專利名稱：凝聚素在治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病。本發(fā)明與神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)髓鞘化及產(chǎn)生細(xì)胞的髓磷脂生成或再生有關(guān)。本發(fā)明特別涉及凝聚素或凝聚素活性激動劑在制備用于治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)疾病是與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)或與支援周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)有關(guān)的失調(diào)。周圍神經(jīng)病變是最常見的周圍神經(jīng)疾病。
周圍神經(jīng)病變是一種綜合征，包括感覺喪失、肌無力和肌萎縮、深度腱反射減弱、血管舒張癥狀的一種或幾種癥狀的綜合。
這種疾病可以影響單個(gè)神經(jīng)(單一神經(jīng)病變)，兩或多個(gè)分離區(qū)域的神經(jīng)(多發(fā)性單一神經(jīng)病變)，或者同時(shí)影響很多神經(jīng)(多神經(jīng)病變)。最初主要是軸突受影響(如糖尿病、萊姆病、或尿毒癥或毒性藥物引起的疾病)，或者是髓鞘或施萬細(xì)胞(如急性或慢性感染性多神經(jīng)病變、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、或格-巴綜合征)。對小的無髓或有髓神經(jīng)纖維造成的損傷主要是導(dǎo)致溫度及疼痛感覺喪失；對大的有髓神經(jīng)纖維造成的損傷主要會導(dǎo)致運(yùn)動或本體感覺障礙。某些神經(jīng)障礙(如由于鉛中毒，氨苯砜的應(yīng)用，蜱叮咬，卟啉病或格-巴綜合征)主要影響運(yùn)動纖維；其它的神經(jīng)障礙(如由于腫瘤引起的背根神經(jīng)節(jié)炎，痳瘋病，AIDS，糖尿病，或慢性吡哆醇中毒)主要影響背根神經(jīng)節(jié)或感覺纖維，產(chǎn)生感覺癥狀。有時(shí)候顱側(cè)神經(jīng)也可能受到影響(如格-巴綜合征、萊姆病、糖尿病、以及白喉)。確定那些神經(jīng)受影響有助于判斷病因。
創(chuàng)傷是導(dǎo)致單個(gè)神經(jīng)纖維受到局部損傷的最常見原因。劇烈的肌肉運(yùn)動或關(guān)節(jié)的強(qiáng)迫過度伸張可能會造成局部神經(jīng)病變，重復(fù)的小創(chuàng)傷也可能造成局部神經(jīng)病變(如緊握小的工具，來自汽錘的過度振蕩)。壓力或內(nèi)陷麻痹通常影響骨隆突(如在深度睡眠時(shí)，瘦弱或惡質(zhì)病人感覺缺失時(shí)，以及酒醉時(shí))或狹窄管道(如腕管綜合征)處的淺表神經(jīng)(尺骨的、橈骨的、腓側(cè)的)。壓力造成的麻痹也可能是由于腫瘤、骨肥厚、投擲、拄拐杖、或長時(shí)間保持非正常姿勢(如在花園工作時(shí))而引起的。血液流出后進(jìn)入神經(jīng)以及暴露于寒冷或輻射中也可能引發(fā)神經(jīng)病變。單一神經(jīng)病變也可能是由于腫瘤的直接侵入造成的。
手術(shù)(如外科前列腺切除術(shù))過程中可能引發(fā)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷。在保留神經(jīng)前列腺切除術(shù)中，為了避免神經(jīng)創(chuàng)傷，一般做法是在手術(shù)過程中刺激海綿體神經(jīng)，鑒定海綿體神經(jīng)路程并引導(dǎo)外科醫(yī)生避免損害神經(jīng)(Klotz和Herschorn，1998)。對根治性前列腺切除術(shù)后性無能進(jìn)行評估的研究顯示，503例以前性功能正常的男病人中有212例(42％)在切除部分或完全切除陰莖海綿體神經(jīng)后失去性功能。當(dāng)神經(jīng)保持完好時(shí)，失去性功能的比例下降至24％(Quinlan等人，1991b；Quinlan等人，1991a)。
多發(fā)性單一神經(jīng)病變通常是由膠原性血管病(如結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫綜合征(口眼干燥、關(guān)節(jié)炎綜合征)、結(jié)節(jié)病、代謝性疾病(如糖尿病、淀粉樣變性)、或感染性疾病(如萊姆病、HIV感染)引發(fā)的。微生物如果直接侵入神經(jīng)(如痳瘋病)也可以引起多發(fā)性單一神經(jīng)病變。
由急性發(fā)熱病引起的多神經(jīng)病變通常都是由毒素(如白喉)或自身免疫反應(yīng)(如格-巴綜合征)造成的；有時(shí)伴隨免疫接種而出現(xiàn)的多神經(jīng)病變可能也是自身免疫疾病。
毒性藥物通過造成的是多神經(jīng)病變，但有時(shí)也會引發(fā)單一神經(jīng)病變。這些藥品包括吐根堿、環(huán)幾巴比妥、巴比妥、三氯叔丁醇、磺胺類藥物、苯妥英、硝基呋喃妥英、長春花生物堿、重金屬、一氧化碳、三鄰羥甲苯基磷酸、正二硝基苯酚、多種溶劑、其它工業(yè)毒物、以及某些抗AIDS藥物(如扎西他賓、二脫氧肌苷)。
營養(yǎng)缺乏和代謝障礙也可能引發(fā)多神經(jīng)病變。維生素B缺乏就是一種常見的原因(如酒精中毒、腳氣病、惡性貧血、異煙肼誘導(dǎo)的吡哆醇缺乏、吸收不良綜合征以及孕期嘔吐)。多神經(jīng)病變也可能發(fā)生于甲狀腺功能減退癥、卟啉病、結(jié)節(jié)病、淀粉樣變性以及尿毒癥時(shí)。糖尿病也可以引起感覺運(yùn)動遠(yuǎn)端多神經(jīng)病變(最常見)、多發(fā)性單一神經(jīng)病變、以及局部單一神經(jīng)病變(如動眼神經(jīng)或外展腦神經(jīng)所發(fā)生的局部單一神經(jīng)病變)。
惡性腫瘤也可以引發(fā)多神經(jīng)病變，主要通過單株性丙球蛋白病(多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤)、淀粉樣浸潤、或營養(yǎng)缺失，或者腫瘤相關(guān)病癥而引發(fā)。
特異性單一神經(jīng)病變單發(fā)的和多發(fā)的單一神經(jīng)病變的特征是疼痛、虛弱、以及受影響神經(jīng)分布區(qū)域內(nèi)的感覺異常。多發(fā)性單一神經(jīng)病變是不對稱分布的；受影響的神經(jīng)可以是起始就是全部，也可以是逐漸增多的。如果許多神經(jīng)都受到影響，可能會引發(fā)多神經(jīng)病變。
尺骨神經(jīng)麻痹通常是由肘部尺骨溝內(nèi)的神經(jīng)創(chuàng)傷引起的，持續(xù)重復(fù)依靠肘部或兒童時(shí)期骨折后骨不對稱生長(慢尺骨麻痹)都可以造成肘部尺骨溝內(nèi)的神經(jīng)創(chuàng)傷。尺骨神經(jīng)在肘管處也容易受到擠壓。第五手指或第四手指中間半截會出現(xiàn)感覺異常和感覺缺陷；拇指內(nèi)收肌、第五手指外展肌以及骨間肌肉變?nèi)鹾臀s。嚴(yán)重的慢性尺骨麻痹會導(dǎo)致爪形手畸形。神經(jīng)傳導(dǎo)檢查可以確定損傷的位置。在進(jìn)行外科手術(shù)修復(fù)前應(yīng)保守治療。
腕管綜合征是由于正中神經(jīng)受壓迫引起的，該神經(jīng)位于橫向淺表腕韌帶和屈伸手掌的前臂肌肉的縱向肌腱之間的腕關(guān)節(jié)掌側(cè)?？梢允菃蝹?cè)或雙側(cè)。該神經(jīng)受壓迫會導(dǎo)致手掌的橈骨掌側(cè)感覺異常以及腕和手掌疼痛；有時(shí)疼痛發(fā)生在靠近前臂和肩部的受壓迫位置。疼痛可能在夜間更劇烈。然后前三個(gè)手指的掌側(cè)可能會出現(xiàn)感覺缺陷；控制拇指外展和內(nèi)屈的肌肉可能變?nèi)鹾臀s。這種綜合征應(yīng)該和頸神經(jīng)根病導(dǎo)致的C-6神經(jīng)根受壓區(qū)別開來。
腓神經(jīng)麻痹通常是由于靠腓骨頸側(cè)面的神經(jīng)受壓迫而引起的。這種情況常見于瘦弱的長期臥床的病人或習(xí)慣性交叉雙腿的瘦人。足的背屈及外翻能力減弱(足下垂)。偶爾會有小腿和足背的前面一側(cè)或第一和第二跖骨之間的空隙出現(xiàn)感覺缺失。壓迫性神經(jīng)病變的治療一般是保守的(如避免腿部交叉)。通常隨后出現(xiàn)不完全臨床神經(jīng)病變，但一般都會自然消失。如果難以恢復(fù)可以考慮進(jìn)行手術(shù)探察。
橈神經(jīng)麻痹(周末晚麻痹)是由于壓迫背靠肱骨的神經(jīng)造成的，例如中毒或深度睡眠時(shí)將手臂靠在椅子背上。癥狀包括腕和手指的伸肌無力(腕下垂)，偶爾會有第一背骨間肌肉的背側(cè)感覺消失。治療方法與壓迫性腓側(cè)神經(jīng)障礙一樣。
多神經(jīng)病變一般是相對對稱的，通常同時(shí)影響感覺、運(yùn)動和血管舒張神經(jīng)纖維?？赡苡绊戄S突柱或髓鞘，或者同時(shí)受影響，可能是急性的(如格-巴綜合征)，也可以是慢性的(如腎衰竭)。
由代謝障礙(如糖尿病)或腎衰竭造成的多神經(jīng)病變進(jìn)展緩慢，一般要經(jīng)過數(shù)月或數(shù)年。通常首先出現(xiàn)下肢的感覺異常，一般來說遠(yuǎn)端比近端嚴(yán)重。外周麻刺感、麻木、燒灼感、關(guān)節(jié)本體感覺及震動感消失是比較突出的。夜間一般疼痛較嚴(yán)重，碰到受影響區(qū)域或溫度改變會導(dǎo)致癥狀加重。嚴(yán)重的病人出現(xiàn)感覺喪失的信號，呈典型的長襪-手套(stocking-and-glove)分布。跟腱反射和其它深度腱反射減弱或消失。如果感覺缺失加重會導(dǎo)致指(跖)無痛潰瘍或夏氏關(guān)節(jié)(Charcot′s joints)。感覺或本體感覺缺失會造成步態(tài)異常。運(yùn)動神經(jīng)受影響則會造成遠(yuǎn)端肌無力和萎縮。自主神經(jīng)系統(tǒng)也可能包括在內(nèi)，導(dǎo)致夜間腹瀉、大小便失禁、陽痿或體位性低血壓。血管舒張癥狀有多種多樣。皮膚變得蒼白干燥，有時(shí)甚至灰暗；極易出汗。嚴(yán)重的慢性病人常會出現(xiàn)與營養(yǎng)有關(guān)的癥狀(光滑而有光澤的皮膚，痘痕或脊?fàn)钪讣?、骨質(zhì)疏松)。
營養(yǎng)性多神經(jīng)病變通常出現(xiàn)于酒精中毒和營養(yǎng)不良的人中。最初的軸突病變會導(dǎo)致長大神經(jīng)纖維脫髓鞘和軸突損壞。原因是缺乏維生素B1或其它維生素(如維生素B6、泛酸、葉酸)還不清楚。維生素B6缺乏導(dǎo)致的神經(jīng)病變常常只發(fā)生在使用異煙肼治療結(jié)核的病人身上；缺乏或依賴維生素B6的嬰幼兒可能會出現(xiàn)驚厥。遠(yuǎn)端肢體殘疾或?qū)ΨQ性無力通常是隱襲的并且快速發(fā)展，有時(shí)會伴隨感覺喪失、感覺異常和疼痛。觸碰時(shí)腓及足的疼痛、痙攣、冷感、燒灼感以及麻木等感覺會加重。當(dāng)病因不清時(shí)可以給予多種維生素，但其是否有效還未被證實(shí)。
很少的情況下，感覺神經(jīng)多神經(jīng)病變以周圍疼痛和感覺異常開始，從中央到所有形式的感覺喪失。其發(fā)生與癌癥的遠(yuǎn)期效應(yīng)類似(特別是支氣管的)，癥狀一般出現(xiàn)在過量攝入維生素B6(＞0.5克/天)，以及在淀粉樣變性、甲狀腺功能低下、骨髓瘤和尿毒癥中。在停止攝入維生素B6時(shí)也可能出現(xiàn)維生素B6誘導(dǎo)的神經(jīng)病變。
遺傳性神經(jīng)病變分為感覺運(yùn)動神經(jīng)病變和感覺神經(jīng)病變。夏-馬-圖病(進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮)是最常見的遺傳性感覺運(yùn)動神經(jīng)病變。很少見感覺運(yùn)動神經(jīng)病變起始于出生時(shí)并導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾。感覺神經(jīng)病變是很罕見的，遠(yuǎn)端疼痛及溫度感覺喪失出現(xiàn)的幾率大于震動和位置感覺喪失的幾率。主要的問題是由于對疼痛不敏感而造成的足部殘疾，并且常常發(fā)生感染和骨髓炎。
遺傳性運(yùn)動和感覺神經(jīng)病變I型和II型(夏-馬-圖病，腓側(cè)肌肉萎縮)相對較常見，通常是常染色體顯性遺傳病，其癥狀是肌無力和萎縮，主要影響腓側(cè)的和下肢肌肉。病人還可能患有其它退化性疾病(如弗氏共濟(jì)失調(diào)(Friedreich′s ataxia))或具有家族史。I型病人一般出現(xiàn)在兒童中期，有足下垂，并且伴有緩慢的進(jìn)行性遠(yuǎn)端肌膚萎縮，導(dǎo)致“鸛形腿”。稍后會出現(xiàn)手部的內(nèi)在肌肉萎縮。出現(xiàn)長襪-手套模式的震動、疼痛及溫度感覺減弱。深度腱反射缺失。高足弓或錘狀趾可能只是患有該病的家族成員受影響輕微的標(biāo)志。神經(jīng)傳導(dǎo)速度緩慢，遠(yuǎn)端潛伏期延長。出現(xiàn)節(jié)段性的脫髓鞘和髓鞘再生。II型神經(jīng)病變進(jìn)展更緩慢，在其生命晚期通常會出現(xiàn)肌無力。病人具有相對正常的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，但其激發(fā)勢能的幅度較低?；罱M織檢查發(fā)現(xiàn)有瓦氏(wallerian)變性。
遺傳性運(yùn)動和感覺神經(jīng)病變III型(肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病變，代-索病(進(jìn)行性肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病變))是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，從兒童開始出現(xiàn)進(jìn)行性肌無力、感覺喪失或深度腱反應(yīng)缺乏。開始時(shí)類似于夏-馬-圖病，但其運(yùn)動功能減弱速度很快。發(fā)生脫髓鞘和髓鞘再生現(xiàn)象，導(dǎo)致周圍神經(jīng)膨大，神經(jīng)活組織檢查可見洋蔥泡。
根據(jù)運(yùn)動性肌無力的特征性分布、足畸形、家族史及電生理異?？纱_診此病?？梢酝ㄟ^基因分析，但無特異的治療措施。年輕病人通過專業(yè)咨詢以了解病程進(jìn)行情況可能會有幫助。安裝矯形支架有助于矯正足下垂；通過矯形外科手術(shù)以穩(wěn)定足部也有幫助。
脊髓損傷占因截癱和四肢癱瘓而住院病人的大多數(shù)。80％以上由交通事故造成。臨床上將損傷分為2大組開放性損傷和閉合性損傷。
開放性損傷直接損壞脊髓和神經(jīng)根。貫穿傷可引起大面積破裂和出血。大部分脊髓損傷是閉合性損傷，它通常與脊柱骨折脫位有關(guān)，一般以放射方式就可以得到證實(shí)。脊髓損傷取決于骨損傷程度，可分兩個(gè)階段考慮受傷初級階段，其損傷是挫傷、神經(jīng)纖維橫斷和出血性壞死；受傷次級階段，其損傷是腦膜外血腫、梗塞、感染和水腫。
脊髓損傷的晚期效應(yīng)包括受損神經(jīng)纖維的上升和下降順向變性、創(chuàng)傷后脊髓空洞癥和截癱全身性效應(yīng)，如尿道和胸部感染、壓力疼痛和肌肉萎縮。
脫髓鞘與神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的功能減弱或阻斷有關(guān)聯(lián)。
在某些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞漿膜的某些特殊區(qū)域髓鞘是多層的，富含脂質(zhì)而蛋白質(zhì)較少。它主要是通過防止電荷進(jìn)入周圍組織來支持軸突和促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的電信號傳導(dǎo)。神經(jīng)纖維結(jié)是沿軸突髓鞘的位點(diǎn)，在該位點(diǎn)出現(xiàn)跳躍性傳導(dǎo)。
髓鞘再生的過程可以與抗炎癥策略一起使用，修復(fù)損傷和保護(hù)軸突以免斷裂和死亡。
施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中起著支持作用，屬于衛(wèi)星細(xì)胞。施萬細(xì)胞各自包圍著周圍軸突的軸，沿著軸突節(jié)段形成一層髓鞘。施萬細(xì)胞主要由脂質(zhì)或脂肪組成；脂肪起著絕緣體作用，從而加速動作電位(action potential)沿軸突的傳輸速度。
施萬細(xì)胞對周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元再生也是必不可少的。當(dāng)軸突要死亡時(shí)，該軸突周圍的施萬細(xì)胞有助于它的消化。這會留下一條由連續(xù)施萬細(xì)胞形成的空槽，通過此空槽新的軸突以每天3-4毫米的速度從切斷端生長。
神經(jīng)病變通常以受影響的周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元類型(如應(yīng)覺與自主)，事實(shí)上也以神經(jīng)元的亞型(例如小與大)來選擇的。評價(jià)神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)保護(hù)作用最常用的動物模型是周圍神經(jīng)軸突橫切術(shù)。創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、神經(jīng)叢損害和神經(jīng)根損害都是意外所引致的嚴(yán)重并發(fā)癥。此外，與脊柱矯形并發(fā)癥相關(guān)的壓力施加在周圍神經(jīng)，能造成髓磷脂損害，這在很多疾病例如腕管綜合征中發(fā)現(xiàn)。軸突橫切產(chǎn)生某些現(xiàn)象，例如受損神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞死亡、軸突傳導(dǎo)速度下降、神經(jīng)元傳遞素水平改變。壓迫損傷可以再生，這是與神經(jīng)病變狀態(tài)有關(guān)的另一種令人感興趣的過程(McMahon和Priestley，1995)。
細(xì)胞神經(jīng)生物學(xué)的一個(gè)基本問題是受損或發(fā)病后神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)。功能性神經(jīng)再生不僅要求軸突發(fā)芽和延長，而且要求有新的髓磷脂合成。髓鞘再生對正常神經(jīng)傳導(dǎo)恢復(fù)和保護(hù)軸突免受新的神經(jīng)退化性免疫攻擊是必要的。對神經(jīng)退化性疾病進(jìn)行研究的主要目的是最終研究出一些干預(yù)措施，防止神經(jīng)元死亡，維持神經(jīng)元表型以及修復(fù)神經(jīng)元和髓磷脂損害。許多研究都著重于闡明負(fù)責(zé)橫切的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元完全再生的分子和細(xì)胞機(jī)制(Fawcett和Keynes，1990；Funakosh等人，1993)。受傷誘導(dǎo)的神經(jīng)營養(yǎng)因子和相應(yīng)受體的表達(dá)在神經(jīng)再生能力中發(fā)揮重要作用。過去的研究表明，利用各種肽和非肽化合物，例如胰島素樣生長因子(IGF-1)、ACTH(Lewis等人，1993；Strand等人，1993)、睪丸激素、SR 57746A(Fournier等人，1993)以及4-甲基兒茶酚(Hanaoka等人，1992；Kaechi等人，1993)能明顯改善神經(jīng)再生。
凝聚素是一種胞外蛋白質(zhì)，也稱載脂蛋白J、SGP-2、TRPM-2和SP-40，40。它幾乎遍布在組織中，根據(jù)純化來源而命名，它有很多名稱(綜述見Trougakos和Gonos(Trougakos和Gonos，2002)，Jones和Jomary(Jones和Jomary，2002))。盡管它遍在表達(dá)，在血清中也相對多(100μg/ml)，但仍不知道凝聚素的真正功能。有人提出凝聚素的一些生物功能，其中包括通過與C9補(bǔ)體結(jié)合來抑制互補(bǔ)級聯(lián)的能力(Tschopp等人，1993)，促編程性細(xì)胞死亡活性或抗編程性細(xì)胞死亡活性，視乎所研究的動物模型(Han等人，2001；Wehrli等人，2001)，限制進(jìn)展，最近發(fā)現(xiàn)能夠限制陪伴蛋白性質(zhì)(Poon等人，1993)。也有人提出凝聚素在阿爾茨海默病中具有神經(jīng)保護(hù)作用(Giannakopoulos等人1998)。它的主要形式是由單一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的75-80kDa異二聚體。然后，通過蛋白水解切割多肽鏈，除去22-mer分泌信號肽，再在殘基227/228之間產(chǎn)生兩條鏈α和β，這兩條鏈由每條鏈中央的5個(gè)半胱氨酸鍵裝配。此多肽也含有糖基化位點(diǎn)和核定位信號序列。它的降解似乎受內(nèi)吞受體gp330/megalin/LRP2介導(dǎo)，此受體是低密度脂蛋白質(zhì)受體家族成員(Kounnas等人，1995)。
肝素指酸性高的粘多糖，由等份量的硫酸化D-葡糖胺和D-葡糖醛酸(其間為氨基磺酸橋)形成。分子量范圍在6000至20000之間。肝素存在于脊椎動物的肝、肺、肥大細(xì)胞內(nèi)，可從這些器官和細(xì)胞獲得。它的功能尚未清楚，但可用于體內(nèi)外防止血液凝結(jié)，以多種不同的鹽形式存在(Medical SubiectHeadings(MESH)，http//www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html)。使用肝素鈉(商品名為Lipo-Hepin和Liquaemin)來治療血栓癥。
也存在低分子量肝素(LMWH)、肝素片段。它們的分子量一般在4000至6000kD之間。這些低分子量片段是有效的抗血栓形成藥物。給予它們可以減少出血風(fēng)險(xiǎn)，它們的半衰期長。而且，與未分化肝素相比，它們與血小板的相互作用減弱。它們也能有效地預(yù)防術(shù)后主要肺栓塞(Medical SubjectHeadings(MESH)，http//www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html)。LMWH可以是例如那屈肝素(nadroparin)、N-乙?；嗡?、阿地肝素(ardeparin)、、舍托肝素(certoparin)、達(dá)肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、瑞肝素(reviparin)，亭扎肝素(tinzaparin)。
其它肝素包括類肝素。它們是天然存在的和合成的具有類似結(jié)構(gòu)的高度硫酸化多糖。類肝素制劑，例如達(dá)那肝素鈉，已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用，包括抗凝血劑和抗炎劑，據(jù)稱它們具有降血脂的性質(zhì)(Martindale，The ExtraPharmacopoeia，30th，p232)。
干擾素是一類具有抗炎、抗病毒和抗增殖活性的細(xì)胞因子。根據(jù)其生物化學(xué)和免疫學(xué)特性，天然人干擾素可以分為三類干擾素α(白細(xì)胞型)、干擾素β(成纖維細(xì)胞型)和干擾素γ(免疫型)。α干擾素現(xiàn)在在美國及其它國家已被批準(zhǔn)用于治療毛細(xì)胞白血病、性病疣、卡波西肉瘤(一種惡性腫瘤，常見于獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)病人)和慢性非A、非B型肝炎。
干擾素還是肌體應(yīng)對病毒感染而產(chǎn)生的一種糖蛋白?？梢砸种撇《驹诒槐Ｗo(hù)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。干擾素是由低分子量組成的蛋白質(zhì)，其作用是非特異性的，也就是一種病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素可以有效地對抗多種其它病毒的感染。但是干擾素也有特異性的，也就一個(gè)物種產(chǎn)生的干擾素只能在同種或近似物種的細(xì)胞內(nèi)刺激產(chǎn)生抗病毒活性。干擾素是第一組被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤和抗病毒活性的細(xì)胞因子。
三類主要的干擾素被稱為干擾素α、干擾素β和干擾素γ。這些主要種類的劃分最初是根據(jù)其細(xì)胞來源(白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或T細(xì)胞)。但是現(xiàn)在越來越清楚地顯示一種細(xì)胞可以產(chǎn)生幾種類型的干擾素。因此，白細(xì)胞干擾素現(xiàn)在被稱為干擾素α，成纖維細(xì)胞干擾素被稱為干擾素β，T細(xì)胞干擾素被稱為干擾素γ。干擾素還有第四種類型，淋巴漿細(xì)胞型干擾素，是由“Namalwa”細(xì)胞系產(chǎn)生的(來源于Burkitt’s淋巴瘤)，該細(xì)胞好象能產(chǎn)生白細(xì)胞型干擾和成纖維細(xì)胞型干擾素的混合物。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，干擾素的一個(gè)活性單位被定義為(有些武斷的)為能保護(hù)50％的細(xì)胞免受病毒損害所需要的量。
每一類干擾素又包括幾種不同的亞型。干擾素β和干擾素γ是單基因產(chǎn)物。每一類之間的差別主要在于其糖基化的不同。
干擾素α包括的亞類最多，大約有15個(gè)。9號染色體上有一簇干擾素α基因，至少含有23個(gè)成員，其中15個(gè)是有活性的，可以被轉(zhuǎn)錄。成熟的干擾素α是沒有糖基化的。
干擾素α和干擾素β具有相同的長度(165或166個(gè)氨基酸)及相似的生物學(xué)活性。干擾素γ含有146個(gè)氨基酸，與干擾素α和干擾素β的相似程度較低。只有干擾素γ能活化巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的成熟。效果上這些新的治療藥物被稱為生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)，因?yàn)樗鼈冊谟袡C(jī)體內(nèi)對腫瘤的反應(yīng)過程中發(fā)揮效應(yīng)，通過免疫調(diào)節(jié)影響肌體對腫瘤細(xì)胞的識別。
特別是人成纖維細(xì)胞型干擾素(干擾素β，即IFN-β)具有抗病毒活性，能夠刺激天然殺傷細(xì)胞對抗惡性腫瘤細(xì)胞。它是一種由病毒和雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量大約為20,000 Da的多肽。根據(jù)成纖維細(xì)胞型干擾素基因的核苷酸序列，通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行克隆，Derynck等人(Derynck等人，1980)推算出該蛋白的完整氨基酸序列。它是一個(gè)長166個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
Shepard等人(Shepard等人，1981)描述了了一個(gè)在842位堿基突變的突變體(141位氨基酸由Cys變成Tyr)，該突變體的抗病毒活性消失，還描述了一個(gè)1119-1121位核苷酸缺失的突變克隆。
Mark等人(Mark等人，1984)通過將469位的T替換成A插入了一個(gè)人工突變，使17位的氨基酸由Cys變成Ser。所得到的IFN-β的活性與天然IFN-β一樣，并且在-70℃條件下長期儲存更穩(wěn)定。
IFN發(fā)揮作用的機(jī)制還不是完全清楚。但是在大多數(shù)情況下它們是通過影響某些特定基因的誘導(dǎo)與表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用的。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFN能夠誘導(dǎo)或抑制大約20種基因產(chǎn)物。
骨橋素(OPN)是一種高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齒礦化的細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分。OPN的特征是具有多聚天冬氨酸序列和介導(dǎo)羥磷灰石結(jié)合的Ser/Thr磷酸化位點(diǎn)，以及具有一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞粘附和信號傳導(dǎo)的高度保守性RGD基序。骨橋素抑制劑據(jù)說可用于治療感染、免疫失調(diào)和疾病、自身免疫疾病包括MS、各種免疫缺陷以及癌癥(WO00/63241)。WO02/92122要求保護(hù)骨橋素或骨橋素活性激動劑在制備治療或預(yù)備神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
Bonnard A等人觀察到大鼠坐骨神經(jīng)壓迫后受傷部位凝聚素mRNA表達(dá)上升(Bonnard等人，1997)。
迄今為止，本技術(shù)領(lǐng)域仍未有考慮用凝聚素治療周圍神經(jīng)疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的新方法。
本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)凝聚素在周圍神經(jīng)病變的動物模型中有積極的治療效果。
因此，本發(fā)明涉及凝聚素或凝聚素活性激動劑用于周圍神經(jīng)疾病如周圍神經(jīng)疾病(PNS)的創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷，以及周圍神經(jīng)病變的用途。
利用核酸分子、含有凝聚素的表達(dá)載體以及表達(dá)凝聚素的細(xì)胞在治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病中的用途也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還提供含有凝聚素和肝素或干擾素或骨橋素，可選擇地添加一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明第二方面，也可以利用凝聚素與肝素、干擾素或骨橋素的組合來治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病。


圖1用示意圖描述了凝聚素的結(jié)構(gòu)(根據(jù)Rosenberg和Silkensen，1995)。(A)是前體多肽，(B)代表成熟多肽，它是一個(gè)75-80kDa的異二聚糖蛋白，由α(34-36kDa)和β(36-39kDa)鏈形成，此兩條鏈通過靠近它們中央的5個(gè)二硫鍵反平行方式連接，(C)顯示人凝聚素前體的序列。
圖2所示為腹腔給予載體(空心圓)、300μg/kg小鼠凝聚素(實(shí)心三角形)或1mg/kg小鼠凝聚素(實(shí)心棱形)處理坐骨神經(jīng)壓迫誘導(dǎo)的神經(jīng)病變小鼠的體重，以克(g)計(jì)。對照健康小鼠(實(shí)心方形)。
圖3所示為腹腔給予載體、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素、皮下給予0.01μg/kg陽性對照化合物(4-甲基兒茶酚)或100μg/kg骨橋素處理的神經(jīng)病變小鼠中復(fù)合肌肉動作電位的幅度，以毫伏(mV)計(jì)。對照假手術(shù)小鼠。
圖4所示為腹腔給予載體、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素、皮下給予0.01μg/kg陽性對照化合物(4-甲基兒茶酚)或100μg/kg骨橋素處理的神經(jīng)病變小鼠中復(fù)合肌肉動作電位的潛伏期，以毫秒(ms)計(jì)。對照假手術(shù)小鼠。
圖5所示為腹腔給予載體、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素、皮下給予0.01μg/kg陽性對照化合物(4-甲基兒茶酚)或100μg/kg骨橋素處理的神經(jīng)病變小鼠中復(fù)合肌肉動作電位的持續(xù)時(shí)間，以毫秒(ms)計(jì)。對照假手術(shù)小鼠。
圖6所示為腹腔給予載體、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素處理的神經(jīng)病變小鼠中變性纖維的百分率。對照假手術(shù)小鼠。
圖7所示為腹腔給予載體、300μg/kg或1mg/kg小鼠凝聚素處理的神經(jīng)病變小鼠中非變性纖維的百分率。對照假手術(shù)小鼠。
圖8所示為皮下給予載體、100μg/kg、300μg/kg或1000μg/kg重組人凝聚素以及皮下給予30μg/kg陽性對照化合物(重組人IL-6)處理的神經(jīng)病變小鼠中復(fù)合肌肉動作電位的幅度，以毫伏(mV)計(jì)。在坐骨神經(jīng)損傷后1、2、3或4周后進(jìn)行記錄。數(shù)據(jù)以平均總幅度(mV)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；n＝6(每組)。#p＜0.01，*p＜0.05，**p＜0.01。
圖9所示為皮下給予四周載體、30μg/kg重組人IL-6或100μg/kg、300μg/kg或1000μg/kg重組人凝聚素處理的神經(jīng)病變小鼠中對側(cè)(a)和同側(cè)(b)腓腸肌的每毫克蛋白質(zhì)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性(cpm，每分鐘計(jì)數(shù))，以cpm/μg蛋白質(zhì)計(jì)。n＝6(每組)。#p＜0.1。
圖10所示為皮下給予載體、30μg/kg重組人IL-6或100μg/kg、300μg/kg或1000μg/kg重組人凝聚素后四周，(a)對側(cè)坐骨神經(jīng)、(b)同側(cè)坐骨神經(jīng)的近端部分(壓迫上部)和(c)同側(cè)坐骨神經(jīng)的遠(yuǎn)端部分(壓迫下部)的每毫克蛋白質(zhì)所含神經(jīng)細(xì)絲-高分子量形式(NF-H)的含量(納克)，以ng NF-H/mg蛋白質(zhì)計(jì)。n＝6只小鼠(每組)。**p＜0.01。
圖11所示為在處理第3、6和10日(T3、T6和T10，對應(yīng)于體外第10、13和17日(DIV))用1μg/ml重組小鼠凝聚素處理器官型海馬趾切片，其每毫克蛋白質(zhì)所含髓磷脂堿性蛋白(MBP)的含量(皮克)，以pg MBP/μg總蛋白質(zhì)計(jì)。對照組接受正常培養(yǎng)基(50％MEM、25％HBSS、25％馬血清)。使用由HEK或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝聚素獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。數(shù)據(jù)以平均總MBP±標(biāo)準(zhǔn)差表示；exp＝2，n＝6(每組)。n＝12只小鼠(每組)。p＜0.001***。
圖12所示為以抗-MOG(抗髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白)抗體與補(bǔ)體(IgG抗-MOG+補(bǔ)體)聯(lián)合或者以匹配免疫球蛋白IgG的不相關(guān)同種型與補(bǔ)體(IgG對照+補(bǔ)體)聯(lián)合誘導(dǎo)特異性脫髓鞘后，用10、100和1000ng/ml重組小鼠凝聚素處理器官型海馬趾切片，其每毫克蛋白質(zhì)所含髓磷脂堿性蛋白(MBP)的含量(皮克)，以pg MBP/μg總蛋白質(zhì)計(jì)。作為對照，未作任何處理的一組接受正常培養(yǎng)基(50％MEM、25％HBSS、25％馬血清)。在第21日(DIV，體外第21日)給予小鼠凝聚素，即施加抗體之前24小時(shí)和處理時(shí)。exp＝3，n＝15(每組)。n＝6只小鼠(每組)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
使用由HEK或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝聚素獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
圖13所示為在肝素存在(7500U/kg)或不存在下，靜脈注射重組人凝聚素(300μg/kg)后5或30分鐘，通過ELISA試驗(yàn)檢測到的在血清中的人凝聚素濃度(ng/ml)。
A.先給予肝素，5分鐘后再給予凝聚素(先注射肝素再注射凝聚素)或者同時(shí)給予肝素和凝聚素(凝聚素與肝素混合)。對照小鼠單獨(dú)注射凝聚素，血液收集在試管+/-肝素內(nèi)(凝聚素被收集在肝素內(nèi))。n＝每組3只小鼠。***p＜0.005。
B.收集血液之前給予肝素(7500U/kg)的作用。第1組先給予肝素，5分鐘后再給予凝聚素(1mg/kg)。第2組給予凝聚素(1mg/kg)之后28分鐘注射入肝素。第3組單獨(dú)給予凝聚素(1mg/kg)。a針對第1組進(jìn)行的Anova單因素檢驗(yàn)。b針對第2組進(jìn)行的Anova單因素檢驗(yàn)。N＝每組4只小鼠。#p＜0.1，*p＜0.05，**p＜0.01。給予N-乙?；嗡孬@得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的基礎(chǔ)在于發(fā)現(xiàn)給予凝聚素在周圍神經(jīng)疾病的體內(nèi)動物模型中有積極的治療效果。在一個(gè)坐骨神經(jīng)壓迫誘導(dǎo)的神經(jīng)病變小鼠模型中，凝聚素對與神經(jīng)再生、完整性和生命力有關(guān)的全部生理和形態(tài)參數(shù)都有顯著的療效。
因此，本發(fā)明涉及凝聚素、其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、循環(huán)變換衍生物或其鹽，或者凝聚素活性激動劑在制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
本文中的術(shù)語“凝聚素”是指全長成熟人凝聚素，或任何凝聚素亞型，或其片段。人凝聚素的序列在本文中用附加序列表中的SEQ ID NO1和附圖中的圖1表示。本文中的術(shù)語“凝聚素”還表示任何動物來源的凝聚素，如小鼠、牛、豬、貓或綿羊凝聚素，只要其序列足以維持其凝聚素活性，以及得到的分子在人體內(nèi)無免疫原性。
本文中的術(shù)語“凝聚素”還表示具有生物活性的突變蛋白和蛋白片段，如凝聚素的天然亞型α和β。
本文中的術(shù)語“凝聚素”還包括同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或片段、循環(huán)變換衍生物或其鹽。這些同種型、突變蛋白、融合蛋白或功能性衍生物、活性部分或片段、或循環(huán)變換衍生物保持了凝聚素的生物活性。較好的是其生物活性與野生型凝聚素的一樣。
本文中的術(shù)語“凝聚素活性激動劑”是指能刺激或模仿凝聚素活性的分子，如凝聚素受體的拮抗性抗體，或能通過凝聚素受體激活信號的小分子激動劑。凝聚素受體可以是例如gp330/megalin/LRP2(Kounnas等人，1995)。這些受體的任何激動劑、刺激因子或增強(qiáng)因子都包括在本文所用的術(shù)語“凝聚素活性激動劑”的范圍之內(nèi)。
本文中的術(shù)語“凝聚素活性激動劑”還指能增強(qiáng)凝聚素所介導(dǎo)活性的因子，如模仿凝聚素活性的小分子化合物。
本文所用的術(shù)語“預(yù)防”和“治療”應(yīng)該理解為阻止、抑制、減輕、改善或逆轉(zhuǎn)周圍神經(jīng)疾病的一種或多種癥狀或病因，或者周圍神經(jīng)疾病所導(dǎo)致的癥狀、疾病或并發(fā)癥。當(dāng)“治療”周圍神經(jīng)疾病時(shí)，在疾病開始后給予本發(fā)明的物質(zhì)，而“預(yù)防”是指在病人出現(xiàn)癥狀前給予本發(fā)明的物質(zhì)。
本文所用的術(shù)語“周圍神經(jīng)疾病”包括所有已知的周圍神經(jīng)疾病或障礙，或者周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，包括本發(fā)明背景部分所詳細(xì)描述的那些疾病。
周圍神經(jīng)疾病包括與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)障礙有關(guān)的疾病，如與神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)的疾病、神經(jīng)創(chuàng)傷、PNS感染、PNS脫髓鞘疾病或PNS神經(jīng)病變。
較好地，本發(fā)明的周圍神經(jīng)疾病選自下列疾病周圍神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病以及周圍神經(jīng)退化性疾病和周圍神經(jīng)病變。
創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷可以涉及上述本發(fā)明背景部分所詳細(xì)描述的PNS。
周圍神經(jīng)病變可以是一種綜合征，包括感覺喪失、肌無力和肌萎縮、深度腱反射減弱、血管舒張癥狀的一種或幾種癥狀的綜合。它們可能由酒精中毒、糖尿病或化療所引致。
神經(jīng)病變可以影響單個(gè)神經(jīng)(單一神經(jīng)病變)，兩或多個(gè)分離區(qū)域的神經(jīng)(多發(fā)性單一神經(jīng)病變)或多個(gè)神經(jīng)同時(shí)受影響(多神經(jīng)病變)。受影響的可能主要是軸突(如糖尿病、萊姆病、或尿毒癥或毒性藥物引起的疾病)，或者是髓鞘或施萬細(xì)胞(如急性或慢性感染性多神經(jīng)病變、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、或格-巴綜合征)。按照本發(fā)明的方法還可以治療由下列原因引起的神經(jīng)病變鉛中毒、氨苯砜的使用、蜱咬、卟啉病或格-巴綜合征，這些疾病可能主要影響運(yùn)動纖維。其它的如由于腫瘤引起的背根神經(jīng)節(jié)炎、痳瘋病、AIDS、糖尿病、或慢性維生素B6中毒引起的疾病可能影響背根神經(jīng)節(jié)或感覺纖維，導(dǎo)致感覺障礙。顱側(cè)神經(jīng)也可能受到影響，如格-巴綜合征，萊姆病、糖尿病、以及白喉。
其它的周圍神經(jīng)疾病還有異常髓鞘化引起的神經(jīng)病變，如上面發(fā)明背景中所列出的那種，以及腕管綜合征。脊柱矯形并發(fā)癥可能會伴有創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷，這些損傷也在本發(fā)明所包括的范圍之內(nèi)。
周圍神經(jīng)疾病還可以是由先天性代謝障礙引起的。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式就描述了這種由先天性代謝缺損引起的周圍神經(jīng)疾病。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，周圍神經(jīng)疾病是指周圍神經(jīng)病變，最優(yōu)選的是糖尿病性神經(jīng)病變。與化療相關(guān)的神經(jīng)病變也是本發(fā)明所優(yōu)選的。
術(shù)語“糖尿病性神經(jīng)病變”是指糖尿病性神經(jīng)病變的任何形式，或者指糖尿病性神經(jīng)病變伴隨的或由其引起的一種或多種癥狀或障礙，或者指上述發(fā)明背景中所詳細(xì)描述的影響神經(jīng)的糖尿病并發(fā)癥。糖尿病性神經(jīng)病變可以是多神經(jīng)病變。在糖尿病性多神經(jīng)病變中，許多神經(jīng)同時(shí)受損。糖尿病性神經(jīng)病變也可以是單一神經(jīng)病變。例如在局部單一神經(jīng)病變中疾病只累及單個(gè)神經(jīng)，如動眼神經(jīng)或外展腦神經(jīng)。如果是不同區(qū)域的兩個(gè)或多個(gè)神經(jīng)受損，也可以是多發(fā)性單一神經(jīng)病變。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，周圍神經(jīng)疾病是指周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病。脫髓鞘疾病包括例如慢性炎癥性脫髓鞘疾病多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病變(CIDP)及急性單相疾病如炎癥性脫髓鞘疾病多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病變，也叫格-巴綜合征(GBS)。
優(yōu)選的凝聚素選自下列肽、多肽或蛋白a)含有SEQ ID NO1的多肽；b)含有SEQ ID NO1的23到449氨基酸的多肽；c)含有SEQ ID NO1的35到449氨基酸的多肽；d)含有SEQ ID NO1的23到227氨基酸的多肽；e)含有SEQ ID NO1的35到227氨基酸的多肽；f)含有SEQ ID NO1的228到449氨基酸的多肽；g)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中的氨基酸序列與(a)到(f)中至少一個(gè)序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；h)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼(a)到(f)任何一個(gè)的天然DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；i)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一個(gè)的氨基酸；j)(a)到(f)的任何一個(gè)鹽或同種型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。
活性部分或片段可以指凝聚素的任一部分或區(qū)域，如分隔的但相互連接的α鏈和β鏈，連接手段可以是例如通過二硫鍵直接融合或通過適當(dāng)接頭融合?；钚圆糠诌€包括不同形式糖基化或唾液酸化的凝聚素。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，即使凝聚素的一小部分或其兩個(gè)亞型也能足以維持其功能，例如含有維持凝聚素功能所需的必須氨基酸殘基的活性肽。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，凝聚素的突變蛋白、鹽、同種型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、循環(huán)變換衍生物保留了與凝聚素相似、甚至更好的生物活性。凝聚素及其突變蛋白、同種型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或片段、循環(huán)變換衍生物或鹽可以用共培養(yǎng)分析方法檢測。
優(yōu)選的活性片段是具有與全長凝聚素一樣或更好活性的片段，或者還有其它的優(yōu)點(diǎn)，如更好的穩(wěn)定性或更低的毒性或免疫原性，或者易于大量制備，或易于純化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該懂得，突變蛋白、活性部分和功能性衍生物可以通過在適當(dāng)質(zhì)粒中插入相應(yīng)cDNA的克隆技術(shù)來制備，并且能用上述的共培養(yǎng)分析方法檢測。
本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)可以糖基化或非糖基化，它們可來自天然資源如體液，或者它們最好是重組產(chǎn)生的。重組表達(dá)可以在原核生物表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌中進(jìn)行，或者在真核生物例如昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行，優(yōu)選在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，如CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“突變蛋白”指凝聚素的同類物，其中天然凝聚素的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所取代，或缺失，或者凝聚素的天然序列中加入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，但所產(chǎn)生的產(chǎn)物的活性與野生型凝聚素相比無顯著降低。這些突變型蛋白可用已知的合成和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)，或任何適合的其它已知技術(shù)制備。
按照本發(fā)明的方法能夠使用的凝聚素突變蛋白或編碼這些突變蛋白的核酸包括一組有限的基本上一致的序列作為替代多肽或多核苷酸，這些多肽或多核苷酸可以按照本文提供的指導(dǎo)不需過度的實(shí)驗(yàn)通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)制備。
本發(fā)明的突變蛋白包括由核酸如DNA或RNA編碼的蛋白質(zhì)，所述的核酸在溫和或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼本發(fā)明的凝聚素的DNA或RNA雜交。術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指雜交和隨后的洗滌條件，這些條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)所指“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹睏l件。參見上述文獻(xiàn)Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，Interscience，N.Y，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，F(xiàn)ritsh，E.F.，和Maniatis，T.(1989)，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。
沒有限制作用的嚴(yán)謹(jǐn)條件的例子包括以下洗滌條件例如在比研究中計(jì)算的雜交溫度Tm低12-20℃的溫度下用2x SSC和0.5％SDS洗5分鐘，用2x SSC和0.1％SDS洗15分鐘；37℃用0.1x SSC和0.5％SDS洗30-60分鐘，然后在68℃用0.1x SSC和0.5％SDS洗30-60分鐘。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道嚴(yán)謹(jǐn)條件還取決于DNA序列的長度、寡核苷酸探針(如10-40個(gè)堿基)或混合的寡核苷酸探針。如果采用混合的探針，最好用四甲基氯化銨(TMAC)代替SSC。參見上述引用的文獻(xiàn)Ausubel，同上。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，任何這樣一種突變蛋白與所附序列表的SEQ IDNO1的序列具有至少40％同一性或同源性。更優(yōu)選具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最優(yōu)選至少90％同一性或同源性。
同一性反映兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或者兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系，通過比較這些序列而確定。通常，同一性指在所比較的序列長度上兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽序列，它們的核苷酸與核苷酸或者氨基酸與氨基酸之間的對應(yīng)是完全一樣的。
對于其對應(yīng)不是完全一樣的序列，可以確定“同一性百分比”。通常把待比較的兩個(gè)序列進(jìn)行序列對比，得出這兩個(gè)序列之間的最大相關(guān)性。這可包括在其中一個(gè)或兩個(gè)序列中插入“空格”以增加對比度。比較每一個(gè)序列的整個(gè)長度(所謂的全域性對比(global alignment))，或者比較它們的較短的限定長度(所謂的區(qū)域性對比(local alignment))，可確定同一性百分比，前者特別適合長度相等或長度差不多的序列，后者更適合長度不相等的序列。
兩個(gè)或多個(gè)序列同一性和同源性的比較方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，Wisconsin序列分析軟件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于確定兩個(gè)多核苷酸之間的同一性百分比與兩個(gè)多肽序列之間的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“區(qū)域性同源性”算法(1981)，找出兩個(gè)序列間最佳的單個(gè)相似區(qū)域。其它確定兩個(gè)序列間同一性和/或相似性的程序也已為本領(lǐng)域所知，例如BLAST程序家族(Altschul SF等人，1990，Altschul SF等人，1997，登入NCBI主頁www.ncbi.nlm.nih.gov可查詢得到)與FASTA(Pearson WR，1990，Pearson 1988)。
本發(fā)明突變蛋白中的優(yōu)選變化是稱為“保守性”取代。凝聚素多肽的保守性氨基酸取代可包括一組內(nèi)的同義氨基酸取代，同組氨基酸內(nèi)的氨基酸具有足夠相似的生理化學(xué)特性，該組成員之間的取代將保留該分子的生物功能(Grantham，1974)。顯然，在上述序列中也可進(jìn)行氨基酸的插入和缺失而不改變其功能，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸時(shí)，如30個(gè)以下，最好為10個(gè)以下，而且不除去或取代對功能性構(gòu)型起關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失和/或插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明范圍。
優(yōu)選同義氨基酸組是表1列出的那些組；更好的同義氨基酸組是表2列出的那些組；最好的同義氨基酸組是表3列出的那些組。
表1優(yōu)選同義氨基酸組氨基酸 同義組Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsn Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，LysAsp Glu，Asn，AspGlu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMet Phe，Ile，Val，Leu，MetTrp Trp表2更好的同義氨基酸組氨基酸 同義組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，Met
Pro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表3最好的同義氨基酸組氨基酸 同義組Ser SerArg ArgLeu Leu，Ile，MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile，Met，LeuPhe Phe
Tyr TyrCys Cys，SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met，Ile，LeuTrp Met在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸取代的例子可用來獲得本發(fā)明中所用的凝聚素、多肽或蛋白質(zhì)的突變蛋白，包括任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691專利中提出的方法，以及美國專利4,904,584(Shaw等人)中提出的賴氨酸取代蛋白質(zhì)。
術(shù)語“融合蛋白”指由凝聚素或其突變蛋白或片段與其它蛋白質(zhì)融合而成的多肽，這種融合蛋白在體液內(nèi)的停留時(shí)間延長。故凝聚素可與另一蛋白質(zhì)、多肽及其類似物如免疫球蛋白或其片段融合。免疫球蛋白Fc特別適用于產(chǎn)生二聚或多聚Ig融合蛋白。凝聚素的α和β鏈與免疫球蛋白某些部分相連，以此方式，凝聚素的α和β鏈與Ig Fc二聚化。
本文使用的“功能性衍生物”，包括凝聚素及其突變蛋白和融合蛋白的衍生物，它們可用本領(lǐng)域已知方法通過改變殘基的側(cè)鏈上的功能基團(tuán)或N端或C端基團(tuán)來制備。只要它們?nèi)匀辉谒帉W(xué)上可接受，即它們沒有破壞與凝聚素活性基本上相似的蛋白質(zhì)活性，并且不會使含它的組合物具有毒性，均包括在本發(fā)明中。
這些衍生物例如可以包括聚乙二醇側(cè)鏈，其可遮蔽抗原位并延長凝聚素在體液中的停留時(shí)間。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠址肿?如烷酰基或碳環(huán)芳?；?形成的N-酰基衍生物、或游離羥基(如絲氨酰或蘇氨酰殘基的游離羥基)與?；糠址肿有纬傻腛-酰基衍生物。
本發(fā)明的凝聚素、突變蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括蛋白分子或者蛋白分子與其相連的分子或殘基如糖或磷酸基的多肽鏈的任何片段或前體，或者蛋白分子或糖殘基自身的聚集物，只要所述部分具有與凝聚素基本上相似的活性。
本文所用的術(shù)語“鹽”指羧基鹽凝聚素分子或其類似物的氨基酸加成鹽。羧基鹽可通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法形成，包括無機(jī)鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等，以及有機(jī)堿鹽，例如三乙醇胺等胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包括例如無機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽或硫酸鹽，有機(jī)酸鹽，如乙酸鹽或草酸鹽。當(dāng)然，任何這樣的一種鹽必須保留與本發(fā)明有關(guān)的凝聚素的生物活性，例如，在周圍神經(jīng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用。
凝聚素的功能性衍生物可以共價(jià)連接到聚合物上以改進(jìn)該蛋白質(zhì)的性能，如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用度、人體耐受性、或免疫原性。為達(dá)到此目的，凝聚素可以連接到例如聚乙二醇(PEG)上。例如，可按WO92/13095所述的已知方法進(jìn)行聚乙二醇化。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，凝聚素是PEG化的。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白包含一個(gè)免疫球蛋白。融合可以是直接的，也可以同一個(gè)短接頭肽，可以短至1-3個(gè)氨基酸殘基或更長，如13個(gè)氨基酸殘基。所述的接頭物可以是位于凝聚素序列和免疫球蛋白序列之間的具有E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽，或者是含有Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個(gè)氨基酸的接頭序列。所產(chǎn)生的融合蛋白具有改進(jìn)的性能，如在體液的停留期(半衰期)延長，特異性增高，表達(dá)水平上升等。免疫球蛋白融合分子還有利于該融合蛋白的純化。
在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，凝聚素與Ig分子的恒定區(qū)融合。優(yōu)選與重鏈區(qū)如人IgG1的CH2和CH3區(qū)融合。Ig分子的其它同種型也適于按照本發(fā)明的方法制備融合蛋白，例如，IgG2或IgG4同種型，或其它Ig類如IgM。融合蛋白可以是單體或多聚體，異源或同源多聚體。融合蛋白中的免疫球蛋白部分可以進(jìn)一步修飾以避免激活補(bǔ)體結(jié)合或補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)，或者結(jié)合到Fc受體上。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用凝聚素和免疫抑制劑制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物，二者可以同時(shí)、先后或分開使用。免疫抑制劑可以是類固醇、氨甲蝶呤、環(huán)磷酰胺、抗白細(xì)胞抗體(如CAMPATH-1)以及類似藥物。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用凝聚素和IL-6。
已顯示，給予肝素可以大大提高凝聚素的生物利用度，因此，本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用凝聚素和肝素制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物，二者可以同時(shí)、先后或分開使用。
本文中使用的“肝素”是指本技術(shù)領(lǐng)域已知的全部肝素和類肝素，如上述“發(fā)明背景”中描述的那些，譬如低分子肝素(LMWH)。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用凝聚素和干擾素制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物，二者可以同時(shí)、先后或分開使用。
本專利申請中使用的術(shù)語“干擾素”包括文獻(xiàn)中所定義為干擾素(IFN)的任何分子，例如包括上述“發(fā)明背景”部分所提到的任何種類的IFN。優(yōu)選的是人源干擾素，但其它物種來源的干擾素也可以，只要其生物學(xué)活性與人源干擾素一樣，并且在人體內(nèi)沒有免疫原性。
特別是IFNα、IFN-β和IFN-γ都包括在上述定義中。其中IFN-β是本發(fā)明優(yōu)選的干擾素。
本發(fā)明所用的術(shù)語“干擾素-β(IFN-β)”是指人成纖維細(xì)胞干擾素，通過從生物液體分離得到或通過DNA重組技術(shù)從原核或真核宿主細(xì)胞中獲得。
也指干擾素的鹽、功能性衍生物、突變體、類似物或片段。
也可以將干擾素與聚合物結(jié)合以改進(jìn)該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，例如，WO99/55377敘述了干擾素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之間的共軛物。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，干擾素是干擾素-β(IFN-β)，更優(yōu)選是IFN-β1a。
凝聚素最好與干擾素同時(shí)、先后或分開使用。
本發(fā)明還涉及聯(lián)合使用凝聚素和骨橋素制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物，二者可以同時(shí)、先后或分開使用。
本發(fā)明所用的術(shù)語“骨橋素(osteopontin)”也包括骨橋素的突變蛋白、片段、活性部分和功能性衍生物。這些蛋白質(zhì)的描述見WO02/092122。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，凝聚素的用量大約為每千克體重0.001-100毫克，或者大約每千克體重1-10毫克，或者大約每千克體重5毫克。
本發(fā)明還涉及利用核酸分子制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物，其中核酸分子含有編碼多肽的核酸序列，該多肽含有選自以下組的氨基酸序列之一a)含有SEQ ID NO1的多肽；b)含有SEQ ID NO1的23到449氨基酸的多肽；c)含有SEQ ID NO1的35到449氨基酸的多肽；d)含有SEQ ID NO1的23到227氨基酸的多肽；e)含有SEQ ID NO1的35到227氨基酸的多肽；f)含有SEQ ID NO1的228到449氨基酸的多肽；g)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中的氨基酸序列與(a)到(f)中至少一個(gè)序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；h)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼(a)到(f)任何一個(gè)的天然DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；i)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一個(gè)的氨基酸；或者(a)到(f)的任何一個(gè)同種型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。
核酸分子可以裸核酸分子的形式通過肌肉注射給予。
它還可以包含載體序列，如病毒序列，以有利于核酸分子編碼的基因在人體內(nèi)表達(dá)，優(yōu)選在適當(dāng)細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸分子還包括表達(dá)載體。表達(dá)載體序列是本領(lǐng)域熟知的，可以包含用作表達(dá)感興趣基因的元件。它們也可以包含調(diào)節(jié)序列如啟動子和增強(qiáng)子序列、選擇標(biāo)記物序列、復(fù)制起點(diǎn)以及類似序列。因此，基因治療方法可用于疾病的治療和/或預(yù)防。比較好的是凝聚素在原位表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)載體可以通過肌肉注射給予。
利用載體誘導(dǎo)和/或增加在正常情況下凝聚素表達(dá)停止或凝聚素表達(dá)量不足的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性凝聚素的表達(dá)也是本發(fā)明所涉及的范圍。載體可含有在希望表達(dá)凝聚素的細(xì)胞內(nèi)起作用的調(diào)節(jié)序列。例如，這類調(diào)節(jié)序列可以是啟動子或增強(qiáng)子。然后，可通過同源重組將該調(diào)節(jié)序列導(dǎo)入到基因組的正確基因座中，使調(diào)節(jié)序列與基因作可操作性相連，所需要的表達(dá)即被誘導(dǎo)或被增強(qiáng)。該技術(shù)通常稱為“內(nèi)源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所敘述。
本發(fā)明還涉及利用經(jīng)過基因改造產(chǎn)生凝聚素的細(xì)胞制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物。
本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞，它經(jīng)過基因改造能產(chǎn)生凝聚素，用于制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物。因此，細(xì)胞治療方法也可用于將藥物運(yùn)送到人體的適當(dāng)位置。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，特別是用于預(yù)防和/或治療周圍神經(jīng)疾病的藥物組合物，該組合物含有治療有效量的凝聚素和治療有效量的肝素，還可以選擇添加治療有效量的免疫抑制劑。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，特別是用于預(yù)防和/或治療周圍神經(jīng)疾病的藥物組合物，該組合物含有治療有效量的凝聚素和治療有效量的干擾素，還可以選擇添加治療有效量的免疫抑制劑。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，特別是用于預(yù)防和/或治療周圍神經(jīng)疾病的藥物組合物，該組合物含有治療有效量的凝聚素和治療有效量的骨橋素，還可以選擇添加治療有效量的免疫抑制劑。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”的意思包括不會干擾活性成分的生物活性效果，并對給予的宿主無毒性的任何載體。例如，為了在腸胃外給藥，活性蛋白可以制成注射用單位劑量形式，包含在載體如鹽水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液中。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以以各種途徑給予個(gè)體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如緩釋形式)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、硬膜外、局部、鞘內(nèi)、直腸內(nèi)和鼻內(nèi)等途徑。也可采用其它有效治療途徑給藥，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收或通過基因療法將編碼活性藥物的DNA分子給予患者(如通過載體)，導(dǎo)致該活性藥物在體內(nèi)表達(dá)和分泌。此外，可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與生物活性藥物的其它組分，如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和介質(zhì)等，一起給予。
對于腸胃外(如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))給藥，可將活性蛋白質(zhì)配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉，這種凍干粉末能溶于藥學(xué)上可接受的腸胃外介質(zhì)(如水、鹽水、葡萄糖液)以及能維持等滲性(如甘露糖醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑。以常規(guī)技術(shù)給制劑滅菌。
本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)也可用共軛方法增加分子在人體內(nèi)的半衰期而改善其生物利用度。例如，如PCT專利申請WO92/13095所述那樣，使分子與聚乙二醇連接。
活性蛋白的治療有效量根據(jù)各種因素可以變化，包括蛋白質(zhì)類型、蛋白質(zhì)的親和力、拮抗劑所表現(xiàn)的殘留毒性、給藥途徑、病人的臨床狀態(tài)(包括希望所要維持的內(nèi)源性凝聚素活性的非毒性水平)。
“治療有效量”是給藥后凝聚素能對周圍神經(jīng)疾病產(chǎn)生積極療效的劑量。給藥劑量，不論是單次劑量或重復(fù)給藥劑量，都取決于各種因素，其中包括凝聚素的藥物動力學(xué)性能、給藥途徑、病人的病情和身體特征(性別、年齡、體重、健康狀況和身型大小)、癥狀輕重程度、當(dāng)前的治療措施、治療頻率和所要求的效果。
按照本發(fā)明，凝聚素的用量約為每千克體重0.001-10毫克，或約為每千克體重0.01-5毫克，或每千克體重0.1-3毫克，或每千克體重1-2毫克。更優(yōu)選凝聚素的用量約為每千克體重0.1-1000微克，或每千克體重1-100微克，或每千克體重10-50微克。
本發(fā)明優(yōu)選的給藥途徑是皮下注射，本發(fā)明更優(yōu)選的是肌內(nèi)注射。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，凝聚素每日給藥或隔日給藥。
每日劑量通常分次給藥或制成緩釋劑型以有效地獲得所希望的效果。第二次或隨后給藥可以與首次或原先給予該個(gè)體的相同劑量、小于或大于此劑量進(jìn)行?？稍诎l(fā)病時(shí)或發(fā)病前進(jìn)行第二次或隨后給藥。
根據(jù)本發(fā)明，凝聚素可以在實(shí)施有效劑量的其它治療方案或給予有效劑量的其它治療藥物(多種藥物治療方案)，特別是干擾素、同時(shí)或以后進(jìn)行預(yù)防性或治療性給藥。與其它治療藥物同時(shí)給予的活性藥物可以在一個(gè)組合物中，也可以在不同的組合物中。
本發(fā)明還涉及一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑，可以選擇性地添加藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑，以及肝素，可以選擇性地添加藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑，以及干擾素，可以選擇性地添加藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑，以及骨橋素，可以選擇性地添加藥學(xué)上可接受的載體。
本文所引用的全部文獻(xiàn)，包括期刊文章或摘要、公開或未公開的美國或外國專利申請、已授權(quán)的美國或外國專利或其它文獻(xiàn)，均納入本文參考文獻(xiàn)中。包括引用文獻(xiàn)中提供的全部數(shù)據(jù)、表格、圖形及文字。此外，本文引用文獻(xiàn)內(nèi)所引用的內(nèi)容也整體納入作為參考。
總之，參考已知的方法步驟、常規(guī)的方法步驟、已知方法或常規(guī)方法并不是承認(rèn)本發(fā)明的任何方面、敘述或?qū)嵤┓绞骄言谙嚓P(guān)技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)被包括、被指導(dǎo)或被建議。
前面對特定實(shí)施方式的描述可以全面地揭示本發(fā)明的總體特征，其他人運(yùn)用本領(lǐng)域的一般技術(shù)的常識(包括本文引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)可在無需過多的實(shí)驗(yàn)和不脫離本發(fā)明總體概念的條件下，不難對這些具體實(shí)施例的各種應(yīng)用作出改變和/或調(diào)整。所以，根據(jù)本文的說明和指引可以在所描述的實(shí)施方式等效范圍內(nèi)進(jìn)行這樣一些應(yīng)用和/或修改。很容易理解的是，本文的措辭或術(shù)語是為了描述而不具有限制性，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)按照本文的說明和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的常識來闡釋本說明的措辭或術(shù)語。
根據(jù)到目前所描述的發(fā)明內(nèi)容，可以很容易理解下面的實(shí)施例，這些實(shí)施例是以說明的方式來提供的，并不意味著對本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例實(shí)施例1凝聚素的重組表達(dá)按照以下方法在HEK細(xì)胞內(nèi)表達(dá)帶標(biāo)記的重組小鼠或重組人凝聚素用1體積冷凍緩沖液A(50mM NaH2PO4；600mM NaCl；8.7％(w/v)甘油，pH 7.5)稀釋含有帶C端標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，配至終體積200ml。樣品經(jīng)0.22μm無菌過濾器(Millipore，500ml過濾單位)過濾，于4℃保持在無菌方形培養(yǎng)瓶(Nalgene)內(nèi)。
純化是在4℃進(jìn)行，采用與自動樣品加載器(Labomatic)連接的VISION工作站(Applied Biosystems)。純化程序由兩個(gè)連續(xù)步驟組成第一步是對標(biāo)記有特異性的親和色譜法，第二步是用Sephadex G-25培養(yǎng)基(AmershamPharmacia)柱(1.0×10cm)進(jìn)行凝膠過濾。
第一步色譜法得到洗脫蛋白質(zhì)，收集到1.6ml餾分。
至于第二步色譜法，Sephadex G-25凝膠過濾柱用2ml緩沖液D(1.137MNaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mM Na2HPO4；pH7.2)再生，再用4柱體積緩沖液C(137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mMNa2HPO4；20％(w/v)甘油；pH7.4)平衡。從第一步驟親和柱洗脫出來的峰值餾分自動通過與Sephadex G-25柱連接的VISION工作站上的整合樣品加載器，蛋白質(zhì)用緩沖液C洗脫，流速為2ml/min。脫鹽后的樣品回收得到2.2ml餾分。該餾分用0.22μm無菌離心過濾器(Millipore)過濾，凍干，凍存于-80℃。取樣品的一等分試樣作SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝膠；Novex)分析，方法是用考馬斯染色和抗標(biāo)記抗體的Western blot。
考馬斯染色NuPAGE凝膠在室溫下用0.1％考馬斯藍(lán)R250染色溶液(30％甲醇，10％乙酸)染色1小時(shí)，再用20％甲醇，7.5％乙酸脫色，直至背景澄清，蛋白質(zhì)帶清晰可見。
Western blot在電泳操作后，把蛋白質(zhì)從凝膠電轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜，電轉(zhuǎn)移的條件是290mA，1小時(shí)，4℃。硝基纖維素膜用在緩沖液E(137mMNaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mM Na2HPO4；0.1％Tween 20，pH7.4)中的5％奶粉室溫封閉1小時(shí)，然后，在4℃下與2種兔多克隆抗標(biāo)記抗體(G-18和H-15，各為0.2μg/ml，Santa Cruz)與在緩沖液E中的2.5％奶粉培育過夜。室溫培養(yǎng)多1小時(shí)后，所述膜用緩沖液E(3×10分鐘)洗滌，再與第二種HRP-連接的抗兔抗體(DAKO，HRP 0399)室溫培育2小時(shí)，所述第二種抗兔抗體用含有2.5％奶粉的緩沖液E稀釋至1/3000。用緩沖液E(3×10分鐘)洗滌后，所述膜用ECL試劑盒(Amersham Pharmacia)顯影1分鐘。再將所述膜與超膜(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)接觸，目測分析western blot影像。
蛋白質(zhì)分析用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce)測定蛋白質(zhì)的濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。平均蛋白質(zhì)回收量是每100ml培養(yǎng)基回收到216μg純化凝聚素。
在非還原的SDS PAGE上對純化蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示重組蛋白質(zhì)具有天然凝聚素的異二聚結(jié)構(gòu)(未示出)。
實(shí)施例2凝聚素對小鼠坐骨神經(jīng)壓迫所誘導(dǎo)的神經(jīng)病變的保護(hù)作用縮寫CMAP 復(fù)合肌肉動作電位DAC 坐骨神經(jīng)壓迫后的天數(shù)DIV 體外天數(shù)EMG 肌電描記法IGF-1胰島素樣生長因子i.p.腹腔內(nèi)i.v.靜脈內(nèi)s.c.皮下s.e.m.均值的標(biāo)準(zhǔn)差vs對前言進(jìn)行本研究以評價(jià)用不同劑量的凝聚素處理的小鼠內(nèi)神經(jīng)再生的情況。在此模型中，凝聚素對神經(jīng)元和軸突(感覺和運(yùn)動神經(jīng)元)存活和再生，對髓鞘再生或巨噬細(xì)胞發(fā)炎有積極的作用，能導(dǎo)致運(yùn)動功能恢復(fù)。根據(jù)感覺運(yùn)動功能的恢復(fù)和形態(tài)學(xué)研究測定再生情況。所以，本研究平行進(jìn)行電生理學(xué)記錄和組織形態(tài)測量分析。
材料和方法動物采用72只8周齡的C57b1/6RJ雌性小鼠(Elevage Janvier，Le Genest-St-Isle，F(xiàn)rance)。它們共分為6組，每組12只(a)載體假手術(shù)組；(b)載體處理的神經(jīng)壓迫組；(c)神經(jīng)壓迫/小鼠凝聚素(300μg/kg)組；(d)神經(jīng)壓迫/小鼠凝聚素(1000μg/kg)組；(e)神經(jīng)壓迫/4-甲基兒茶酚(10μg/kg)組；(f)神經(jīng)壓迫/骨橋素(100μg/kg)組。骨橋素(OPN)是一種高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齒礦化的細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分。WO02092122要求保護(hù)它及其活性激動劑在制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
它們分組放在籠內(nèi)飼養(yǎng)(每個(gè)籠12只動物)，置于恒溫(21-22℃)的飼養(yǎng)室內(nèi)，白天和黑夜顛峰(12h/12h)，隨意進(jìn)食和飲水。所有操作都按照研究指導(dǎo)手冊進(jìn)行。
坐骨神經(jīng)的損傷腹腔注射60mg/kg鹽酸氨胺酮(Imalgène 500，Rhne Mérieux，Lyon，F(xiàn)rance)麻醉動物。在右大腿中部手術(shù)暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，在離其三根分叉部5mm壓迫。用止血鉗(寬1.5mm；Koenig；Strasbourg；France)夾住坐骨神經(jīng)90度旋轉(zhuǎn)壓迫兩次，每次30秒。
實(shí)驗(yàn)方案和藥理治療在手術(shù)前記錄一次肌電圖(EMG)(作為基線)，手術(shù)后2周內(nèi)每周再記錄一次肌電圖。
神經(jīng)壓迫手術(shù)的當(dāng)天為0日(D)。手術(shù)后4天內(nèi)不再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
每天記錄動物體重和存活率。
從神經(jīng)受損當(dāng)天起直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日腹腔內(nèi)(i.p)給予小鼠凝聚素(HEK細(xì)胞的重組小鼠凝聚素)或4-甲基兒茶酚，而骨橋素則通過皮下(s.c.)途徑每日給予。
在第2周每組處死4只動物，分離坐骨神經(jīng)作形態(tài)分析。
電生理記錄用Neuromatic 2000M電生理記錄儀(EMG)(Dantec，Les Ulis，F(xiàn)rance)記錄電生理信號。小鼠腹腔內(nèi)注射100mg/kg鹽酸氯胺酮(Imalgene 500，Rhne Mérieux，Lyon，F(xiàn)rance)使之麻醉。用加熱燈加熱使其維持正常的30℃體溫，在尾巴上放置一個(gè)接觸式溫度計(jì)(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，F(xiàn)rance)控制溫度。
以超極限強(qiáng)度(12.8mA)的電流給予坐骨神經(jīng)一個(gè)0.2ms的刺激后測量腓腸肌的復(fù)合肌肉動作電位(CMAP)。記錄動作電位的幅度(mV)、潛伏期(ms)和持續(xù)時(shí)間(去極化和復(fù)極化所需要的時(shí)間)。幅度是反映活性運(yùn)動單位數(shù)目的指標(biāo)，而遠(yuǎn)端潛伏期間接反映了運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)和神經(jīng)肌肉傳遞速率。
形態(tài)學(xué)分析壓迫神經(jīng)后2周進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。每組隨機(jī)選取4只動物用于本實(shí)驗(yàn)。小鼠腹腔內(nèi)注射100mg/kg Imalgène 500使之麻醉。取5mm的坐骨神經(jīng)片段用于組織學(xué)分析。組織用溶于磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中的4％戊二醛水溶液(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，F(xiàn)rance)固定過夜，戊二醛水溶液使用前保存在30％蔗糖中，于4℃儲存。神經(jīng)在磷酸緩沖液溶解的2％四氧化鋨(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，F(xiàn)rance)固定2小時(shí)，然后用一系列乙醇溶液脫水，再用環(huán)氧樹脂包被。包被的組織置于70℃使之聚合3天。用切片機(jī)切出1.5μm的橫切面，用1％甲苯胺藍(lán)(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，F(xiàn)rance)染色2分鐘，脫水后置于Eukitt上。在壓迫位置中部獲得橫切面。用半自動數(shù)碼影像分析軟件(Biocom，F(xiàn)rance)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和計(jì)算纖維數(shù)量。分析變性和非變性有髓鞘纖維的比例。帶有多小葉軸漿和/或不規(guī)則髓鞘的有髓鞘纖維是正經(jīng)歷變性過程的纖維。計(jì)算下列參數(shù)軸突面積、髓磷脂面積以及纖維面積(軸突和髓磷脂面積)。
數(shù)據(jù)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行Global分析時(shí)用一種因素或重復(fù)測量方差的分析(ANOVA)以及用單向ANOVA和非-參數(shù)檢驗(yàn)(Mann Whitney檢驗(yàn))。適當(dāng)時(shí)可進(jìn)一步進(jìn)行Dunnett’s檢驗(yàn)。顯著性差異的水平設(shè)定為p＜0.05。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(s.e.m.)來表示。
結(jié)果經(jīng)神經(jīng)壓迫處理后所有的動物都存活下來。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，有幾只小鼠死亡小鼠n°8(神經(jīng)壓迫/骨橋素組)和小鼠n°12(神經(jīng)壓迫/小鼠凝聚素(1mg/kg)組)死于第2天；小鼠n°9(神經(jīng)壓迫/載體組)和小鼠n°9(神經(jīng)壓迫/小鼠凝聚素(1mg/kg)組)死于第7天，死亡是由麻醉造成的。
動物體重如圖2所示，所有動物的體重在手術(shù)后2-3天內(nèi)有輕微上升。動物體重的恢復(fù)是漸進(jìn)的。以凝聚素作不同處理，不會導(dǎo)致坐骨神經(jīng)受壓迫的小鼠的體重與未處理小鼠有明顯改變。
電生理學(xué)檢測復(fù)合肌肉動作電位的幅度(圖3)整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組動物的CMAP幅度無顯著變化。相反，坐骨神經(jīng)壓迫誘導(dǎo)的CMAP幅度大大下降，在第7天和第14天，與假手術(shù)組動物各水平相比下降超過90％。當(dāng)坐骨神經(jīng)壓迫小鼠用300μg/kg或1mg/kg凝聚素或者100μg/kg骨橋素處理后，它們的CMAP幅度與未處理小鼠的水平相比顯著升高(約1.5倍)。類似地，用4-甲基兒茶酚處理也可使坐骨神經(jīng)壓迫小鼠的CMAP幅度升高，但與凝聚素或者骨橋素相比其升幅較小。
復(fù)合肌肉動作電位的潛伏期(圖4)整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組動物的CMAP潛伏期沒有變差。與之相反，坐骨神經(jīng)壓迫組小鼠的CMAP潛伏期比假手術(shù)組動物延長1.2倍。用凝聚素或者骨橋素處理坐骨神經(jīng)壓迫組的小鼠，它們的CMAP潛伏期與任一只未處理小鼠相比顯著縮短。第7天，0.3mg/kg凝聚素和0.1mg/kg骨橋素處理后觀察到動物表現(xiàn)出這種效果。第14天，凝聚素的兩種濃度也表現(xiàn)出是有效的。
復(fù)合肌肉動作電位的持續(xù)時(shí)間(圖5)假手術(shù)組動物的CMAP持續(xù)時(shí)間與基線值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相反，坐骨神經(jīng)壓迫組小鼠的CMAP持續(xù)時(shí)間顯著延長，特別是在第14天，CMAP持續(xù)時(shí)間比假手術(shù)組動物延長3倍。
當(dāng)坐骨神經(jīng)壓迫組小鼠用300μg/kg凝聚素或者骨橋素處理后，它們的CMAP持續(xù)時(shí)間與用載體處理的坐骨神經(jīng)壓迫小鼠相比顯著縮短。
形態(tài)學(xué)分析在第14天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
變性(圖6)和非變性纖維(圖7)的百分率如圖6所示，假手術(shù)組動物(對照)坐骨神經(jīng)的變性纖維百分率＜20％。當(dāng)坐骨神經(jīng)受到壓迫，變性纖維的百分率顯著增加至60％(神經(jīng)壓迫/載體)。小鼠用300μg/kg或1mg/kg凝聚素處理后，其變性纖維百分率與未處理組相比顯著降低。
相反地，假手術(shù)組動物(對照)的非變性纖維百分率比未經(jīng)處理的坐骨神經(jīng)壓迫組小鼠(神經(jīng)壓迫/載體)高2倍(圖7)。小鼠用300μg/kg或1mg/kg凝聚素處理后，其非變性纖維的密度有明顯增加。
結(jié)論通過神經(jīng)壓迫可以造成很好的周圍神經(jīng)病變模型。神經(jīng)被壓迫后大多數(shù)大直徑的神經(jīng)纖維立刻就會失去功能，由于機(jī)械損傷其CMAP幅度顯著下降。CMAP潛伏期不會立刻受到影響，但是在14天時(shí)會延長，這是由于受次級的免疫介導(dǎo)的變性作用(巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞)影響小直徑纖維出現(xiàn)變性。CMAP持續(xù)時(shí)間在第7天時(shí)開始延長，14天達(dá)到高峰。第21天(未示出)，壓迫所造成的損傷得以恢復(fù)，這是另一個(gè)與神經(jīng)病變狀態(tài)有關(guān)的感興趣的過程。
凝聚素對神經(jīng)壓迫模型鼠的所有測量參數(shù)具有保護(hù)作用。壓迫后2周的形態(tài)學(xué)分析表明變性纖維的百分率顯著降低，總纖維數(shù)顯著增加。凝聚素作為一個(gè)對照分子用在本實(shí)驗(yàn)中被證明是有效的，4-甲基兒茶酚對功能性或組織學(xué)指標(biāo)無任何有顯著意義的影響。這種對功能性或組織學(xué)指標(biāo)的正效應(yīng)是由于凝聚素具有以下效應(yīng)-直接保護(hù)纖維免受次級免疫介導(dǎo)變性損傷的影響；-加速髓鞘再生和保護(hù)軸突；-加速受損軸突的再生/發(fā)芽；-促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除髓磷脂碎片；
-調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對軸突橫切的應(yīng)答。
實(shí)施例3坐骨神經(jīng)受壓迫后皮下給予凝聚素加速功能恢復(fù)前言為了研究凝聚素處理對神經(jīng)再生的長期影響，第2組動物連續(xù)4周每日(5次/周，皮下給予)被給予HEK細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝聚素進(jìn)行處理。
材料和方法將小鼠分為6組，每組6只動物，各組的處理方案如下(a)載體處理的神經(jīng)壓迫組；(b)神經(jīng)壓迫/h-IL6(30μg/kg)；(c)神經(jīng)壓迫/人凝聚素(0.1mg/kg)；(d)神經(jīng)壓迫/人凝聚素(300μg/kg)；(e)神經(jīng)壓迫/人凝聚素(1mg/kg)。
按照實(shí)施例2描述的程序進(jìn)行，除了動物接受皮下注射(100μl/鼠)HEK細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝聚素而非通過腹腔注射重組小鼠凝聚素外。載體是NaCl0.9％、BSA 0.02％。陽性對照是重組人IL-6(30μg/kg，皮下)。如上所述，評價(jià)動物電生理和體重參數(shù)。
電生理記錄以超極限強(qiáng)度(12.8mA)的電流給予坐骨神經(jīng)一個(gè)0.2ms的刺激后測量腓腸肌的復(fù)合肌肉動作電位(CMAP)。如上所述，在壓迫側(cè)(同側(cè))腓腸肌和相對側(cè)(對側(cè))腓腸肌受壓迫后第0、7、14、21和28天評價(jià)各個(gè)參數(shù)，即動作電位的幅度(mV)、潛伏期(ms)和持續(xù)時(shí)間。
膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性如實(shí)施3所述處理4周后，小鼠被麻醉并處死。收集對側(cè)和同側(cè)腓腸肌，對其分析膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性，該種活性是神經(jīng)元神經(jīng)支配的指標(biāo)。除了去掉冷凍乙酰輔酶A(acetyl-CoA)和加入對應(yīng)于0.05μCi的0.25nmol of3H-acetyl-CoA之外，根據(jù)Contreras等人(Contreras等人，1995)描述的方案測定ChAT活性。
神經(jīng)細(xì)絲-高分子量形式(NF-H)NF-H及其磷酸化形式是軸突成熟的指標(biāo)(Riederer等人，1996)。如實(shí)施3所述處理4周后，小鼠被麻醉并處死。收集神經(jīng)并用三倍去污劑緩沖液提取，加工樣品，通過蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Pierce)分析它們的蛋白質(zhì)含量，并通過夾心ELISA試驗(yàn)定量分析NF-H。
用ELISA分析NF-H時(shí)，采用下列方案使捕獲抗體即小鼠單克隆抗體SMI 31(抗-NF-H磷酸化形式，1/2500；Sternberger)與PBS在4℃培育過夜。培育板用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)。與樣品培育2小時(shí)后，將檢測抗體即兔多克隆N4142抗-NF抗體(1/1000；Sigma)用PBS-BSA稀釋，培育2小時(shí)，與抗兔HRP連接的抗體(1/3000，Sigma；用PBS-BSA稀釋，1小時(shí))培育后通過過氧化物酶揭示。記錄492nm處讀取的每個(gè)光密度，繪制成牛NF-H(Sigma)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再得到每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量。
結(jié)果電生理測量復(fù)合肌肉動作電位的幅度(圖8)壓迫后1周，在IL-6(30μg/kg)、人凝聚素(100、300或1000μg/kg)處理的動物或者載體處理組之間的CMAP幅度不存在顯著性差異。從第15天至第28天，人凝聚素和IL-6處理的坐骨神經(jīng)壓迫組小鼠的CMAP幅度逐漸升高。4周后，凝聚素處理組小鼠的CMAP幅度與未處理小鼠相比有很顯著的升高。
復(fù)合肌肉動作電位的潛伏期測量載體、重組人IL-6(30μg/kg)或人凝聚素(100、300和1000μg/kg)處理的神經(jīng)病變小鼠的CMAP潛伏期。在坐骨神經(jīng)損傷后第1、2、3或4周對同側(cè)和對側(cè)進(jìn)行測量。結(jié)果見下表(表1)
表1

a針對對側(cè)數(shù)值的Anova單因素檢驗(yàn)b針對載體處理組數(shù)值的Anova單因素檢驗(yàn)斜體數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)N＝6小鼠/組；#p＜0.1，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對側(cè)的CMAP潛伏期沒有變差，除了在第7天0.1mg/kg凝聚素處理小鼠之外。與之相反，同側(cè)的CMAP潛伏期在壓迫后延長。IL-6和凝聚素處理小鼠的同側(cè)CMAP潛伏期與任一只未處理的小鼠相比顯著縮短。第21天和第28天(DAC)，給予重組IL-6和凝聚素(1和0.3mg/kg)能使?jié)摲诘幕謴?fù)得到顯著改善。
復(fù)合肌肉動作電位的持續(xù)時(shí)間與上述潛伏期一樣，測量各組動物同側(cè)和對側(cè)的CMAP持續(xù)時(shí)間，結(jié)果見表2表2

A針對對側(cè)數(shù)值的Anova單因素檢驗(yàn)b針對載體處理組數(shù)值的Anova單因素檢驗(yàn)斜體數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)N＝6小鼠/組；#p＜0.1，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005在載體處理組中，坐骨神經(jīng)壓迫后同側(cè)CMAP持續(xù)時(shí)間延長，4周后恢復(fù)至對側(cè)水平。凝聚素(1和0.3mg/kg)處理減少了CMAP持續(xù)時(shí)間的延長，并加速了它的恢復(fù)。
膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性(圖9)壓迫4周后，同側(cè)腓腸肌的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性還未完全恢復(fù)(圖9a)。凝聚素處理對腓腸肌的ChAT活性恢復(fù)稍微有利。人凝聚素處理小鼠的對側(cè)腓腸肌的ChAT含量與載體處理動物相比有所增加(圖9b)。
神經(jīng)細(xì)絲-高分子量形式(NF-H)(圖10)壓迫4周后，載體處理組動物的坐骨神經(jīng)近端部分(壓迫位置以上，圖10b)和遠(yuǎn)端部分(壓迫位置以下，圖10c)的NF-H水平與對側(cè)神經(jīng)(圖10a)的NF-H水平是不同的。凝聚素處理使對側(cè)和壓迫神經(jīng)近端部分的NF-H含量增加。
結(jié)論處理15天后獲得的這些結(jié)果(實(shí)施例2)表明，凝聚素在處理神經(jīng)壓迫模型鼠具有有益的效果。取決于處理時(shí)間，這種效果可反映在所有被研究的復(fù)合動作肌肉電位(CAMP)參數(shù)上，即潛伏期、持續(xù)時(shí)間和幅度。凝聚素處理也使壓迫和對側(cè)神經(jīng)的ChAT和NF-H水平增加。觀察不到對體重有任何不利影響(數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例4凝聚素刺激成熟海馬趾切片培養(yǎng)內(nèi)髓磷脂堿性蛋白(MBP)形成前言神經(jīng)受損或發(fā)病后調(diào)節(jié)神經(jīng)再生不僅需要軸突發(fā)芽和延長，而且要求有新的髓磷脂合成。髓鞘再生對正常神經(jīng)傳導(dǎo)和保護(hù)軸突免受例如興奮毒性或免疫攻擊是必要的。因?yàn)樗枇字迯?fù)最主要是重復(fù)再生事件(Capello等人，1997；Kuhn等人，1993)，所以利用器官型海馬趾切片培養(yǎng)模擬發(fā)育的髓鞘再生(developmental demyelination)。更準(zhǔn)確地說，通過ELISA監(jiān)測髓磷脂堿性蛋白(MBP)水平，MBP是一種代表成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
材料和方法器官型海馬趾切片培養(yǎng)根據(jù)Stoppini等人描述的方法(Stoppini等人，1991)制備器官型海馬趾切片培養(yǎng)。簡言之，從五天齡的C57/B16小鼠獲得海馬。通過Mcillvain組織切片機(jī)切成500微米厚的切片。然后把切片置于Millicell-CM植入物上，后者放在含1ml培養(yǎng)基(50％MEM、25％HBSS、25％馬血清)的6孔板內(nèi)。在5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)6天，再把溫度調(diào)到33℃。每3天更換培養(yǎng)基。
發(fā)育的髓鞘再生測試凝聚素提高髓鞘再生的能力，一般情況下髓鞘再生在體外發(fā)生于最初3周。
首先，第7天起直至第17天用在含馬血清(25％)的培養(yǎng)基中的小鼠凝聚素(1μg/ml、100ng/ml和10ng/ml)處理切片。每2天重復(fù)處理。
處理結(jié)束時(shí)(即處理第3天、第6天和第10天，分別對應(yīng)于體外第10天、第13天和第17天)，用三倍去污劑緩沖液溶解切片(每組6片)，并通過MBPELISA試驗(yàn)分析MBP含量。
此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二次，結(jié)果示于圖11。
當(dāng)用HEK或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝聚素代替重組小鼠凝聚素，也獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
MBP ELISA在不同時(shí)間點(diǎn)溶解樣品后，加工樣品，以蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Pierce)分析蛋白質(zhì)含量，以夾心ELISA試驗(yàn)定量分析MBP。
按照下列方案進(jìn)行MBP-ELISA。使捕獲抗體即小鼠單克隆抗體抗-MBP(1/5000；Chemicon)用PBS稀釋，并在4℃培育過夜。培育板用含1％BSA的PBS封閉1小時(shí)。樣品用PBS稀釋后培育2小時(shí)。將檢測抗體即兔多克隆抗-MBP(1/300；Zymed)用PBS-BSA稀釋，培育2小時(shí)，與抗兔HRP連接的抗體(1/3000，Sigma；用PBS-BSA稀釋，1小時(shí))培育后通過過氧化物酶揭示。記錄492nm處讀取的每個(gè)光密度，繪制成MBP(InVitrogen)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再得到每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量。
結(jié)果在開始培養(yǎng)時(shí)，P4小鼠(出生后4天)的海馬趾切片不表達(dá)可檢測水平的MBP。隨著海馬趾切片成熟，ELISA檢測的MBP水平逐漸增加，在體外21天(DIV)后達(dá)到穩(wěn)定水平(數(shù)據(jù)未示出)。
在第7天、第10天和第14天(DIV)向培養(yǎng)基加入10、100和1000ng/ml重組人凝聚素，在加入蛋白質(zhì)后3天實(shí)施MBP-ELISA進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)海馬趾切片培養(yǎng)的MBP含量增加。圖11所示為用1μg/ml小鼠凝聚素處理切片的MBP含量。當(dāng)?shù)?1天(DIV)髓磷脂發(fā)育完成，發(fā)現(xiàn)MBP不再增加(數(shù)據(jù)未示出)。
用小鼠凝聚素的其他濃度(10和100ng/ml)以及用人凝聚素都獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
結(jié)論凝聚素刺激海馬趾切片培養(yǎng)內(nèi)MBP形成，而又不影響成熟海馬趾切片可檢測的總量。
實(shí)施例5凝聚素通過抗-MOG抗體和幼田鼠補(bǔ)體保護(hù)海馬趾切片免受脫髓鞘作用前言慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病變(CIDP)和格-巴綜合征(GBS)的一個(gè)特征是髓磷脂(包括髓磷脂組成成分)分解，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由于存在抗神經(jīng)的自身免疫反應(yīng)所引起(Ho等人，1998；Kwa等人，2003；Steck等人，1998)。為了模擬抗體誘導(dǎo)的脫髓鞘作用，建立一個(gè)體外系統(tǒng)，其中器官型海馬趾切片培養(yǎng)用抗-MOG(髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白)抗體與幼田鼠補(bǔ)體聯(lián)合處理2天。該處理導(dǎo)致產(chǎn)生特異性的脫髓鞘，這是因?yàn)榕c對照免疫球蛋白處理匹配的同種型不會誘導(dǎo)大量的脫髓鞘。利用此系統(tǒng)測試凝聚素的保護(hù)作用。在此示例中，凝聚素是在脫髓鞘處理前一天以及伴隨脫髓鞘處理加入的。通過ELISA監(jiān)測MBP水平(詳細(xì)情況見實(shí)施例4)。
材料和方法脫髓鞘方案按照實(shí)施例4所述的方法制備切片(器官型海馬趾切片培養(yǎng)橫切面)，在體外第21天(DIV)后發(fā)育的脫髓鞘結(jié)束時(shí)對這些切片加以處理。
誘導(dǎo)切片脫髓鞘的處理方法是在含25％馬血清的培養(yǎng)基中用幼兔補(bǔ)體相關(guān)的抗-MOG抗體(按批量為1/60-1/30；CL-3441，Cedarlane)處理切片2天。
作為對照，用不相關(guān)抗體IgG1(60μg/ml；M-7894，Sigma)處理切片，而且補(bǔ)體或切片未經(jīng)處理。
處理結(jié)束時(shí)，用三倍去污劑緩沖液溶解切片(每組5片)，并用MBP ELISA分析髓磷脂含量。
先施加1μg/ml、100ng/ml或10ng/ml重組小鼠凝聚素，24小時(shí)后再進(jìn)行脫髓鞘處理，以及在處理時(shí)加入上述重組小鼠凝聚素(總共3天)。
本實(shí)施進(jìn)行三次，結(jié)果見圖12。
當(dāng)這些實(shí)驗(yàn)用HEK或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝聚素代替重組小鼠凝聚素進(jìn)行，也獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖12。在抗-MOG/補(bǔ)體處理時(shí)向培養(yǎng)基加入低至10ng/ml凝聚素能產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用，免于脫髓鞘。
結(jié)論在自身免疫介導(dǎo)的脫髓鞘模型中，凝聚素通過抗-MOG和補(bǔ)體誘導(dǎo)來保護(hù)免于發(fā)生脫髓鞘作用。
實(shí)施例6共注射凝聚素和肝素前言已經(jīng)知道，凝聚素在血清中可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合(綜述見Trougakos和Gonos(Trougakos and Gonos，2002)以及Jones和Jomary(Jones and Jomary，2002)，并且呈遞多個(gè)推定位點(diǎn)(見圖1，方案基于Rosenberg and Silkensen，1995)。在這些位點(diǎn)中有4個(gè)被認(rèn)為是肝素結(jié)合域。為了研究這些肝素結(jié)合域與凝聚素生物利用度的關(guān)系，測試了肝素在此情況下Liquemine(Roche)對凝聚素藥物動力學(xué)的影響。
材料和方法第一實(shí)驗(yàn)給3組C57B16雌性小鼠(8周齡，20g)靜脈注射以下物質(zhì)，每組6只-第1組先注射在100μl 0.9％NaCl中的肝素(7500U/kg)，5分鐘后注射在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(300μg/kg)。
-第2組注射在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(300μg/kg)和肝素(7500U/kg)混合液。
-第3組單獨(dú)注射300μg/kg人凝聚素。
注射凝聚素后5分鐘和30分鐘把血液收集在試管內(nèi)。屬于第3組的小鼠血液收集在裝有肝素或者無肝素的試管(+/-肝素)。然后，按照下文所述方法用ELISA試驗(yàn)研究凝聚素是否存在。
第二實(shí)驗(yàn)給3組C57B16雌性小鼠(8周齡，20g)靜脈注射以下物質(zhì)，每組6只-第1組先注射在100μl 0.9％NaCl中的肝素(7500U/kg)，5分鐘后注射在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(1mg/kg)。第1組接受在100μl 0.9％NaCl中的人凝聚素(1mg/kg)和肝素(7500U/kg)混合液。
-第2組單獨(dú)注射1mg/kg人凝聚素。在注射人凝聚素后28分鐘注射肝素(7500U/kg)(即30分鐘出血點(diǎn)之前2分鐘)。
-第3組單獨(dú)注射1mg/kg人凝聚素。
注射凝聚素后5和30分鐘收集血液。然后，按照下文所述方法用ELISA試驗(yàn)監(jiān)測血清中凝聚素的水平。
凝聚素ELISA試驗(yàn)以單克隆抗體41D(1/1000-50μl，Upstate N.05-354)為捕獲抗體，設(shè)計(jì)夾心ELISA試驗(yàn)。室溫下用封閉緩沖液(1％BSA(餾分V)/0.1％Tween-20，溶劑為0.5M NaCl)封閉剩余的結(jié)合位點(diǎn)。用在PBS中的一系列稀釋液測試含有重組人凝聚素的血清樣品。接著，用PBS/0.05％Tween-20洗4次。以標(biāo)簽生物素共軛物(1/1000，Qiagen N.34440)作為揭示抗體(revealing antibody)。室溫下通過鏈親和素連接的辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP，1/5000，用PBS稀釋，DAKO P0397)監(jiān)測揭示抗體是否存在，保持1小時(shí)，然后進(jìn)行OPD反應(yīng)(Sigma)。
結(jié)果如圖13A所示，先使凝聚素與肝素(凝聚素與肝素混合)預(yù)培育或者注射凝聚素之前先注射肝素(即先注射肝素再注射凝聚素)，大大提高了(p＜0.005)凝聚素的生物利用度。相反，在含肝素的試管內(nèi)收集凝聚素不會改變被檢測凝聚素的水平。
若第二次出血之前給予肝素(第二實(shí)驗(yàn)中第2組，見圖13B)，在血清中檢測到的凝聚素水平比共注射肝素與凝聚素的情況顯著降低(p＜0.05)。不過，收集血液之前注射肝素與單獨(dú)注射凝聚素相比，可檢測凝聚素的水平稍微升高(p＜0.1)。
結(jié)論給予肝素能顯著提高凝聚素的生物利用度(圖13A)。然而，要使肝素的功效充分發(fā)揮出來，需要在送入凝聚素之前注射肝素或者同時(shí)注射肝素與凝聚素(圖13B)。
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序列表<110>應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS股份公司<120>凝聚素在治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病中的用途<130>057538<160>1<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>449<212>PRT<213>智人<400>1Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu1 5 10 15Ser Gly Gln Val Leu Gly Asp Gln Thr Val Ser Asp Asn Glu Leu Gln20 25 30Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu Ile Gln Asn35 40 45Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn50 55 60Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys65 70 75 80Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys85 90 95Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu100 105 110Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val115 120 125
Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu130 135 140Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp145 150 155 160Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met165 170 175Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln180 185 190Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr His Tyr Leu Pro195 200 205Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg210 215 220Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Phe225 230 235 240His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln245 250 255Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro Thr260 265 270Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu Ile275 280 285Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys290 295 300Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln305 310 315 320Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg325 330 335Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met340 345 350Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp355 360 365
Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu370 375 380Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser385 390 395 400Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr405 410 415Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Ash Pro Lys Phe Met Glu420 425 430Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu435 440 445Glu
權(quán)利要求
1.凝聚素、其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分、循環(huán)變換衍生物或其鹽，或者凝聚素活性激動劑在制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述周圍神經(jīng)疾病選自由周圍神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病、周圍神經(jīng)病變和周圍神經(jīng)退化性疾病組成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述周圍神經(jīng)疾病由先天性代謝障礙引起。
4.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述周圍神經(jīng)疾病是周圍神經(jīng)病變。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述周圍神經(jīng)病變是糖尿病性神經(jīng)病變。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述周圍神經(jīng)病變是化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病變。
7.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述凝聚素選自以下組a)含有SEQ ID NO1的多肽；b)含有SEQ ID NO1的23到449氨基酸的多肽；c)含有SEQ ID NO1的35到449氨基酸的多肽；d)含有SEQ ID NO1的23到227氨基酸的多肽；e)含有SEQ ID NO1的35到227氨基酸的多肽；f)含有SEQ ID NO1的228到449氨基酸的多肽；g)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中的氨基酸序列與(a)到(f)中至少一個(gè)序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；h)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼(a)到(f)任何一個(gè)的天然DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；i)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一個(gè)的氨基酸；j)(a)到(f)的任何一個(gè)鹽或同種型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述功能性衍生物包含一個(gè)PEG基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求7或8所述的用途，其中，所述融合蛋白含有一個(gè)免疫球蛋白(Ig)融合子。
10.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述藥物還含有同時(shí)、先后或分開使用的肝素。
11.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述藥物還含有同時(shí)、先后或分開使用的干擾素和/或骨橋素。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述干擾素是干擾素-β。
13.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述凝聚素的用量約為每千克體重0.001-100毫克，或者每千克體重1-10毫克，或每千克體重5毫克。
14.核酸分子在制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物中的用途，其中，所述核酸分子含有編碼多肽的核酸序列，該多肽含有選自以下組的氨基酸序列a)含有SEQ ID NO1的多肽；b)含有SEQ ID NO1的23到449氨基酸的多肽；c)含有SEQ ID NO1的35到449氨基酸的多肽；d)含有SEQ ID NO1的23到227氨基酸的多肽；e)含有SEQ ID NO1的35到227氨基酸的多肽；f)含有SEQ ID NO1的228到449氨基酸的多肽；g)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中的氨基酸序列與(a)到(f)中至少一個(gè)序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；h)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼(a)到(f)任何一個(gè)的天然DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；i)(a)到(f)的任何一個(gè)突變蛋白，其中，所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)中任何一個(gè)的氨基酸；或者(a)到(f)的任何一個(gè)同種型、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，其中，所述核酸分子還含有表達(dá)載體序列。
16.能誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)內(nèi)源性凝聚素或凝聚素活性激動劑產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)載體在制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
17.如權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的用途，用于基因治療。
18.經(jīng)過基因改造能產(chǎn)生凝聚素或凝聚素活性激動劑的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
19.含有凝聚素或凝聚素活性激動劑及肝素的藥物組合物，可選擇性添加一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，該組合物用于治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病。
20.含有凝聚素或凝聚素活性激動劑及干擾素的藥物組合物，可選擇性添加一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，該組合物用于治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病。
21.含有凝聚素或凝聚素活性激動劑及骨橋素的藥物組合物，可選擇性添加一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，該組合物用于治療和/或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病。
22.一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的病人有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑，可選擇性添加藥學(xué)上可接受的載體。
23.一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的病人有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑及肝素，可選擇性添加藥學(xué)上可接受的載體。
24.一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的病人有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑及干擾素，可選擇性添加藥學(xué)上可接受的載體。
25.一種治療周圍神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的病人有效劑量的凝聚素或凝聚素活性激動劑及骨橋素，可選擇性添加藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及凝聚素(clusterin)或凝聚素活性激動劑在治療或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病中的用途。本發(fā)明還涉及凝聚素和肝素的組合在治療或預(yù)防周圍神經(jīng)疾病中的用途。
文檔編號A61P9/10GK1791422SQ200480013595
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者G·菲格, U·博斯切特, Y·薩戈, R·帕珀恩 申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司