(QIAGEN)純化上述PCR擴增的DNA片段，并溶于含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH8.0)。
1.5連接和轉(zhuǎn)化上述制備的包含源于Kappa型小鼠MABL-1L鏈V區(qū)編碼基因的DNA片段約140ng，與50ng pGEM-T Easy載體(Promega)于15℃連接3小時，反應緩沖液包含30mM Tris-HCl(pH7.8)、10mMMgCl2、10mM二硫蘇糖醇、1mM ATP以及3單位T4DNA連接酶(Promega)。
然后將1μl反應混合物加入50μlE.ColiDH5α感受態(tài)細胞中(Toyobo Inc.)，細胞于冰上保存30分鐘，42℃溫育1分鐘，冰上再保存2分鐘。加入100μl SOC培養(yǎng)基(GIBCO BRL)。將E.coli細胞接種在含100μg/ml氨芐青霉素(SIGMA)的LB瓊脂培養(yǎng)基中(Molecular CloningA laboratory Manual，Sambrook等人，ColdSpring Harbor laboratory Press，1989)，37℃培養(yǎng)過夜，獲得E.coli轉(zhuǎn)化子。
轉(zhuǎn)化子在3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，使用QIAprep Spin Minprep試劑盒(QIAGEN)從培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。
所得包含源于雜交瘤MABL-1的小鼠Kappa型L鏈V區(qū)的編碼基因的質(zhì)粒，命名為pGEM-M1L。
按照上述相同的方法，從純化的DNA片段中制備質(zhì)粒，其包含源于雜交瘤MABL-1的小鼠H鏈V區(qū)編碼基因，命名為pGEM-M1H。
從純化的DNA片段中制備質(zhì)粒，其包含源于雜交瘤MABL-2的小鼠Kappa型L鏈V區(qū)編碼基因，命名為pGEM-M2L。
從純化的DNA片段中制備質(zhì)粒，其包含源于雜交瘤MABL-2的小鼠H鏈V區(qū)編碼基因，命名為pGEM-M2H。
實施例2(DNA測序)利用Auto DNA Sequencer(Applied Biosystem)和ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒(AppliedBiosystem)，按照制造商規(guī)程，測定上述質(zhì)粒中cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列。
質(zhì)粒pGEM-M1L中包含小鼠抗體MABL-1的L鏈V區(qū)編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
質(zhì)粒pGEM-M1H中包含小鼠抗體MABL-1的H鏈V區(qū)編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
質(zhì)粒pGEM-M2L中包含小鼠抗體MABL-2的L鏈V區(qū)編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
質(zhì)粒pGEM-M2H中包含小鼠抗體MABL-2的H鏈V區(qū)編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
實施例3(確定CDR)L鏈與H鏈的V區(qū)通常結(jié)構(gòu)相似，其每四個構(gòu)架區(qū)通過三個高度可變區(qū)，即互補決定區(qū)(CDR)相連。構(gòu)架的氨基酸序列相對很保守，而CDR的氨基酸序列極其高度可變(Kabat E.A.等人，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，US Dept.Health and HumanServices，1983)。
基于這些事實，將小鼠抗人IAP單克隆抗體的可變區(qū)氨基酸序列，應用到Kabat等人建立的抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中，檢索其同源性。表1所示為根據(jù)同源性確定的CDR區(qū)。
表1質(zhì)粒SEQ ID No.CDR(1)CDR(2)CDR(3)pGEM-M1L543-58 74-80113-121pGEM-M1H650-54 69-85118-125pGEM-M2L743-58 74-80113-121pGEM-M2H850-54 69-85118-125實施例4(鑒定克隆cDNA的表達、制備嵌合MABL-1抗體和嵌合MABL-2抗體)4.1制備表達嵌合MABL-1抗體的載體分別編碼小鼠抗體MABL-1的L鏈與H鏈V區(qū)的cDNA克隆pGEM-M1L和pGEM-M1H，經(jīng)過PCR方法改變后，引入HEF表達載體(WO92/19759)，制備表達嵌合MABL-1抗體的載體。
設計L鏈V區(qū)的正向引物MLS(SEQ ID No.9)和H鏈V區(qū)的正向引物MHS(SEQ ID No.10)，使之可與每個V區(qū)前導序列開始處的編碼DNA雜交，并包含Kozak共有序列(J.Mol.Biol.，196，947-950，1987)以及HindIII限制性酶位點。設計L鏈V區(qū)反向引物MLAS(SEQ ID No.11)和H鏈V區(qū)反向引物MHAS(SEQ ID No.12)，使之可與J區(qū)末端編碼DNA雜交，并包含剪接供體序列以及BamHI限制性酶位點。
將包含10μl 10×PCR緩沖液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold、0.4uM每種引物和8ng模板DNA(pGEM-M1L或pGEM-M1H)的100μl PCR溶液，在起始溫度94℃預熱9分鐘，然后依次94℃加熱1分鐘、60℃ 1分鐘、72℃ 1分20秒。此溫度循環(huán)重復35次，72℃再加熱反應混合物10分鐘。
用QIAquick PCR Purification試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，然后用HindIII和BamHI消化。L鏈V區(qū)的產(chǎn)物克隆到HEF表達載體HEF-κ中，將H鏈V區(qū)的產(chǎn)物克隆到HEF表達載體HEF-γ中。DNA測序后，包含正確序列DNA片段的質(zhì)粒，分別命名為HEF-M1L和HEF-M1H。
4.2制備表達嵌合MABL-2抗體的載體按照如實施例4.1所述相同的方法，對cDNA進行改變和克隆，只是使用pGEM-M2L和pGEM-M2H為模板DNA，而非pGEM-M1L和pGEM-M1H。DNA測序后，含有正確序列DNA片段的質(zhì)粒，分別命名為HEF-M2L和HEF-M2H。
4.3轉(zhuǎn)染COS7細胞在COS7細胞中測試上述表達載體，觀察嵌合MABL-1和MABL-2抗體的瞬時表達。
(1)轉(zhuǎn)染嵌合MABL-1抗體的基因使用Gene Pulser裝置(BioRad)，通過電穿孔將HEF-M1L和HEF-M1H載體共轉(zhuǎn)化COS7細胞。小杯中加入每種DNA(10μg)和0.8ml含1×107細胞/ml的PBS?；旌衔镉?.5KV、25μF電容脈沖處理。
室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞轉(zhuǎn)到包含10％無γ-球蛋白的胎牛血清的DMFM培養(yǎng)基中(GIBCO BRL)。培養(yǎng)72小時后，收集上清，離心去除細胞碎片并回收。
(2)轉(zhuǎn)染編碼嵌合MABL-2抗體的基因利用如實施例4.3-(1)所述相同方法，將嵌合MABL-2抗體的編碼基因共轉(zhuǎn)染COS7細胞，只是使用HEF-M2L和HEF-M2H載體，而非HEF-M1L和HEF-M1H載體。以同樣方法回收上清。
4.4流式細胞術利用上述COS7細胞培養(yǎng)上清進行流式細胞術分析，測量其抗原結(jié)合。將表達嵌合MABL-1抗體的COS7細胞或表達嵌合MABL-2抗體的COS7的細胞的培養(yǎng)上清或者作為對照的人IgG抗體(SIGMA)，加入4×105表達人IAP的小鼠白血病細胞系L1210細胞中，冰浴。洗滌后，向其中加入FITC標記的抗人IgG抗體(Cappel)。溫育并洗滌后，用FACScan裝置(BECTON DICKINSON)測量其熒光強度。
由于嵌合MABL-1和MABL-2抗體特異性結(jié)合表達人IAP的L1210細胞，可以確認，這些嵌合抗體分別具有小鼠單克隆抗體MABL-1和MABL-2的正確V區(qū)結(jié)構(gòu)(附圖1-3)。
實施例5(制備抗體MABL-1和抗體MABL-2的重建單鏈Fv(scFv))5.1制備抗體MABL-1的重建單鏈Fv如下制備抗體MABL-1的重建單鏈Fv。利用PCR方法分別擴增抗體MABL-1的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，以及接頭，并連接在一起，以制備抗體MABL-1的重建單鏈Fv。制備方法如圖4所示。利用六種引物(A-F)制備抗體MABL-1的單鏈Fv。引物A、C和E具有正義序列，引物B、D和F具有反義序列。
H鏈V區(qū)的正向引物VHS(引物A，SEQ ID No.13)設計為可與H鏈V區(qū)N端編碼DNA雜交，并包含NcoI限制性酶識別位點。H鏈V區(qū)的反向引物VHAS(引物B，SEQ ID No.14)設計為可與H鏈V區(qū)C端編碼DNA雜交，并與接頭重疊。
接頭的正向引物LS(引物C，SEQ ID No.15)設計為可與接頭N端編碼DNA雜交，并與H鏈V區(qū)C端編碼DNA重疊。接頭的反向引物LAS(引物D，SEQ ID No.16)設計為可與接頭C端編碼DNA雜交，并與L鏈V區(qū)N端編碼DNA重疊。
L鏈V區(qū)的正向引物VLS(引物E，SEQ ID No.17)設計為可與接頭C端編碼DNA雜交，并與L鏈V區(qū)N端編碼DNA重疊。L鏈V區(qū)的反向引物VLAS-FLAG(引物F，SEQ ID No-18)設計為可與L鏈V區(qū)C端編碼DNA雜交，并具有FLAG肽編碼序列(Hopp T.P.等人，Bio/Technology，6，1204-1210，1988)、兩個終止密碼子以及EcoRI限制性酶識別位點。
在第一個PCR步驟中，進行A-B、C-D、E-F三個反應，純化其PCR產(chǎn)物。將第一步PCR獲得的三種PCR產(chǎn)物按照其互補性進行組裝。然后加入引物A和F，擴增抗體MABL-1的重建單鏈Fv的全長編碼DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分別用作模板的質(zhì)粒包括，編碼抗體MABL-1H鏈V區(qū)的質(zhì)粒pGEM-M1H(參見實施例2)，包含接頭區(qū)編碼DNA序列的質(zhì)粒pSC-DP1(該接頭區(qū)包含Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID No.19))(Huston J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883，1988)，以及編碼抗體MABL-1L鏈V區(qū)的質(zhì)粒pGEM-M1L(參見實施例2)。
第一步PCR反應的50μl溶液包含5μl 10×PCR緩沖液II、2mMMgCl2、0.16mM dNTPs、2.5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKIN ELMER)、0.4μM每種引物和5ng每種模板DNA。PCR溶液在起始溫度94℃預熱9分鐘，然后依次94℃加熱1分鐘、65℃ 1分鐘，72℃ 1分20秒。此溫度循環(huán)重復35次，然后72℃再加熱反應混合物7分鐘。
利用QIApuick PCR Purification試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物A-B(371bp)、C-D(63bp)和E-F(384bp)，并在第二步PCR中組裝。第二步PCR中，將包含120ng第一步PCR產(chǎn)物A-B、20ng PCR產(chǎn)物C-D和120ng PCR產(chǎn)物E-F、10μl 10×PCR緩沖液II、2mMMgCl2、0.16mM dNTPs、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKINELMER)的98μl PCR溶液，在起始溫度94℃預熱8分鐘，然后依次94℃加熱2分鐘、65℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘。此溫度循環(huán)重復2次，然后反應中分別加入每種引物A和F 0.4μM?；旌衔镌谄鹗紲囟?4℃預熱1分鐘，然后依次94℃加熱1分鐘、65℃ 1分鐘、72℃ 1分20秒。此溫度循環(huán)重復35次，然后72℃再加熱反應混合物7分鐘。
純化第二步PCR制備的843bp DNA片段，用NcoI和EcoRI消化。將得到的DNA片段克隆到pSCFVT7載體。表達載體pSCFVT7包含適于E.coli周質(zhì)表達系統(tǒng)的peIB信號序列(Lei S.P.等人，J.Bacteriology，169，4379-4383，1987)。DNA測序后，將包含抗體MABL-1的重建單鏈Fv正確氨基酸序列的編碼DNA片段的質(zhì)粒，命名為“pscM1”(參見圖5)。質(zhì)粒pscM1中包含抗體MABL-1重建單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列，如SEQ ID No.20所示。
利用PCR方法改變pscM1載體，以制備在哺乳動物細胞中表達抗體MABL-1重建單鏈Fv的載體。將得到的DNA片段引入pCHO1表達載體。表達載體pCHO1是經(jīng)過EcoRI和SmaI消化DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759)，去除抗體基因，并連上EcoRI-NotI-BamHI銜接頭(Takara Shuzo)而構(gòu)建的。
設計SEQ ID No.21所示Sal-VHS引物，作為PCR正向引物，其可與H鏈V區(qū)N端的編碼DNA雜交，并包含Sal I限制性酶識別位點。設計如SEQ ID No.22所示FRH1anti引物，作為PCR反向引物，其可與第一構(gòu)架序列末端的編碼DNA雜交。
將包含10μl 10×PCR緩沖液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold、0.4μl每種引物以及8ng模板DNA(pscM1)的100μl PCR溶液，在起始溫度95℃預熱9分鐘，然后依次95℃加熱1分鐘、60℃ 1分鐘，72℃ 1分20秒。重復此溫度循環(huán)35次，然后72℃再加熱反應混合物7分鐘。
利用QIAquick PCR Purification試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，用SalI和MboII消化，獲得抗體MABL-1的重建單鏈Fv的N端編碼DNA片段。用MboII和EcoRI消化pscM1載體，獲得抗體MABL-1的重建單鏈Fv C端編碼DNA片段。將該SalI-MboII DNA片段和MboII-EcoRI DNA片段克隆到pCHO1-IgS載體。DNA測序后，將包含目的DNA序列的質(zhì)粒命名為“pCHOM1”(參見圖6)。表達載體pCHO1-Igs包含適于哺乳動物細胞分泌表達系統(tǒng)的小鼠IgG1信號序列(Nature，322，323-327，1988)。質(zhì)粒pCHOM1包含的抗體MABL-1重建單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。
5.2制備抗體MABL-2的重建單鏈Fv按照上述實施例5.1方法，制備抗體MABL-2的重建單鏈Fv。第一步PCR中利用編碼MABL-2的H鏈V區(qū)的質(zhì)粒pGEM-M2H(參見實施例2)，而非pGEM-M1H，以及編碼MABL-2的L鏈V區(qū)的質(zhì)粒pGEM-M2L(參見實施例2)，而非pGEM-M1L，從而獲得質(zhì)粒pscM2，其中包含的抗體MABL-2的單鏈Fv目的氨基酸序列的編碼DNA片段。質(zhì)粒pscM2中包含抗體MABL-2的重建單鏈Fv，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。
利用PCR方法改變pscM2載體，制備載體pCHOM2，用于在哺乳動物細胞中表達，其中包含抗體MABL-2的重建單鏈Fv正確氨基酸序列的編碼DNA片段。質(zhì)粒pCHOM2中包含的抗體MABL-2的重建單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.25所示。
5.3轉(zhuǎn)染COS7細胞在COS7細胞中測試pCHOM2載體，觀察抗體MABL-2的重建單鏈Fv的瞬時表達。
利用Gene Pulser裝置(BioRad)，通過電穿孔將pCHOM2轉(zhuǎn)化COS7細胞。向小杯中加入DNA(10μg)以及0.8ml含1×107細胞/ml的PBS。用1.5KV、25μF電容脈沖處理混合物。
室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞轉(zhuǎn)到含有10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中(GIBCO BRL)。培養(yǎng)72小時后，收集上清，離心去除細胞碎片并回收。
5.4在COS7細胞培養(yǎng)上清中檢測抗體MABL-2的重建單鏈Fv在經(jīng)pCHOM2載體轉(zhuǎn)染的COS7細胞的培養(yǎng)上清中，通過Western印跡方法確認抗體MABL-2的單鏈Fv的存在。
將經(jīng)pCHOM2載體轉(zhuǎn)染的COS7細胞的培養(yǎng)上清，以及作對照的經(jīng)pCHO1轉(zhuǎn)染的COS7細胞培養(yǎng)上清，進行SDS電泳，并轉(zhuǎn)到REINFORCED NC膜上(Schleicher & Schuell)。用5％脫脂牛奶(Morinaga Nyu-gyo)封閉膜，用0.05％Tween20-PBS洗滌，與抗FLAG抗體混合(SIGMA)。膜在室溫下溫育、洗滌并混合堿性磷酸酶偶聯(lián)的小鼠IgG抗體(Zymed)。室溫下溫育并洗滌后，加入底物液(Kirkegaard Perry Laboratories)顯色(圖7)。
只在引入pCHOM2載體的COS7細胞的培養(yǎng)上清中檢測到FLAG肽特異性蛋白質(zhì)，從而證明抗體MABL-2的重建單鏈Fv分泌到培養(yǎng)上清中。
5.5流式細胞術利用上述COS7細胞培養(yǎng)上清，通過流式細胞術測定抗原結(jié)合。將表達抗體MABL-2的重建單鏈Fv的COS7細胞培養(yǎng)上清，或者作對照的經(jīng)pCHO1載體轉(zhuǎn)化的COS7細胞培養(yǎng)上清，加入2×105個表達人整合素相關蛋白質(zhì)(IAP)的小鼠白血病細胞系L1210細胞中，或者加入作對照的pCOS1轉(zhuǎn)化的L1210細胞系的細胞中。冰浴并洗滌后，加入小鼠抗FLAG抗體(SIGMA)。然后溫育細胞并洗滌。之后向其中加入FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BECTONDICKINSON)，溫育細胞并再次洗滌。隨后用FACScan裝置(BECTON DICKINSON)測量熒光強度。
由于抗體MABL-2的單鏈Fv與表達人IAP的L1210細胞特異性結(jié)合，故可以確定抗體MABL-2的重建單鏈Fv對人整合素相關蛋白質(zhì)(IAP)具有親和力(參見圖8-11)。
5.6競爭性ELISA根據(jù)對小鼠單克隆抗體結(jié)合抗原的抑制活性，測定抗體MABL-2的重建單鏈Fv的結(jié)合活性。
將抗FLAG抗體調(diào)整為1μg/ml，加入96孔板的每孔中，37℃溫育2小時。洗滌后，用1％BSA-PBS封閉。室溫下溫育并洗滌后，將引入了分泌型人IAP抗原基因(SEQ ID No.26)的COS7細胞培養(yǎng)上清，用PBS稀釋到兩倍體積，加入每孔中。室溫下溫育并洗滌后，將50μl調(diào)整為100ng/ml的生物素化MABL-2抗體與50μl順序稀釋的表達抗體MABL-2的重建單鏈Fv的COS7細胞培養(yǎng)上清的混合物，加入每孔中。室溫下溫育并洗滌后，每孔中加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈親合素(Zymed)。室溫下溫育并洗滌后，加入底物液(SIGMA)，測量每孔中反應混合物在405nm處的吸光度。
結(jié)果表明，以引入pCHO1的COS7細胞培養(yǎng)上清作對照，相比之下，抗體MABL-2的重建單鏈Fv(MABL2-scFv)濃度依賴性地顯著抑制小鼠抗體MABL-2與人IAP抗原的結(jié)合(圖12)。因此提示，抗體MABL-2的重建單鏈Fv中，源于小鼠單克隆抗體MABL-2的每個V區(qū)的結(jié)構(gòu)均正確。
5.7體外凋亡誘導效應使用人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細胞、作對照的經(jīng)pCOS1載體轉(zhuǎn)染的L1210細胞以及CCRF-CEM細胞，通過Annexin-V染色(Boehninger Mannheim)，檢測抗體MABL-2的重建單鏈Fv的凋亡誘導作用。
在1×105上述每種細胞中，按50％終濃度加入表達抗體MABL-2的重建單鏈Fv的COS7細胞培養(yǎng)上清、或作對照的經(jīng)pCHO1載體轉(zhuǎn)染的COS7細胞培養(yǎng)上清，混合物培養(yǎng)24小時。然后進行Annexin-V染色，用FACScan裝置(BECTON DICKINSON)測定熒光強度。
Annexin-V的染色結(jié)果分別如圖13-18所示。左下區(qū)的點代表活細胞，右下區(qū)的點代表凋亡早期細胞，右上區(qū)的點代表凋亡晚期細胞。結(jié)果顯示，抗體MABL-2的重建單鏈Fv(MABL2-scFv)顯著地誘導了特異性針對人IAP抗原的L1210細胞死亡(圖13-16)，與對照相比，重建的單鏈Fv也顯著誘導CCRF-CEM細胞死亡(圖17-18)。
5.8在CHO細胞中表達源于MABL-2的單鏈Fv用pCHOM2載體轉(zhuǎn)染CHO細胞，建立恒定表達源于抗體MABL-2的單鏈Fv(多肽)的CHO細胞系。
使用Gene Dulser裝置(BioRad)，通過電穿孔方法將pCHOM2載體轉(zhuǎn)化CHO細胞。小杯中加入DNA(10μg)和0.7ml含CHO細胞(1×107細胞/ml)的PBS的混合物。用1.5KV、25μF電容脈沖處理混合物。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞轉(zhuǎn)到含10％胎牛血清的無核酸α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中培養(yǎng)。用SDS-PAGE確認得到的克隆中目的蛋白質(zhì)的表達，選擇表達水平高的克隆，作為源于抗體MABL-2的單鏈Fv的生產(chǎn)細胞系。在含有10nM氨甲蝶呤(SIGMA)的無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中培養(yǎng)該細胞系。然后，收集培養(yǎng)上清，離心去除細胞碎片并回收。
5.9純化CHO細胞中產(chǎn)生的源于MABL-2的單鏈Fv將實施例5.8中獲得的表達單鏈Fv的CHO細胞系的培養(yǎng)上清，利用人工透析柱(PAN130SF，ASAHI MEDICALS)濃縮多達20倍。濃縮液-20℃保存，并于純化時融化。
利用三種層析方法，即Blue-sepharose、羥基磷灰石和凝膠過濾，從CHO細胞培養(yǎng)上清中純化單鏈Fv。
(1)Blue-sepharose柱層析用20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)將濃縮的上清稀釋10倍，離心去除不溶物(10000×轉(zhuǎn)/分，30分鐘)。用相同緩沖液平衡Blue-sepharose柱(20ml)，將上清上樣。用相同緩沖液洗柱后，利用相同緩沖液中逐步梯度0.1、0.2、0.3、0.5到高達1.0M的NaCl，洗脫柱中吸附的蛋白質(zhì)。用SDS-PAGE分析流過組分和每個洗脫組分。將確認含有單鏈Fv的組分(0.1-0.3M NaCl洗脫組分)混合在一起，利用Centri Prep-10(AMICON)濃縮高達大約20倍。
(2)羥基磷灰石(1)中獲得的濃縮液用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋10倍，上樣羥基磷灰石柱(20ml，BIORAD)。用60ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗柱。然后，用高達200mM的磷酸鈉緩沖液的線性梯度，洗脫柱中吸附的蛋白質(zhì)(參見圖19)。用SDS-PAGE分析每個組分，確認在組分A和組分B中存在單鏈Fv。
(3)凝膠過濾用CentriPrep-10分別濃縮(2)中組分A和B，并上樣到用含0.15M NaCl的20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡的TSKgelG3000SWG柱(21.5×600mm)。層析圖如圖20所示。經(jīng)SDS-PAGE分析各組分，確認了兩個主峰(AI和BI)是目的單鏈Fv。凝膠過濾分析中，組分A在36KDa表觀分子量處洗脫，組分B在76kDa處洗脫。用15％SDS聚丙烯酰胺凝膠分析純化的單鏈Fv(AI、BI)。在有或無還原劑存在下處理樣品，按照Laemmli’s方法進行電泳。然后用考馬斯亮藍染色蛋白質(zhì)。如圖21所示，無論還原劑存在與否，AI和BI都呈現(xiàn)35kDa表觀分子量處的單鏈。從上所述可以推斷，AI是單鏈Fv的單體，BI是單鏈Fv非共價結(jié)合的二聚體。使用TSKgelG3000SW柱(7.5×60mm)通過凝膠過濾分析組分AI和BI，表明只在組分AI中檢測到單體峰，只在組分BI中檢測到二聚體峰(圖22)。二聚體組分(組分BI)占總單鏈Fv的百分之四。二聚體組分中超過90％的二聚體可4℃穩(wěn)定保存超過1個月。
5.10構(gòu)建在E.Coli細胞中表達源于抗體MABL-2的單鏈Fv的載體利用PCR方法改變pscM2載體，以制備在E.coli細胞中有效表達抗體MABL-2的單鏈Fv的載體。將得到的DNA片段引入pSCFVT7表達載體。
設計如SEQ ID No.27所示Nde-VHSm02引物，作為PCR正向引物，其可與H鏈V區(qū)N端編碼DNA雜交，并包含起始密碼子和NdeI限制性酶識別位點。設計如SEQ ID No.28所示VLAS引物，作為PCR反向引物，其可與L鏈V區(qū)C端編碼DNA雜交，并包含二個終止密碼子和EcoRI限制性酶識別位點。為在E.coli中有效表達，在正向引物Nde-VHSm02中與H鏈V區(qū)N端編碼DNA可雜交的部分中包含5個點突變。
將包含10μl 10×PCR緩沖液#1、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs、5單位KOD DNA聚合酶(都來自TOYOBO)、1μM每種引物和100ng模板DNA(pscM2)的100μl PCR溶液，依次98℃加熱15秒、65℃ 2秒以及74℃ 30秒。重復此溫度循環(huán)25次。
利用QIAquick PCR Purification試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，用NdeI和EcoRI消化，得到的DNA片段然后克隆到pSCFVT7載體，該載體中已用NdeI和EcoRI消化去除了pel B信號序列。經(jīng)DNA測序后，將產(chǎn)生的包含帶有目的DNA序列的DNA片段的質(zhì)粒命名為“pscM2DEm02”(參見圖23)。質(zhì)粒pscM2DEm02中包含的源于抗體MABL-2的單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ IDNo.29所示。
5.11在E.coli細胞中表達源于抗體MABL-2的單鏈Fv用pscM2DEm02載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)pLysS(STRATAGENE)，得到表達源于抗體MABL-2的單鏈Fv的E.coli菌株。用SDS-PAGE檢查得到的克隆中目的蛋白質(zhì)的表達，選擇表達水平高的克隆，作為源于抗體MABL-2的單鏈Fv的生產(chǎn)菌株。
5.12純化E.coli中產(chǎn)生的源于抗體MABL-2的單鏈Fv將轉(zhuǎn)化獲得的E.coli單克隆在3ml LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7小時，然后在70ml LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)過夜。將預培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到7L LB培養(yǎng)基中，300轉(zhuǎn)/分攪拌，用Jar發(fā)酵罐28℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基吸光度達到O.D.＝1.5時，用1mM IPTG誘導細菌，然后培養(yǎng)3小時。
培養(yǎng)基離心(10000×g，10分鐘)回收細菌沉淀物。向細菌中加入含5mM EDTA、0.1M NaCl和1％ Triton x-100的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，超聲波破碎細菌(輸出量4，工作循環(huán)70％，1分鐘×10次)。離心破碎細菌的懸浮液(12000g，10分鐘)，以沉淀包涵體。將分離的包涵體與含5mM EDTA、0.1M NaCl和4％Tritonx-100的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)混合，再次超聲處理(輸出量4，工作循環(huán)50％，30秒×2次)，離心(12000g，10分鐘)分離目的蛋白質(zhì)沉淀，去除上清中包含的蛋白質(zhì)。
在含6M脲、5mM EDTA和0.1M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中裂解含目的蛋白質(zhì)的包涵體，上樣到Sephacryl S-300凝膠過濾柱(5×90cm，Amersharm Pharmacia)，該柱用含4M脲、5mM EDTA、0.1M NaCl和10mM巰基乙醇的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)平衡，流速為5ml/分鐘，以去除相關的高分子量單鏈Fv。經(jīng)SDS-PAGE分析得到的組分，用凝膠過濾所用緩沖液將高純度的蛋白質(zhì)組分稀釋到O.D280＝0.25。然后用含5mM EDTA、0.1M NaCl、0.5MArg、2mM還原型谷胱苷肽以及0.2mM氧化型谷胱苷肽的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)，透析該組分3次，以使蛋白質(zhì)重折疊。進一步用含0.15M NaCl的20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)透析該組分三次，以更換緩沖液。
將透析產(chǎn)物上樣到Superde×200pg凝膠過濾柱(2.6×60cm，Amersharm Pharmacia)，該柱已用含0.15M NaCl的20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡，以去除少量通過分子間S-S鍵交聯(lián)的高分子量蛋白質(zhì)。如圖24所示，在寬峰(預期為高分子量聚集物)后洗脫出兩個峰，即主峰和副峰。SDS-PAGE分析(參見圖21)以及凝膠過濾分析這兩個峰的洗脫位置，提示主峰是單鏈Fv單體，副峰是非共價結(jié)合的單鏈Fv二聚體。非共價結(jié)合的二聚體占總單鏈Fv的4％。
5.13源于抗體MABL-2的單鏈Fv的體外凋亡誘導活性利用引入人IAP基因的L1210細胞(hIAP/L1210)，按照兩種Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)方法，檢測CHO細胞和E.coli產(chǎn)生的源于抗體MABL-2的單鏈Fv(MABL2-scFv)的凋亡誘導作用。
第一種方法中，向5×104個hIAP/L1210細胞中加入樣品抗體，終濃度為3μg/ml，培養(yǎng)24小時。分析樣品抗體，即實施例5.9中獲得的來自CHO細胞的MABL-2單鏈Fv的單體和二聚體，實施例5-12中從E.coli獲得的MABL-2單鏈Fv的單體和二聚體，以及作對照的小鼠IgG抗體。培養(yǎng)后進行Annexin-V染色，用FACScan裝置(BECTON DICKINSON)測量其熒光強度。
第二種方法中，向5×104個hIAP/L1210細胞中加入樣本抗體，終濃度為3μg/ml，培養(yǎng)2小時，并與抗FLAG抗體(SIGMA)混合，終濃度為15μg/ml，再培養(yǎng)22小時。分析樣本抗體，它們是從實施例5.9的CHO細胞獲得的MABL-2單鏈Fv的單體，以及作對照的小鼠IgG抗體。培養(yǎng)后進行Annexin-V染色，使用FACScan裝置測量其熒光強度。
Annexin-V染色分析的結(jié)果如圖25-31所示。結(jié)果表明，CHO細胞和E.coli中產(chǎn)生的MABL-2單鏈Fv多肽的二聚體，與對照相比(圖25)，可顯著誘導細胞死亡(圖26，27)，而針對CHO細胞和E.coli中產(chǎn)生的MABL-2單鏈Fv多肽的單體，則沒有觀察到凋亡誘導作用(圖28，29)。當一起使用抗FLAG抗體時，與對照相比(圖30)，CHO細胞中產(chǎn)生的源于MABL-2抗體的單鏈Fv多肽的單體顯著誘導細胞死亡(圖31)。
5.14 scFv/CHO多肽的單體和二聚體對人骨髓瘤模型小鼠的抗腫瘤效應(1)定量測量小鼠血清中的人IgG利用以下ELISA方法測量小鼠血清中含有的、由人骨髓瘤細胞產(chǎn)生的人IgG(M蛋白質(zhì))。用0.1％碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)將山羊抗人IgG抗體(BIOSOURCE，Lot#7902)稀釋到1μg/ml，向96孔板(Nunc)中每孔加入100μl，4℃溫育過夜，使抗體固定化。封閉后，向每孔加入100μl逐步稀釋的小鼠血清或作為標準的人IgG(CAPPEL，Lot#00915)，室溫下溫育2小時。洗滌后，加入100μl 5000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體(BIOSOURCE，Lot#6202)，室溫下溫育1小時。洗滌后加入底物液。溫育后，使用MICROPLATEREADER Model 3550(BioRad)測量405nm處的吸光度?；谟扇薎gG標準品的吸光值得到的校準曲線，計算小鼠血清中人IgG的濃度。
(2)制備給藥用抗體在給藥當天，用無菌過濾的PBS(-)將scFv/CHO多肽的單體和二聚體分別稀釋到0.4mg/ml或0.25mg/ml，制備給藥用樣品。
(3)制備人骨髓瘤的小鼠模型如下制備人骨髓瘤的小鼠模型。將在SCID小鼠(Japan Clare)體內(nèi)傳代的KPMM2細胞(JP-Appl.7-236475)懸浮于含10％胎牛血清(GIBCO-BRL)的RPMI1640培養(yǎng)基中(GIBCO-BRL)，調(diào)整為3×107細胞/ml。通過尾靜脈將200μl KPMM2細胞懸液(6×106細胞/小鼠)移植給SCID小鼠(雄性，6周齡)，該SCID小鼠已于移植前一天皮下注射脫唾液酸GM1抗體(WAKO JUNYAKU，1瓶溶于5ml)。
(4)抗體給藥將(2)中制備的抗體樣本，單體(250μl)和二聚體(400μl)通過尾靜脈給藥于(3)中制備的人骨髓瘤細胞模型小鼠。移植KPMM2細胞3天后開始給藥，每天2次，進行3天。作為對照，同樣通過尾靜脈給藥200μl無菌過濾的PBS(-)，一天2次，進行3天。每組包含7只小鼠。
(5)用人骨髓瘤模型小鼠評價scFv/CHO多肽的單體和二聚體的抗腫瘤效應根據(jù)小鼠血清中人IgG(M蛋白質(zhì))濃度的變化以及小鼠的存活時間，用人骨髓瘤模型小鼠評價scFv/CHO多肽單體和二聚體的抗腫瘤效應。移植KPMM2細胞后24天收集小鼠血清，利用上述(1)中的ELISA方法測定人IgG濃度的變化。PBS(-)給藥組(對照)血清中人IgG(M蛋白質(zhì))的量提高到約8500μg/ml，而scFv/CHO二聚體給藥組的人IgG的量明顯較低，等于或少于對照組的十分之一。所以，此結(jié)果表明scFv/CHO二聚體強烈抑制KPMM2細胞生長(圖32)。如圖33所示，與PBS(-)給藥組相比，在scFv/CHO二聚體給藥組觀察到的存活時間明顯延長。
如上所述可以確認，scFv/CHO二聚體對于人骨髓瘤模型小鼠具有抗腫瘤效應?？梢哉J為scFv/CHO二聚體，即本發(fā)明的改變的抗體，其抗腫瘤效應是由于該改變的抗體具有凋亡誘導作用。
5.15血細胞凝集反應實驗根據(jù)Tokyo Kagaku Dojin出版，日本生物化學會編輯的Zoku-Seikagaku Jikken Koza“Immuno-Biochemical Investigation”，進行血細胞凝集反應測試并確定血細胞凝集反應。
用經(jīng)肝素處理的注射器取健康供者血液，用PBS(-)洗滌三次，然后用PBS(-)制備終濃度2％的紅細胞懸液。測試樣本包括，MABL-2抗體，CHO細胞產(chǎn)生的單鏈Fv多肽的單體和二聚體，E.coli產(chǎn)生的單鏈Fv多肽的單體和二聚體，以小鼠IgG為對照(ZYMED)。利用購自Falcon的圓底96孔板研究血細胞凝集效應。每孔中加入50μl上述抗體樣本，以及50μl 2％紅細胞懸液，于孔中混合。37℃溫育2小時后，將反應混合物4℃保存過夜，測定其血細胞凝集反應。對照為每孔50μl PBS(-)，按同樣方法進行血細胞凝集反應測試。使用的小鼠IgG和抗體MABL-2的抗體終濃度為0.01、0.1、1.0、10.0或100.0μg/ml。使用的單鏈Fv終濃度為0.004、0.04、0.4、4.0、40.0或80.0μg/ml，只在E.coli產(chǎn)生的多肽二聚體情況下，另外使用160.0μg/ml。結(jié)果如表2所示。對于抗體MABL-2而言，在大于0.1μg/ml濃度下觀察到血細胞凝集反應，而對單鏈Fv的單體和二聚體都沒有觀察到血細胞凝集反應。
表2血細胞凝集反應測試

實施例6包含2個H鏈V區(qū)和2個L鏈V區(qū)的改變的抗體sc(Fv)2，以及具有不同長度接頭的抗體MABL-2scFv。
6.1構(gòu)建抗體MABL-2 sc(Fv)2表達質(zhì)粒。
利用下述PCR方法改變上述pCHOM2，其中包含源于上述MABL-2的scFv的編碼DNA，將產(chǎn)生的DNA片段插入pCHOM2，以制備改變的抗體[sc(Fv)2](其中包含源于抗體MABL-2的二個H鏈V區(qū)和二個L鏈V區(qū))的表達質(zhì)粒。
PCR所用引物包括，EF1引物(SEQ 2D No30)為正向引物，設計為可與EF1α編碼DNA雜交，和反向引物(SEQ ID No19)，設計為可與L鏈V區(qū)C端編碼DNA雜交，并包含接頭區(qū)的編碼DNA序列，以及包含SalI限制性酶識別位點的VLLAS引物(SEQ ID No31)。
100μl PCR溶液包含10μl 10×PCR緩沖液#1、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs(dATP，dGIP，dCTP和dTTP)、5單位KOD DNA聚合酶(Toyobo，Inc.)、1μM每種引物以及100ng模板DNA(pCHOM2)。將該PCR溶液依次94℃加熱30秒、50℃ 30秒以及74℃ 1分鐘。重復此溫度循環(huán)30次。
利用QIAquick PCR Purification試劑盒(QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物，并用SalI消化。將產(chǎn)生的DNA片段克隆到pBluescript KS+載體(Toyobo，Inc.)。DNA測序后，用SalI消化包含目的DNA序列的質(zhì)粒，得到的DNA片段用快速DNA Ligation試劑盒(BOEHRINGER MANNHEIM)與經(jīng)SalI消化的pCHOM2連接。DNA測序后，將包含目的DNA序列的質(zhì)粒命名為“pCHOM2(Fv)2”(參見圖34)。質(zhì)粒pCHOM2(Fv)2中包含的抗體MABL-2 sc(Fv)2區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.32所示。
6.2制備具有不同長度接頭的抗體MABL-2 scFv的表達質(zhì)粒。
利用源于MABL-2的H鏈和L鏈編碼cDNA作模板，如下所述制備scFv，其中包含不同長度接頭以及V區(qū)，按[H鏈]-[L鏈](下文稱“HL”)或[L鏈]-[H鏈](下文稱“LH”)順序設計。
利用pCHOM2(Fv)2作模板，PCR方法構(gòu)建HL型scFv。PCR步驟中，使用引物對CFHL-F1(SEQ ID No33)和CFHL-R2(SEQID No34)，或引物對CFHL-F2(SEQ ID No35)和CFHL-R1(SEQID No36)，和KOD聚合酶。進行PCR程序，溫度循環(huán)為94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分鐘，重復30次，以產(chǎn)生5′端含有前導序列的H鏈cDNA，或其3′端含有FLAG序列的L鏈cDNA?；旌纤a(chǎn)生的H鏈和L鏈cDNA，進行PCR，溫度循環(huán)為依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分鐘，重復5次，使用混合物為模板以及KOD聚合酶。向反應混合物中加入CFHL-F1和CFHL-R1引物，然后重復上述溫度循環(huán)30次，進行PCR反應，以產(chǎn)生無接頭的HL-0型cDNA。
為構(gòu)建LH型scFv，利用pGEM-M2L和pGEM-M2H為模板，其中分別包含抗體MABL-2的L鏈V區(qū)和H鏈V區(qū)的編碼cDNA，進行PCR反應(參見JP-Appl.11-63557)。使用引物對T7(SEQ IDNo37)和CFLH-R2(SEQ ID No38)，或引物對CFLH-F2(SEQID No39)和CFLH-R1(SEQ ID No40)，以及KOD聚合酶(ToyoboInc.)。溫度循環(huán)為順次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分鐘，重復30次，進行PCR反應，以產(chǎn)生5′端包含前導序列的L鏈cDNA，或其3′端包含F(xiàn)LAG序列的H鏈cDNA?；旌纤a(chǎn)生的L鏈和H鏈cDNA，以該混合物為模板，使用KOD聚合酶，溫度循環(huán)包含依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分鐘，重復5次，進行PCR。反應混合物中加入T7和CFLH-R1引物，上述溫度循環(huán)重復30次進行反應。以反應產(chǎn)物為模板，利用引物對CFLH-F4(SEQ ID No41)和CFLH-R1，溫度循環(huán)包含依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分鐘，重復30次，進行PCR，以產(chǎn)生無接頭的LH-0型cDNA。
產(chǎn)生的LH-0和HL-0型cDNA用EcoRI和BamHI限制性酶(Takara Shuzo)消化，將消化的cDNA用Ligation High(Toyobo Inc.)分別引入哺乳動物表達質(zhì)粒INPEP4中。用每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109(Nippon Gene)，利用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(QUIAGEN)從轉(zhuǎn)化的E.coli中分離目的質(zhì)粒。從而制備質(zhì)粒pCF2LH-0和pCF2HL-0。
為構(gòu)建包含不同大小接頭的HL型表達質(zhì)粒，以pCF2HL-0為模板，使用的正義引物為CFHL-X3(SEQ ID No42)、CFHL-X4(SEQ IDNo43)、CFHL-X5(SEQ ID No44)、CFHL-X6(SEQ ID No45)或CFHL-X7(SEQ ID No46)，反義引物為BGH-1(SEQ ID No47)，其與載體序列互補。使用KOD聚合酶進行PCR反應，溫度循環(huán)包括依次94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃ 1分鐘，重復30次，用限制性酶XhoI和BamHI(Takara Shuzo)消化反應產(chǎn)物。消化的片段分別用Ligation High(Toyobo Inc.)引入pCF2HL-0的Xhol和BamHl位點之間。用每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109，利用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒從轉(zhuǎn)化的E.coli中分離目的質(zhì)粒。從而制備表達質(zhì)粒pCF2HL-3、pCF2HL-4、pCF2HL-5、pCF2HL-6和pCF2HL-7。
為構(gòu)建在COS7細胞中瞬時表達的表達質(zhì)粒，用限制性酶EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化質(zhì)粒pCF2HL-0、pCF2HL-3、pCF2HL-4、pCF2HL-5、pCF2HL-6和pCF2HL-7，用瓊脂糖凝膠電泳純化產(chǎn)生的約800bp片段。利用Ligation High(Toyobo Inc.)分別將獲得的片段引入表達質(zhì)粒pCOS1的EcoRI和BamHI位點之間，用于在哺乳動物細胞中表達。用每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α(ToyoboInc.)，使用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒從轉(zhuǎn)化的E.coli中分離目的質(zhì)粒。從而制備表達質(zhì)粒CF2HL-0/pCOS1、CF2HL-3/pCOS1、CF2HL-4/pCOS1、CF2HL-5/pCOS1、CF2HL-6/pCOS1和CF2HL-7/pCOS1。
作為這些質(zhì)粒的典型實例，質(zhì)粒CF2HL-0/pCOS1的構(gòu)建如圖35所示，該質(zhì)粒中包含的MABL2-scFv<HL-0>的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.48所示。這些質(zhì)粒中接頭區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列也如圖36所示。
為構(gòu)建包含不同大小接頭的LH型表達質(zhì)粒，使用pCF2LH-0為模板，CFLH-X3(SEQ ID No49)、CFLH-X4(SEQ ID No50)、CFLH-X5(SEQ ID No51)、CFLH-X6(SEQ ID No52)或CFLH-X7(SEQ ID No53)為正義引物，BGH-1為反義引物，其與載體序列互補。利用KOD聚合酶，溫度循環(huán)包含依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分鐘，重復30次，進行PCR反應，反應產(chǎn)物用限制性酶XhoI和BamHI消化。利用Ligation High分別將消化的片段引入pCF2LH-0的XhoI和BamHI位點之間。每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α(Toyobo Inc.)，使用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒從轉(zhuǎn)化的E.coli中分離目的質(zhì)粒。從而制備表達質(zhì)粒pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7。
為構(gòu)建COS7細胞瞬時表達質(zhì)粒，質(zhì)粒pCF2LH-0、pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7用限制性酶EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化，用瓊脂糖凝膠電泳純化產(chǎn)生的約800bp片段。利用Ligation High分別將獲得的片段引入哺乳動物細胞表達質(zhì)粒pCOS1的XhoI和BamHI位點之間。用每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH-5α(Toyobo Inc.)，利用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒從轉(zhuǎn)化的E.coli中分離目的質(zhì)粒。從而制備表達質(zhì)粒CF2LH-0/pCOS1、CF2LH-3/pCOS1、CF2LH-4/pCOS1、CF2LH-5/pCOS1、CF2LH-6/pCOS1和CF2LH-7/pCOS1。
作為這些質(zhì)粒的典型實例，質(zhì)粒CF2LH-0/pCOS1的構(gòu)建如圖37所示，該質(zhì)粒中包含的MABL2-scFv<LH-0>的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.54所示。這些質(zhì)粒中接頭區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列也如圖38所示。
6.3在COS7細胞中表達scFv和sc(Fv)2(1)用含血清培養(yǎng)基制備培養(yǎng)上清在COS7細胞中(JCRB9127，Japan Health Sciences Foundation)瞬時表達HL型和LH型的scFv和sc(Fv)2。在CO2氣體培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清(HyClone)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)，37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)COS7細胞。使用Gene Pulser裝置(BioRad)，通過電穿孔將實施例6.2制備的CF2HL-0、3～7/pCOS1或CF2LH-0、3～7/pCOS1，或pCHOM2(Fv)2載體轉(zhuǎn)染COS7細胞。小杯中加入DNA(10μg)以及0.25ml含2×107細胞/ml、10％FBS和5mM BES(SIGMA)的DMEM培養(yǎng)基。維持10分鐘后，用0.17kv、950μF電容脈沖處理混合物。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞轉(zhuǎn)到75cm3培養(yǎng)瓶的DMEM培養(yǎng)基(10％FBS)中。培養(yǎng)72小時后，收集培養(yǎng)上清，離心去除細胞碎片。培養(yǎng)上清用0.22um過濾器(FALCON)過濾，以獲得培養(yǎng)上清(下文稱“CM”)。
(2)用無血清培養(yǎng)基制備培養(yǎng)上清將按與(1)相同方法轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)到75cm3培養(yǎng)瓶的DMEM培養(yǎng)基(10％FBS)中培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，棄去上清，用PBS洗滌細胞，然后加入CHO-S-SFM II培養(yǎng)基(GIBCO BRL)。培養(yǎng)72小時后，收集培養(yǎng)上清，離心去除細胞碎片，用0.22um過濾器(FALCON)過濾以獲得CM。
6.4檢測COS7 CM中的scFv和sc(Fv)2用Western印跡方法檢測上述實施例6.3(2)中制備的COS7 CM中的各種MABL2-scFv和sc(Fv)2。
SDS-PAGE電泳分析每個COS7的CM，轉(zhuǎn)到REINFORCED NC膜(Schleicher & Schuell)上。用5％脫脂牛奶(Morinaga Nyu-gyo)封閉膜，TBS洗滌。然后向其中加入抗FLAG抗體。膜在室溫下溫育并洗滌。加入過氧化物酶標記的小鼠IgG抗體(Jachson Immuno Research)。室溫下溫育并洗滌后，加入底物液(KirKegaard Perry Laboratories)顯色(圖39)。
6.5流式細胞術使用實施例6.3(1)制備的COS7細胞培養(yǎng)上清，進行流式細胞術分析，測定MABL2-scFv和sc(Fv)2與人整合素相關蛋白質(zhì)(IAP)抗原的結(jié)合。將待測培養(yǎng)上清或作對照的COS7細胞培養(yǎng)上清，加入2×105個表達人IAP的小鼠白血病細胞L1210。冰浴并洗滌后，加入10μg/ml小鼠抗FALG抗體(SIGMA)，然后溫育并洗滌細胞。然后加入FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BECTON DICKINSON)，再次溫育并洗滌細胞。利用FACScan裝置(BECTON DICKINSON)測定熒光強度。流式細胞術結(jié)果顯示，在COS7細胞培養(yǎng)上清中，具有不同長度接頭的MABL2-scFv和sc(Fv)2對人IAP具有高親合力(參見圖40a和40b)。
6.6體外凋亡誘導效應通過Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)，利用轉(zhuǎn)染人IAP基因的L1210細胞(hIAP/L1210)，檢測實施例6.3(1)制備的COS7培養(yǎng)上清的凋亡誘導作用。
向5×104個hIAP/L1210細胞中加入用每個載體轉(zhuǎn)染的COS7細胞培養(yǎng)上清，或作對照的COS7細胞培養(yǎng)上清，終濃度為10％，混合物培養(yǎng)24小時。然后進行Annexin-V/PI染色，利用FACScan裝置(BEKTON DICHINSON)測定熒光強度。結(jié)果表明，COS7細胞CM中的scFv<HL3、4、6、7，LH3、4、6、7>以及sc(Fv)2顯著誘導了hIAP/L1210細胞的死亡。這些結(jié)果如圖41所示。
6.7構(gòu)建用于CHO細胞中表達scFv和sc(Fv)2的載體為從培養(yǎng)上清中分離、純化MABL2-scFv和sc(Fv)2，如下構(gòu)建用于CHO細胞中表達的載體。
使用Ligation High，將實施例6.2制備的pCF2HL-0、3～7以及pCF2LH-0、3～7的EcoRI-BamHI片段，引入CHO細胞表達載體pCHO1的EcoRI和BamHI位點之間。用其轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α。使用QIAGEN Plasmind Midi試劑盒(QIAGEN)從轉(zhuǎn)化的E.coli中分離質(zhì)粒，制備表達質(zhì)粒pCHOM2HL-0、3～7以及pCHOM2LH-0、3～7。
6.8制備表達MABL2-scFv<HL-0、3～7>、MABL2-scFv<LH-0、3～7>以及sc(Fv)2的CHO細胞，并制備其培養(yǎng)上清用實施例6.7構(gòu)建的每個表達質(zhì)粒pCHOM2HL-0、3～7和pCHOM2LH-0、3～7，以及pCHOM2(Fv)2載體，轉(zhuǎn)化CHO細胞，以制備恒定表達每種改變的抗體的CHO細胞。作為其典型實例，恒定表達MABL2-scFv<HL-5>或sc(Fv)2的CHO細胞的制備如下所示。
通過限制性酶PvuI消化，線性化表達質(zhì)粒pCHOM2HL-5和pCHOM2(Fv)2，使用Gene Pulser裝置(BioRad)通過電穿孔轉(zhuǎn)染CHO細胞。向小杯中加入DNA(10μg)和0.75ml 1×107細胞/ml的PBS，用1.5KV、25μF電容脈沖處理。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞轉(zhuǎn)到含10％胎牛血清的包含核酸的α-MEM培養(yǎng)基中(GIBCO BRL)培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，棄去上清。用PBS洗滌細胞，加入含10％胎牛血清的無核酸α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)。培養(yǎng)兩周后，將細胞在含10nM(終濃度)氨甲蝶呤(SIGMA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后是50nM和100nM的氨甲蝶呤。得到的細胞在CHO-S-SFM II無血清培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。收集培養(yǎng)上清，離心去除細胞碎片，用0.22μm孔徑濾膜過濾，分別獲得CM。
如上所述，獲得了恒定表達MABL2-scFv<HL-0、-3、-4、-6、-7>和<LH-0、-3、-4、-5、-6、-7>的CHO細胞及其CM。
6.9純化MABL2-scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2利用下述兩種純化方法，從實施例6.8制備的CM中純化MABL2-scFv<HL-5>以及sc(Fv)2。
<純化方法1>
利用位于多肽C端的FLAG序列，通過抗FLAG抗體親和柱層析以及凝膠過濾純化HL-5和sc(Fv)2。用抗FLAG M2親和凝膠(SIGMA)制備柱子(7.9ml)，用含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(TBS，pH7.5)平衡，上樣在6.8中得到的1升CM。用TBS洗柱后，通過0.1M甘氨酸-HCl緩沖液(pH3.5)洗脫scFv。利用SDS-PAGE分析所得到的組分，確認洗脫了scFv。將scFv組分與終濃度可高達0.01％的Tween 20混合，并用Centricon-10(MILIPORE)濃縮。TSKgel G3000SWG柱(7.5×600mm)用含150mM NaCl和0.01％Tween 20的20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡后，將濃縮液上樣。流速為0.4ml/分，通過280nm的吸光度檢測scFv。在二聚體處洗脫的主要組分為HL-5，單體處洗脫sc(Fv)2。
<純化方法2>
使用離子交換層析、羥基磷灰石和凝膠過濾，三步純化HL-5和sc(Fv)2。在離子交換層析中，純化HL-5使用Q Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)，純化sc(Fv)2使用SP-sepharose Fast Flow柱。在第二步之中及之后，用相同程序處理HL-5和sc(Fv)2。
HL-5的第一步HL-5的CM用含0.02％ Tween 20的20mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0)稀釋2倍，然后用1M Tris調(diào)pH到9.0。用含0.02％ Tween20的20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)平衡Q sepharose fast flow柱后，將溶液上樣。通過含0.1-0.55M NaCl線性梯度的相同緩沖液，洗脫柱上結(jié)合的多肽。經(jīng)SDS-PAGE監(jiān)測洗脫組分，收集含HL-5的洗脫組分，上樣到第二步的羥基磷灰石上。
sc(Fv)2的第一步sc(Fv)2的CM用含0.02％ Tween 20的20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.5)稀釋2倍，用1M乙酸調(diào)pH到5.5。用含0.02％ Tween 20的20mM乙酸鹽緩沖液(pH5.5)平衡SP-sepharose fast flow柱后，將溶液上樣。通過含0～0.5M NaCl線性梯度的緩沖液洗脫柱上結(jié)合的多肽。經(jīng)SDS-PAGE監(jiān)測洗脫組分，收集包含sc(Fv)2的組分，上樣到第二步的羥基磷灰石中。
第二步HL-5和sc(Fv)2的羥基磷灰石層析羥基磷灰石柱(I型，BIORAD)用含0.02％ Tween 20的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡后，分別上樣第一步獲得的HL-5和sc(Fv)2組分。用同一緩沖液洗柱后，利用高達0.5M線性梯度的磷酸鹽緩沖液，洗脫柱上結(jié)合的多肽。經(jīng)SDS-PAGE監(jiān)測洗脫的組分，收集包含目的多肽的組分。
第三步HL-5和sc(Fv)2的凝膠過濾用CentriPrep-10(MILIPORE)分別濃縮第二步獲得的每一組分，并上樣到用含0.02％ Tween 20和0.15M NaCl的20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)平衡的Superde×200柱(2.6×60cm，Pharmacia)。在二聚體處洗脫到HL-5，sc(Fv)HL-5和sc(Fv)2分別在單體處作為主要峰被洗脫。
兩種純化方法均難以檢測HL-5單體，已證實當單鏈Fv的接頭包含大約5個氨基酸時，高產(chǎn)量形成單鏈Fv二聚體。此外，HL-5的二聚體和sc(Fv)2能夠在純化后4℃穩(wěn)定保存一個月。
6.10評價純化的scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2與抗原的結(jié)合活性利用純化的MABL2-scFv<HL-5>二聚體和純化的sc(Fv)2進行流式細胞術分析，以評價其與人整合素相關蛋白質(zhì)(IAP)抗原的結(jié)合。將10μg/ml純化的MABL2-scFv<HL-5>二聚體、純化的sc(Fv)2、陽性對照抗體MABL-2或陰性對照小鼠IgG(Zymed)，加入2×105個表達人IAP的小鼠白血病L1210細胞(hIAP/L1210)，或經(jīng)pCOS1轉(zhuǎn)化的L1210細胞(pCOS1/L1210)作對照。冰浴并洗滌后，加入10μg/ml小鼠抗FLAG抗體(SIGMA)，然后溫育并洗滌細胞。向其中加入FITC標記的抗小鼠IgG抗體(BECTION DICKINSON)，再次溫育并洗滌細胞。然后利用FACScan裝置(BECTON DICKINSON)測定熒光強度。
由于純化的MABL2-scFv<HL-5>二聚體和純化的sc(Fv)2特異性結(jié)合hIAP/L1210細胞，可以證實scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2對人IAP具有高親和力(參見圖42)。
6.11純化的scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2在體外的凋亡誘導活性使用引入人IAP基因的L1210細胞(hIAP/L1210)以及人白血病細胞系CCRF-CEM細胞，通過Annexin-V染色(BoehringerMannheim)，檢測純化的MABL2-scFv<HL-5>二聚體和純化的sc(Fv)2的凋亡誘導作用。
將不同濃度的純化的MABL2-scF<HL-5>二聚體、純化的MABL2-sc(Fv)2、陽性對照抗體MABL-2或陰性對照小鼠IgG，加入5×104個hIAP/L1210細胞或1×105個CCRF-CEM細胞中。培養(yǎng)24小時后進行Annexin-V染色，使用FACScan裝置(BECTONDICKLNSON)測定其熒光強度。結(jié)果，MABL2-scFv<HL-5>二聚體和MABL2-sc(Fv)2以濃度依賴方式顯著誘導hIAP/L1210和CCRF-CEM細胞死亡(參見圖43)。結(jié)果表明，與原始抗體MABL-2相比，MABL2-scFv<HL-5>和MABL2-sc(Fv)2具有增強的誘導凋亡的效力。
6.12純化的scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2的血細胞凝集反應測試按照實施例5.15方法，使用不同濃度的純化的scFv<HL-5>二聚體和純化的sc(Fv)2，進行血細胞凝集反應測試。
用抗體MABL-2作為陽性對照，觀察到血細胞凝集反應，而對單鏈抗體MABL2-sc(Fv)2和MABL2-scFv<HL-5>均未觀察到血細胞凝集反應。此外，抗體MABL-2使用的兩種緩沖液進行血細胞凝集反應，沒有實質(zhì)差別。這些結(jié)果如表3所示。
表3血細胞凝集反應測試

6.13純化的scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2對人骨髓瘤模型小鼠的抗腫瘤效應測試實施例6.8和6.9制備和純化的scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2的抗腫瘤效應。利用實施例5.1產(chǎn)生的人骨髓瘤小鼠模型，ELISA測定小鼠血清中人骨髓瘤細胞產(chǎn)生的M蛋白質(zhì)的量，并檢測小鼠的存活時間，進行測試。然后根據(jù)小鼠血清中M蛋白質(zhì)的量的變化以及小鼠的存活時間，評價scFv<HL-5>二聚體和sc(Fv)2的抗腫瘤效應。
測試中使用0.01、0.1或1mg/ml的HL-5和sc(Fv)2，它們?nèi)苡诎?50mM NaCl、0.02％ Tween和20mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0)的載體中，按0.1、1或10mg/kg劑量對小鼠給藥。對照組小鼠只給予載體。
移植人骨髓瘤細胞26天后，收集小鼠血清，按實施例5.14方法，ELISA測定血清中M蛋白質(zhì)的量。結(jié)果，給予HL-5二聚體和sc(Fv)2的兩組小鼠的血清M蛋白質(zhì)的量，均以劑量依賴性方式下降(參見圖44)。此外，與給予載體的對照組相比，觀察到給予HL-5(圖45)和sc(Fv)2(圖46)的兩組，其存活時間均顯著延長。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的HL-5和sc(Fv)2具有極好的體內(nèi)抗腫瘤效應。
實施例7包含抗人MPL的人抗體12B5的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的單鏈Fv如下構(gòu)建編碼抗人MPL的人單克隆抗體12B5的V區(qū)7.1構(gòu)建編碼12B5H鏈V區(qū)的基因通過其基因的核苷酸序列(SEQ ID NO55)在5’端連接來源于人抗體基因(Eur.J.Immunol.1996；2663-69)的前導序列(SEQ IDNO56)，設計編碼結(jié)合人MPL的人抗體12B5的H鏈V區(qū)的基因。設計的核苷酸序列分為每個具有15bp重疊序列的四個寡核苷酸(12B5VH-1、12B5VH-2、12B5VH-3、12B5VH-4)。分別地，12B5VH-1(SEQ ID NO57)和12B5VH-3(SEQ ID NO59)為正義方向合成，12B5VH-2(SEQ ID NO58)和12B5VH-4(SEQ ID NO60)為反義方向合成。根據(jù)各自的互補性組裝每個合成的寡核苷酸以后，加入外部引物(12B5VH-S和12B5VH-A)擴增全長基因。分別地，12B5VH-S(SEQ ID NO61)設計為通過正向引物與前導序列的5’端雜交，并具有Hind III限制性酶識別位點和Kozak序列，而12B5VH-A(SEQID NO62)設計為通過反向引物與編碼H鏈V區(qū)C端的核苷酸序列雜交，并具有剪接供體序列和Bam HI限制性酶識別位點。
100μl PCR溶液包含10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mMMgCl2、0.08mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均來自PERKIN ELMER)、2.5p mol每種合成的寡核苷酸(12B5VH-1至-4)，起始溫度94℃加熱9分鐘，94℃ 2分鐘、55℃ 2分鐘以及72℃ 2分鐘。此循環(huán)重復2次后，加入各15pmol外部引物12B5VH-S和12B5VH-A。該混合物進行包含94℃ 30秒、55℃ 30秒以及72℃ 1分鐘的循環(huán)35次，并72℃再加熱5分鐘。
利用1.5％低熔點溫度瓊脂糖凝膠(Sigma)純化PCR產(chǎn)物，利用限制性酶BamHI和Hind III消化，并克隆到人H鏈表達載體HEF-gγ1。DNA測序后，將包含正確DNA序列的質(zhì)粒命名為HEF-12B5H-gγ1。
HEF-12B5H-gγ1用限制性酶EcoRI和BamHI消化，產(chǎn)生編碼12B5VH的基因，其然后克隆到人Fab H鏈表達載體pCOS-Fd，產(chǎn)生pFd-12B5H。利用PCR擴增包含內(nèi)含子區(qū)與人H鏈部分恒定區(qū)的編碼基因的DNA(SEQ ID NO63)，該內(nèi)含子區(qū)位于人抗體H鏈V區(qū)和恒定區(qū)的編碼基因之間，將該PCR產(chǎn)物插入動物細胞表達載體pCOS1，構(gòu)建人Fab H鏈表達載體。以HEF-gγ1為模板，正向引物G1CH1-S(SEQ ID NO64)(設計為與內(nèi)含子1的5’端序列雜交，并具有限制性酶識別位點EcoRI和BamHI)，反向引物G1CH1-A(SEQID NO65)(設計為與人H鏈恒定區(qū)CH1結(jié)構(gòu)域的3’端DNA雜交，并具有編碼一部分鉸鏈區(qū)的序列、2個終止密碼子以及限制性酶識別位點Bgl II)，于上述相同條件下擴增人H鏈恒定區(qū)基因。
質(zhì)粒HEF-12B5H-gγ1和pFd-12B5H中包含重建的12B5H鏈可變區(qū)，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO66所示。
7.2構(gòu)建編碼12B5L鏈V區(qū)的基因通過基因的核苷酸序列(SEQ ID NO67)在5’端連接來源于人抗體基因3D6(Nuc.Acid Res.199018；4927)的前導序列(SEQ IDNO68)，設計編碼結(jié)合人MPL的人抗體12B5的L鏈V區(qū)的基因。按上述相同方法設計的核苷酸序列分為每個具有15bp重疊序列的四個寡核苷酸(12B5VL-1、12B5VL-2、12B5VL-3、12B5VL-4)，分別進行合成。分別地，12B5VL-1(SEQ ID NO69)和12B5VL-3(SEQID NO71)具有正義序列，12B5VL-2(SEQ ID NO70)和12B5VL-4(SEQ ID NO72)具有反義序列。按照各自的互補性組裝每個合成的寡核苷酸以后，與外部引物(12B5VL-S和12B5VL-A)混合，擴增全長基因。分別地，12B5VL-S(SEQ ID NO73)設計為通過正向引物與前導序列的5’端雜交，并具有Hind III限制性酶識別位點和Kozak序列。12B5VL-A(SEQ ID NO74)設計為通過反向引物與編碼L鏈V區(qū)C端的核苷酸序列雜交，并具有剪接供體序列和Bam HI限制性酶識別位點。
如上所述進行PCR，利用1.5％低熔點溫度瓊脂糖凝膠(Sigma)純化PCR產(chǎn)物，利用限制性酶BamHI和Hind III消化，并克隆到人L鏈表達載體HEF-gκ。DNA測序后，將包含正確DNA序列的質(zhì)粒命名為HEF-12B5L-gκ。質(zhì)粒HEF-12B5L-gκ中包含重建的12B5L鏈V區(qū)，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO75所示。
7.3產(chǎn)生重建的12B5單鏈Fv(scFv)重建的12B5抗體單鏈Fv設計為12B5VH-接頭-12B5VL順序，并且C端具有FLAG序列(SEQ ID NO76)，以便于檢測和純化。利用由(Gly4Ser)3所代表的15個氨基酸組成的接頭序列，構(gòu)建該重建的12B5單鏈Fv(sc12B5)。
(1)利用由15個氨基酸組成的接頭序列產(chǎn)生重建的12B5單鏈Fv利用PCR分別擴增12B5的H鏈V區(qū)、接頭區(qū)和12B5的L鏈V區(qū)并連接，構(gòu)建包含由15個氨基酸組成的接頭序列的重建的12B5抗體單鏈Fv的編碼基因。方法圖解示于圖47。利用六種引物(A-F)制備重建的12B5單鏈Fv。引物A、C和E具有正義序列，引物B、D和F具有反義序列。
H鏈V區(qū)的正向引物12B5-S(引物A，SEQ ID No.77)設計為可與H鏈前導序列的5’端雜交，并具有EcoRI限制性酶識別位點。H鏈V區(qū)的反向引物HuVHJ3(引物B，SEQ ID No.78)設計為可與H鏈V區(qū)C端的編碼DNA雜交。
接頭的正向引物RHuJH3(引物C，SEQ ID No.79)設計為與接頭N端的編碼DNA雜交，并與H鏈V區(qū)C端的編碼DNA重疊。接頭的反向引物RHuVK1(引物D，SEQ ID No.80)設計為可與接頭C端的編碼DNA雜交，并與L鏈V區(qū)N端的編碼DNA重疊。
L鏈V區(qū)的正向引物HuVK1.2(引物E，SEQ ID No.81)設計為與L鏈V區(qū)N端的編碼DNA雜交。L鏈V區(qū)的反向引物12B5F-A(引物F，SEQ ID No.82)設計為可與L鏈V區(qū)C端的編碼DNA雜交，并具有FLAG肽編碼序列(Hopp T.P.等人，Bio/Technology，6，1204-1210，1988)、兩個終止密碼子以及NotI限制性酶識別位點。
在第一個PCR步驟中，進行A-B、C-D、E-F三個反應，將第一步PCR獲得的三種PCR產(chǎn)物按照各自互補性進行組裝。加入引物A和F以后，擴增具有由15個氨基酸組成的接頭的、重建的12B5單鏈Fv的全長編碼DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分別以編碼重建的12B5H鏈V區(qū)的質(zhì)粒HEF-12B5H-gγ1(參見實施例7.1)、包含接頭區(qū)編碼DNA(SEQ ID NO83)的質(zhì)粒pSCFVT7-hM21(人源化的ONS-M21抗體)(Ohtomo等人，Anticancer Res.18(1998)，4311-4316)(該接頭區(qū)由Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser組成)(Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883，1988)、以及編碼重建的12B5L鏈V區(qū)的質(zhì)粒HEF-12B5L-gκ(參見實施例7.2)用作模板。
第一步的50μlPCR反應溶液包含5μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均來自PERKIN ELMER)、100pmol每種引物和100ng每種模板DNA。PCR溶液在起始溫度94℃加熱9分鐘，在94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘。此溫度循環(huán)重復35次以后，72℃再加熱反應混合物5分鐘。
利用第二步組裝PCR產(chǎn)物A-B、C-D和E-F。98μl第二步PCR混合物溶液包含1μl第一步PCR產(chǎn)物A-B、0.5μl PCR產(chǎn)物C-D和1μlPCR產(chǎn)物E-F為模板、10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均來自PERKINELMER)，在起始溫度94℃加熱8分鐘，在94℃ 2分鐘、65℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘。此循環(huán)重復2次以后，加入每種引物A和F各100pmol。重復由94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘組成的循環(huán)35次以后，反應混合物在72℃加熱5分鐘。
利用1.5％低熔點溫度瓊脂糖凝膠純化第二步PCR制備的DNA片段，用EcoRI和NotI消化，克隆到pCHO1載體和pCOS1載體(日本專利申請?zhí)?-255196)。表達載體pCH01是利用EcoRI和SmaI消化從DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(參見WO92/19759)去除抗體基因，并連上EcoRI-NotI-BamHI接頭(TAKARA SHUZO)而構(gòu)建的。DNA測序后，將包含重建的12B5單鏈Fv正確氨基酸序列的編碼DNA片段的質(zhì)粒命名為pCHO-sc12B5和pCOS-sc12B5。質(zhì)粒pCHO-sc12B5和pCOS-sc12B5中包含的重建的12B5單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO84所示。
7.4利用動物細胞表達抗體12B5(IgG、Fab)和單鏈Fv多肽利用COS-7細胞或CHO細胞表達抗體12B5(IgG、Fab)和來源于抗體12B5的單鏈Fv。
如下進行利用COS7細胞的瞬時表達。使用Gene Pulser裝置(BioRad)，通過電穿孔方法進行轉(zhuǎn)染。在懸浮于0.8ml PBS的COS-7細胞中(1×107細胞/ml)，為表達抗體12B5(IgG)而加入上述表達載體HEF-12B5H-gγ1和HEF-12B5L-gκ各10μg，為表達12B5 Fab片段而加入pFd-12B5H和HEF-12B5L-gκ各10μg，為表達單鏈Fv而加入10μg pCOS-sc12B5。利用1.5KV、25μFD電容脈沖處理小杯中的混合物。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞加到含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(GIBCO BRL)培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，用PBS洗滌細胞一次，加到無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II中培養(yǎng)2天。培養(yǎng)基離心去除細胞碎片，用0.22μm濾膜過濾，制備培養(yǎng)上清。
為建立穩(wěn)定表達來源于抗體12B5的單鏈Fv(多肽)的CHO細胞系，如下將表達載體pCHO-sc12B5引入CHO細胞。
使用Gene Pulser裝置(BioRad)，通過電穿孔方法將表達載體引入CHO細胞。利用限制性酶PvuI消化，獲得線性化DNA(100μg)，在小杯中與懸浮于0.8ml PBS的CHO細胞(1×107細胞/ml)混合，冰上靜置10分鐘，利用1.5KV、25μFD電容脈沖處理。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞加到含有10％胎牛血清的CHO-S-SFM II中(GIBCO BRL)培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，在含有5nM氨甲蝶呤(SIGMA)和10％胎牛血清的CHO-S-SFM II中(GIBCO BRL)繼續(xù)培養(yǎng)。從這樣獲得的克隆中選擇高表達率克隆，作為12B5單鏈Fv的生產(chǎn)細胞系。在含有5nM氨甲蝶呤(SIGMA)的無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中培養(yǎng)以后，離心分離細胞碎片，獲得培養(yǎng)上清。
7.5純化CHO細胞產(chǎn)生的來源于12B5的單鏈Fv將7.4中獲得的表達12B5單鏈Fv的CHO細胞系的培養(yǎng)上清，利用抗FLAG抗體柱和凝膠過濾柱純化。
(1)抗FLAG抗體柱將培養(yǎng)上清加入PBS平衡的抗FLAG M2親和凝膠(Sigma)。利用相同緩沖液洗柱以后，通過0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 3.5)洗脫柱上吸附的蛋白質(zhì)。洗脫組分立即加入1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)進行中和。用SDS-PAGE分析洗脫組分，將確認含有單鏈Fv的組分利用Centricon-10(MILLIPORE)濃縮。
(2)凝膠過濾(1)中獲得的濃縮溶液加入用含有0.01％ Tween20的PBS平衡的Superde×200柱(10×300mm，AMERSHAM PHARMACIA)。產(chǎn)物sc12B5洗脫為2個峰(A、B)(參見圖48)。利用14％-SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析組分A和B。按照Laemmli方法，在有或無還原劑存在下將樣品進行電泳，電泳后用考馬斯亮藍染色。如圖49所示，無論還原劑存在與否，組分A和B都產(chǎn)生具有表觀分子量大約31kD的單一條帶。利用Superde×200PC 3.2/3.0(3.2×300mm，AMERSHAMPHARMACIA)通過凝膠過濾分析組分A和B，組分A產(chǎn)生表觀分子量大約44kD的洗脫產(chǎn)物，而組分B產(chǎn)生22kD的產(chǎn)物(參見圖50a和b)。此結(jié)果表明，組分A是sc12B5單鏈Fv的非共價鍵二聚體，組分B是單體。
7.6測量各種單鏈Fv的TPO樣激動劑活性通過測定對表達人TPO受體(MPL)的Ba/F3細胞(BaF/mpl)的增殖活性，評價抗MPL單鏈抗體的TPO樣活性。利用含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)洗滌BaF/Mpl細胞兩次后，細胞按5×105細胞/ml的細胞密度懸浮于培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)基分別稀釋抗MPL單鏈抗體和人TPO(R&D Systems)。將50μl細胞懸液和50μl稀釋的抗體或人TPO加入96孔微孔板中(平底)(Falcon)，CO2保溫箱中(CO2濃度5％)培養(yǎng)24小時。加入10μlWST-8試劑(用于測定原始細胞SF的數(shù)目Nacalai Tesque)溫育以后，利用熒光吸收光度計SPECTRA Fluor(TECAN)立即測量吸光度，測量波長450nm，參比波長620nm。在CO2保溫箱中(CO2濃度5％)溫育2小時以后，利用SPECTRA Fluor再次測量吸光度，測量波長450nm，參比波長620nm。由于WST-8試劑根據(jù)活細胞數(shù)目在波長450nm處產(chǎn)生顯色反應，通過如下計算的ED50，基于2小時后吸光度的變化，評價BaF/Mpl的增殖活性。在增殖反應曲線中，以吸光度為縱坐標、抗體濃度為橫坐標畫圖，平臺期的吸光度設為100％反應率?；诮咏?0％反應率所畫數(shù)值，利用直線擬合(straight lineapproximation)方法獲得擬合公式，計算50％反應率的抗體濃度，采用為ED50。
利用表達各種12B5抗體分子的COS-7細胞培養(yǎng)上清，測定對MPL的激動劑活性，如圖51所示結(jié)果表明，具有雙價抗原結(jié)合位點的12B5IgG，其吸光度以濃度依賴性方式提高，并具有TPO樣激動劑活性(ED50；29nM)，而具有單價抗原結(jié)合位點的12B5Fab的激動劑活性非常弱(ED50；34,724nM)。相反，如Fab具有單價抗原結(jié)合位點的單鏈Fv(sc12B5)，顯示強激動劑活性水平，ED50為75nM。然而，已知單鏈Fv H鏈和L鏈的可變區(qū)通過非共價鍵結(jié)合，因此各個可變區(qū)在溶液中分離，可與其它分子的可變區(qū)結(jié)合，形成多聚體，如二聚體。測定凝膠過濾純化的sc12B5的分子量時，證實存在識別為單體和二聚體的分子(參見圖48)。分離sc12B5單體和sc12B5二聚體(參見圖50)，測定其對MPL的激動劑活性。如圖51和52所示，sc12B5單體的ED50為4438.7nM，這證實相比利用COS-7細胞培養(yǎng)上清的結(jié)果，其激動劑活性下降。相反，具有雙價抗原結(jié)合位點的單鏈Fv(sc12B5二聚體)，顯示比單價sc12B5高約400倍的激動劑活性(ED50；10.1nM)。此外，雙價單鏈Fv顯示的激動劑活性等于或高于人TPO和12B5IgG的激動劑活性。
實施例8構(gòu)建編碼抗人MPL的人抗體12E10的可變區(qū)的基因如下構(gòu)建編碼抗人MPL的人單克隆抗體12E10的可變區(qū)基因8.1構(gòu)建編碼12E10H鏈V區(qū)的基因SEQ ID NO86的核苷酸序列是以WO99/10494所述的氨基酸序列(SEQ ID NO85)為基礎設計的編碼結(jié)合人MPL的人抗體12E10的H鏈V區(qū)的基因。全長氨基酸序列設計為其5’端連接來源于人抗體基因(GeneBank登錄號AF062252)的前導序列(SEQ ID NO87)。設計的核苷酸序列分為每個具有15bp重疊序列的四個寡核苷酸(12E10VH1、12E10VH2、12E10VH3、12E10VH4)。分別地，12E10VH1(SEQ ID NO88)和12E10VH3(SEQ ID NO90)為正義方向合成，12E10VH2(SEQ ID NO89)和12E10VH4(SEQ ID NO91)為反義方向合成。根據(jù)各自的互補性組裝每個合成的寡核苷酸以后，加入外部引物(12E10VHS和12E10VHA)擴增全長基因。分別地，12E10VHS(SEQ ID NO92)設計為通過正向引物與前導序列的5’端雜交，并具有Hind III限制性酶識別位點和Kozak序列，而12E10VHA(SEQ ID NO93)設計為通過反向引物與編碼H鏈V區(qū)C端的核苷酸序列雜交，并具有剪接供體序列和Bam HI限制性酶識別位點。
100μl PCR溶液包含10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mMMgCl2、0.08mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均來自PERKIN ELMER)、2.5pmol每種合成的寡核苷酸(12E10VH-1至-4)，起始溫度94℃加熱9分鐘，在94℃ 2分鐘、55℃ 2分鐘以及72℃ 2分鐘。此循環(huán)重復2次后，加入各100pmol外部引物12E10VHS和12E10VHA。該混合物進行由94℃ 30秒、55℃ 30秒以及72℃ 1分鐘組成的循環(huán)35次，并在72℃再加熱5分鐘。
利用1.5％低熔點溫度瓊脂糖凝膠(Sigma)純化PCR產(chǎn)物，利用限制性酶BamHI和Hind III消化，并克隆到人H鏈表達載體HEF-gγ1。DNA測序后，將包含正確DNA序列的質(zhì)粒命名為HEF-12E10H-gγ1。
HEF-12E10H-gγ1用限制性酶EcoRI和BamHI消化，產(chǎn)生編碼12E10VH的基因，然后克隆到人Fab H鏈表達載體pCOS-Fd，產(chǎn)生pFd-12E10H。利用PCR擴增包含內(nèi)含子區(qū)與人H鏈一部分恒定區(qū)的編碼基因的DNA(SEQ ID NO63)，該內(nèi)含子區(qū)位于人抗體H鏈V區(qū)和恒定區(qū)的編碼基因之間，該PCR產(chǎn)物插入動物細胞表達載體pCOS1，構(gòu)建人Fab H鏈表達載體。以HEF-gγ1為模板，正向引物G1CH1-S(SEQ ID NO64)(設計為與內(nèi)含子1的5’端序列雜交，并具有限制性酶識別位點EcoRI和BamHI)，反向引物G1CH1-A(SEQID NO65)(設計為與人H鏈恒定區(qū)CH1結(jié)構(gòu)域的3’端DNA雜交，并具有編碼一部分鉸鏈區(qū)的序列、2個終止密碼子以及限制性酶識別位點Bgl II)，于上述相同條件下擴增人H鏈恒定區(qū)基因。
質(zhì)粒HEF-12E10H-gγ1和pFd-12E10H中包含的重建的12E10 H鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO94所示。
8.2構(gòu)建編碼12E10L鏈V區(qū)的基因SEQ ID NO96的核苷酸序列是以WO99/10494所述的氨基酸序列(SEQ ID NO95)為基礎設計的編碼結(jié)合人MPL的人抗體12E10的L鏈V區(qū)的基因。通過其5’端連接來源于人抗體基因(Mol.Immunol.1992；291515-1518)的前導序列(SEQ ID NO97)，進一步進行設計。按上述相同方法設計的核苷酸序列分為每個具有15bp重疊序列的四個寡核苷酸(12E10VL1、12E10VL2、12E10VL3、12E10VL4)，分別進行合成。分別地，12E10VL1(SEQ ID NO98)和12E10VL3(SEQ ID NO100)具有正義序列，12E10VL2(SEQ ID NO99)和12E10VL4(SEQ ID NO101)具有反義序列。按照各自的互補性組裝每個合成的寡核苷酸以后，與外部引物(12E10VLS和12E10VLA)混合，擴增全長基因。12E10VLS(SEQ ID NO102)設計為通過正向引物與前導序列的5’端雜交，并具有EcoR I限制性酶識別位點和Kozak序列。12E10VLA(SEQ ID NO103)設計為通過反向引物與編碼L鏈V區(qū)C端的核苷酸序列雜交，并具有BlnI限制性酶識別位點。
如上所述進行PCR，利用1.5％低熔點溫度瓊脂糖凝膠(Sigma)純化PCR產(chǎn)物，利用限制性酶EcoR I和BlnI消化，并克隆到包含人λ鏈恒定區(qū)基因的pUC19中。DNA測序后，將包含正確DNA序列的質(zhì)粒用EcoR I消化，產(chǎn)生編碼12E10L鏈V區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)的基因，然后插入表達載體pCOS-1。具有12E10L鏈基因(SEQ ID NO104)的質(zhì)粒命名為pCOS-12E10L。
8.3產(chǎn)生重建的12E10單鏈Fv重建的12E10抗體單鏈Fv設計為12E10VH-接頭-12E10VL順序，并且C端具有FLAG序列(SEQ ID NO105)以便于檢測和純化。利用由(Gly4Ser)3所代表的15個氨基酸、或(Gly4Ser)1所代表的5個氨基酸組成的接頭序列，構(gòu)建該重建的12E10單鏈Fv(sc12E10和db12E10)。
(1)利用由5個氨基酸組成的接頭序列產(chǎn)生重建的12E10單鏈Fv將(Gly4Ser)1接頭的核苷酸序列引入編碼12E10 H鏈V區(qū)基因的3’端以及編碼12E10 L鏈V區(qū)基因的5’端，利用PCR分別擴增這樣獲得的各個基因，并連接所擴增的基因，構(gòu)建包含由5個氨基酸組成的接頭序列的重建的12E10單鏈Fv的編碼基因。利用四種PCR引物(A-D)制備重建的12E10單鏈Fv。引物A和C具有正義序列，引物B和D具有反義序列。
H鏈V區(qū)的正向引物為12E10S(引物A，SEQ ID No.106)。H鏈V區(qū)的反向引物DB2(引物B，SEQ ID No.107)設計為與H鏈V區(qū)C端的編碼DNA雜交，并具有接頭(Gly4Ser)1的編碼核苷酸序列以及L鏈V區(qū)N端的編碼核苷酸序列。
L鏈V區(qū)的正向引物DB1(引物C，SEQ ID No.108)設計為與L鏈V區(qū)N端的編碼DNA雜交，并具有接頭(Gly4Ser)1的編碼核苷酸序列以及H鏈V區(qū)C端的編碼核苷酸序列。L鏈V區(qū)的反向引物12E10FA(引物D，SEQ ID No.109)設計為可與L鏈V區(qū)C端的編碼DNA雜交，并具有FLAG編碼序列以及NotI限制性酶識別位點。
在第一個PCR步驟中，進行A-B、C-D二個反應，將第一步PCR獲得的二種PCR產(chǎn)物按照各自互補性進行組裝。加入引物A和D以后，擴增具有由5個氨基酸組成的接頭的、重建的12E10單鏈Fv的全長編碼DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分別用編碼重建的12E10H鏈V區(qū)的質(zhì)粒HEF-12E10H-gγ1(參見實施例8.1)、以及編碼重建的12E10L鏈V區(qū)的質(zhì)粒pCOS-12E10L(參見實施例8.2)作模板。
50μl第一步PCR反應的溶液包含5μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(來自PERKIN ELMER)、100pmol每種引物和100ng每種模板DNA。PCR溶液在起始溫度94℃加熱9分鐘，在94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘。此溫度循環(huán)重復35次以后，72℃再加熱反應混合物5分鐘。
利用第二步PCR組裝產(chǎn)物A-B(429bp)和C-D(395bp)。第二步PCR混合物溶液(98μl)包含第一步PCR產(chǎn)物A-B和C-D每種1μl為模板、每種引物各100pmol、10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5單位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(來自PERKIN ELMER)，在上述相同條件下反應。
利用1.5％低熔點溫度瓊脂糖凝膠純化第二步PCR產(chǎn)生的795bpDNA片段，用EcoRI和NotI消化，克隆到pCHO1載體或pCOS1載體。表達載體pCHO1是利用EcoRI和SmaI消化DHFR-ΔE-RVH-PM1-f(參見WO92/19759)，去除抗體基因，并連上EcoRI-NotI-BamHI接頭(TAKARA SHUZO)而構(gòu)建的。DNA測序后，將包含重建的12E10單鏈Fv正確氨基酸序列的編碼DNA片段的質(zhì)粒，命名為pCHO-db12E10和pCOS-db12E10。質(zhì)粒pCHO-db12E10和pCOS-db12E10中包含的重建的12E10單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO110所示。
(2)利用由15個氨基酸組成的接頭序列產(chǎn)生重建的12E10單鏈Fv將接頭(Gly4Ser)3的核苷酸序列引入編碼12E10H鏈V區(qū)基因的3’端以及編碼12E10 L鏈V區(qū)基因的5’端，利用PCR分別擴增這樣獲得的各個基因，并連接所擴增的基因，構(gòu)建包含由15個氨基酸組成的接頭序列的重建的12E10抗體單鏈Fv的編碼基因。利用四種PCR引物(A-D)制備重建的12E10單鏈Fv。引物A和C具有正義序列，引物B和D具有反義序列。
H鏈V區(qū)的正向引物為12E10S(引物A，SEQ ID No.106)。H鏈V區(qū)的反向引物sc4.3(引物B，SEQ ID No.111)設計為與H鏈V區(qū)C端的編碼DNA雜交，并具有接頭(Gly4Ser)3的編碼核苷酸序列以及L鏈V區(qū)N端的編碼核苷酸序列。
L鏈V區(qū)的正向引物sc1.3(引物C，SEQ ID No.112)設計為與L鏈V區(qū)N端的編碼DNA雜交，并具有接頭(Gly4Ser)3的編碼核苷酸序列以及H鏈V區(qū)C端的編碼核苷酸序列。L鏈V區(qū)的反向引物12E10FA(引物D，SEQ ID No.109)設計為可與L鏈V區(qū)C端的編碼DNA雜交，并具有FLAG編碼序列以及NotI限制性酶識別位點。
在第一個PCR步驟中，進行A-B、C-D二個反應，將第一步PCR獲得的二種PCR產(chǎn)物按照各自互補性進行組裝。加入引物A和D以后，擴增具有由15個氨基酸組成的接頭的、重建的12E10單鏈Fv的全長編碼DNA(第二步PCR)。第一步PCR中，以編碼重建的12E10單鏈Fv的質(zhì)粒pCOS-db12E10(參見實施例8.3(1))作模板。
第一步PCR反應的50μl溶液包含5μl 10×ExTaq Buffer、0.4mM dNTPs、2.5單位DNA聚合酶TaKaRa ExTaq(來自TAKARA)、每種引物各100pmol和10ng每種模板DNA。PCR溶液在起始溫度94℃加熱30秒，在94℃ 15秒、72℃ 2分鐘，此循環(huán)重復5次。在94℃ 15秒、72℃ 2分鐘的循環(huán)重復28次以后，72℃再加熱反應混合物5分鐘。
利用第二步組裝PCR產(chǎn)物A-B(477bp)和C-D(447bp)。第二步PCR混合物溶液(98μl)包含第一步PCR產(chǎn)物A-B和C-D每種1μl為模板、每種引物A和D各100pmol、5μl 10×ExTaq Buffer、0.4mM dNTPs、2.5單位DNA聚合酶TaKaRa ExTaq(來自TAKARA)，在上述相同條件下反應。
利用1.0％低熔點溫度瓊脂糖凝膠純化第二步PCR產(chǎn)生的825bpDNA片段，用EcoRI和NotI消化。這樣獲得的DNA片段克隆到pCHO1載體或pCOS1載體。DNA測序后，將包含重建的12E10單鏈Fv正確氨基酸序列的編碼DNA片段的質(zhì)粒命名為pCHO-sc12E10和pCOS-sc12E10。質(zhì)粒pCHO-sc12E10和pCOS-sc12E10中包含的重建的12E10單鏈Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO113所示。
8.4利用動物細胞表達抗體12E10(IgG、Fab)和單鏈Fv多肽利用COS-7細胞或CHO細胞表達抗體12E10(IgG、Fab)和來源于抗體12E10的單鏈Fv(接頭序列5個氨基酸、15個氨基酸)。
利用COS7細胞如下進行瞬時表達。使用Gene Pulser II裝置(BioRad)，通過電穿孔方法進行轉(zhuǎn)染。在懸浮于0.8ml PBS的COS-7細胞中(1×107細胞/ml)，為表達抗體12E10(IgG)而加入上述表達載體HEF-12E10H-gγ1和pCOS-12E10L各10μg，為表達12E10Fab片段而加入pFd-12E10H和pCOS-12E10L各10μg，為表達單鏈Fv而加入10μg pCOS-sc12E10(10μg)或pCOS-db12E10(10μg)。利用1.5KV、25μFD電容脈沖處理小杯中的混合物。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞加到含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(GIBCOBRL)培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，用PBS洗滌細胞一次，加到無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)上清離心去除細胞碎片，用0.22μm濾膜過濾。
為建立穩(wěn)定表達來源于抗體12E10的單鏈Fv(多肽)的CHO細胞系，將表達載體pCHO-sc12E10或pCOS-ds12E10分別引入CHO細胞。
使用Gene Pulser II裝置(BioRad)，通過電穿孔方法將每種表達載體引入CHO細胞。利用限制性酶PvuI消化，獲得線性化DNA(100μg)，在小杯中與懸浮于0.8ml PBS的CHO細胞(1×107細胞/ml)混合，冰上靜置10分鐘，利用1.5KV、25μFD電容脈沖處理。室溫恢復10分鐘后，將電穿孔細胞加到含有10％透析過的胎牛血清和核酸的CHO-S-SFM II中(GIBCO BRL)培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，在含有10％透析過的胎牛血清的無核酸CHO-S-SFM II培養(yǎng)基中(GIBCO BRL)繼續(xù)培養(yǎng)。從這樣獲得的克隆中選擇高表達率克隆，作為12E10單鏈Fv的生產(chǎn)細胞系。在無血清CHO-S-SFM II培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中培養(yǎng)以后，培養(yǎng)上清離心去除細胞碎片，用0.22μm濾膜過濾。
8.5純化CHO細胞產(chǎn)生的來源于12E10的單鏈Fv將實施例8.4中獲得的表達12E10單鏈Fv(sc12E10、db12E10)的CHO細胞系產(chǎn)生的培養(yǎng)上清，分別利用抗FLAG抗體柱和凝膠過濾柱純化，產(chǎn)生純化的單鏈Fv。
(1)利用抗FLAG抗體柱純化將每種培養(yǎng)上清(sc12E10、db12E10)加入用含150mM NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)平衡的抗FLAG M2親和凝膠柱(Sigma)。利用相同緩沖液洗柱以后，通過100mM甘氨酸緩沖液(pH3.5)洗脫柱上吸附的蛋白質(zhì)。洗脫組分立即加入1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)進行中和，并用SDS-PAGE分析。將確認含有單鏈Fv的組分混合，利用Centricon-10(AMICON)濃縮大約20倍。
(2)凝膠過濾(1)中獲得的濃縮溶液加入用含0.01％ Tween20的PBS平衡的Superde×200柱HR(10×300mm，AMERSHAM PHARMACIA)。層析圖如圖53和54所示。產(chǎn)物sc12E10洗脫為2個峰(A、B)(參見圖53)。產(chǎn)物db12E10洗脫為2個峰(C、D)(參見圖54)。收集每個峰組分，按照Laemmli方法，在有或無還原劑存在下利用電泳樣品，電泳后用考馬斯亮藍染色。如圖55所示，無論還原劑存在與否，所有組分A、B、C和D都產(chǎn)生具有表觀分子量大約31kD的單一條帶。利用Superde×200 HR通過凝膠過濾分析這些組分時，組分A產(chǎn)生表觀分子量大約42kD處洗脫的產(chǎn)物，組分B產(chǎn)生20kD的產(chǎn)物(參見圖56)，組分C產(chǎn)生69kD的產(chǎn)物，組分D產(chǎn)生41kD的產(chǎn)物(參見圖57)。此結(jié)果提示，sc12E10來源的組分A是單鏈Fv的非共價鍵二聚體，組分B是單鏈Fv的單體，db12E10來源的組分C是單鏈Fv的非共價鍵三聚體，組分D是單鏈Fv的非共價鍵二聚體。
8.6測量各種單鏈Fv的TPO樣激動劑活性通過測定對表達人TPO受體(MPL)的Ba/F3細胞(BaF/mpl)的增殖活性，評價抗mpl單鏈抗體的TPO樣活性。
利用含有1％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)洗滌BaF/mpl細胞兩次后，細胞按5×105細胞/ml的細胞密度懸浮于培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)基分別稀釋抗MPL單鏈抗體或人TPO(R&DSystems)。將50μl細胞懸液和50μl稀釋的抗體或人TPO加入96孔微孔板中(平底)(Corning)，在CO2保溫箱中(CO2濃度5％)培養(yǎng)24小時。溫育以后加入10μl WST-8試劑(用于測定原始細胞SF數(shù)目的試劑Nacalai Tesque)，利用吸收光度計Benchmark Plus(BioRad)立即測量吸光度，測量波長450nm，參比波長655nm。在CO2保溫箱中(CO2濃度5％)溫育2小時以后，利用Benchmark Plus再次測量吸光度，測量波長450nm，參比波長655nm。由于WST-8試劑根據(jù)活細胞數(shù)目在波長450nm處產(chǎn)生顯色反應，基于2小時后吸光度的變化，評價BaF/mpl的增殖活性。
利用表達各種12E10抗體分子的COS-7細胞培養(yǎng)上清，測定對MPL的激動劑活性，如圖58所示。具有5個氨基酸接頭(ds12E10)和15個氨基酸接頭(sc12E10)的單鏈Fv，其吸光度以濃度依賴性方式提高，顯示TPO樣激動劑活性(ED50；分別9pM和51pM)，而12E10IgG和12E10Fab沒有活性。
已知單鏈Fv H鏈和L鏈不僅分子內(nèi)結(jié)合，而且分子間結(jié)合形成多聚體，例如二聚體。表達12E10單鏈Fv的CHO細胞的培養(yǎng)上清經(jīng)凝膠過濾，測定對MPL的激動劑活性。結(jié)果如圖59所示。sc12E10中包含的小量二聚體，顯示比單體(sc12E10單體，ED50；＞10nM)強大約5000倍的TPO樣激動劑活性(sc12E10二聚體，ED50；1.9pM)?；钚愿哂赥PO(ED50；27pM)。db12E10的二聚體(db12E10二聚體，ED50；2.0pM)顯示與sc12E10二聚體相當?shù)母呋钚浴b12E10的三聚體(從凝膠過濾獲得的分子量推測為三聚體)(ED50；7.4pM)顯示低于db12E10二聚體的高活性。這些結(jié)果提示，雙價抗原結(jié)合位點(二聚體)對于激動劑抗體12E10的活性是重要的。鑒于12E10 IgG沒有活性，推測雙價以外的其它因素是重要的，例如抗原結(jié)合位點的定位、距離或角度。


圖1表示流式細胞術結(jié)果，表明人IgG抗體不結(jié)合表達人IAP的L1210細胞(hIAP/L1210)。
圖2表示流式細胞術結(jié)果，表明嵌合MABL-1抗體特異性結(jié)合表達人IAP的L1210細胞(hIAP/L1210)。
圖3表示流式細胞術結(jié)果，表明嵌合MABL-2抗體特異性結(jié)合表達人IAP的L1210細胞(hIAP/L1210)。
圖4本發(fā)明單鏈Fv的產(chǎn)生過程示意圖。
圖5闡明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒可用于在E.coli中表達本發(fā)明單鏈Fv的編碼DNA。
圖6闡明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，該質(zhì)?？捎糜谠诓溉閯游锛毎斜磉_本發(fā)明單鏈Fv的編碼DNA。
圖7顯示實施例5.4中Western印跡的結(jié)果圖。從左側(cè)開始為，分子量標志(從上面顯示97.4、66、45、31、21.5和14.5kDa)、引入pCHO1的COS7細胞培養(yǎng)上清、以及引入pCHOM2的COS7細胞培養(yǎng)上清。表明在引入pCHOM2的COS7細胞培養(yǎng)上清中包含抗體MABL-2的重建單鏈Fv(箭頭)。
圖8表示流式細胞術結(jié)果，表明作對照的pCHO1/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，不結(jié)合pCOS1/L1210對照細胞。
圖9表示流式細胞術結(jié)果，表明MABL2-scFv/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，不結(jié)合pCOS1/L1210對照細胞。
圖10表示流式細胞術結(jié)果，表明作對照的pCOS1/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體不結(jié)合hIAP/L1210細胞。
圖11表示流式細胞術結(jié)果，表明MABL2-scFv/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體特異性結(jié)合hIAP/L1210細胞。
圖12表示實施例5.6中競爭性ELISA結(jié)果，其中以對小鼠單克隆抗體MABL-2結(jié)合抗原的抑制作用為指征，與對照的pCHO1/COS7細胞培養(yǎng)上清比較，闡明本發(fā)明單鏈Fv(MABL2-scFv)的抗原結(jié)合活性。
圖13表示實施例5.7中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明作對照的pCHO1/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，不能誘導pCOS1/L1210對照細胞凋亡。
圖14表示實施例5.7中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明MABL2-scFv/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，不能誘導pCOS1/L1210對照細胞凋亡。
圖15表示實施例5.7中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明作對照的pCHO1/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，不能誘導hIAP/L1210細胞凋亡。
圖16表示實施例5.7中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明MABL2-scFv/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，特異性誘導hIAP/L1210細胞凋亡。
圖17表示實施例5.7中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明作對照的pCHO1/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，不能誘導CCRF-CEM細胞凋亡(終濃度50％)。
圖18表示實施例5.7中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明MABL2-scFv/COS7細胞培養(yǎng)上清中的抗體，特異性誘導CCRF-CEM細胞凋亡(終濃度50％)。
圖19表示實施例5.9純化CHO細胞產(chǎn)生的源于抗體MABL-2的單鏈Fv所得到的層析結(jié)果，表明用羥基磷灰石柱純化來自Blue-sepharose柱的組分時，獲得的主要峰，組分A和組分B。
圖20表示實施例5.9-(2)獲得的組分A和組分B的凝膠過濾純化結(jié)果，表明組分A在表觀分子量約36kD處、以及組分B在約76kD處洗脫的主要峰(分別為AI和BI)。
圖21為實施例5.9純化CHO細胞產(chǎn)生的源于抗體MABL-2的單鏈Fv所獲得組分的SDS-PAGE分析，表明兩個組分中都觀察到分子量約35kD的單一條帶。
圖22表示凝膠過濾純化CHO細胞產(chǎn)生的源于抗體MABL-2的單鏈Fv所獲得組分AI和BI的分析結(jié)果，其中組分AI包含單體，組分BI包含二聚體。
圖23闡明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，其可用于在E.coli中表達本發(fā)明單鏈Fv的編碼DNA。
圖24表示實施例5.12凝膠過濾柱純化E.coli產(chǎn)生的源于抗體MABL-2的單鏈Fv多肽粗產(chǎn)物的結(jié)果，其中每個峰分別表示E.coli產(chǎn)生的單鏈Fv的單體或二聚體。
圖25表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明作對照的小鼠IgG抗體，不能誘導hIAP/L1210細胞凋亡(終濃度3μg/ml)。
圖26表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明CHO細胞產(chǎn)生的MABL2-scFv二聚體，顯著誘導hIAP/L1210細胞凋亡(終濃度3μg/ml)。
圖27表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明E.coli產(chǎn)生的MABL2-scFv二聚體，顯著誘導hIAP/L1210細胞凋亡(終濃度3μg/ml)。
圖28表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明CHO細胞產(chǎn)生的MABL2-scFv單體對hIAP/L1210細胞的凋亡誘導，與對照處于相同水平(終濃度3μg/ml)。
圖29表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明E.coli產(chǎn)生的MABL2-scFv單體對hIAP/L1210細胞的凋亡誘導，與對照處于相同水平(終濃度3μg/ml)。
圖30表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明作對照的小鼠IgG抗體，即使加入抗FLAG抗體，也不能誘導hIAP/L1210細胞凋亡(終濃度3μg/ml)。
圖31表示實施例5.13中凋亡誘導效應的結(jié)果，表明CHO細胞產(chǎn)生的MABL2-scFv單體，當加入抗FLAG抗體時，顯著誘導hIAP/L1210細胞凋亡(終濃度3μg/ml)。
圖32表示在人骨髓瘤細胞系KPMM2移植小鼠的血清中，人IgG的定量測量結(jié)果，顯示小鼠中由人骨髓瘤細胞產(chǎn)生的人IgG的量。表明scFv/CHO二聚體顯著抑制KPMM2細胞生長。
圖33表示小鼠在移植腫瘤后的存活時間，表明scFv/CHO二聚體給藥組存活時間顯著延長。
圖34闡明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，其可表達包含源于抗體MABL-2的兩個H鏈V區(qū)和兩個L鏈V區(qū)的改變的抗體[sc(Fv)2]。
圖35闡明表達scFv(HL型)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，其中V區(qū)通過沒有肽接頭的[H鏈]-[L鏈]方式連接。
圖36闡明HL型多肽的結(jié)構(gòu)以及肽接頭的氨基酸序列。
圖37闡明表達scFv(LH型)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，其中V區(qū)通過沒有肽接頭的[L鏈]-[H鏈]方式連接。
圖38闡明LH型多肽的結(jié)構(gòu)以及肽接頭的氨基酸序列。
圖39表示實施例6.4 Western印跡的結(jié)果，表明表達了包含兩個H鏈V區(qū)和兩個L鏈V區(qū)的改變的抗體sc(Fv)2、以及具有不同長度肽接頭的MABL2-scFv。
圖40a和40b表示實施例6.3(1)制備的COS7細胞培養(yǎng)上清的流式細胞術結(jié)果，表明MABL2-scFv和具有不同長度肽接頭的sc(Fv)2對人IAP具有高親和力。
圖41a和41b表示實施例6.6凋亡誘導效應的結(jié)果，表明scFv<HL3、4、6、7、LH3、4、6和7>以及sc(Fv)2，顯著誘導hIAP/L1210細胞死亡。
圖42表示實施例6.10抗原結(jié)合能力的評價結(jié)果，表明scFv<HL5>二聚體和sc(Fv)2對人IAP具有高親和力。
圖43表示實施例6.11體外凋亡誘導效應的結(jié)果，表明scFv<HL5>二聚體和sc(Fv)2以濃度依賴方式誘導hIAP/L1210細胞和CCRF-CEM細胞凋亡。
圖44表示在移植人骨髓瘤細胞的小鼠血清中，由人骨髓瘤細胞系KPMM2產(chǎn)生的M蛋白質(zhì)的定量測量結(jié)果。表明scFv<HL5>二聚體和sc(Fv)2顯著抑制KPMM2細胞生長。
圖45表示腫瘤移植后小鼠的存活時間(天)，表明scFv<HL5>給藥組的存活時間顯著延長。
圖46表示腫瘤移植后小鼠的存活時間(天)，表明sc(Fv)2給藥組的存活時間顯著延長。
圖47圖示構(gòu)建包含由15個氨基酸組成的接頭序列的重建12B5單鏈Fv的編碼DNA片段的方法及其結(jié)構(gòu)。
圖48表示實施例7.5(1)中獲得的通過凝膠過濾純化每種12B5單鏈Fv的結(jié)果，表明sc12B5分為兩個峰(組分A和B)。
圖49表示實施例7.5(2)中進行的每個組分A和B的SDS-PAGE分析結(jié)果。
圖50表示實施例7.5(2)中進行的每個組分A和B的Superde×200柱分析結(jié)果，表明組分A的主峰在(a)中所示大約44kD表觀分子量處洗脫，組分B的主峰在(b)中所示大約22kD表觀分子量處洗脫。
圖51表示sc12B5和抗體12B5(IgG、Fab)的TPO樣激動劑活性的測量結(jié)果，表明12B5IgG和單價單鏈Fv(sc12B5)以濃度依賴性方式顯示TPO樣激動劑活性。
圖52表示sc12B5單體和二聚體的TPO樣激動劑活性的測量結(jié)果，表明具有雙價抗原結(jié)合位點的單鏈Fv(sc12B5二聚體)的激動劑活性高于單價sc12B5大約400倍，并且效力等于或高于人TPO。
圖53表示利用Superde×200HR柱通過凝膠過濾層析獲得的sc12E10單鏈抗體的純化結(jié)果，表明sc12E10分為兩個峰(組分A和B)。
圖54表示利用Superde×200HR柱通過凝膠過濾層析獲得的db12E10單鏈抗體的純化結(jié)果，表明db12E10分為兩個峰(組分C和D)。
圖55表示組分A和B(sc12E10)以及組分C和D(db12E10)在還原或非還原條件下的SDS-PAGE分析。
圖56表示利用Superde×200HR柱通過凝膠過濾層析的組分A和B的分析結(jié)果，表明(1)組分A的主峰在大約42kD表觀分子量處洗脫，以及(2)組分B的主峰在大約20kD表觀分子量處洗脫。。
圖57表示利用Superde×200HR柱通過凝膠過濾層析的組分C和D的分析結(jié)果，表明(1)組分C的主峰在大約69kD表觀分子量處洗脫，以及(2)組分D的主峰在大約41kD表觀分子量處洗脫。。
圖58圖示各種12E10抗體分子對MPL的激動劑活性，表明單鏈Fv(sc12E10、db12E10)顯示TPO樣激動劑活性，而12E10 IgG和12E10 Fab不顯示。
圖59圖示sc12E10單體和二聚體以及db12E10二聚體和三聚體對MPL的激動劑活性，表明sc12E10二聚體以及db12E10二聚體和三聚體顯示高于TPO的TPO樣激動劑活性。
工業(yè)應用本發(fā)明的改變的抗體具有能夠通過交聯(lián)細胞表面分子而轉(zhuǎn)導信號進入細胞的激動劑作用，優(yōu)勢在于因其相比親本抗體分子(完全IgG)的分子大小下降而對組織和腫瘤的通透性高。本發(fā)明提供了相比天然配基(例如TPO)和親本抗體(完全IgG)具有顯著高的激動劑活性的改變的抗體。即使親本抗體沒有激動劑活性，也能夠提供相比天然配基具有較高激動劑活性的改變的抗體。這歸因于改變的抗體與原始抗體相比，形狀更接近于配基。因此，該改變的抗體可用于信號轉(zhuǎn)導激動劑，以實現(xiàn)誘導凋亡、誘導細胞增殖、誘導細胞分化、誘導細胞分裂或細胞周期調(diào)節(jié)作用。根據(jù)本發(fā)明，將抗體分子改變?yōu)楦淖兊目贵w，導致降低細胞間交聯(lián)引起的副作用，并提供通過交聯(lián)細胞表面分子只誘導所需作用的新型藥物。包含本發(fā)明改變的抗體為活性成分的醫(yī)藥制劑可用作預防和/或治療藥物，用于癌癥、炎癥、激素紊亂、自身免疫疾病以及血液病，例如白血病、惡性淋巴瘤、再生障礙性貧血、骨髓發(fā)育不良綜合癥以及真性紅細胞增多癥。
序列表<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120>低分子化的激動劑抗體<130>FP1032<141>2001-10-22<150>JP2000-321821<151>2000-10-20<150>JP2000-321822<151>2000-10-20<150>PCT/JP01/01912<151>2001-03-12<150>PCT/JP01/03288<151>2001-04-17<150>JP2001-277314<151>2001-09-12<160>113<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1ccatcctaat acgactcact atagggc 27
<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3ggatcccggg ccagtggata gacagatg 28<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4ggatcccggg agtggataga ccgatg 26<210>5
<211>394<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(393)<223>pGEM-M1L.1-57；信號肽，58-394；成熟肽<400>5atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gcg 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac cta cag aag cca 192Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg ggg acc aag ctg 384Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125gaa ata aaa c394Glu Ile Lys130<210>6<211>409<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(408)<223>pGEM-M1H.1-57；信號肽，58-409；成熟肽<400>6atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys20 25 30cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser85 90 95gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g409Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser130 135<210>7<211>394<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(393)<223>pGEM-M2L.1-57；信號肽，58-394；成熟肽<400>7atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly
1 5 10 15tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc 96Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys100 105 110tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125gaa ata aaa c394Glu Ile Lys130<210>8<211>409
<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(408)<223>pGEM-M2H.1-57；信號肽，58-409；成熟肽<400>8atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr85 90 95aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110
tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g409Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser130 135<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>PCR引物<400>14accaccacct gaggagactg tgagagt 27<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>18ccggaattct cattatttat cgtcatcgtc tttgtagtct tttatttcca gcttggt 57<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接頭氨基酸序列和核苷酸序列<400>19ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser5 10 15<210>20<211>828<212>DNA<213>Mus
<220>
<221>CDS<222>(1)...(822)<223>pscM1.MABL1-scFv<400>20atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gct 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp20 25 30ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly35 40 45tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly50 55 60cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr65 70 75 80aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa 288Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys85 90 95tcc tcc agc gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp100 105 110tct gcg gtc tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac 384Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp
115 120 125tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln145 150 155 160act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser165 170 175tgc aga tct agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta 576Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu180 185 190caa tgg tac cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac 624Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr195 200 205aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser210 215 220gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag 720Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu225 230 235 240gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr245 250 255tcc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp260 265 270
gat aaa taatga828Asp Lys<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
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130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc 480Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu145 150 155 160tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct 528Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser165 170 175agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac 576Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr180 185 190cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser195 200 205aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg 672Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly210 215 220aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly225 230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg 768Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly245 250 255ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa taa 816Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys260 265 270tga 819<210>24
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100 105 110tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac 384Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp115 120 125tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln145 150 155 160agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser165 170 175tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta 576Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr180 185 190cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac 624His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr195 200 205aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser210 215 220gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag 720Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu225 230 235 240gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr245 250 255
ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp260 265 270gat aaa taatga 828Asp Lys<210>25<211>819<212>DNA<213>Mus<220>
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Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr85 90 95aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc 480Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu145 150 155 160tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca 528Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser165 170 175agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 576Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr180 185 190ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc624Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser195 200 205aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg 672Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val
210 215 220aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly225 230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg 768Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly245 250 255ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa taa 816Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys260 265 270tga 819<210>26<211>456<212>DNA<213>Mus<220>
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Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala35 40 45caa aac act act gaa gta tac gta aag tgg aaa ttt aaa gga aga gat 192Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp50 55 60att tac acc ttt gat gga gct cta aac aag tcc act gtc ccc act gac 240Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp65 70 75 80ttt agt agt gca aaa att gaa gtc tca caa tta cta aaa gga gat gcc 288Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala85 90 95tct ttg aag atg gat aag agt gat gct gtc tca cac aca gga aac tac 336Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr100 105 110act tgt gaa gta aca gaa tta acc aga gaa ggt gaa acg atc atc gag 384Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu115 120 125cta aaa tat cgt gtt gtt tca tgg ttt tct cca aat gaa aat gac tac 432Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Asp Tyr130 135 140aag gac gac gat gac aag tgatag 456Lys Asp Asp Asp Asp Lys145 150<210>27<211>46<212>DNA<213>人工序列
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20 25 30cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg 144His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp35 40 45att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag 192Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys50 55 60ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc 240Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala65 70 75 80tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac 288Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr85 90 95tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc 336Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg 384Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg 432Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu130 135 140cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag 480Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln145 150 155 160agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag 528Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln165 170 175
aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga 576Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg180 185 190ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat 624Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp195 200 205ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat 672Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr210 215 220ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc 720Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr225 230 235 240aag ctg gaa ata aaa taatga 741Lys Leu Glu Ile Lys245<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc288Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr85 90 95aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc336Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt432Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc480Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu145 150 155 160tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca528Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser165 170 175agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac576Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr180 185 190ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc624Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser195 200 205aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg672
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val210 215 220aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga720Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly225 230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg768Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly245 250 255ggg acc aag ctg gaa ata aaa ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt816Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly260 265 270tcg ggt ggt ggc gga tcg gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct864Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser275 280 285gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag912Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys290 295 300gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag960Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln305 310 315 320aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat 1008Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn325 330 335gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act 1056Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr340 345 350tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc 1104Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala
355 360 365tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act1152Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr370 375 380tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt1200Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly385 390 395 400ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg1248Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val405 410 415atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc1296Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala420 425 430tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag1344Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys435 440 445acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc1392Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu450 455 460ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc1440Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe465 470 475 480agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg1488Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val485 490 495gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt1536Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val500 505 510
ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa 1584Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys515 520 525gac gat gac gat aaa taatga 1605Asp Asp Asp Asp Lys530<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>33tgaggaattc ccaccatggg atg 33<210>34<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>34cacgacgtca ctcgagactg tgagagtggt gccttggccc 40<210>35<211>40<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>35agtctcgagt gacgtcgtga tgacccaaag tccactctcc 40<210>36<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>36gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt c 31<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>37cgcgtaatac gactcactat ag 22<210>38<211>46<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>38gcaattggac ctgttttatc tcgagcttgg tcccccctcc gaacgt 46<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>39gctcgagata aaacaggtcc aattgcagca gtctggacct gaact 45<210>40<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>40gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt ctttgtagtc tgaggagact gtgagagtgg 60<210>41<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>41gactgaattc ccaccatgaa gttgcctgtt ag 32<210>42<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>42cagtctcgag tggtggttcc gacgtcgtga tgacccaaag 40<210>43<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>43cagtctcgag tggtggtggt tccgacgtcg tgatgaccca aag 43<210>44<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>44cagtctcgag tggtggtggt ggttccgacg tcgtgatgac ccaaag 46<210>45<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>45cagtctcgag tggtggtggt ggtggttccg acgtcgtgat gacccaaag 49<210>46<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>46cagtctcgag tggtggtggt ggtggtggtt ccgacgtcgt gatgacccaa ag 52<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>47
ggccgcatgt tgtcacgaat 20<210>48<211>780<212>DNA<213>Mus<220>
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90 95 100agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt 357Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly105 110 115tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcg agt 408Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser120 125 130 135gac gtc gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat 459Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp140 145 150caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga 510Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly155 160 165 170aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc 561Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu175 180 185ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt 612Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser190 195 200ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct 663Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu MET Ile Ser Arg Val Glu Ala205 210 215 220gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 714Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr225 230 235ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat 765Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp240 245 250 255
aaa taa tga gga tcc 780Lys<210>49<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>49caagctcgag ataaaatccg gaggccaggt ccaattgcag cagtc 45<210>50<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>50caagctcgag ataaaatccg gaggtggcca ggtccaattg cagcagtc 48<210>51<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>51
caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg ccaggtccaa ttgcagcagt c 51<210>52<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>52caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggccaggtc caattgcagc agtc 54<210>53<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>53caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggtggccag gtccaattgc agcagtc 57<210>54<211>780<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(768)<223>CF2LH-0/pCOS1.MABL2-scFv<LH-0>
<400>54atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt tcc 51MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro Gly Ser5 10 15agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt 102Ser Ser Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu20 25 30gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt 153Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser35 40 45 50aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca 204Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro55 60 65aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg 255Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg70 75 80 85ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg 306Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu MET Ile Ser Arg Val90 95 100gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg 357Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro105 110 115tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctc gag ata aaa cag gtc caa ttg cag 408Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Val Gln Leu Gln120 125 130 135cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc 459Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys MET Ser Cys140 145 150
aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag 510Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln155 160 165 170aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 561Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp175 180 185ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac 612Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp190 195 200aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 663Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp205 210 215 220tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg 714Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp225 230 235ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gac tac aaa gac gat gac gat 765Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp240 245 250 255aaa taa tga gga tcc 780Lys<210>55<211>351<212>DNA<213>人<220>
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<211>57<212>DNA<213>人<220>
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<213>人工序列<220>
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<223>12B5VH-3<400>59ggcaggtata tcctttgacg gaagaagtga atactatgca gactccgtgc agggccgatt 60caccatctcc agagacagtt ccaagaacac cctgtatctg caaatgaaca gcctg 115<210>60<211>108<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VH-4<400>60actcgagacg gtgaccattg tcccttggcc ccagatatcg aaaccataat gtgctcctct 60cgcacagtaa tacacagccg tgtcctcggc tctcaggctg ttcatttg 108<210>61
<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VH-S，PCR引物<400>61ttcaagcttc caccatggag tttgggctga gc 32<210>62<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
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atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg 180ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca caacctctct tgca gcc237Ala1tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc285Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser5 10 15acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc333Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe20 25 30ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc381Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly35 40 45gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc429Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu50 55 60 65agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac477Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr70 75 80atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa525Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys85 90 95gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca558Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr100 105<210>64<211>27
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<223>G1CH1-A，PCR引物<400>65aaaagatctt tatcatgtgt gagttttgtc acaagatttg ggctcaactt tcttgtccac 60<210>66<211>432<212>DNA<213>人<220>
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tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 98Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly15 20 25ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga 146Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly30 35 40 45atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc 194Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa 242Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu65 70 75tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt 290Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser80 85 90tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac 338Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp95 100 105acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc 386Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile110 115 120 125tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggtgagtgga tcc 432Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser130 135<210>67<211>321<212>DNA
<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(321)<223>12B5LV.1-321肽<400>67gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga 48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp20 25 30ttg gcc tgg tat cag cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc 144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat aag gcc tct agt tta gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc 192Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gat gat ttt gca act tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc 288Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu85 90 95act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc aaa 321Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
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<221>CDS<222>(1)...(66)<223>前導序列<400>68atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48MET Asp MET Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp5 10 15ctc cca ggt gcc aaa tgt 66Leu Pro Gly Ala Lys Cys20<210>69<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-1<400>69atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60aaatgtgaca tccagatgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctat110<210>70<211>110
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<223>12B5VL-2<400>70ggagtttagg ggctttccctggcttctgct gataccaggc caaccagtga taaataccct 60cgctggcccg gcaggtgatg gtgactctgt ctccaataga tgcagacagg 110<210>71<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-3<400>71aagcccctaa actcctgatc tataaggcct ctagtttagc cagtggggcc ccatcaaggt 60tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg110<210>72<211>103<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-4<400>72tttgatctcc agcttggtcc ctccgccgaa agtgagcgga taattactat attgttggca 60gtaataagtt gcaaaatcat caggctgcag gctgctgatg gtg 103
<210>73<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-S，PCR引物<400>73ttcaagcttc caccatggac atgagggtcc cc 32<210>74<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-A，PCR引物<400>74tctaggatcc actcacgttt gatctccagc ttggt 35<210>75<211>415<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(12)...(398)<223>HEF-12B5H-g kappa.12-398肽<400>75aagcttccac c atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg 50
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu1 5 10ctg ctc tgg ctc cca ggt gcc aaa tgt gac atc cag atg acc cag tct 98Leu Leu Trp Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser15 20 25cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc tgc 146Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys30 35 40 45cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag cag aag 194Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta gcc 242Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala65 70 75agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc 290Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe80 85 90act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act tat tac 338Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr95 100 105tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag 386Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys110 115 120 125ctg gag atc aaa cgtgagtgga tcctaga 415Leu Glu Ile Lys<210>76<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FLAG標志序列<400>76gac tac aag gat gac gac gat aag 24Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys5<210>77<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5-S，PCR引物<400>77atagaattcc accatggagt ttgggctgag c 31<210>78<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuVHJ3，PCR引物<400>78tgaagagacg gtgaccattg tccc 24<210>79
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RhuJH3，PCR引物<400>79ggacaatggt caccgtctct tcaggtgg 28<210>80<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RhuVK1，PCR引物<400>80ggagactggg tcatctggat gtccgatccg cc 32<210>81<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuVK1.2，PCR引物<400>81gacatccaga tgacccagtc tcc 23<210>82<211>59
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5F-A，PCR引物<400>82attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctttgatctc cagcttggt 59<210>83<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接頭氨基酸序列和核苷酸序列<400>83ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser5 10 15<210>84<211>823<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(12)...(809)<223>sc12B5，單鏈Fv<400>84aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt 50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu1 5 10tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 98Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly15 20 25ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga 146Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly30 35 40 45atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc 194Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa 242Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu65 70 75tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt 290Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser80 85 90tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac 338Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp95 100 105acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc 386Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile110 115 120 125tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggt ggt ggt ggt tcg 434Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gac atc cag atg acc cag 482Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc 530Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr160 165 170tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag cag 578Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln175 180 185aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta 626Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu190 195 200 205gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat 674Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp210 215 220ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act tat 722Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr225 230 235TAC TGC CAA CAA TAT AGT AAT TAT CCG CTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC 770Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr240 245 250aag ctg gag atc aaa gac tac aag gat gac gac gat aag tgataagcgg c 820Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys255 260 265cgc 823<210>85<211>114<212>PRT<213>人
<400>85Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val100 105 110Ser Ser<210>86<211>342<212>DNA<213>人<400>86caggtgcagc tgcagcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtga ctccatcagt agttactact ggagctggat tcggcagccc 120ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagagcca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggcggtac 300ttcgatgtct ggggccgtgg caccatggtc actgtctcct ca 342<210>87<211>57<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(57)<223>前導序列<308>GenBank No.AF062252<400>87atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15gtc ctg tcc 57Val Leu Ser<210>88<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VH1<400>88atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60gtgcagctgc agcagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct110
<210>89<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VH2<400>89acccaatcca ctccagtccc ttccctgggg gctgccgaat ccagctccag tagtaactac 60tgatggagtc accagagaca gtgcaggtga gggacagggt ctccgaaggc 110<210>90<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10V13<400>90tggagtggat tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga 60gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agagccagtt ctccctgaag 110<210>91<211>114<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VH4<400>91
tgaggagaca gtgaccatgg tgccacggcc ccagacatcg aagtaccgcc ctctcgcaca 60gtaatacacg gccgtgtctg cggcggtcac agagctcagc ttcagggaga actg114<210>92<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VHS，PCR引物<400>92ttcaagcttc caccatgaaa catctgtggt tc 32<210>93<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VHA，PCR引物<400>93ttgggatcca ctcacctgag gagacagtga ccat 34<210>94<211>426<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(12)...(417)
<223>12E10H，H鏈V區(qū)<400>94aagcttccac c atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct 50Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala1 5 10ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 98Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly15 20 25ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 146Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly30 35 40 45gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 194Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 242Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn65 70 75tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 290Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser80 85 90aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 338Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr95 100 105gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 386Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg110 115 120 125ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggtgagtgga tcccaa426Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130<210>95<211>110<212>PRT<213>Mus<400>95Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg85 90 95Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>96<211>330<212>DNA<213>Mus
<400>96tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaaacggcc ctcaggggtt 180tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccagaag cactcgggtg 300ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330<210>97<211>57<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(57)<223>前導序列<310>
<400>97atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15tct gtg acc 57Ser Val Thr<210>98<211>110<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>12E10VL1，PCR引物<400>98atggcctgga ccgttctcct cctcggcctc ctctctcact gcacaggctc tgtgacctcc 60tatgtgctga ctcagccacc ctcggtgtca gggtctcctg gacagtcgat 110<210>99<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL2，PCR引物<400>99tcatgagttt gggggctttg cctgggtgct gttggtacca ggagacatag ttataaccac 60caacgtcact gctggttcca gtgcaggaga tggtgatcga ctgtccagga 110<210>100<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL3，PCR引物<400>100cccccaaact catgatttat gagggcagta aacggccctc aggggtttct aatcgcttct 60ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tgggctccag 110<210>101<211>102
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL4，PCR引物<400>101taggacggtc agcttggtcc ctccgccgaa cacccgagtg cttctggttg tatatgagct 60gcagtaataa tcagcctcgt cctcagcctg gagcccagag at 102<210>102<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VLS，PCR引物<400>102atcaagcttc caccatggcc tggaccgttc t 31<210>103<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VLA，PCR引物<400>103ctaggatccg ggctgaccta ggacggtcag cttggt 36<210>104<211>387
<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(387)<223>12E10L，L鏈V區(qū)<310>
<400>104atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15tct gtg acc tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct 96Ser Val Thr Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser20 25 30cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt 144Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val35 40 45ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc 192Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala50 55 60ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct 240Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser65 70 75 80aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc 288Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile85 90 95tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat 336Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
100 105 110Aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val115 120 125cta 387Leu<210>105<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(24)<223>FLAG，前導序列<400>105gac tac aag gat gac gac gat aag 24Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys<210>106<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10S，PCR引物<400>106tatgaattcc accatgaaac atctgtggtt 30
<210>107<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DB2，PCR引物<400>107taggagctac cgcctccacc tgaggagaca gtgaccat 38<210>108<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DB1，PCR引物<400>108gtctcctcag gtggaggcgg tagctcctat gtgctgactc agcc 44<210>109<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10FA，PCR引物<400>109attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctaggacggt cagcttggt 59<210>110
<211>792<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(11)...(778)<223>12E10，單鏈Fv<400>110gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct49Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala1 5 10ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 97Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly15 20 25ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 145Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly30 35 40 45gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 193Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 241Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn65 70 75tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 289Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser80 85 90aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 337Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
95 100 105gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 385Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg110 115 120 125ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggt gga ggc ggt agc tcc tat gtg 433Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val130 135 140ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc 481Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr145 150 155atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc 529Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val160 165 170tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat 577Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr175 180 185gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc 625Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser190 195 200 205aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag 673Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu210 215 220gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg 721Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg225 230 235gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac 769Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp240 245 250
gac gat aag tgataagcgg ccgc 792Asp Asp Lys255<210>111<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>sc4.3，PCR引物<400>111ggtggctgag tcagcacata ggacgatccg ccaccacccg aaccaccacc acccgaacca 60cc 62<210>112<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>sc1.3，PCR引物<400>112gcaccatggt cactgtctcc tcaggtggtg gtggttcggg tggtggtggt tcgggtggtg 60g 61<210>113<211>822<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>CDS<222>(11)...(807)<223>sc12E10，單鏈Fv<400>113gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct49Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala1 5 10ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 97Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly15 20 25ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 145Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly30 35 40 45gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 193Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 241Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn65 70 75tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 289Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser80 85 90aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 337Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr95 100 105gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 385Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
110 115 120 125ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 433Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg 481Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser145 150 155gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc 529Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr160 165 170agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac 577Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His175 180 185cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc 625Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro190 195 200 205tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc 673Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala210 215 220tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac 721Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr225 230 235tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc 769Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr240 245 250aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac gac gat aag tgataagcgg 818Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys255 260 265
ccgc 82權利要求
1.增加激動劑活性的方法，其通過將抗體改變成改變的改體而進行，所述的改變的抗體包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)。
2.將信號轉(zhuǎn)導入細胞的方法，其通過使用改變的抗體交聯(lián)細胞表面的分子而進行，所述的改變的抗體包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)。
3.權利要求1或2的方法，其中H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過接頭相連。
4.權利要求3的方法，其中該接頭是包含至少一個氨基酸的肽接頭。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中該改變的抗體是包含H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的單鏈Fv的多聚體。
6.權利要求5的方法，其中該改變的抗體由單鏈Fv的四聚體、三聚體或二聚體組成。
7.權利要求6的方法，其中該改變的抗體由單鏈Fv的二聚體組成。
8.權利要求5-7中任一項的方法，其中處于相同鏈上的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)不結(jié)合形成抗原結(jié)合位點。
9.權利要求1-4中任一項的方法，其中該改變的抗體是包含二個或多個H鏈V區(qū)以及二個或多個L鏈V區(qū)的單鏈多肽。
10.權利要求9的方法，其中該改變的抗體是包含二個H鏈V區(qū)以及二個L鏈V區(qū)的單鏈多肽。
11.權利要求1-10中任一項的方法，其中該改變的抗體另外包含用于肽純化的氨基酸序列。
12.權利要求1-11中任一項的方法，其中該改變的抗體已經(jīng)純化。
13.權利要求1-12中任一項的方法，其中H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)是來源于人抗體的H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)。
14.權利要求1-13中任一項的方法，其中H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)是人源化的H鏈V區(qū)和/或L鏈V區(qū)。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中該細胞表面分子或細胞內(nèi)分子是激素受體、細胞因子受體、酪氨酸激酶受體或細胞核內(nèi)受體。
16.權利要求1-15中任一項的方法，其中該細胞表面分子或細胞內(nèi)分子是紅細胞生成素(EPO)受體、血小板生成素(TPO)受體、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)受體、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)受體、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)受體、腫瘤壞死因子(TNF)受體、白細胞介素-1(IL-1)受體、白細胞介素-2(IL-2)受體、白細胞介素-3(IL-3)受體、白細胞介素-4(IL-4)受體、白細胞介素-5(IL-5)受體、白細胞介素-6(IL-6)受體、白細胞介素-7(IL-7)受體、白細胞介素-9(IL-9)受體、白細胞介素-10(IL-10)受體、白細胞介素-11(IL-11)受體、白細胞介素-12(IL-12)受體、白細胞介素-13(IL-13)受體、白細胞介素-15(IL-15)受體、干擾素-α(IFN-α)受體、干擾素-β(IFN-β)受體、干擾素-γ(IFN-γ)受體、生長激素(GH)受體、胰島素受體、血液干細胞增殖因子(SCF)受體、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)受體、上皮細胞生長因子(EGF)受體、神經(jīng)生長因子(NGF)受體、成纖維細胞生長因子(FGF)受體、血小板源性生長因子(PDGF)受體、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)受體、白細胞遷移抑制因子(LIF)受體、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體、制瘤素M(OSM)受體、Notch家族受體、E2F、E2F/DP1或TAK1/TAB1。
17.權利要求1-16中任一項的方法，其中該激動劑作用為誘導凋亡、誘導細胞增殖、誘導細胞分化、誘導細胞分裂或細胞周期調(diào)節(jié)作用。
18.權利要求1-17中任一項的方法，其中該改變的抗體為單特異性改變的抗體。
19.權利要求1-17中任一項的方法，其中該改變的抗體為多特異性的改變的抗體。
20.權利要求19的方法，其中該改變的抗體為雙特異性的改變的抗體。
21.權利要求20的方法，其中該L鏈V區(qū)和H鏈V區(qū)來自同一單克隆抗體。
22.權利要求1-21中任一項的方法，其相比親本單克隆抗體顯示相同或更好的激動劑作用(ED50)。
23.權利要求22的方法，其相比親本單克隆抗體顯示至少2倍的激動劑作用(ED50)。
24.權利要求23的方法，其相比親本單克隆抗體顯示至少10倍的激動劑作用(ED50)。
25.權利要求1-21中任一項的方法，其來源于基本上沒有激動劑作用的親本抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及改變的抗體，其包含單克隆抗體的至少二個H鏈V區(qū)以及至少二個L鏈V區(qū)，能夠通過交聯(lián)細胞表面分子轉(zhuǎn)導信號進入細胞，從而用作激動劑。由于該改變的抗體能夠用作信號轉(zhuǎn)導激動劑，并因此用作各種疾病的預防和/或治療藥物，例如癌癥、炎癥、內(nèi)分泌障礙以及血液病。
文檔編號A61P7/00GK1720991SQ20041008566
公開日2006年1月18日 申請日期2001年10月22日 優(yōu)先權日2000年10月20日
發(fā)明者福島直, 土屋政幸, 宇野慎介, 大友俊彥, 藪田尚弘, 角田浩行 申請人:中外制藥株式會社