專利名稱：羥基苯交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨在健康的關(guān)節(jié)中行使基本功能。關(guān)節(jié)軟骨吸收和分散沖擊和摩擦載荷從而將這些載荷從骨骼上轉(zhuǎn)移，保護(hù)骨骼免受傷害。軟骨通過將載荷力轉(zhuǎn)移至受限于關(guān)節(jié)間隙內(nèi)的聚集蛋白聚糖分子(在下一節(jié)中有所描述)三維網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的流體相實(shí)現(xiàn)該功能。聚集蛋白聚糖分子含有與核心蛋白相連的多達(dá)100條的硫酸軟骨素鏈，在每條硫酸軟骨素鏈全長上分布著多個(gè)電負(fù)性的硫酸根基團(tuán)。這些硫酸根基團(tuán)引起了單個(gè)聚集蛋白聚糖分子上的各條硫酸軟骨素鏈之間的相互排斥(造成靜態(tài)聚集蛋白聚糖分子占有最大的空間體積)，并導(dǎo)致軟骨聚集體中相鄰的聚集蛋白聚糖分子互相排斥。
在健康軟骨中，聚集蛋白聚糖分子與透明質(zhì)酸長鏈相連，而透明質(zhì)酸鏈被胞外膠原纖維基質(zhì)限制于關(guān)節(jié)間隙內(nèi)的大型軟骨聚集體中。因此，即使每個(gè)聚集蛋白聚糖分子(和與相同或不同的透明質(zhì)酸鏈相連的相鄰聚集蛋白聚糖分子)中相鄰的硫酸軟骨素鏈之間相互排斥，它們?nèi)匀槐幌拗圃谀z原基質(zhì)中。圖1描述了正常、健康的軟骨。由于硫酸軟骨素鏈之間如此排斥，透明質(zhì)酸—聚集蛋白聚糖網(wǎng)絡(luò)(或大分子網(wǎng)絡(luò))在膠原基質(zhì)的限制下會(huì)盡可能大的延展從而在靜態(tài)獲得盡可能低的能量態(tài)，即使得相鄰的電負(fù)性的硫酸根基團(tuán)間的距離盡可能最大化。由此，網(wǎng)絡(luò)分子為了避免和相鄰的網(wǎng)絡(luò)分子靠近而很難發(fā)生移動(dòng)或替代。這些大型軟骨聚集體被限制在體積為其自由溶液體積五分之一的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)中，無法繼續(xù)膨脹。具有很高的負(fù)電荷密度的軟骨聚集體與大量溶劑結(jié)合從而賦予軟骨吸收載荷和抵抗變形的能力。在壓縮下，固定在聚集蛋白聚糖上的負(fù)電荷基團(tuán)之間的距離縮小，從而增加了電荷—電荷之間的排斥力以及自由浮動(dòng)的平衡陽離子的濃度(如Ca2+和Na+)。這些效應(yīng)均對(duì)軟骨的粘彈性和軟骨抵抗變形及吸收壓縮載荷的能力有所幫助，以下將進(jìn)一步加以說明。
水分子在大分子網(wǎng)絡(luò)中提供了充分連續(xù)的流體相。如下所述，大分子網(wǎng)絡(luò)通過將沖擊和摩擦載荷轉(zhuǎn)移至連續(xù)的流體(水)相將它們從骨骼上轉(zhuǎn)移。當(dāng)關(guān)節(jié)承受載荷時(shí)，大分子網(wǎng)絡(luò)首先將力吸收，該力作用于網(wǎng)絡(luò)欲使其變形或?qū)⑵鋲嚎s。力在流體相中形成壓力梯度從而誘導(dǎo)流體流動(dòng)以適應(yīng)由載荷造成的網(wǎng)絡(luò)的變形或壓縮。但是流體無法改變堅(jiān)實(shí)的大分子網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)填滿了相互排斥的硫酸軟骨素鏈，足以在不移動(dòng)或替代網(wǎng)絡(luò)分子的情況下容納大量的水。因此，雖然每個(gè)水分子可以在網(wǎng)絡(luò)中擴(kuò)散，但由于網(wǎng)絡(luò)分子不會(huì)發(fā)生替代，因此除非流速大幅減慢，否則大量的流體相將基本被限制于網(wǎng)絡(luò)中而無法通過。盡管存在壓力梯度，但是由于水分子無法順利流動(dòng)，沖擊或摩擦載荷的能量轉(zhuǎn)移至流體相并被其吸收，其中該能量壓縮液體水直至水發(fā)生充分的轉(zhuǎn)移以適應(yīng)網(wǎng)絡(luò)形狀且壓力梯度發(fā)生衰減?？傮w效果即軟骨吸收潛在有害載荷，并將其從骨骼上轉(zhuǎn)移。
通過該完善的機(jī)制，正常的關(guān)節(jié)能夠通過將大量的載荷力轉(zhuǎn)移至受限于大分子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的流體相而吸收大量的載荷。在現(xiàn)有技術(shù)中，該過程還沒有被人工或合成方法充分地重現(xiàn)。因此，對(duì)于軟骨退行性疾病還無法進(jìn)行充分的治療，如關(guān)節(jié)炎，其中聚集蛋白聚糖分子從它們的透明質(zhì)酸鏈上脫離，被消化或運(yùn)出軟骨聚集體。
據(jù)估計(jì)，骨性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分別影響著20.7和2.1百萬美國人。僅骨性關(guān)節(jié)炎每年就造成大約7百萬次的醫(yī)生探訪。對(duì)于嚴(yán)重的致殘性關(guān)節(jié)炎，目前的治療包括全關(guān)節(jié)置換手術(shù)，僅美國每年就平均進(jìn)行168,000樁全髖關(guān)節(jié)置換和267,000樁全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)。由于軟骨細(xì)胞在修復(fù)軟骨中的有限能力，關(guān)節(jié)軟骨的缺陷帶來了復(fù)雜的治療問題。迄今為止的治療策略將重點(diǎn)放在對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的自體軟骨細(xì)胞的應(yīng)用或在體內(nèi)通過趨化試劑或促有絲分裂試劑對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞的募集上。這些策略的目的在于增加和/或活化軟骨細(xì)胞群落從而重新合成正常的、健康的關(guān)節(jié)軟骨表面。這些策略的一個(gè)主要問題是無法將這些試劑保留在缺陷位點(diǎn)。由于透明質(zhì)酸特有的性質(zhì)，包括極佳的生物相容性、可降解性和流變學(xué)及理化性質(zhì)，有提議將透明質(zhì)酸用作發(fā)展軟骨細(xì)胞或生物活性試劑局部給藥的生物材料的候選材料。然而，懸浮于組織工程透明質(zhì)酸基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞能否合成機(jī)械性質(zhì)與正常健康的關(guān)節(jié)軟骨相當(dāng)?shù)男萝浌腔|(zhì)仍然是未知的。這是因?yàn)橛赏该髻|(zhì)酸制成傳統(tǒng)生物材料的化學(xué)制備方法與保持細(xì)胞存活力不相容。軟骨細(xì)胞必須在基質(zhì)形成后才能被引入基質(zhì)，結(jié)果不穩(wěn)定且通常很差。
因此，本領(lǐng)域需要一種能夠以有效的方式將載荷力從骨骼上有效轉(zhuǎn)移的人工或合成基質(zhì)。優(yōu)選地，此基質(zhì)在整形外科手術(shù)過程中可以在原位點(diǎn)或在體內(nèi)修復(fù)或置換關(guān)節(jié)軟骨。更優(yōu)地，人工或合成基質(zhì)以一種液體或多種液體的形式提供在原位點(diǎn)或體內(nèi)靶點(diǎn)，在位點(diǎn)與病人體內(nèi)已經(jīng)存在的軟骨或骨骼組織形成基本密實(shí)的整合。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明綜述本發(fā)明提供的大分子網(wǎng)絡(luò)包含以下結(jié)構(gòu) 其中R1和R2分別是或者包含選自聚羧酸酯、聚胺、聚羥基苯分子以及它們的共聚體的結(jié)構(gòu)，其中R1和R2的結(jié)構(gòu)可以相同也可以不同。
本發(fā)明還提供了含有大量酪胺取代透明質(zhì)酸分子的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中至少兩個(gè)相鄰?fù)该髻|(zhì)酸分子由二酪胺鍵相連。
本發(fā)明還提供了一種水凝膠，水凝膠包含酪胺取代透明質(zhì)酸分子的大分子網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)通過透明質(zhì)酸分子之間的二酪胺鍵交聯(lián)。
本發(fā)明還提供了制備大分子網(wǎng)絡(luò)的方法，包含步驟有提供第一類大分子，大分子選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它聚羥基苯分子和它們的共聚物；以及在與相鄰的第一類大分子分別相連的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)之間形成至少一個(gè)二羥基苯鍵。
本發(fā)明還提供了包含下列步驟的制備水凝膠的方法a)提供第一溶液，其中含有過氧化物酶或過氧化物但不同時(shí)含有兩者，同時(shí)含有一類大分子，大分子選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它聚羥基苯分子和它們的共聚物；b)提供第二溶液，其中含有第一溶液中所沒有的過氧化酶或過氧化物中的一種；和c)混合第一和第二溶液起始二羥基苯交聯(lián)反應(yīng)，形成水凝膠。


圖1是正常健康的人體軟骨的示意圖。
圖2是本發(fā)明的二羥基苯交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)的示意圖。
圖3是透明質(zhì)酸分子的結(jié)構(gòu)式。
圖4是本發(fā)明的T-HA水凝膠在封閉抗壓測(cè)試機(jī)械測(cè)試中(平衡應(yīng)力對(duì)施加張力)的結(jié)果與已公開的關(guān)節(jié)軟骨栓的結(jié)果(實(shí)施例3)的比較圖表。
圖5是埋于T-HA水凝膠中(1.7％和4.7％T-HA)的軟骨細(xì)胞與在組織培養(yǎng)塑膠上培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞(對(duì)照)關(guān)于葡萄糖利用的比較數(shù)據(jù)的圖表。
具體實(shí)施例方式
在此所用的術(shù)語聚羧酸酯指鏈長含有至少兩個(gè)功能基團(tuán)或單位的分子、結(jié)構(gòu)或類，其鏈中的至少兩個(gè)這樣的基團(tuán)或單位是或者包含羧酸基團(tuán)，在所述的親核取代反應(yīng)中，該羧酸基團(tuán)在空間上是可以接近的。同樣在此所用的術(shù)語聚胺指鏈長含有至少兩個(gè)功能基團(tuán)或單位的分子、結(jié)構(gòu)或類，其鏈中的至少兩個(gè)這樣的基團(tuán)或單位是或包含可用于親核取代反應(yīng)的一級(jí)胺基團(tuán)。同樣在此所用的聚羥基苯分子指鏈長含有至少兩個(gè)功能基團(tuán)或單位的分子，其鏈中的至少兩個(gè)這樣的基團(tuán)或單位是或包含羥基苯基團(tuán)，它們能通過C-C鍵與另一個(gè)羥基苯基團(tuán)相連。同樣用于此的水凝膠是制備的一種含有大分子網(wǎng)絡(luò)的材料，大分子網(wǎng)絡(luò)用于組織置換或工程應(yīng)用，例如作為人工軟骨、作為手術(shù)器材的包被材料以防止組織發(fā)炎、或作為人工腎的半透膜等。
本發(fā)明包括大分子網(wǎng)絡(luò)的一種新穎的結(jié)構(gòu)，大分子網(wǎng)絡(luò)通過相鄰長鏈大分子上的羥基苯基團(tuán)之間的連接形成，這些連接使得大分子之間形成有效的交聯(lián)從而生成一個(gè)巨大的網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)的基本交聯(lián)結(jié)構(gòu)如下所示 其中R1和R2分別是長鏈大分子。R1和R2可以是相同的或不同的分子，但將了解到為了生成合適的網(wǎng)絡(luò)，本發(fā)明的網(wǎng)絡(luò)中至少有部分二羥基苯鍵中的R1和R2是不同的分子。R1和R2不必需但卻優(yōu)選地是同類分子。
通過相鄰大分子之間形成的大量二羥基苯鍵，生成了如圖2中所示的二羥基苯交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)。在圖中，大分子用圓柱形帶表示，每個(gè)大分子含有至少兩個(gè)與其相連的羥基苯基團(tuán)。需要注意的是并不是每個(gè)羥基苯基團(tuán)都必須與另一個(gè)羥基苯基團(tuán)相連。
簡要地，所記載的發(fā)明包括含有羥基苯的化合物經(jīng)過碳化二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)通過它們的一級(jí)胺(或羧基)基團(tuán)共價(jià)連接到各種聚合支架材料上的羧基(或一級(jí)胺)基團(tuán)上，所述化合物包括但不限于酪胺，所述聚合支架材料包括但不限于透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素(例如以聚集蛋白聚糖的形式)。在分離和純化羥基取代聚合支架后，在極稀的過氧化氫的存在下，山葵過氧化物酶(HRP)使得羥基苯殘基選擇性地發(fā)生交聯(lián)生成水凝膠。
制備大分子網(wǎng)絡(luò)的第一步是制備或提供周期性地帶有羥基苯基團(tuán)的長鏈大分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，大分子為帶有多個(gè)或周期性帶有羥基苯基團(tuán)的聚羥基苯分子，如多酚。合適的多酚包括聚氨基酸(例如聚酪氨酸)、表沒食子兒茶酚(EGC)和從綠茶中分離出的表沒食子兒茶酚沒食子酸(EGCG)、其他次優(yōu)的多酚。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，通過化學(xué)反應(yīng)可將羥基苯基團(tuán)周期性地或隨機(jī)地添加到大分子的長鏈上。將羥基苯基團(tuán)添加到大分子上的一個(gè)優(yōu)選方法是利用碳二亞胺介導(dǎo)的取代反應(yīng)途徑在帶有一個(gè)羥基苯基團(tuán)的一級(jí)胺和大分子上的羧酸基團(tuán)之間形成酰胺鍵。在此方法中，優(yōu)選的長鏈大分子是周期性帶有羧酸基團(tuán)的聚羧酸酯分子。羥基苯基團(tuán)是帶有一級(jí)胺基團(tuán)的小分子中的一部分，通過碳二亞胺途徑可以連接到長鏈大分子的羧酸基團(tuán)中的羧基碳原子上。反應(yīng)進(jìn)行如下
其中結(jié)構(gòu)A是碳二亞胺；結(jié)構(gòu)B是聚羧酸酯(雖然僅標(biāo)明了一個(gè)CO2H基團(tuán))；結(jié)構(gòu)C是反應(yīng)A的產(chǎn)物，活化的O-?；愲澹唤Y(jié)構(gòu)D是含有羥基苯基團(tuán)的一級(jí)胺；結(jié)構(gòu)E是羥基苯取代聚羧酸酯；結(jié)構(gòu)F是?；甯碑a(chǎn)物；其中各個(gè)R可以分別選擇，彼此相同或不同，可以是直鏈或支鏈烷基或?；鶊F(tuán)，或其他任何結(jié)構(gòu)，只要這些結(jié)構(gòu)不會(huì)干擾碳二亞胺反應(yīng)途徑在NH2和CO2H之間生成上述結(jié)構(gòu)E中的酰胺鍵即可。
在以上示意的途徑中，反應(yīng)A代表了碳二亞胺對(duì)羧基基團(tuán)的活化進(jìn)而生成活化的O-?；愲逯虚g體。該中間體中正電性的碳原子可以接受相鄰的帶有羥基苯基團(tuán)的一級(jí)胺分子中氮原子的孤對(duì)電子的親核攻擊。該親核取代反應(yīng)(反應(yīng)B)的產(chǎn)物是羥基苯取代聚羧酸酯和酰基脲副產(chǎn)物，?；蹇梢酝ㄟ^透析去除從而得到足夠純的羥基苯取代聚羧酸酯產(chǎn)物。
上述碳二亞胺反應(yīng)途徑中可能發(fā)生特定的副反應(yīng)，該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該對(duì)此加以考慮。首先，碳二亞胺可與其它親核試劑反應(yīng)，而不是與生成理想的O-?；愲逅匦璧木埕人狨シ肿拥聂人嵫踉影l(fā)生反應(yīng)(反應(yīng)A)。其它的親核試劑可以包括上述結(jié)構(gòu)D中的胺和/或羥基苯基團(tuán)。特別地，反應(yīng)A會(huì)發(fā)生3種可能的副反應(yīng)從而降低碳二亞胺和帶有羥基苯基團(tuán)的一級(jí)胺的有效濃度(結(jié)構(gòu)A和D)，并且可能導(dǎo)致在聚羧酸酯(結(jié)構(gòu)B)上生成非理想的加合物
反應(yīng)C 反應(yīng)D 反應(yīng)E 胺和碳二亞胺的反應(yīng)產(chǎn)物(反應(yīng)C)沒有自由胺基，因此有效地減少了可以和O-?；愲灏l(fā)生反應(yīng)的酪胺的量。該反應(yīng)還減少了可以生成理想的O-?；愲宓奶级啺返牧?。羥基苯反應(yīng)產(chǎn)物(反應(yīng)D)沒有UV吸收，這使得在最終的羥基苯取代聚羧酸酯產(chǎn)物(解釋見下)中用UV光譜對(duì)它們進(jìn)行觀察變得更加困難。但是，由于這些產(chǎn)物仍然帶有自由胺基，它們可以通過反應(yīng)B和聚羧酸酯分子生成酰胺鍵。反應(yīng)可生成兩種無效的透明質(zhì)酸取代結(jié)構(gòu)，由于缺乏生成自由基(解釋見下)所需的可提取的酚羥基氫原子，兩個(gè)結(jié)構(gòu)均無法參與到制備本發(fā)明交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的第二步過氧化物酶交聯(lián)反應(yīng)中(說明見下)。最終，碳二亞胺會(huì)與水發(fā)生無效的反應(yīng)(反應(yīng)E)生成與上述反應(yīng)B副產(chǎn)物相同的?；?，但是沒有理想產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)E的生成。
一旦在反應(yīng)A中生成理想的O-酰基異脲產(chǎn)物，又可能發(fā)生某些額外的副反應(yīng)反應(yīng)F 反應(yīng)G 反應(yīng)H O-酰基異脲(結(jié)構(gòu)C)可以如反應(yīng)F所示發(fā)生水解，釋放出原始的未修飾的聚羧酸酯(結(jié)構(gòu)B)和碳二亞胺的酰基脲(結(jié)構(gòu)F)。該反應(yīng)是和反應(yīng)E相似的無效反應(yīng)，降低了碳二亞胺的有效濃度。O-酰基異脲還可以通過分子內(nèi)重排(反應(yīng)G)生成兩種化學(xué)惰性的N-?；?。這些結(jié)構(gòu)在羧酸酯分子上生成無效的加合物，無法用于本發(fā)明網(wǎng)絡(luò)制備中的過氧化物酶催化交聯(lián)反應(yīng)(以下討論的步驟2)。O-?；愲逡部梢院拖嗤虿煌埕人狨シ肿由系牡诙€(gè)羧基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)(反應(yīng)H)生成酸酐。該分子隨后可與結(jié)構(gòu)D發(fā)生反應(yīng)形成理想的酰胺并重新獲得第二個(gè)羧基基團(tuán)。因此對(duì)于O-?；愲宕嬖趦蓚€(gè)可能的副反應(yīng)，這些副反應(yīng)能降低碳二亞胺的有效濃度(反應(yīng)F和G)并可能導(dǎo)致在聚羧酸酯分子上生成非理想的加合物。
這些副反應(yīng)的負(fù)面效應(yīng)并非由于不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法，而是通過常規(guī)操作就會(huì)發(fā)生。
上述途徑中的大分子為聚羧酸酯(結(jié)構(gòu)B)，在另一種可選擇的途徑中，大分子可以是帶有多個(gè)或周期性帶有胺基基團(tuán)的聚胺，其中羥基苯基團(tuán)作為羧酸小分子的一部分。合適的聚胺包括聚己糖胺如殼聚糖(聚葡萄糖胺)；聚氨基酸如聚賴氨酸；聚脫氧核糖核酸如聚(dA)(聚脫氧腺苷酸)、聚(dC)(聚脫氧胞苷酸)、聚(dG)(聚脫氧鳥苷酸)；以及聚核糖核酸如聚(A)(聚腺苷酸)、聚(C)(聚胞苷酸)和聚(G)(聚鳥苷酸)。碳二亞胺介導(dǎo)反應(yīng)途徑完全按照以上所解釋的反應(yīng)途徑進(jìn)行，從而在胺基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)之間形成酰胺鍵，唯一的不同是生成的產(chǎn)物是羥基苯取代聚胺而不是聚羧酸酯，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解的。其他肽和/或蛋白質(zhì)也可以用作本發(fā)明中的大分子，只要其帶有羥基苯基團(tuán)，或通過在此說明的取代反應(yīng)可以獲得羥基苯取代基團(tuán)即可。例如，除了本發(fā)明已記載的肽，聚精氨酸可以被用作大分子。
當(dāng)聚羧酸酯分子上發(fā)生取代時(shí)，用于本發(fā)明的合適的含有羥基苯的化合物包括帶有自由一級(jí)胺的化合物，一級(jí)胺能夠用于修飾帶有多個(gè)或周期性帶有CO2H基團(tuán)的支架材料，包括酪氨酸(2-氨基-3-(4-羥基苯)丙酸)和酪胺(酪胺或2-(4-羥基苯)乙胺)。當(dāng)聚胺上發(fā)生取代時(shí)，合適的含有羥基苯的化合物包括帶有自由CO2H基團(tuán)的化合物，CO2H基團(tuán)可以用于修飾帶有多個(gè)或周期性帶有一級(jí)NH2基團(tuán)的支架材料，包括酪氨酸、3-(4-羥基苯)丙酸和4-羥基苯乙酸。
根據(jù)本發(fā)明制備交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)的第二步是通過二羥基苯連接結(jié)構(gòu)將獲得的已經(jīng)帶有一個(gè)或多個(gè)羥基苯基團(tuán)的大分子連接。在這一步中，不同的大分子上的羥基苯基團(tuán)通過以下的反應(yīng)機(jī)理在過氧化物酶的存在下利用過氧化物試劑發(fā)生連接
(應(yīng)當(dāng)注意的是一些二羥基苯連接也可以在同一分子的不同羥基苯基團(tuán)之間形成。)在稀釋的過氧化物(優(yōu)選H2O2)存在下過氧化物酶可以從帶有羥基苯的化合物中(如酪胺)提取酚羥基的氫原子，留給酚羥基氧原子一個(gè)孤電子，成為極端活躍的自由基。該自由基將兩個(gè)等價(jià)鄰位碳原子中的一個(gè)異構(gòu)化，隨后兩個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)發(fā)生二聚化形成共價(jià)鍵將結(jié)構(gòu)有效地交聯(lián)，交聯(lián)結(jié)構(gòu)經(jīng)過烯醇化生成二羥基苯二聚體(以下說明的二羥基苯鍵如二酪胺鍵)。
簡明起見，以上只顯示了單個(gè)的二羥基苯連接反應(yīng)，但是應(yīng)該明白當(dāng)把帶有羥基苯基團(tuán)的大分子置于反應(yīng)條件下時(shí)(過氧化物和過氧化物酶)將會(huì)生成數(shù)個(gè)或多重這樣的鍵。上述機(jī)制中使用了過氧化氫，但也可以使用其他合適的過氧化物。同樣地，過氧化物酶優(yōu)選山葵過氧化物酶(HRP)。可選地，能夠生成自由基使帶有羥基苯基團(tuán)的支架材料發(fā)生交聯(lián)的其它任何合適的酶(或其它試劑)均可以使用，在下述的普通代謝條件下發(fā)生作用的為優(yōu)選。
由于交聯(lián)反應(yīng)是酶驅(qū)動(dòng)的(過氧化物酶)，二羥基苯交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)優(yōu)于傳統(tǒng)的軟骨或其它組織置換或取代方法和產(chǎn)品。酶驅(qū)動(dòng)意味著交聯(lián)反應(yīng)在普通的體內(nèi)或代謝條件下進(jìn)行，溫度為35℃-39℃(例如37℃)、pH范圍為6-7(例如6.5)，反應(yīng)試劑等等。(過氧化物，如過氧化氫，是交聯(lián)反應(yīng)中唯一需要的反應(yīng)試劑)。因此，交聯(lián)反應(yīng)可以在體內(nèi)進(jìn)行，在手術(shù)位點(diǎn)如整形外科手術(shù)位點(diǎn)提供交聯(lián)的水凝膠，從而促成水凝膠和天然組織如骨骼和軟骨組織之間最大程度的密實(shí)整合。由于羥基苯取代大分子支架在交聯(lián)之前迅速地滲透入已經(jīng)存在的軟骨基質(zhì)中，不僅與其它的羥基苯取代大分子支架材料發(fā)生交聯(lián)，還可能與已存在于軟骨基質(zhì)中的蛋白的酪氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)，因此新的水凝膠支架和天然軟骨基質(zhì)的整合可以迅速發(fā)生。這樣就可以消除在使用預(yù)先制成的基質(zhì)栓時(shí)發(fā)現(xiàn)的典型問題，即它們很難整合進(jìn)天然的軟骨組織。能夠?qū)⑺z直接交聯(lián)在關(guān)節(jié)表面就不再需要在手術(shù)中將傷口擴(kuò)大以適應(yīng)預(yù)先制好的栓，對(duì)于那些化學(xué)反應(yīng)對(duì)病人有毒或否則就無法在病人體內(nèi)形成的水凝膠必須事先制栓。應(yīng)當(dāng)注意的是由關(guān)節(jié)炎引起的大部分軟骨損傷表現(xiàn)為關(guān)節(jié)表面不同程度的變薄而不是具有一定形狀的洞。
由于交聯(lián)反應(yīng)需要過氧化物和過氧化物酶(優(yōu)選山葵過氧化物酶)，為了方便地應(yīng)用于手術(shù)位點(diǎn)，可以制備含有所有組分而唯缺一種組分的溶液。例如，可以制備含有酪胺(或其它含有羥基苯的種類)取代聚羧酸酯(如酪胺取代透明質(zhì)酸等)和過氧化物酶的溶液，并制備含有過氧化物的第二溶液?？蛇x地，第一和第二溶液中的過氧化物和過氧化物酶可以交換，重要的是在交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生之前過氧化物和過氧化物酶分開保存(即在分開的溶液中)。隨后，使用第一溶液，(例如在體內(nèi)手術(shù)位點(diǎn))，并將第二溶液在體內(nèi)使用或噴灑在第一溶液上，在原位點(diǎn)形成酪胺殘基的交聯(lián)。交聯(lián)反應(yīng)在體內(nèi)發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明的記載，其它的組合對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是顯而易見的。
此外，由于交聯(lián)反應(yīng)在普通代謝條件下發(fā)生，因此可以將額外的活細(xì)胞，如軟骨細(xì)胞、祖細(xì)胞、干細(xì)胞等，直接加入含有未交聯(lián)的羥基苯取代聚羧酸酯或聚胺(或多酚)的培養(yǎng)基中，即前一節(jié)中的第一或第二溶液，其中將富含細(xì)胞的培養(yǎng)基和大分子一起應(yīng)用于體內(nèi)位點(diǎn)，分子隨后在加入過氧化物酶和過氧化物后發(fā)生交聯(lián)。于是交聯(lián)后的大分子網(wǎng)絡(luò)中分散了理想的細(xì)胞。由于制備傳統(tǒng)基質(zhì)時(shí)極端的溫度和pH條件，這種富含細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)不可能在傳統(tǒng)組織置換基質(zhì)中形成。此外，如以下實(shí)施例5中所描述，已經(jīng)證實(shí)上述發(fā)明基質(zhì)中的細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明發(fā)生酪胺取代透明質(zhì)酸交聯(lián)(描述見下)生成網(wǎng)絡(luò)后仍然存活。
在特別適用于制備合成軟骨及其它合成或人工組織的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明用于生成網(wǎng)絡(luò)的大分子是透明質(zhì)酸(HA)，且羥基苯基團(tuán)以酪胺的形式提供。
如圖3所示，HA由重復(fù)的以β-1，3糖苷鍵連接的葡萄糖醛酸(glcA)和N-乙酰葡萄糖胺(glcNAc)殘基對(duì)組成。對(duì)于每一條透明質(zhì)酸鏈，該簡單的二糖重復(fù)多達(dá)10,000次，每個(gè)重復(fù)的二糖之間通過β-1，4糖苷鍵連接。每個(gè)glcA在其葡萄糖環(huán)的5位碳原子上連有一個(gè)羧酸基團(tuán)(CO2H)。酪胺是帶有與苯環(huán)OH基團(tuán)正對(duì)的乙胺基團(tuán)的酚類分子。當(dāng)使用這些分子時(shí)，將酪胺取代至HA的CO2H基團(tuán)的單鍵氧原子上的機(jī)制如下所示，是通過上述碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行的。優(yōu)選的碳二亞胺類是所示的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。
其中結(jié)構(gòu)A是EDC；結(jié)構(gòu)B是透明質(zhì)酸(雖然只表明了一個(gè)CO2H)；結(jié)構(gòu)C是反應(yīng)A的產(chǎn)物1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)異脲；結(jié)構(gòu)D是酪胺；結(jié)構(gòu)E是酪胺取代透明質(zhì)酸；結(jié)構(gòu)F是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)尿素(EDU)。
在上述途徑中，透明質(zhì)酸分子羧基基團(tuán)上的電負(fù)性的氧原子通過親核反應(yīng)機(jī)制攻擊碳二亞胺分子(EDC)上缺電子的二酰亞胺碳原子生成活化的O-?；愲?反應(yīng)A)。于是HA羧酸酯基團(tuán)中的碳原子對(duì)電子的缺乏使得其易受酪胺分子中胺基團(tuán)的孤對(duì)電子的攻擊(反應(yīng)B)。優(yōu)選地，反應(yīng)A由合適的催化劑催化在反應(yīng)A中生成活化的酯，使得反應(yīng)可以在基本中性的pH(例如pH＝6.5)下進(jìn)行。合適的催化劑包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、次優(yōu)的1-羥基苯并三唑(HOBt)或N-羥基磺基琥珀酰亞胺(NHSS)、次優(yōu)的其它通過形成活化酯有效提高碳二亞胺反應(yīng)使得碳二亞胺在更高pH下的無效水解最小化的合適催化劑或它們的混合物。除了EDC外可以使用的其它次優(yōu)的碳二亞胺包括1-環(huán)己基-3-[2-(4-甲基嗎啡啉)乙基]碳二亞胺(CMC)以及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。
上述反應(yīng)A生成了O-?；愲迦〈该髻|(zhì)酸；EDC分子臨時(shí)取代至HA分子中g(shù)lcA殘基的羧酸基團(tuán)上，使得羧酸基團(tuán)的碳原子帶有弱正電性。如上一節(jié)中所解釋的，酪胺分子末端胺基團(tuán)的電子對(duì)隨后通過親核取代反應(yīng)取代至碳原子上(反應(yīng)B)。反應(yīng)B生成了酪胺取代HA分子(T-HA)和副產(chǎn)品酰基異脲。應(yīng)當(dāng)了解的是反應(yīng)A和B將在HA分子的周期性glcA殘基上生成多個(gè)酪胺取代；出于簡單明了的考慮在此只顯示了單個(gè)取代。
如以上說明和解釋，在生成T-HA之后，多個(gè)T-HA分子通過過氧化物和過氧化物酶發(fā)生反應(yīng)生成交聯(lián)的T-HA分子。即與HA分子相連的酪胺殘基的羥基苯基團(tuán)在過氧化物酶的存在下和過氧化物(優(yōu)選H2O2)發(fā)生反應(yīng)從而去除了酚羥基的氫原子生成酪胺自由基，其中酚上的氧原子帶有未配對(duì)電子。該自由基發(fā)生異構(gòu)化或共振，生成的共振結(jié)構(gòu)(或自由基異構(gòu)體)中未配對(duì)電子轉(zhuǎn)移至酚環(huán)上的鄰位碳原子。在該位置，未配對(duì)電子迅速地和另一個(gè)酪胺自由基上相似位置上的未配對(duì)電子生成共價(jià)鍵。其結(jié)果是在相同或不同的HA分子的不同glcA上的不同酪胺自由基殘基之間發(fā)生自由基驅(qū)動(dòng)的二聚化。該二聚體進(jìn)一步發(fā)生烯醇化生成相互連接的酪胺殘基，生成二酪胺鍵結(jié)構(gòu)。應(yīng)該明確的是在相鄰的酪胺殘基間將發(fā)生很多所述的反應(yīng)，生成本發(fā)明的T-HA分子的交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)具有如下交聯(lián)結(jié)構(gòu) 交聯(lián)的T-HA網(wǎng)絡(luò)可以通過傳統(tǒng)方法如通過連接蛋白加入聚集蛋白聚糖，生成的交聯(lián)T-HA網(wǎng)絡(luò)中聚集蛋白聚糖分子與HA鏈相連。于是，根據(jù)本發(fā)明可以獲得與正常軟骨聚集體中的網(wǎng)絡(luò)相似的網(wǎng)絡(luò)，其中二酪胺鍵取代正常軟骨中的膠原纖維將網(wǎng)絡(luò)連在一起并由此限制住所含的聚集蛋白聚糖網(wǎng)絡(luò)。
由本發(fā)明可知，其它的粘多糖、多糖和聚羧酸也可被用作大分子生成在此記載的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。例如，除了HA以外的合適的粘多糖包括軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素和肝磷脂。其它合適的聚羧酸酯包括蛋白聚糖如多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和由聚集蛋白聚糖、透明質(zhì)酸及連接蛋白組成的軟骨聚集體；聚糖醛酸如聚果膠酸鹽(聚半乳糖醛酸)、聚葡萄糖醛酸、果膠(聚半乳糖醛酸甲基酯)、聚唾液酸(聚[2，8-(N-乙酰神經(jīng)氨酸)])和海藻酸鹽(甘露糖醛酸和古洛糖醛酸共聚物)；以及符合上述聚羧酸酯的定義的氨基酸(具有至少2個(gè)氨基酸單元)，如聚天冬氨酸和聚谷氨酸。采用在此記載的碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)途徑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過正確的實(shí)驗(yàn)方法可以對(duì)所有這些大分子進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)羥基苯基團(tuán)的取代。
如上所述，還應(yīng)當(dāng)了解的是天然多酚化合物已經(jīng)含有兩個(gè)或多個(gè)羥基苯基團(tuán)，羥基苯基團(tuán)可以通過所述酶催化化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)，因此多酚化合物可以替代上述必須通過化學(xué)反應(yīng)加上羥基苯基團(tuán)的聚羧酸酯和聚胺。
在另一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方案中，用酪胺交聯(lián)的硫酸軟骨素分子(獨(dú)立地或作為聚集蛋白聚糖的一部分)網(wǎng)絡(luò)用于模擬或置換正常軟骨。硫酸軟骨素與透明質(zhì)酸相同，除了1)重復(fù)的二糖結(jié)構(gòu)包含的是N-乙酰半乳糖胺(galNAc)而不是glcNAc，唯一的差別在于接在4位碳上的羥基基團(tuán)(在圖3中用圓圈標(biāo)明)；2)O-硫酸鹽發(fā)生在galNAc殘基的4和/或6位和/或glcA殘基的2位羥基上(圖3)以及3)硫酸軟骨素的鏈長，比透明質(zhì)酸少20-100個(gè)重復(fù)的二糖單位。(聚集蛋白聚糖分子由多條——大約100條硫酸軟骨素鏈通過每條鏈的還原末端的連接糖與核心蛋白相連)。在該具體實(shí)施方案中，相鄰的(交聯(lián)的)硫酸軟骨素分子電負(fù)性的SO42-基團(tuán)產(chǎn)生的排斥力使得網(wǎng)絡(luò)聚集體具有抗壓性而酪胺交聯(lián)防止硫酸軟骨素網(wǎng)絡(luò)斷裂或散裂。由此生成了與正常軟骨中類似的不可替代的硫酸軟骨素網(wǎng)絡(luò)(以及伴隨著的不透水性)，但是沒有正常軟骨中的胞外膠原纖維基質(zhì)或HA鏈。事實(shí)上，通過直接交聯(lián)硫酸軟骨素分子(而不是前述具體實(shí)施方案中的核心HA分子)，相鄰硫酸軟骨素分子之間的排斥力增強(qiáng)，使得其對(duì)流體流的抵抗力較正常軟骨更強(qiáng)。由于間隙內(nèi)流體相的流動(dòng)受到更大的限制，直接交聯(lián)的硫酸軟骨素分子對(duì)于載荷力的吸收和分散能力比正常軟骨更強(qiáng)。在硫酸軟骨素分子直接交聯(lián)的該具體實(shí)施方案中，一些軟骨退化的情況被徹底控制；例如某些情況下正常軟骨中與硫酸軟骨素分子正常相連的核心蛋白在HA結(jié)合域(G1)與第二個(gè)球形結(jié)構(gòu)域(G2)之間發(fā)生斷裂，于是軟骨素硫酸富集區(qū)從軟骨聚集體中擴(kuò)散出去。在該具體實(shí)施方案中，由于硫酸軟骨素分子之間直接交聯(lián)而沒有與聚集蛋白聚糖或其它蛋白聚糖分子相連，它們不會(huì)像在正常軟骨中那樣被切斷或運(yùn)走。
然而，由于HA的可利用度高，優(yōu)選酪胺交聯(lián)的T-HA網(wǎng)絡(luò)(帶有聚集蛋白聚糖分子的HA骨架鏈，聚集蛋白聚糖分子包括硫酸軟骨素鏈)。這在使用本發(fā)明進(jìn)行軟骨置換或修復(fù)中可能是有益的，因?yàn)樯眢w生成軟骨的正常代謝途徑可以直接在植入的酪胺交聯(lián)T-HA網(wǎng)絡(luò)上形成，以下將對(duì)此進(jìn)行說明。
上述的二酪胺交聯(lián)T-HA網(wǎng)絡(luò)對(duì)于生產(chǎn)人工或合成軟骨具有特別的用途。軟骨移植常用于頭和頸重建過程以修復(fù)外傷或先天畸形中的軟骨或骨骼缺陷。專門針對(duì)于耳的應(yīng)用包括耳廓和耳的重建，此應(yīng)用經(jīng)常用于修復(fù)由于外傷、腫瘤(即鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌和黑素瘤)和先天形成的缺陷如小耳癥。專門針對(duì)鼻的應(yīng)用包括鼻和鼻中隔的修飾和重建過程。在鼻部美容整形中常用到鼻梁增高、鼻尖軟骨(tipgraft)、罩軟骨(shield graft)和支撐軟骨(spreader graft)。對(duì)外傷、腫瘤、自免疫疾病如Wegeners肉芽腫或先天性缺陷的鼻重建需要軟骨進(jìn)行修復(fù)。隔膜穿孔難以治療并經(jīng)常治療失敗。將軟骨嫁接用于這些治療非常理想，但是自體或捐贈(zèng)的軟骨經(jīng)常短缺。專門針對(duì)喉的應(yīng)用包括喉氣管的重建，對(duì)于兒童通常需要取肋軟骨，這也是危險(xiǎn)的。耳和隔膜軟骨對(duì)于這種應(yīng)用而言經(jīng)常是不夠的。因此在此描述的交聯(lián)HA網(wǎng)絡(luò)形成的工程軟骨在解決這些問題上將產(chǎn)生重大影響。喉氣管重建經(jīng)常用于治療由于聲門下或氣管狹窄而引起的氣道狹窄。病源可以是外傷(即插管損傷或氣管切開術(shù))或先天性的。
其它應(yīng)用還包括下巴和面頰增高、下眼瞼外翻修復(fù)以及大量的顱面應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)注意的是在這些應(yīng)用中的軟骨可能不需要和關(guān)節(jié)軟骨有著完全一致的機(jī)械性質(zhì)。同時(shí)可能希望其中可以包含細(xì)胞群或生物活性試劑。
本發(fā)明的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮主要作用的一個(gè)特別應(yīng)用是生產(chǎn)人工腎。腎臟通過兩種機(jī)制過濾血液一種通過尺寸排除，另一種通過電荷排除。已經(jīng)設(shè)計(jì)出MEMS裝置用于人工腎裝置，裝置中包含了精確定義的微孔，微孔只能有效地模擬腎臟的尺寸排除特征。在健康的腎臟中，關(guān)于電荷排除的過濾是由于基底膜中存在硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，該過濾將兩種不同類型的細(xì)胞分離，對(duì)于腎臟的其它相關(guān)功能非常重要。為了在MEMS工程人工腎中模擬這種電荷屏障，可以制備含有硫酸乙酰肝素或肝磷脂的水凝膠，水凝膠通過在此描述的二羥基苯(二酪胺)聯(lián)結(jié)進(jìn)行交聯(lián)，并且裝入MEMS裝置的孔中。該肝磷脂/硫酸乙酰肝素水凝膠隨后可被夾入兩層在此所述的透明質(zhì)酸水凝膠(如上述的T-HA)中，兩層水凝膠分別含有正常功能腎臟中通常存在的一類細(xì)胞。中間的肝磷脂/硫酸乙酰肝素水凝膠為該裝置提供了電荷排除的能力。外面的兩層透明質(zhì)酸水凝膠保護(hù)中間層免受免疫系統(tǒng)侵犯和正常細(xì)胞及分子碎片的污染。在過濾屏障兩面包含的兩類細(xì)胞以正常的生理方向提供了細(xì)胞組分。
在另一個(gè)具有前景的應(yīng)用中，本發(fā)明的水凝膠可用于發(fā)展人工胰腺。發(fā)展人工胰腺的一個(gè)問題是由于體內(nèi)監(jiān)測(cè)儀電極的污垢，MEMS工程葡萄糖感應(yīng)器的半衰期很短。在這些監(jiān)測(cè)儀表面覆蓋上在此所述的透明質(zhì)酸水凝膠(即T-HA)將允許探測(cè)用的小分子量葡萄糖分子的擴(kuò)散，但同時(shí)可以保護(hù)感應(yīng)器免受免疫系統(tǒng)侵犯和正常細(xì)胞及分子碎片的污染。
總而言之，根據(jù)前述顯而易見的是用作形成水凝膠的支架材料的大分子包括但不限于聚羧酸酯(含有自由羧基基團(tuán))、聚胺(含有自由一級(jí)胺基團(tuán))、多酚(含有自由羥基苯基團(tuán))和它們的共聚體，以上已經(jīng)舉例描述。當(dāng)使用多酚時(shí)，本發(fā)明上述制備網(wǎng)絡(luò)的第一步可以省略，因?yàn)槎喾右呀?jīng)包含了多個(gè)或周期性的羥基苯基團(tuán)。相反地，聚羧酸酯和聚胺都必須優(yōu)選地通過上述碳二亞胺反應(yīng)途徑在其中加上或取代上羥基苯基團(tuán)。為了形成交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，制備網(wǎng)絡(luò)的第二步是在相鄰大分子(無論是聚羧酸酯、聚胺或多酚)上的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)間進(jìn)行酶驅(qū)動(dòng)的二聚化反應(yīng)。該步驟在代謝溫度和pH條件下，在合適的酶(優(yōu)選HRP)存在下用過氧化物試劑(優(yōu)選過氧化氫)進(jìn)行。
在優(yōu)選的二酪胺交聯(lián)T-HA網(wǎng)絡(luò)中，在第一步中高分子量透明質(zhì)酸(HA)上的羧基基團(tuán)由酪胺取代，酪胺將活性的羥基苯基團(tuán)引入HA分子。該酪胺取代反應(yīng)優(yōu)選地由碳二亞胺，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)介導(dǎo)，HA上酪胺的取代程度由反應(yīng)混合物中的酪胺、EDC和HA的摩爾比例及絕對(duì)濃度決定。過量的反應(yīng)試劑如未發(fā)生反應(yīng)的酪胺和EDC隨后通過透析去除，從而可以分離和恢復(fù)高分子量的酪胺取代HA(T-HA)。在各T-HA制備中的酪胺取代百分比可以通過以下測(cè)量簡單地計(jì)算1)制備中酪胺的濃度，根據(jù)酪胺在275nm特有的UV吸收性質(zhì)可以光譜定量(見以下實(shí)施例2)；和2)HA制備中總的羧基基團(tuán)的濃度，通過標(biāo)準(zhǔn)的己糖醛酸分析光譜定量。通過該技術(shù)，僅含有4-6％的酪胺取代的T-HA已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)常規(guī)合成。在此酪胺取代水平上，HA分子中的大部分(優(yōu)選的至少60、70、80、90或95％)化學(xué)上保持不變，由此仍然保持生物功能?；谠揟-HA配方(即4-6％酪胺取代)，通過簡單地改變過程第二步中使用的T-HA的濃度可以生成具有廣泛的物理性質(zhì)的廣泛的生物材料。
在交聯(lián)反應(yīng)中，T-HA溶液通過酶(過氧化物酶)驅(qū)動(dòng)反應(yīng)交聯(lián)形成水凝膠，反應(yīng)催化相鄰HA分子上的兩個(gè)酪胺加合物間形成共價(jià)鍵，生成單個(gè)二酪胺交聯(lián)。每個(gè)HA分子中通過生成數(shù)百個(gè)這樣的二酪胺交聯(lián)從而生成了穩(wěn)定的三維支架或水凝膠。交聯(lián)反應(yīng)的起始需要加入非常稀的過氧化物(優(yōu)選H2O2)，因?yàn)檫^氧化物酶的真正底物是過氧化物，而不是HA。過氧化物酶對(duì)過氧化物的反應(yīng)產(chǎn)物是由酪胺的羥基苯環(huán)優(yōu)先獲取的自由基，從而生成二酪胺交聯(lián)。二酪胺連接結(jié)構(gòu)具有藍(lán)色熒光(見實(shí)施例2)，該性質(zhì)可用于水凝膠成像和衡量水凝膠的交聯(lián)程度。由于交聯(lián)反應(yīng)是酶驅(qū)動(dòng)的，水凝膠可以在生理?xiàng)l件下形成，因此在形成中可以包含細(xì)胞或生物活性制劑，或直接與活體組織相鄰而保持細(xì)胞和組織的活性。
生成的水凝膠視覺上是透明的，根據(jù)起始T-HA的濃度的不同可具有各種物理性質(zhì)。例如，實(shí)驗(yàn)顯示通過含有6.25、12.5、25、50和100mg/ml T-HA的T-HA溶液形成的水凝膠分別具有果凍、凝膠、生面團(tuán)、類彈力橡膠合成物(類似于橡膠球)和類軟骨材料的物理性質(zhì)——見實(shí)施例3。這些材料在廣泛的臨床條件下具有應(yīng)用潛力，包括用于整形外科(即軟骨、骨骼、肌腱、半月板、椎間盤等)和非整形外科(腎、肝、胰腺等)組織的組織工程、基因和藥物傳遞、體內(nèi)移植的非生物設(shè)備(即葡萄糖感應(yīng)器、人工心臟等)的包被、傷口修復(fù)、生物感應(yīng)器設(shè)計(jì)和聲帶重建。
所述水凝膠的優(yōu)良性質(zhì)包括1)能夠簡單地進(jìn)行鑒定和質(zhì)量控制；2)能夠與現(xiàn)存組織基質(zhì)整合；3)能夠直接整合進(jìn)新生成基質(zhì)；4)能夠直接包含細(xì)胞和生物活性因子；5)能夠保持生物相容性；6)能夠控制生物重吸收；7)能夠簡單地在復(fù)雜的解剖形態(tài)中制膠(見以下實(shí)施例6)；和8)能夠呈現(xiàn)天然組織如關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)械性質(zhì)。
結(jié)合以下一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的各方面進(jìn)行進(jìn)一步了解，實(shí)施例提供于此作為例證。
實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)用量的本發(fā)明的具有二酪胺交聯(lián)的酪胺取代透明質(zhì)酸水凝膠按照如下方法制備。HA以基于己糖醛酸的1mg/ml的濃度溶解于250mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，150mM NaCl，75mM NaOH，pH6.5的溶液中，溶液中含有相對(duì)于HA羧基基團(tuán)的摩爾濃度10倍過量的酪胺。隨后加入相對(duì)于HA羧基基團(tuán)摩爾濃度10倍過量的EDC起始羧基基團(tuán)上的酪胺取代。將相對(duì)于EDC摩爾量的摩爾比為1/10的N-羥琥珀酰亞胺(NHS)加入反應(yīng)通過形成活化酯協(xié)助EDC催化的酰胺化反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)在室溫進(jìn)行24小時(shí)，隨后通過先后對(duì)150mM NaCl和超純水進(jìn)行徹底的透析及凍干將大分子從未發(fā)生反應(yīng)的小分子量反應(yīng)試劑如酪胺、EDC、NHS和MES中恢復(fù)過來。在凍干后，根據(jù)所需的最終水凝膠的硬度，將酪胺取代HA(T-HA)產(chǎn)物以5-100mg/ml之間的操作濃度溶解于PBS(該緩沖液與細(xì)胞懸液、體內(nèi)組織接觸以及交聯(lián)反應(yīng)兼容)中進(jìn)行不同濃度的制備?？蛇x擇的，溶劑可以是除了PBS以外的其它任何合適的溶劑，只要溶劑對(duì)酶活性基本沒有負(fù)面影響且不會(huì)通過選擇性吸收由酶產(chǎn)生的自由基而干擾交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。合適的替換溶劑包括水、傳統(tǒng)的生物組織培養(yǎng)基和細(xì)胞冷凍液(通常由大約90％的血清和大約10％的二甲亞颯)。在將細(xì)胞懸浮(見實(shí)施例5)或在體內(nèi)與組織接觸之前，應(yīng)將T-HA通過0.2μm的濾器過濾。隨后在每一個(gè)T-HA制備中加入10U/ml II型山葵過氧化物酶(HRP)進(jìn)行酪胺—酪胺連接。加入小體積(1-5μl)的稀過氧化氫溶液(0.012％-0.00012％終濃度)起始交聯(lián)以生成最終具有理想硬度的水凝膠。為了制備更大量或大體積的理想水凝膠，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以將本節(jié)中提供的試劑量適當(dāng)放大。
實(shí)施例2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定本發(fā)明的T-HA大分子網(wǎng)絡(luò)的酪胺取代(以及隨后的二酪胺交聯(lián))程度。首先，根據(jù)上述方法制備3種配方的(未交聯(lián)的)酪胺取代透明質(zhì)酸(T-HA)，命名為0X、1X或10X。0X配方的制備不使用EDC(即不含有碳二亞胺)，意味著不存在碳二亞胺介導(dǎo)酪胺NH2基團(tuán)和HA分子CO2H基團(tuán)之間生成酰胺鍵的反應(yīng)。因此，0X配方可被視作對(duì)照。1X配方在反應(yīng)混合物中含有與HA分子上的CO2H基團(tuán)量的化學(xué)計(jì)量比為1∶1的EDC。10X配方在反應(yīng)混合物中含有與HA分子上的CO2H基團(tuán)量的化學(xué)計(jì)量比為10∶1(或10倍過量)的EDC。在所有三個(gè)配方中，酪胺的化學(xué)計(jì)量過量都是相對(duì)于HA的CO2H基團(tuán)的數(shù)量而言的。在所有三個(gè)配方(0X、1X和10X)中，反應(yīng)試劑和配方中適量的EDC在試劑瓶中混合并搖晃加速酪胺取代反應(yīng)。所有的配方在室溫反應(yīng)24小時(shí)，隨后透析試劑瓶中的內(nèi)容物去除未發(fā)生反應(yīng)的酪胺分子、EDC和反應(yīng)副產(chǎn)物?；?EDU)。由于酪胺、EDC和EDU的體積相對(duì)于大分子HA而言比較小，通過透析很容易將這些分子與HA和任何已生成的T-HA分子分離。一旦去除了未發(fā)生反應(yīng)的酪胺和EDC，對(duì)每個(gè)配方的剩余物進(jìn)行分析以確定對(duì)于HA分子上的所有可利用的CO2H總數(shù)的酪胺取代率。
酪胺在275nm出現(xiàn)UV吸收峰，根據(jù)酪胺標(biāo)準(zhǔn)曲線可以容易地觀察出酪胺取代程度。根據(jù)對(duì)上述三種T-HA配方的UV光譜分析發(fā)現(xiàn)在沒有EDC存在時(shí)(配方0X)進(jìn)行的HA-酪胺取代反應(yīng)在HA分子上發(fā)生的酪胺取代幾乎為0。該結(jié)果證實(shí)了在酪胺取代反應(yīng)中使用碳二亞胺反應(yīng)途徑的重要性。但是，酪胺取代反應(yīng)中以1∶1EDC∶CO2H的化學(xué)計(jì)量比制備的T-HA配方中的酪胺吸收顯示HA鏈上所有可用的CO2H基團(tuán)中的酪胺取代率大約為1.7％。10X配方(10∶1EDC∶CO2H)造成了大約4.7％的取代率。
隨后，將過氧化氫和山葵過氧化物酶(HRP)以5mg/ml的濃度分別加入三個(gè)透析過的HA/T-HA配方中(0X、1X和10X)，生成的配方發(fā)生反應(yīng)直至反應(yīng)完全。在加入過氧化物和HRP的反應(yīng)完成后觀察到0X配方仍保持完全的液體，具有明顯的彎月面；沒有觀察到凝膠的形成，證實(shí)了在沒有使用EDC的酪胺取代反應(yīng)中沒有或基本沒有發(fā)生酪胺取代的事實(shí)。1X配方只觀察到微弱的彎月面且試劑瓶中的內(nèi)容物已經(jīng)凝膠化，證實(shí)發(fā)生了酪胺取代和交聯(lián)。10X配方形成了較硬的凝膠，事實(shí)上相對(duì)于容器中初始的液體體積發(fā)生了收縮，在其上部留有一定量的液體(具有彎月面)。10X配方制備的膠(有4.7％的酪胺取代率)比具有1.7％酪胺取代率的1X配方堅(jiān)硬很多。
二酪胺結(jié)構(gòu)暴露在UV光下呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光。將上述各配方的產(chǎn)物暴露于UV光下以觀察二酪胺交聯(lián)的存在。和預(yù)期的相同，1X和10X水凝膠均呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光(10X水凝膠的熒光比1X水凝膠的熒光更強(qiáng))，但是0X配方完全沒有藍(lán)色熒光。結(jié)果證實(shí)在1X和10X水凝膠中存在二酪胺交聯(lián)，在較硬的水凝膠(10X)中生成的二酪胺比在較軟的水凝膠(1X)中更多。
總的結(jié)果證明了碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)途徑的重要性，證實(shí)了本發(fā)明中由交聯(lián)T-HA網(wǎng)絡(luò)形成的水凝膠的相對(duì)硬度與二酪胺交聯(lián)程度成正比，二酪胺交聯(lián)程度與HA上的酪胺取代程度成正比。相當(dāng)驚人和出人意料的結(jié)果是根據(jù)本發(fā)明，即使1.7％的酪胺取代率(以及隨后形成二酪胺的連接率)仍可提供合適強(qiáng)度的T-HA凝膠(或水凝膠)。4.7％的取代率(和交聯(lián))甚至生成了更加堅(jiān)固的T-HA凝膠。同樣驚人的是在反應(yīng)混合物中存在的相對(duì)于羧酸基團(tuán)量以化學(xué)計(jì)量10倍過量的碳二亞胺(EDC)(配方10X)僅造成了大約4.5-4.7％的酪胺取代率，雖然可以得到穩(wěn)定和粘著的酪胺交聯(lián)T-HA網(wǎng)絡(luò)。
這些結(jié)果意味著雖然生成的網(wǎng)絡(luò)是粘著穩(wěn)定的水凝膠，HA分子上的大部分羧酸基團(tuán)沒有發(fā)生取代和酪胺交聯(lián)而基本保持與天然HA分子中的一樣。因此，當(dāng)本發(fā)明的網(wǎng)絡(luò)在體內(nèi)用作軟骨取代物時(shí)，由于和正常軟骨中的HA相比，本發(fā)明的T-HA網(wǎng)絡(luò)或凝膠中的大部分HA分子基本沒有改變，人們相信身體的天然代謝途徑(需要或不需要T-HA網(wǎng)絡(luò)中提供的細(xì)胞的幫助)可將本發(fā)明的網(wǎng)絡(luò)看作天然生物材料并能夠進(jìn)行與其相關(guān)的普通的合成和代謝功能。此外，人們注意到在身體內(nèi)HA是一種高度普遍存在的材料且在人體內(nèi)不產(chǎn)生免疫性。因此，人們相信本發(fā)明的含有大量未發(fā)生改變的天然HA的交聯(lián)大分子網(wǎng)絡(luò)將在廣泛的希望或必須在人體中提供合成組織的組織工程應(yīng)用中具有重要應(yīng)用。這標(biāo)志著技術(shù)狀態(tài)的顯著進(jìn)步。因此，非常讓人吃驚地，高度的酪胺取代，例如大于大約10-20％的取代可能是不希望的；上述實(shí)驗(yàn)證明生成合適的T-HA網(wǎng)絡(luò)并不需要高度的取代。優(yōu)選地，本發(fā)明的二羥基苯(例如二酪胺)交聯(lián)聚羧酸酯(例如HA)網(wǎng)絡(luò)基于聚羧酸酯(HA)分子上的CO2H總量的羥基苯(酪胺)取代率的百分比低于50，優(yōu)選地低于40，優(yōu)選地低于30，優(yōu)選地低于20，優(yōu)選地低于15，優(yōu)選地低于10，優(yōu)選地低于9，優(yōu)選地低于8，優(yōu)選地低于7，優(yōu)選地低于6，優(yōu)選地低于5。
實(shí)施例3傳統(tǒng)地，人們已經(jīng)相信天然軟骨具有粘彈性，并且主要由于聚集蛋白聚糖基質(zhì)中存在的相鄰硫酸軟骨素鏈上負(fù)電性的SO42-基團(tuán)之間的排斥力，天然軟骨能夠抵抗變形和吸收壓縮載荷。進(jìn)行試驗(yàn)確定本發(fā)明中只含有二酪胺交聯(lián)透明質(zhì)酸分子(即沒有聚集蛋白聚糖和硫酸軟骨素)的大分子網(wǎng)絡(luò)在沒有SO42-基團(tuán)的情況下與天然軟骨相比在抵抗變形和吸收壓力方面的功效。根據(jù)實(shí)施例1制備和純化未交聯(lián)的具有大約5％酪胺取代率的T-HA配方?；谠揟-HA配方，制備五種不同的T-HA濃度濃度16.25mgT-HA/ml PBS；濃度212.5mgT-HA/ml PBS；濃度325mgT-HA/ml PBS；濃度450mgT-HA/ml PBS；濃度5100mgT-HA/ml PBS。
以上各制備隨后在過氧化氫和山葵過氧化氫酶的存在下發(fā)生反應(yīng)，和實(shí)施例1中一樣在T-HA分子間形成二酪胺交聯(lián)從而相應(yīng)地生成水凝膠1、2、3、4和5。令人吃驚和出乎意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)制備中T-HA濃度的不同，五種水凝膠成為具有不同物理性質(zhì)的穩(wěn)定和基本粘著的材料。例如，濃度1生成的水凝膠具有與凡士林或果凍相當(dāng)?shù)挠捕群土髯儗W(xué)性質(zhì)；水凝膠穩(wěn)定且粘著，然而用諸如抹刀或其它傳統(tǒng)工具施加外力可以引起流動(dòng)或伸展。水凝膠1具有極佳的粘性，是外科手術(shù)如眼外科手術(shù)中外科器械的非過敏性包被材料的理想候選材料。水凝膠2比水凝膠1更加堅(jiān)硬，這是由于制備中T-HA的濃度更高及隨后可預(yù)見的T-HA濃度的增加引起的分子內(nèi)交聯(lián)的減少和分子間交聯(lián)的增加。水凝膠2呈現(xiàn)出凝膠特征性的流變學(xué)和硬度性質(zhì)，以及對(duì)于外部載荷一定程度的粘反彈力。在更大的載荷下，水凝膠2不會(huì)流動(dòng)而是破裂成小碎片，這也是凝膠材料的特征。水凝膠3具有生面團(tuán)或可延展面團(tuán)的性質(zhì)和一致性，在施加外部載荷力時(shí)也不會(huì)流動(dòng)。和水凝膠1和2相比，該材料顯示出更強(qiáng)的粘彈性。水凝膠4是高度堅(jiān)硬和粘著的凝膠，能夠很強(qiáng)地抵抗外力不會(huì)破裂。水凝膠4是具有高度彈力的類橡膠合成物，在突然性壓力(如摔在地板上)下可以產(chǎn)生彈力。水凝膠4這種對(duì)于突然性壓力產(chǎn)生彈力的能力使其在一些關(guān)節(jié)置換/修復(fù)應(yīng)用中成為理想的材料，這些關(guān)節(jié)要經(jīng)受重復(fù)性的或周期性的壓力載荷(如踝關(guān)節(jié))。除了所述水凝膠4的性質(zhì)外，水凝膠5具有類軟骨性質(zhì)，外觀類似關(guān)節(jié)軟骨且用手術(shù)刀片切割時(shí)具有軟骨的感覺。
進(jìn)行封閉抗壓測(cè)試以定量地確定上述五種不同的水凝膠的壓縮機(jī)械性質(zhì)。封閉抗壓測(cè)試使用定制的聚碳酸酯封閉箱和多孔的聚丙稀濾器滾筒(20μm孔，20％有孔率)。用封閉箱和以下實(shí)施例4所述的冷凍—融解技術(shù)制備五個(gè)具有各水凝膠濃度的圓柱形栓(直徑為7.1mm，厚度大約3mm)。隨后按照下列測(cè)試步驟進(jìn)行封閉抗壓中的一系列應(yīng)力釋放實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)用Instron 5543測(cè)試儀在電腦控制下進(jìn)行，機(jī)器以10Hz的頻率記錄時(shí)間—位移—載荷數(shù)據(jù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均使用±5N或±50N的荷重儀(Sensotec)對(duì)載荷量全程跟蹤。每一步使用30μm(30μm/秒)的速度，該速度相當(dāng)于1％的張力，直至樣品達(dá)到平衡。這被定義為弛豫率，當(dāng)該弛豫率減慢至10mN min-1以下時(shí)，下一步自動(dòng)啟動(dòng)直至完成20個(gè)循環(huán)(相當(dāng)于大約20％的張力)。封閉抗壓測(cè)試中各樣品的厚度采用機(jī)械法確定，通過Instron 5543儀測(cè)量抗壓反應(yīng)引起的樣品相對(duì)于箱底的位移。測(cè)試的厚度用于計(jì)算每一步的張力百分比。
五種水凝膠的壓縮機(jī)械性質(zhì)通過前一節(jié)所述的方法確定。載荷數(shù)據(jù)用樣品橫剖面面積(39.6mm2)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以計(jì)算應(yīng)力。每種材料配方的平衡應(yīng)力對(duì)所加張力描點(diǎn)作圖。每一步的聚集系數(shù)定義為平衡應(yīng)力除以所加張力。對(duì)于每種材料，聚集系數(shù)定義為平衡應(yīng)力—張力數(shù)據(jù)在線性最好的范圍內(nèi)的斜率。圖4顯示了封閉抗壓測(cè)試的結(jié)果。所有五種水凝膠均可以進(jìn)行封閉抗壓測(cè)試并在測(cè)試中證明了典型的兩相材料(如軟骨)特征性的張力弛豫反應(yīng)。6.25mg/ml和12.5mg/ml H-TA水凝膠的聚集系數(shù)比關(guān)節(jié)軟骨低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。25mg/ml T-HA水凝膠的聚集系數(shù)是關(guān)節(jié)軟骨的報(bào)道值的一半。50和100mg/ml T-HA水凝膠的聚集系數(shù)在線性區(qū)域小于關(guān)節(jié)軟骨的報(bào)道值，但是大于關(guān)節(jié)軟骨在15-20％張力下的值。這些數(shù)據(jù)證明了用標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械分析可以對(duì)水凝膠進(jìn)行鑒定，并且證明了可以生成與關(guān)節(jié)軟骨具有相似機(jī)械性質(zhì)的水凝膠。
基于以上實(shí)驗(yàn)，驚人并出入意料地發(fā)現(xiàn)二酪胺交聯(lián)的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)可以生成粘著的水凝膠材料，為了適應(yīng)特定的應(yīng)用，通過在對(duì)酪胺基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)前變化T-HA的濃度可以改變水凝膠的硬度和其它物理性質(zhì)(流變學(xué))。即使網(wǎng)絡(luò)中沒有(或基本沒有)任何SO42-基團(tuán)提供電荷—電荷排斥力產(chǎn)生材料的抗壓性和彈性，仍然觀察到這些水凝膠的粘著性和彈性。這個(gè)相當(dāng)驚人和出乎意料的結(jié)果在組織工程應(yīng)用中可能具有相當(dāng)積極的作用。透明質(zhì)酸是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的高度普遍存在和無免疫反應(yīng)性的分子。因此，由二酪胺交聯(lián)透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)組成的水凝膠可以成為非常合適的組織置換材料移植入人體內(nèi)，其硬度可以根據(jù)應(yīng)用的需要加以調(diào)節(jié)。由于這些材料主要由沒有發(fā)生改變的無免疫反應(yīng)性的透明質(zhì)酸組成，人們相信該材料可能引起的免疫反應(yīng)為零或接近于零。這是和很多傳統(tǒng)組織工程材料相比具有的重要優(yōu)勢(shì)，傳統(tǒng)材料由于在化學(xué)合成中苛刻的反應(yīng)條件或反應(yīng)試劑，其在體內(nèi)的應(yīng)用受到阻礙，且材料最終的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有更大的誘發(fā)免疫反應(yīng)的可能。
實(shí)施例4已經(jīng)發(fā)展了多種制備方法用于在事先確定的三維形狀中制備或形成水凝膠，諸如上述實(shí)施例3中的水凝膠。這對(duì)于很多組織工程應(yīng)用非常重要，這些應(yīng)用中必須將人工組織材料填入病人的天然組織缺陷或空洞中。
第一種方法是采用原位點(diǎn)形成技術(shù)，在該技術(shù)中水凝膠在原位置形成，即以最終應(yīng)用的位置和結(jié)構(gòu)的形狀形成。此原位點(diǎn)形成方法按如下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。酪胺取代透明質(zhì)酸(T-HA)通過在此描述的碳二亞胺介導(dǎo)途徑制備。在透析去除未反應(yīng)的酪胺、EDC、NHS等以及將產(chǎn)物以理想濃度溶解于PBS中后(見以上實(shí)施例1)，將小量山葵過氧化物酶加入T-HA制備液體中形成第一溶液。將第一溶液加入內(nèi)部具有特定幾何形狀的實(shí)驗(yàn)室容器中(模擬體內(nèi)位點(diǎn))。隨后，制備含有很稀的過氧化氫的第二溶液(終濃度為0.012％-0.00012％)。隨后將相對(duì)于第一溶液而言小體積的第二溶液注射進(jìn)已經(jīng)裝有第一溶液的容器從而起始二酪胺交聯(lián)反應(yīng)生成水凝膠。通過該技術(shù)制備的水凝膠具有以上實(shí)施例3中所述的不同的硬度和流變學(xué)性質(zhì)，并且很好地與制備容器的內(nèi)表面輪廓吻合。由于主要的試劑(H2O2、透明質(zhì)酸和過氧化物酶)是非過敏性分子或擴(kuò)散性分子，并且由于交聯(lián)反應(yīng)在代謝的溫度和pH下進(jìn)行，該技術(shù)可作為手術(shù)程序在病人體內(nèi)的手術(shù)位點(diǎn)操作，從而生成缺陷適配水凝膠。該方法對(duì)于面部重建手術(shù)特別具有吸引力，該手術(shù)中外科醫(yī)生可以將未交聯(lián)的T-HA制備物(包含過氧化物酶)進(jìn)行皮下注射并操作以形成理想的面部輪廓，隨后通過注射小體積的過氧化氫溶液使水凝膠發(fā)生交聯(lián)。
第二種方法是多孔模具技術(shù)，適合形成具有更復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的水凝膠。該技術(shù)中首先根據(jù)所需最終結(jié)構(gòu)的形狀和輪廓制備多孔中空模具。例如，如果需要立方形水凝膠，制備的模型可以具有立方體形的內(nèi)表面。模具可以用傳統(tǒng)的多孔材料通過傳統(tǒng)技術(shù)制備或澆鑄，例如熟石膏、多孔或燒結(jié)塑料或金屬等。在特別優(yōu)選具體實(shí)施方案中，模具用纖維素透析膜制備。按以上方法制備第一和第二溶液，將第一溶液裝入多孔模具中空的模巢中。隨后，將裝滿的模具用極稀的過氧化物浴浸沒。大分子T-HA和過氧化物酶由于其分子尺寸不能從多孔模具中擴(kuò)散出模具，但是非常小的過氧化物分子(H2O2)能夠擴(kuò)散進(jìn)模具并在過氧化物酶的存在下發(fā)生反應(yīng)生成二酪胺交聯(lián)。在該方法中交聯(lián)自外向內(nèi)發(fā)生生成最終的水凝膠形狀，且在過氧化物浴中需要一定程度的試錯(cuò)法以決定最優(yōu)的或充分的浸沒時(shí)間。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有能力確定這段時(shí)間的長短。通過這種多孔模具技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)成功完成了三維水凝膠的制備。
第三種方法是冷凍—融解技術(shù)，該技術(shù)適用于制備具有預(yù)先確定的高度復(fù)雜三維形狀的本發(fā)明的水凝膠，例如人耳內(nèi)部折回。在該技術(shù)中，模具用柔軟的或有延展性的材料制備，如具有低玻璃轉(zhuǎn)換溫度的多聚體材料，例如低于-80℃。優(yōu)選的模具材料是具有低玻璃轉(zhuǎn)換溫度的硅樹膠，如玻璃轉(zhuǎn)換溫度大約為-127℃的聚二甲基硅氧烷，當(dāng)然其它合適的低玻璃轉(zhuǎn)換溫度的硅樹膠(例如低于-80℃)及其它多聚體也可以使用。首先通過傳統(tǒng)或適用技術(shù)(即模壓成形法、雕刻法等)制備硅樹膠(首選材料)，使其內(nèi)部模巢和所需的水凝膠部分的表面形狀、輪廓和體積吻合。如上制備第一和第二溶液并將第一溶液加入硅樹膠模的內(nèi)部模巢中。充填后的硅樹膠模隨后通過與固體CO2(干冰)接觸冷凍至大約-80℃。由于第一溶液主要是水，溶液冷凍成固態(tài)冰的形式與模具的內(nèi)表面的形狀和輪廓吻合。但是，玻璃轉(zhuǎn)移溫度低于-80℃的硅樹膠模仍然是柔軟且有延展性的，可以輕易地將第一溶液的固態(tài)冰形式取出。由于第一溶液在冷凍時(shí)發(fā)生膨脹，應(yīng)當(dāng)使用合適的機(jī)械器材確保在溶液膨脹時(shí)硅樹膠模不會(huì)變形或膨脹。優(yōu)選地，在模中提供出入孔，當(dāng)?shù)谝蝗芤涸诶鋬鲞^程中膨脹時(shí)允許溶液的膨脹及釋放。
一旦第一溶液的固態(tài)冰形式被制成模，三維結(jié)構(gòu)中微小的缺陷或瑕疵可以使用合適的工具通過雕刻加以修復(fù)，且可以加入更多的液態(tài)第一溶液充填表面空洞，液體通過和固態(tài)冰形式接觸瞬間凍結(jié)。同樣地，如果希望保證一致的溫度以及確保所有加入的第一溶液材料的凍結(jié)，可以將冰放回干冰表面。一旦冰的三維形狀完美形成，將其浸沒于液態(tài)過氧化物溶液中自外而內(nèi)地起始冰凍水的融化及二酪胺的交聯(lián)。由于交聯(lián)反應(yīng)的快速動(dòng)力學(xué)，這種方法是可行的。當(dāng)形成的水凝膠的中心最后剩余的冰凍水融化時(shí)認(rèn)為交聯(lián)完成，由于形成的水凝膠基本透明，所以很容易觀察到交聯(lián)的完成。
根據(jù)該冷凍—融解技術(shù)已經(jīng)進(jìn)行了非常成功的實(shí)驗(yàn)生成了人耳形狀的本發(fā)明的固體水凝膠。通過這種方法可以形成的其它結(jié)構(gòu)，如椎間盤、半月板等，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。在該冷凍—融解技術(shù)中應(yīng)當(dāng)注意的是，模具材料的臨界玻璃轉(zhuǎn)移溫度-80℃是大致根據(jù)固體CO2(干冰)的表面溫度選擇的，從而確保在第一溶液冷凍生成固態(tài)冰的形式時(shí)模具材料不會(huì)變得易碎。但是如果使用CO2以外的其它冷凍材料，合適的模具材料的臨界玻璃轉(zhuǎn)移溫度可以相應(yīng)的調(diào)整。
對(duì)于上述生成水凝膠的三種方法，第一溶液含有過氧化物酶和T-HA，而第二溶液含有過氧化物。盡管可以交換第一和第二溶液中的過氧化物酶和過氧化物，但將過氧化物與T-HA加入第一溶液并非優(yōu)選。這是因?yàn)橐坏⑦^氧化物、過氧化物酶和T-HA混合，T-HA迅速地開始形成交聯(lián)的大分子網(wǎng)絡(luò)。如果過氧化物酶(過氧化物酶是大分子)還沒有均勻地分布于T-HA內(nèi)，過氧化物酶可能不能或基本難以通過形成的水凝膠的孔擴(kuò)散，難以在整個(gè)T-HA/過氧化物溶液中生成均一的交聯(lián)。結(jié)果可能導(dǎo)致T-HA不均一的和/或不完全的交聯(lián)和不均一的水凝膠。相反地，相對(duì)小的過氧化物分子(過氧化氫只比水大一個(gè)氧原子)可以相對(duì)容易地通過水凝膠的孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行擴(kuò)散，生成均一的水凝膠結(jié)構(gòu)。
此外，過氧化物酶的大分子量使得其與T-HA類似地保留在多孔模具中，該模具只對(duì)小分子量過氧化物具有滲透性，過氧化物可以通過模具和新生成的大分子網(wǎng)絡(luò)(即水凝膠)輕松且均一地發(fā)生擴(kuò)散。由于這些原因，優(yōu)選在第一溶液中均一分布過氧化物酶和T-HA，在第二溶液中單獨(dú)提供過氧化物。
第四種方法是交互噴霧層覆或刷涂層覆技術(shù)。按上述方法制備第一溶液并包含過氧化物酶和T-HA。但是，第二溶液不僅含有上述的過氧化物，并且含有與第一溶液相同濃度的T-HA。隨后將第一溶液的薄層涂在所需位點(diǎn)(原位點(diǎn))隨后覆蓋上第二溶液的薄層。重復(fù)該步驟連續(xù)交替噴刷第一和第二溶液層直至缺陷或使用位點(diǎn)充填完成。非常薄的第一和第二溶液的交替層促進(jìn)了二酪胺交聯(lián)的完成，確保了最終水凝膠的高度一致性，且水凝膠具有理想的由兩溶液的起始T-HA濃度決定的流變學(xué)性質(zhì)。理想的液體層很薄，以確保第一溶液層中過氧化物酶生成的自由基能夠完全滲透進(jìn)相鄰的第二溶液層并完成交聯(lián)，該交聯(lián)不依賴于過氧化物酶向第二溶液層的擴(kuò)散(見上)。在兩溶液中均包含T-HA從而保證在最終水凝膠中均一的T-HA濃度。在實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)完成了該技術(shù)并生成了輪廓吻合和大量充填的均一的水凝膠。當(dāng)需要生成薄而變化的酪胺交聯(lián)HA層時(shí)該技術(shù)高度適用，如在骨關(guān)節(jié)炎裸露的關(guān)節(jié)的表面，在病人的移植位點(diǎn)幾乎沒有健康的軟骨。
以上所有四種技術(shù)對(duì)二酪胺交聯(lián)透明質(zhì)酸進(jìn)行描述，但是應(yīng)該知道在本發(fā)明的范圍內(nèi)的其它組合(其它二羥基苯交聯(lián)大分子，如聚羧酸酯、聚胺、聚羥基苯分子和它們的共聚物)可以通過以上技術(shù)制模。
實(shí)施例5將大鼠的軟骨細(xì)胞埋入(交聯(lián)的)T-HA水凝膠中以測(cè)試它們?cè)诮宦?lián)反應(yīng)中的存活能力。將活細(xì)胞加入第一溶液與T-HA和過氧化物酶共同分散，隨后加入含有過氧化物的第二溶液起始二酪胺交聯(lián)，于是分離得到的軟骨細(xì)胞被懸浮于實(shí)施例2中描述的1.7％和4.7％的T-HA水凝膠中。埋有軟骨細(xì)胞的1.7％和4.7％T-HA水凝膠中均一地分布了軟骨細(xì)胞，且凝膠視覺透明，整個(gè)凝膠具有可視性。采用葡萄糖利用作為交聯(lián)形成水凝膠后細(xì)胞活力的指示劑，因?yàn)檐浌羌?xì)胞對(duì)于葡萄糖消耗巨大，在少于24小時(shí)內(nèi)耗盡葡萄糖培養(yǎng)基。結(jié)果顯示埋于T-HA水凝膠中的軟骨細(xì)胞與在單層中培養(yǎng)的相同的軟骨細(xì)胞在24小時(shí)中具有基本相同的葡萄糖消耗情況(圖5)。該情況持續(xù)長達(dá)7天，說明細(xì)胞是活的且代謝活躍。培養(yǎng)基葡萄糖通過標(biāo)準(zhǔn)己糖激酶分析進(jìn)行測(cè)試。
對(duì)于含有軟骨細(xì)胞和軟骨組織的T-HA水凝膠的凍結(jié)部分還進(jìn)行了熒光成像。水凝膠骨架和軟骨基質(zhì)的HA樣品通過生物素標(biāo)記的HA結(jié)合蛋白(b-HABP)試劑熒光染色成像，而細(xì)胞核用標(biāo)準(zhǔn)的DAPI染色成像。b-HABP試劑用純化的軟骨聚集蛋白聚糖(只含G1結(jié)構(gòu)域)和連接蛋白制備，該試劑識(shí)別并不可逆地與天然HA片斷結(jié)合，這些片斷正常情況下與軟骨中的聚集蛋白聚糖和連接蛋白相結(jié)合。結(jié)果顯示b-HABP對(duì)T-HA水凝膠的染色比對(duì)軟骨染色效果更強(qiáng)，因?yàn)榻M織中的透明質(zhì)酸已經(jīng)結(jié)合了天然聚集蛋白聚糖和連接蛋白。在水凝膠T-HA骨架和懸浮的軟骨組織基質(zhì)之間沒有明顯分別意味著嚴(yán)密的整合。這些結(jié)果證明了在水凝膠交聯(lián)反應(yīng)中保持軟骨細(xì)胞活性的可行性，以及水凝膠嚴(yán)密地整合進(jìn)已存在的軟骨基質(zhì)的能力，兩者均對(duì)軟骨修復(fù)的應(yīng)用非常有利。結(jié)果還證明T-HA中足夠多的片段在化學(xué)上保持不變，并可以在原位點(diǎn)與新合成的聚集蛋白聚糖和連接蛋白結(jié)合。結(jié)果還證實(shí)氧氣、二氧化碳、葡萄糖和胰島素可以在本發(fā)明的T-HA水凝膠中以一定速率擴(kuò)散，該速率對(duì)軟骨細(xì)胞代謝不發(fā)生限制，這不僅對(duì)于軟骨置換物非常重要，而且對(duì)于其它應(yīng)用如葡萄糖感應(yīng)器設(shè)計(jì)和人工腎的發(fā)展非常重要。
為了將細(xì)胞如軟骨細(xì)胞加入用實(shí)施例4中的冷凍/融解技術(shù)以復(fù)雜的組織形態(tài)制模的水凝膠中，人們希望酶驅(qū)動(dòng)交聯(lián)反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞冷凍溶液的存在下進(jìn)行，比如包含10％二甲亞砜(DMSO)/90％胎牛血清(FBS)的細(xì)胞冷凍溶液。這一點(diǎn)已在實(shí)驗(yàn)室中通過實(shí)施例3中描述的所有T-HA水凝膠配方加以了證實(shí)。能夠直接加入含有90％FBS的溶液也證明了反應(yīng)中可以包含生物活性因子，如生長因子、荷爾蒙和控制細(xì)胞分化的因子，因?yàn)檫@些因子是FBS的正常組分。
雖然上述具體實(shí)施方案組成了優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該清楚的是，在不悖離所附權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變或修正。
權(quán)利要求
1.一種大分子網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含 其中R1和R2分別包含選自聚羧酸酯、聚胺、聚羥基苯分子和它們的共聚體的結(jié)構(gòu)，其中R1和R2可以是相同或不同的結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1是聚羧酸酯。
3.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1是聚胺。
4.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1是多酚。
5.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自粘多糖的結(jié)構(gòu)。
7.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含透明質(zhì)酸。
8.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的結(jié)構(gòu)。
9.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自硫酸乙酰肝素和肝磷脂的結(jié)構(gòu)。
10.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自藻酸鹽、聚葡萄糖醛酸、聚半乳糖醛酸、果膠和聚唾液酸的結(jié)構(gòu)。
11.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自聚天冬氨酸和聚谷氨酸的結(jié)構(gòu)。
12.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含聚酪氨酸。
13.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含選自聚賴氨酸和聚精氨酸的結(jié)構(gòu)。
14.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含蛋白聚糖。
15.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，其中R1包含聚集蛋白聚糖。
16.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，在大分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步包含了有活力的活細(xì)胞群。
17.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，在大分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步包含了生物活性因子。
18.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述網(wǎng)絡(luò)包含了由羥基苯化合物取代的聚羧酸酯分子，其中至少一個(gè)二羥基苯鍵在分別與相鄰聚羧酸酯分子連接的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)之間形成。
19.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述網(wǎng)絡(luò)包含由羥基苯化合物取代的聚胺分子，其中至少一個(gè)二羥基苯鍵在分別與相鄰聚胺分子連接的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)之間形成。
20.如權(quán)利要求1中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述網(wǎng)絡(luò)包含由羥基苯化合物取代的肽和/或蛋白質(zhì)，其中至少一個(gè)二羥基苯鍵在分別與相鄰肽和/或蛋白質(zhì)分子連接的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)之間形成。
21.如權(quán)利要求18中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述羥基苯化合物是酪胺或酪氨酸。
22.如權(quán)利要求19中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述羥基苯化合物是酪胺、4-羥基苯乙酸、或3-(4-羥基苯)丙酸。
23.如權(quán)利要求18中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述聚羧酸酯分子中的羥基苯化合物取代率相對(duì)于所述聚羧酸酯分子上的CO2H位點(diǎn)摩爾量小于50％。
24.如權(quán)利要求19中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，所述聚胺分子中的羥基苯化合物取代率相對(duì)于所述聚胺分子上的一級(jí)NH2位點(diǎn)摩爾量小于50％。
25.含有大量酪胺取代透明質(zhì)酸分子的大分子網(wǎng)絡(luò)，兩個(gè)相鄰的透明質(zhì)酸分子至少由一個(gè)二酪胺鍵相連。
26.如權(quán)利要求25中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，在所述透明質(zhì)酸分子中的酪胺取代率相對(duì)于所述透明質(zhì)酸上的CO2H位點(diǎn)摩爾量低于50％。
27.如權(quán)利要求25中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，在所述透明質(zhì)酸分子中的酪胺取代率相對(duì)于所述透明質(zhì)酸上的CO2H位點(diǎn)摩爾量低于10％。
28.如權(quán)利要求25中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，大分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步包含了有活力的活細(xì)胞群。
29.如權(quán)利要求25中所述的大分子網(wǎng)絡(luò)，大分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步包含了生物活性因子。
30.含有由酪胺取代透明質(zhì)酸分子形成的大分子網(wǎng)絡(luò)的水凝膠，所述大分子網(wǎng)絡(luò)通過透明質(zhì)酸分子之間的二酪胺鍵交聯(lián)。
31.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，具有果凍的硬度和流變學(xué)性質(zhì)。
32.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，具有凝膠的硬度和流變學(xué)性質(zhì)。
33.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，具有生面團(tuán)的硬度和流變學(xué)性質(zhì)。
34.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，具有類彈力橡膠合成物的硬度和流變學(xué)性質(zhì)。
35.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，具有類軟骨的硬度和流變學(xué)性質(zhì)。
36.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，在大分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步包含了有活力的活細(xì)胞群。
37.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，用作合成或人工軟骨。
38.如權(quán)利要求30中所述的水凝膠，大分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步包含了生物活性因子。
39.一種制備大分子網(wǎng)絡(luò)的方法，包含的步驟有提供選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它聚羥基苯分子及它們的共聚物的第一類大分子；以及在分別與相鄰的所述第一類大分子相連的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)之間生成至少一個(gè)二羥基苯鍵。
40.如權(quán)利要求39中所述的方法，進(jìn)一步包含在聚羧酸酯和含有一級(jí)胺基團(tuán)及羥基苯功能基團(tuán)的第二類分子之間通過發(fā)生化學(xué)反應(yīng)制備所述羥基苯取代聚羧酸酯。
41.如權(quán)利要求39中所述的方法，進(jìn)一步包含在聚胺和含有CO2H基團(tuán)及羥基苯功能基團(tuán)的第二類分子之間通過發(fā)生化學(xué)反應(yīng)制備所述羥基苯取代聚胺。
42.如權(quán)利要求40中所述的方法，所述第二類分子是酪胺或酪氨酸。
43.如權(quán)利要求41中所述的方法，所述第二類分子是酪氨酸、4-羥基苯乙酸、或3-(4-羥基苯)丙酸。
44.如權(quán)利要求40中所述的方法，所述聚羧酸酯是透明質(zhì)酸。
45.如權(quán)利要求40中所述的方法，所述聚羧酸酯是硫酸軟骨素。
46.如權(quán)利要求40中所述的方法，所述第二類分子是酪胺，所述聚羧酸酯是透明質(zhì)酸，生成的大分子網(wǎng)絡(luò)是酪胺取代透明質(zhì)酸分子的二酪胺交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。
47.如權(quán)利要求40中所述的方法，所述化學(xué)反應(yīng)在pH范圍6-7之間進(jìn)行。
48.如權(quán)利要求40中所述的方法，所述化學(xué)反應(yīng)經(jīng)過以下途徑進(jìn)行a)所述聚羧酸酯上的羧酸基團(tuán)和碳二亞胺反應(yīng)生成O-酰基異脲取代的聚羧酸酯；以及b)O-?；愲迦〈埕人狨ヅc所述第二類分子上的一級(jí)胺基團(tuán)反應(yīng)生成所述羥基苯取代聚羧酸酯。
49.如權(quán)利要求41中所述的方法，所述化學(xué)反應(yīng)經(jīng)過以下途徑進(jìn)行a)所述第二類分子上的CO2H基團(tuán)和碳二亞胺反應(yīng)生成O-?；愲迦〈牡诙惙肿?；以及b)所述O-酰基異脲取代的第二類分子和所述聚胺上的一級(jí)胺基團(tuán)反應(yīng)生成所述羥基苯取代聚胺。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，所述碳二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺。
51.如權(quán)利要求48中所述的方法，步驟(a)在生成活性酯的催化劑的存在下進(jìn)行。
52.如權(quán)利要求51中所述的方法，所述催化劑是N-羥琥珀酰亞胺。
53.如權(quán)利要求39中所述的方法，進(jìn)一步包含所述二羥基苯鍵的形成所述羥基苯基團(tuán)與過氧化物在酶的存在下反應(yīng)生成相鄰的羥基苯自由基，所述自由基通過二聚化反應(yīng)發(fā)生二聚化生成所述二羥基苯鍵。
54.如權(quán)利要求53中所述的方法，所述過氧化物是過氧化氫，所述酶是山葵過氧化物酶。
55.一種制備水凝膠的方法，所述方法包括的步驟有a)提供含有過氧化物酶或過氧化物的第一溶液，但溶液中不同時(shí)含有上述兩種物質(zhì)，溶液中還含有選自羥基苯取代聚羧酸酯、羥基苯取代聚胺、其它聚羥基苯分子以及它們的共聚物的大分子；b)提供第二溶液，該溶液含有所述第一溶液中沒有提供的所述過氧化物酶或過氧化物中的一種；以及c)混合所述第一和第二溶液促使二羥基苯交聯(lián)以形成所述水凝膠。
56.如權(quán)利要求55中所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含無孔模具，所述模具的內(nèi)模巢與所需水凝膠部分的形狀、輪廓和體積吻合，所述方法還包括在所述內(nèi)模巢中混合第一和第二溶液生成具有內(nèi)模巢形狀的所述水凝膠。
57.如權(quán)利要求55中所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含的步驟有d)提供用多孔材料制作的模具，所述模具具有與所需水凝膠部分的形狀、輪廓和體積吻合的內(nèi)模巢；e)在所述模具的所述內(nèi)模巢中提供所述第一溶液；以及f)將其中含有所述第一溶液的所述多孔模具浸沒于所述第二溶液浴中從而促使所述的二羥基苯交聯(lián)和所述水凝膠的生成。
58.如權(quán)利要求55中所述的方法進(jìn)一步包含的步驟有d)提供用柔韌材料制作的模具，所述模具具有與所需水凝膠部分形狀、輪廓和體積吻合的內(nèi)模巢；e)在所述模具的所述內(nèi)模巢中加入所述第一溶液；f)冷卻所述模具，凍結(jié)內(nèi)模巢中的所述第一溶液，生成具有所述內(nèi)模巢形狀的固態(tài)冰形式；以及g)將所述固態(tài)冰形式浸沒于所述第二溶液浴中由此促使凍結(jié)水的融解和二羥基苯的交聯(lián)以形成所述水凝膠。
59.如權(quán)利要求58中所述的方法，所述柔韌材料是玻璃轉(zhuǎn)換溫度低于大約-80℃的聚合材料。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，所述冷卻步驟通過將所述模具及其內(nèi)容物與干冰接觸進(jìn)行。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含在浸沒所述固態(tài)冰形式之前將所述固態(tài)冰形式從所述模具中脫模。
62.如權(quán)利要求58中所述的方法，所述柔韌材料的玻璃轉(zhuǎn)換溫度低于所述第一溶液在所述冷卻步驟中凍結(jié)的溫度。
63.如權(quán)利要求55中所述的方法，所述第二溶液進(jìn)一步包含所述大分子，所述步驟進(jìn)一步包含在位點(diǎn)交替使用第一和第二溶液層由此促使所述二羥基苯交聯(lián)和所述水凝膠的形成。
64.如權(quán)利要求55中所述的方法，所述第一溶液包含過氧化物酶。
65.如權(quán)利要求55中所述的方法，所述大分子是酪胺取代透明質(zhì)酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了二羥基苯交聯(lián)的大分子網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)可用于人工組織和組織工程應(yīng)用中，如人工或合成軟骨中。在該網(wǎng)絡(luò)制備中首先提供聚胺或聚羧酸酯大分子(在分子鏈上分別帶有多個(gè)胺基或羧酸基團(tuán))，該大分子若是聚胺，則將其與帶有自由羧酸基團(tuán)的羥基苯化合物反應(yīng)，若是聚羧酸酯，則與帶有自由一級(jí)胺基團(tuán)的羥基苯化合物反應(yīng)，通過碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)途徑將羥基苯化合物取代至大分子上生成羥基苯取代大分子。隨后在代謝的溫度和pH條件下，在分別與不同大分子相連的兩個(gè)羥基苯基團(tuán)間發(fā)生酶催化二聚化反應(yīng)，從而將該大分子連接至另一大分子上。在優(yōu)選具體實(shí)施方案中，大分子網(wǎng)絡(luò)由通過二酪胺鍵連接的酪胺取代透明質(zhì)酸分子組成，從而提供了具有理想物理性質(zhì)的穩(wěn)定、粘著的水凝膠。本發(fā)明還提供了制備該網(wǎng)絡(luò)的方法。
文檔編號(hào)A61K31/765GK1826381SQ200480005571
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2004年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者安東尼·卡拉布羅, 理查德·A·格羅斯, 安尼克·B·達(dá)爾 申請(qǐng)人:克利夫蘭臨床基金會(huì)