專利名稱：Vegf捕獲劑及其治療用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明包括具有特定理想性質(zhì)的能結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、VEGF家族成員以及剪接變體的融合多肽和使用的治療方法。
發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明展示了編碼包含受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y的融合多肽的分離的核酸分子，其中R1是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體組分Flt-1的Ig結(jié)構(gòu)域2(FltD2)，R2是VEGF受體組分Flk-1Ig結(jié)構(gòu)3(Flk1D3)，以及R3是VEGF受體組分Flt-4的Ig結(jié)構(gòu)域3(Flt1D3或R3)，并且其中X≥1和Y≥1。
在相關(guān)的第二方面，本發(fā)明展示了單體VEGF捕獲劑(trap)或包含VEGF受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y的融合多肽，其中X≥1，Y≥1，并且R1、R2和R3如上面定義。該VEGF受體組分R1、R2和R3可直接相互連接或通過一個或多個間隔區(qū)序列連接。在一特定實施方案中，單體VEGF捕獲劑是(R1R2)x，其中X＝2。在一更特定的實施方案中，單體VEGF捕獲劑是SEQ ID NO24，或是它的功能等效氨基酸變體。本發(fā)明包括基本由VEGF受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y組成的單體VEGF捕獲劑和它的功能等效氨基酸變體。
在第三方面，本發(fā)明展示了編碼包含VEGF受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y和選自多聚化組分(MC)、血清蛋白或能結(jié)合血清蛋白的分子的融合配偶體(FP)組分的多肽的分離的核酸分子。在一優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)P是能與另一融合多肽上的多聚化組分相互作用以形成多聚體結(jié)構(gòu)，如二聚體或三聚體的多聚化組分(MC)。最優(yōu)選地，MC選自(i)包含可切割區(qū)(C-區(qū))的多聚化組分、(ii)截短的多聚化組分、(iii)具有至少一個半胱氨酸的長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列、(iv)亮氨酸拉鏈、(v)螺旋環(huán)基序、(vi)卷曲-卷曲基序和(vii)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。更進(jìn)一步包含的是基本上由(R1R2)x和/或(R1R3)Y和FP組成的融合多肽。在優(yōu)選的實施方案中，融合多肽基本由(R1R2)x和MC組成。
在第四個方面，本發(fā)明展示了如上描述的包含VEGF受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y和FP的融合多肽。受體組分可以不同順序排列，如(R1R2)x-FP；(R1R2)x-FP-(R1R2)x；FP-(R2R1)x等。融合多肽的組分可直接相互連接或通過間隔區(qū)序列連接。
在第五方面，本發(fā)明展示了包含兩個或多個由VEGF受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y和FP組成的融合多肽的多聚體的VEGF捕獲劑，其中FP組分是含有C-區(qū)的多聚化組分(MC)。該C-區(qū)可以是天然出現(xiàn)的或人工的，并可以出現(xiàn)在多聚化組分中的任意位點(diǎn)，具有使得能切割母體MC得到截短的MC的功能。由兩個或多個具有至少一個截短的MC的融合多肽組成的VEGF捕獲劑稱為“截短的小捕獲劑”。
可在MC中通過插入、刪除或突變來產(chǎn)生C-區(qū)，從而產(chǎn)生酶促或化學(xué)可切割的位點(diǎn)。C-區(qū)可在任意MC內(nèi)和MC內(nèi)任意位置產(chǎn)生；優(yōu)選地，C-區(qū)在全長的Fc結(jié)構(gòu)域或它的片段內(nèi)，或CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)產(chǎn)生。C-區(qū)可以是通過酶如凝血酶、無花果蛋白酶、胃蛋白酶、matrilysin或氨?；彼岫拿缚汕懈畹奈稽c(diǎn)或在化學(xué)上通過如蟻酸或CuCl2可切割的位點(diǎn)。
在第六個相關(guān)的方面，本發(fā)明展示了截短的VEGF小捕獲劑，它是包含兩個或多個融合多肽的多聚體蛋白，所述的融合多肽由(R1R2)x和/或(R1R3)Y和通過從含有C-區(qū)的母體MC切割截短的多聚化組分(tMC)組成。
在第七方面，本發(fā)明展示了由VEGF受體組分(R1R2)x和/或(R1R3)Y及MC組成的融合多肽，其中MC是含有至少一個半胱氨酸的長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列，其中所述的半胱氨酸殘基能與存在于另一融合多肽的MC(cMC)中的半胱氨酸形成二硫鍵。在一優(yōu)選的實施方案中，cMC是含有至少一個半胱氨酸殘基長度在1-50個氨基酸之間的氨基酸序列。在一較優(yōu)選的實施方案中，cMC是含有至少一個氨基酸的長度在1-15個氨基酸之間的氨基酸序列。在一更優(yōu)選的實施方案中，cMC是含有1-2個半胱氨酸的長度在1-10個氨基酸之間的氨基酸序列。本發(fā)明這種實施方案的一個范例由SEQ ID NO27表示，其具有一個信號序列(1-26)，接著的是R1(27-129)和R2(130-231)組分，隨后是以半胱氨酸結(jié)尾的九個氨基酸的序列。在另一實施方案中，范例在SEQ ID NO28顯示，其具有一個信號序列(1-26)，隨后是R1(27-129)和R2(130-231)組分，接著的是以半胱氨酸殘基結(jié)尾的六個氨基酸的序列。
在第8個方面，本發(fā)明展示了包含兩個或多個融合多肽的多聚體的VEGF小捕獲劑，所述的融合多肽由(R1R2)x和/或(R1R3)Y和cMC組成。在更特定的實施方案中，小捕獲劑是二聚體。本發(fā)明小捕獲劑的本實施方案的一個范例是在SEQ ID NO2中表示的融合多肽的二聚體，其中每個融合多肽(R1R2-cMC)具有23.0kD的分子量并且pI是9.22。
在另一實施方案中，cMC含兩個半胱氨酸，長度為4個氨基酸，例如XCXC(SEQ ID NO3)。在本發(fā)明該實施方案的一個范例中，小捕獲劑由本發(fā)明的VEGF受體組分和包括ACGC的cMC(SEQ ID NO4)組成。本發(fā)明小捕獲劑的該實施方案的一個范例是在SEQ ID NO5中表示的融合多肽的二聚體，其中每個單體具有23.0kD的分子量并且pI是9.22。本發(fā)明該實施方案的另一個范例在SEQ ID NO26中表示，其具有一個信號序列(1-26)，隨后是R1(27-129)和R2(130-231)組分，接著的是以CPPC結(jié)尾的九個氨基酸的序列。
在本發(fā)明VEGF捕獲劑的所有實施方案中(包括截短的VEGF小捕獲劑、VEGF小捕獲劑和單體VEGF小捕獲劑)，可將信號序列(S)包含于本發(fā)明融合多肽的開頭(或N-端)。信號序列可以是細(xì)胞固有的、重組的或合成的。當(dāng)將信號序列連接至第一個受體組分的N-端時，融合多肽因而可以命名為如S-(R1R2)x。
融合多肽的組分可以相互之間直接連接或通過間隔區(qū)連接。在特定的實施方案中，融合多肽的一個或多個受體和/或融合配偶體組分不需要間隔區(qū)而相互直接連接。在其它實施方案中，一個或多個受體和/或融合配偶體組分用間隔區(qū)連接。
本發(fā)明包括包含本發(fā)明核酸分子的載體，包括包含有效連接至表達(dá)控制序列的核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于產(chǎn)生融合多肽的宿主-載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括表達(dá)載體，位于合適的宿主細(xì)胞；宿主-載體系統(tǒng)中合適的宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細(xì)胞；大腸桿菌細(xì)胞或COS或CHO細(xì)胞。額外包含的是通過乙?；蚓垡叶蓟揎椀谋景l(fā)明VEGF捕獲劑。將蛋白乙?；蚓垡叶蓟姆椒楸绢I(lǐng)域熟知。
在相關(guān)的第九方面，本發(fā)明展示了產(chǎn)生本發(fā)明VEGF捕獲劑的方法，方法包括在適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)用含有本發(fā)明核酸序列的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并回收所表達(dá)的融合多肽。
本發(fā)明VEGF捕獲劑可用于治療任何通過除去、抑制或減少VEGF可改進(jìn)、改善或抑制的疾病或病癥。通過抑制或減少VEGF而改善的特定病癥的不完全名單包括例如不當(dāng)?shù)难獫{滲出或血管滲透性，不當(dāng)?shù)难苌L，例如腫瘤中的，與炎性疾病如銀屑病或關(guān)節(jié)炎相關(guān)的水腫，所述關(guān)節(jié)炎包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；哮喘；與燒傷相關(guān)的一般性水腫；與腫瘤、炎癥或外傷相關(guān)的腹水和胸膜積液；慢性呼吸道炎癥；哮喘；毛細(xì)血管滲漏綜合征；敗血癥；與增加的蛋白滲漏相關(guān)的腎??；胰管腺癌(PDAC)和眼部疾病如與年齡相關(guān)的黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病。VEGF小捕獲劑特別地可用于眼部疾病的治療并作為眼部手術(shù)包括青光眼手術(shù)的輔藥；以及通過玻璃體內(nèi)遞送用于治療眼內(nèi)腫瘤例如眼色素層黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。
因此，在第十方面，本發(fā)明展示了用于治療VEGF相關(guān)的疾病或病癥的治療方法，該方法包括將本發(fā)明VEGF捕獲劑施用至遭受VEGF相關(guān)的疾病或病癥的受試者上。盡管任何哺乳動物可通過本發(fā)明治療方法治療，受試者優(yōu)選為遭受或有可能遭受可用VEGF捕獲劑改善、減輕、抑制或治療的疾病或病癥的人患者。
在第十一方面，本發(fā)明進(jìn)一步展示了診斷和預(yù)測方法以及采用本發(fā)明小捕獲劑用于檢測、定量和/或監(jiān)控VEGF的試劑盒。
在第十二方面，本發(fā)明展示了包含可藥用載體和本發(fā)明VEGF捕獲劑的藥物組合物。這種藥物組合物可包含二聚體融合多肽捕獲劑，或編碼融合多肽的核酸。在一些情形下發(fā)現(xiàn)本發(fā)明小捕獲劑具有特定的用途，在所述的這些情形下期望具有減少的血清半衰期(例如更快被清除)和/或因為更小的大小而具有增加的組織滲透性的VEGF捕獲劑。VEGF小捕獲劑的特定應(yīng)用包括例如用于治療一些疾病，其中所述疾病期望將藥物局部施用至特定的組織或細(xì)胞中。這種疾病或病癥的實例是眼部的眼病。
在研究隨后的詳細(xì)描述后，本發(fā)明其它的目標(biāo)和優(yōu)勢變得顯而易見。
發(fā)明詳述在本發(fā)明得以描述以前，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于描述的特定方法和試驗條件，因為所用的方法和條件可以不同。因為本發(fā)明范圍僅由附加的權(quán)利要求書限制，所以也應(yīng)該理解這里使用的術(shù)語目的僅在于描述特定的實施方案，用意并不在于用作限制。
如該說明書和附加權(quán)利要求書中使用，除非上下文另外明確規(guī)定，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代。因此例如，提及“amethod”包括一種或多種方法和/或這里描述的類型的步驟和/或在讀過本公開內(nèi)容后對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方法等。
除非另外定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的含義相同的含義。雖然與這里描述那些相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜趯嵺`或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。所有在這里提到的出版物在這里通過引用作為參考來描述與引用的文獻(xiàn)相關(guān)的方法和/或材料。
一般描述本發(fā)明包括能結(jié)合并抑制VEGF活性的VEGF捕獲劑，該捕獲劑是單體或一個或多個融合多肽的多聚體。本發(fā)明的分子結(jié)合并抑制VEGF的生物學(xué)作用和/或生理學(xué)反應(yīng)或響應(yīng)。對于基于VEGF受體的拮抗劑VEGF捕獲劑Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO7-8)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)的描述，見PCT WO/0075319，其全部內(nèi)容在這里引用作為參考。
本發(fā)明小捕獲劑比完整捕獲劑要小，如約50-60kD，而母體捕獲劑為120kD，并包括基本由VEGF受體結(jié)構(gòu)域(R1R2)x、(R1R3)Y或它們的組合組成的單體捕獲劑、通過切割具有融合配偶體組分的母體多聚化捕獲劑的一部分產(chǎn)生的捕獲劑，其中所述的融合配偶體組分是含有切割區(qū)(C-區(qū))的多聚化組分(MC)；或通過連接半胱氨酸殘基或含有一個或多個半胱氨酸殘基的氨基酸序列至受體組分或在兩個受體組分之間連接半胱氨酸殘基或含有一個或多個半胱氨酸殘基的氨基酸序列產(chǎn)生的捕獲劑。在特定的實施方案中，用SDS-PAGE分析法測量，本發(fā)明的小捕獲劑小于約60kD；較優(yōu)選地約50kD；更優(yōu)選地約為20-30kD；或約25kD并能以與在PCT/US00/14142中描述的完整母體捕獲劑相當(dāng)?shù)挠H和性結(jié)合VEGF。
核酸構(gòu)建體和表達(dá)本發(fā)明提供能編碼結(jié)合VEGF的單獨(dú)的融合多肽或多聚化VEGF捕獲劑的核酸分子構(gòu)建體。本發(fā)明核酸分子能編碼野生型R1、R2和/或R3受體組分或它們的功能上相當(dāng)?shù)淖凅w。本發(fā)明捕獲劑的R1、R2和/或R3受體組分的氨基酸變體也可以通過在編碼核酸分子中產(chǎn)生突變而得以制備。這種變體包括，如刪減，或插入或取代R1、R2和/或R3的氨基酸序列中的氨基酸而得到的變體?？蓪h減、插入和取代做任意組合來得到最終的構(gòu)建體，前提是最終構(gòu)建體具有結(jié)合和抑制VEGF的能力。
將這些核苷酸分子插入載體中，當(dāng)將所述的載體引入合適的宿主細(xì)胞時能表達(dá)融合多肽。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于將DNA片段插入載體的任何方法可用于構(gòu)建在轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號控制下編碼本發(fā)明融合多肽的表達(dá)載體。
本發(fā)明核苷酸分子的表達(dá)可通過另一核苷酸序列調(diào)控，因而該分子在用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中得以表達(dá)。例如，表達(dá)可通過本領(lǐng)域已知的任何啟動子/增強(qiáng)子元件控制。可用于控制嵌合多肽分子表達(dá)的啟動子包括但不限于長末端重復(fù)序列(Squinto等(1991)Cell651-20)；SV40早期啟動子區(qū)、CMV、M-MuLV、胸苷激酶啟動子、金屬硫蛋白(metallothionine)基因的調(diào)控序列；原核表達(dá)載體如b-內(nèi)酰胺酶啟動子或tac啟動子(也見Scientific American(1980)24274-94)；來自酵母或其它真菌的啟動子元件如Gal 4啟動子、ADH、PGK、堿性磷酸酶和源于基因如彈性蛋白酶I基因的組織特異性轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。
使用包括本發(fā)明核酸分子的能在細(xì)菌或真核宿主中復(fù)制的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染宿主并因而指導(dǎo)表達(dá)這種核酸分子來產(chǎn)生本發(fā)明的融合多肽，所述多肽構(gòu)成能結(jié)合至VEGF的捕獲劑。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可暫時地或優(yōu)選為組成性地和永久地表達(dá)本發(fā)明VEGF捕獲劑。
可通過任何技術(shù)純化本發(fā)明捕獲劑，這種純化使得能隨后形成穩(wěn)定的、有生物活性的捕獲劑。例如，但不作為限定，可從細(xì)胞以可溶蛋白的形式或以包涵體的形式回收該因子，從中可定量地通過8M鹽酸胍和透析提取(見，例如美國專利號5,663,304)。為了進(jìn)一步純化該因子，可使用常規(guī)的離子交換色譜、疏水相互作用色譜、反向色譜或凝膠過濾。
VEGF受體組分VEGF小捕獲劑的VEGF受體組分由Flt-1的Ig結(jié)構(gòu)域2(Flt1D2)(R1)、Flk-1的Ig結(jié)構(gòu)域3(Flk1D3)(R2)(一起成為R1R2)和/或R1和Flt-4的Ig結(jié)構(gòu)域3(Flt1D3)(R3)(一起成為R1R3)組成。術(shù)語Flt-1、Flt-4或Flk-1的“Ig結(jié)構(gòu)域”意指不僅包括完整的野生型結(jié)構(gòu)域，也包括野生型結(jié)構(gòu)域的插入的、刪減的和/或取代的變體，其中所述的變體基本保留完整結(jié)構(gòu)域的功能特性。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可以獲得上述Ig結(jié)構(gòu)域的能保持與野生型結(jié)構(gòu)域基本相同的功能特性的許多變體。
當(dāng)用于指R1、R2或R3時，術(shù)語“功能等同”意指包括具有至少一種改變?nèi)鐒h減、添加和/或取代的R1、R2或R3結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域保持與野生型R1、R2或R3結(jié)構(gòu)域基本相同的功能特性，即基本等同地與VEGF結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解可在R1、R2或R3中作各種氨基酸取代而在關(guān)于這些受體組分結(jié)合并抑制VEGF活性的能力上不偏離本發(fā)明的精神。本發(fā)明捕獲劑的功能特性可通過任何用于測量目標(biāo)特性的本技術(shù)領(lǐng)域已知的合適的篩選檢測法測定。這種檢測法的實例在下面的實驗部分有描述，所述的檢測法使得能測定VEGF(Kd)捕獲劑的結(jié)合特性和測定它們的捕獲劑-配體復(fù)合物解離半衰期(T1/2)。其它檢測法，例如特異性結(jié)合至VEGF的能力的改變可通過競爭型VEGF結(jié)合檢測法測定。蛋白特性的修飾如熱穩(wěn)定性、疏水性、蛋白水解降解的易感性或積聚傾向性可通過本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的方法測定。
融合多肽的組分可直接相互連接或通過間隔區(qū)連接。通常，術(shù)語“間隔區(qū)”(或連接區(qū))指一個或多個分子，例如核酸或氨基酸或非肽部分如聚乙二醇，它們可插入至一個或多個組分結(jié)構(gòu)域之間。例如，間隔區(qū)序列可用于在組分之間提供合意的靶標(biāo)位點(diǎn)來使得操作變得容易。也可以提供間隔區(qū)來增強(qiáng)融合多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)、減少空間位阻從而該組分可采取它最佳的三級結(jié)構(gòu)和/或與它的靶標(biāo)分子正確地相互作用。關(guān)于間隔區(qū)和鑒定理想間隔區(qū)的方法，見例如George等(2003)Protein Engineering 15871-879頁，在這里特別將其引用作為參考。間隔區(qū)序列可包括一個或多個天然連接至受體組分的氨基酸或可以是后加上去的序列以用于增強(qiáng)融合蛋白的表達(dá)、提供特定理想的靶標(biāo)位點(diǎn)、使得組分結(jié)構(gòu)域能形成最佳的三級結(jié)構(gòu)和/或增強(qiáng)組分與其靶標(biāo)分子的相互作用。在一實施方案中，間隔區(qū)包含在一個或多個組分之間的一個或多個肽序列，這些多肽序列在1-100個氨基酸之間，優(yōu)選在1-25個之間。
在最特定的實施方案中，R1是SEQ ID NO8的氨基酸27-126，或SEQ ID NO8的氨基酸1-126(包括信號序列1-26)；或SEQ ID NO10的氨基酸27-129，或SEQ ID NO10的氨基酸1-129(包括信號序列1-26)。在最特定的實施方案中，R2是SEQ ID NO8的氨基酸127-228，或SEQ ID NO10的氨基酸130-231。在最特定的實施方案中，R3是SEQ ID NO13的氨基酸127-225(沒有信號序列)。當(dāng)例如，將R2置于融合多肽的N端時，信號序列在受體組分之前是理想的。連接在多聚化組分的受體組分可進(jìn)一步包含間隔區(qū)組分，例如SEQ IDNO7的氨基酸229-231的GPG序列。
融合配偶體和多聚化組分融合配偶體是增強(qiáng)融合多肽功能性的任何組分。因此，例如融合配偶體可增強(qiáng)融合多肽的生物活性，有助于其產(chǎn)生和/或回收，或通過例如增強(qiáng)其血清半衰期、組織穿透性、缺乏免疫源性、或穩(wěn)定性來增強(qiáng)融合多肽的藥理學(xué)性質(zhì)或藥代動力學(xué)特性。在優(yōu)選的實施方案中，融合配偶體選自多聚化組分、血清蛋白或能結(jié)合血清蛋白的分子。
當(dāng)融合配偶體是血清蛋白或其片斷時，它選自α-1微球蛋白、AGP-1、血清類粘蛋白(orosomuciod)、α-1酸性糖蛋白、維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、血紅素結(jié)合蛋白、人血清白蛋白(hSA)、運(yùn)鐵蛋白、鐵蛋白、afamin、結(jié)合珠蛋白、α-甲胎蛋白、甲狀腺球蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-2-糖蛋白、透明質(zhì)素-結(jié)合蛋白、syntaxin、C1R、Clq鏈、galectin3-Mac2結(jié)合蛋白、纖維蛋白原、聚合Ig受體(PIGR)、α-2-巨球蛋白、尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)合珠蛋白、IGFBPs、巨噬細(xì)胞清除受體、纖連蛋白、giantin、Fc、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(antichyromotrypsin)、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、載脂蛋白A-I、載脂蛋白B、β-2-微球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、補(bǔ)體成分C3或C4、CI酯酶抑制劑、C-反應(yīng)蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C和蛋白C。在更特定的實施方案中，融合配偶體選自α-1微球蛋白、AGP-1、血清類粘蛋白、α-1酸性糖蛋白、維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、血紅素結(jié)合蛋白、人血清白蛋白(hSA)、afamin和結(jié)合珠蛋白。當(dāng)需要時，包含融合配偶體可延長本發(fā)明融合多肽的血清半衰期。見例如美國專利6,423,512、5,876,969、6,593,295和6,548,653，在這里特別地全文引用作為參考，例如引用血清白蛋白融合多肽作為參考。hSA在周身特別是在腸和血液成分中廣泛分布，并在維持摩爾滲透壓濃度和血漿體積中起重要作用。它在肝臟中緩慢被清除并在人中通常具有14-20天的體內(nèi)半衰期(Waldmann等(1977年)Albumin，StructureFunction and Uses；Pergamon Press；255-275頁)。
當(dāng)融合配偶體是能結(jié)合血清蛋白的分子時，該分子可以是合成的小分子、脂類或脂質(zhì)體、核酸(包括合成的核酸，例如aptomer)、肽或寡糖。此外該分子可以是蛋白，例如FcγR1、FcγR2、FcγR3、聚合Ig受體(PIGR)、ScFv和其它血清蛋白特異性抗體片段。
當(dāng)融合配偶體是多聚化組分(MC)時，它是任何天然或合成的序列，這種序列能與另外的MC反應(yīng)而形成更高級的結(jié)構(gòu)如二聚體、三聚體等。合適的MC可包括亮氨酸拉鏈，包括源于c-jun或c-fos的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；源于κ或λ輕鏈的恒定區(qū)序列；合成的序列如螺旋-環(huán)-螺旋基序(Müller等(1998)FEBS Lett.43245-49頁)、卷曲-卷曲基序等或其它本技術(shù)領(lǐng)域已知的通常接受的多聚化結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，融合組分包括來自如人IgG、IgM或IgA的免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域。在特定的實施方案中，免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域可選自IgG的Fc結(jié)構(gòu)域、IgG的重鏈和IgG的輕鏈。IgG的Fc結(jié)構(gòu)域可選自同種型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4及每個同種型組中的任何異型。在本發(fā)明VEGF捕獲劑的一個實施例中，多聚化組分是IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO29)。
截短的VEGF小捕獲劑的產(chǎn)生在本發(fā)明捕獲劑的一個實施方案中，將具有含有C-區(qū)的MC的母體捕獲劑處于某種條件下，在所述的條件下一個或多個含有C-區(qū)的MC得以切割，從而產(chǎn)生包含兩個或多個本發(fā)明融合多肽的截短的VEGF小捕獲劑。
含有C-區(qū)的MC可以是任何能與另外的MC相互作用來形成更高級結(jié)構(gòu)如二聚體或三聚體的MC?？稍贛C中任意理想的位置產(chǎn)生C-區(qū)。根據(jù)下面實施例中提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域任意一位技術(shù)人員應(yīng)該能基于得到的截短的捕獲劑的期望特性如分子量、單體或二聚體等特性而選擇理想的位點(diǎn)來產(chǎn)生C-區(qū)。
在特定的實施方案中，C-區(qū)是插入至緊隨N-端CPPC序列(SEQ IDNO1)的FcΔC1結(jié)構(gòu)域中的凝血酶切割位點(diǎn)(LVPRGS)(SEQ ID NO6)。在該實施方案中，完整的母體VEGF捕獲構(gòu)建體在細(xì)胞中表達(dá)為Fc標(biāo)記蛋白，因而使得能通過如蛋白A柱捕獲并純化。在形成二聚體和在CPPC序列(SEQ ID NO1)的一個或兩個半胱氨酸殘基之間形成共價結(jié)合后，在某些條件下將二聚體暴露給凝血酶，在這些條件下凝血酶切割一個或兩個FcΔC1結(jié)構(gòu)域，由此產(chǎn)生了具有約50kD-90kD分子量的截短的二聚體小捕獲劑，并且這種小捕獲劑具有與母體捕獲劑相當(dāng)?shù)腣EGF親和性。切割的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員控制來促成部分切割產(chǎn)物或完全切割產(chǎn)物的形成，根據(jù)對具有特定性質(zhì)如分子量的特定產(chǎn)物的期望來選擇切割條件。
在特定的實施方案中，C-區(qū)是插入至在CPPC序列(SEQ ID NO1)N-端的FcΔC1結(jié)構(gòu)域中的凝血酶切割位點(diǎn)(LVPRGS)(SEQ ID NO6)。在形成二聚體和在CPPC序列(SEQ ID NO1)的一個或兩個半胱氨酸殘基之間形成共價結(jié)合后，在某些條件下將二聚體暴露給凝血酶，在其中一個或兩個FcΔC1結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)并生成截短的單體小捕獲劑。因而產(chǎn)生的單體截短的小捕獲劑包含受體組分和Fc的小片段且大小約為25kD，并相對于截短的二聚體捕獲劑和全長母體捕獲劑表現(xiàn)出減少的VEGF親和性。作為重組蛋白產(chǎn)生的一個相似單體捕獲劑已經(jīng)表現(xiàn)出具有約1nM的KD值。
VEGF小捕獲劑的產(chǎn)生在一個實施方案中，本發(fā)明刻畫了具有一個或多個受體組分結(jié)構(gòu)域(R1R2)x和/或(R1R3)Y的VEGF小捕獲劑，其中X≥1，Y≥1，并且R1、R2和R3如上定義，并任選地具有融合配偶體，所述融合配偶體優(yōu)選地是MC結(jié)構(gòu)域，該MC結(jié)構(gòu)域是長度在1-約200個氨基酸之間的包含至少一個半胱氨酸的氨基酸序列，其中所述的半胱氨酸殘基能與存在于另一個融合多肽的MC(cMC)中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵。cMC可出現(xiàn)在融合多肽的N端或C端，或在兩個受體組分結(jié)構(gòu)域之間。在一特定的實施方案中，將半胱氨酸加至VEGF受體組分的C-端，如R1R2C，這使得融合多肽能通過在一個融合多肽C-端的半胱氨酸殘基和另一個融合多肽C-端的半胱氨酸殘基之間形成共價二硫鍵來形成共價二聚體。在該示范中，小捕獲劑是在SEQ ID NO2中表示的融合多肽的二聚體，其中每個融合多肽(R1R2-cMC或R1R2C)具有約23.0kD的分子量。
在另一實施方案中，cMC是4個氨基酸(XXXX)的序列(SEQ ID NO11)，其中X是任意氨基酸并且該序列包含至少一個半胱氨酸殘基。在一特定的實施方案中，將cMC加至受體組分結(jié)構(gòu)域的C-端。在更特定的實施方案中，該4個氨基酸的序列是ACGC(SEQ ID NO4)并且該cMC與存在于第二個融合多肽的半胱氨酸殘基形成兩個二硫鍵。如下面顯示(表2)，作為例子的兩個小捕獲劑都表現(xiàn)出與母體捕獲劑相當(dāng)?shù)腣EGF親和性。
治療用途本發(fā)明的VEGF小捕獲劑可用于治療任何通過除去、抑制或減少VEGF可改善、減輕、抑制或預(yù)防的疾病和病癥。通過抑制或減少VEGF來改善的特定疾病的不窮盡的名單包括特征為過度的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管穿透性、水腫或炎癥如與外傷相關(guān)的腦水腫、中風(fēng)或腫瘤；與炎性疾病如銀屑病或關(guān)節(jié)炎相關(guān)的水腫，所述關(guān)節(jié)炎包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；哮喘；與燒傷相關(guān)的一般性的水腫；與腫瘤、炎癥或外傷相關(guān)的腹水和胸膜積液；慢性呼吸道炎癥；毛細(xì)血管滲漏綜合征；敗血癥；與增加的蛋白滲漏相關(guān)的腎?。谎鄄考膊∪缗c年齡相關(guān)的黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病的臨床癥狀。
本發(fā)明組合物在治療上可用于治療與升高的VEGF水平相關(guān)的廣泛的多種疾病。例如，過度的Th2炎癥和呼吸道重塑在哮喘的發(fā)病機(jī)理中是特有的(見如Elias等(1999)J.Clin.Invest.1041001-1006頁)。在來自有哮喘的患者的組織和生物樣品中已經(jīng)檢測到上升的VEGF水平，VEGF水平直接與疾病活性相關(guān)(Lee等(2001)J.AllergyClin.Immunol.1071106-1108頁)并與呼吸道的口徑及呼吸道的響應(yīng)負(fù)相關(guān)。另外，已經(jīng)公認(rèn)VEGF對哮喘組織水腫起作用。
與上升的VEGF相關(guān)的另外的疾病是胰管腺癌(PDAC)。這種惡性腫瘤常常表現(xiàn)出增強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖病灶并經(jīng)常過度表達(dá)VEGF(Ferrara(1999)J.Mol.Med.77527-543頁)。PDAC是造成超過20％的由腸胃道惡性腫瘤引起的死亡的原因，這使得它成為美國及其它工業(yè)化國家中第四最普遍的與癌癥相關(guān)的死亡率原因。實驗證據(jù)支持VEGF在胰腺癌中起重要作用，因而VEGF抑制劑有希望作為治療劑來消弱胰腺內(nèi)的腫瘤生長及區(qū)域性的和向遠(yuǎn)處的腫瘤轉(zhuǎn)移。
在大腸桿菌中表達(dá)的更小的、非糖基化的小捕獲劑(實施例4)、在CHO細(xì)胞中表達(dá)的糖基化的小捕獲劑(實施例5)或基于受體的單體捕獲劑(實施例6)具有用于局部/玻璃體內(nèi)遞送的最優(yōu)化的特性，即更短血清半衰期使得能更快的清除和使不必要的全身暴露量最小化。而且由于有更小的大小，小捕獲劑具有穿透眼睛內(nèi)界膜(ILM)，并通過玻璃體擴(kuò)散至視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)層的能力，這有助于治療視網(wǎng)膜疾病。而且，小捕獲劑可用于局部施用來治療眼病如脈絡(luò)膜新生血管、糖尿病性黃斑水腫、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、角膜新生血管化/移植排斥反應(yīng)。更進(jìn)一步，可將小捕獲劑用于任何需要暫時(短期)阻斷VEGF如用以避免處于長期的VEGF阻斷下的情形，例如用于治療銀屑病。
導(dǎo)致青光眼手術(shù)后失敗的一個嚴(yán)重問題是初期的炎癥和血管新生以及太快的傷口復(fù)原。因此，可有效地使用本發(fā)明的VEGF捕獲劑用作青光眼手術(shù)的輔藥來預(yù)防青光眼手術(shù)后早期的血管和淋巴管新生以及巨噬細(xì)胞募集至濾過泡，并提高手術(shù)成果。
組合療法在許多實施方案中，可將VEGF捕獲劑與一種或多種額外的化合物或療法，包括第二種VEGF捕獲劑分子、化療劑、手術(shù)、導(dǎo)管裝置和放射結(jié)合施用。組合療法包括施用包含VEGF捕獲劑和一個或多個額外的試劑的單一藥物劑量制劑；也包括施用VEGF捕獲劑和在其自己獨(dú)立的藥物劑量制劑中的一個或多個額外的試劑。例如，可將VEGF捕獲劑和細(xì)胞毒性劑、化療劑或生長抑制劑以單一劑量組合物的形式如組合制劑的形式一起施用給患者，或每種試劑可以以獨(dú)立的劑量制劑施用。當(dāng)使用獨(dú)立的劑量制劑時，本發(fā)明VEGF特異性融合多肽和一種或多種額外的試劑可同時施用或在分別交錯的時間即按順序施用。
如此處所用的術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻礙細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意指包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化療劑和毒素如細(xì)菌、真菌、植物或動物源的酶促活性毒素或它們的片段。
“化療劑”是用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑膶嵗ㄍ榛瘎┤缛媾?、環(huán)磷酰胺制劑(Cytoxan)；烷基磺酸鹽如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；次乙亞胺類和methylamelamine類包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酰胺、trimethylolomelamine；氮芥子氣類如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧化氮芥、美法侖、新氮芥、氮芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀、亞硝基苯脲類(nitrosoureas)如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素類如aclacinomysins、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、馬塞羅霉素、絲裂霉素、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁斯(新制癌菌素)、佐柔比星、抗代謝藥如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、葉酸類似物如denopterin、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙、嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、Thiamiprine、硫鳥嘌呤、嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟脲苷、依諾他濱、氟尿苷；
雄激素類如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯、抑制腎上腺類藥物如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦、葉酸再補(bǔ)充類藥物如frolinic酸；醋葡醛內(nèi)酯；aldophosphamide glycoside；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺、地吖醌、elfornithine；依利醋銨；依托格魯、硝酸鎵、羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙、米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他??；phenamet；吡柔比星、鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；urethan；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；派泊溴烷；Gacytosine；腺嘌呤阿糖甙(arabinoside)；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫杉醇類藥物(Taxanes)，如紫杉醇(Taxol，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)；多西他塞(Taxotere；Aventis Antony，法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉑類藥物如順鉑和卡鉑(Carboplatin)；長春堿；鉑；依托泊苷(VP16)(etoposide(VP-16))；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓；諾維苯；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維A酸；esperamicin類；卡培他濱；以及任意上述藥物的可藥用鹽、酸或衍生物。用作調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤起作用的抗激素劑也包含在本定義中，所述的抗激素劑包括例如抗雌激素類藥物；如他莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥三苯氧胺(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬、keoxifene、LY 117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通(Fareston))；和抗雄激素類藥物如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任意上述藥物的可藥用鹽、酸或衍生物。
當(dāng)在這里使用“生長抑制劑”時指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞生長，特別是癌細(xì)胞生長的化合物或組合物。生長抑制劑的實例包括阻斷細(xì)胞周期(在除了S期的其它階段)的試劑，例如誘導(dǎo)G1期阻斷和M期阻斷的試劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括Vincas(長春新堿和長春堿)、Taxol和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素。阻斷G1的那些劑也延長到S期的阻斷，例如DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。
施用方法本發(fā)明提供治療方法，包括施用給受試者有效量的本發(fā)明VEGF捕獲劑。在一優(yōu)選的方面，捕獲劑是充分純化的(例如，基本沒有限制其效果或產(chǎn)生非期望的副作用的物質(zhì))。受試者優(yōu)選地是哺乳動物并最優(yōu)選地是人。
不同的遞送體系是已知的并可用于施用本發(fā)明的試劑，例如封裝于脂質(zhì)體、微粒、微膠囊、能表達(dá)化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(見例如Wu和Wu，1987年，J.Biol.Chem.2624429-4432頁)、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它載體的一部分的核酸構(gòu)建體等中。引入的方法可以是經(jīng)腸的或腸胃外的，并包括但不限于皮內(nèi)的、肌肉的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮下的、鼻內(nèi)的、眼內(nèi)的和經(jīng)口的途徑?；衔锟赏ㄟ^任意便利的途徑施用，例如通過灌注、推注注射、通過經(jīng)由上皮或粘膜襯里(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收并可與其它生物活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部。施用可以是急性的或慢性的(例如每日、每周、每月等)或與其它試劑結(jié)合施用。也可采用肺部施用，例如通過使用吸入器或噴霧器以及使用含有霧化劑制劑。
在另外的實施方案中，活性劑可在泡囊中，特別是在脂質(zhì)體中、在受控制的釋放體系中或在泵中遞送。在另外的實施方案中，其中本發(fā)明活性劑是編碼蛋白的核酸，可在體內(nèi)施用該核酸來促進(jìn)其編碼的蛋白的表達(dá)，通過將其構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分并將其施用使得它進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，例如通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見例如美國專利4,980,286)、通過直接注射或通過使用微粒轟擊或通過用脂類或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被施用該核酸，或通過與已知的能進(jìn)入細(xì)胞核的類似同源異型框的肽連接施用該核酸(見例如，Joliot等，1991年，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)。備選地，例如通過同源重組，可將核酸引入細(xì)胞內(nèi)并整合進(jìn)宿主細(xì)胞DNA來表達(dá)。
在特定的實施方案中，期望將本發(fā)明藥物組合物局部施用至需要治療的區(qū)域；這可通過例如，但不以此作為限制，在手術(shù)期間局部灌注、局部施用完成，所述的局部灌注和局部施用是例如通過注射、通過導(dǎo)管的方式或通過植入物的方式進(jìn)行，其中的植入物是多孔的、非多孔的或凝膠狀的物質(zhì)，包括膜，例如硅橡膠(sialastic)膜、纖維或商業(yè)的皮膚代用品。
用于實踐本發(fā)明方法的組合物可以是包含本發(fā)明試劑的溶液、懸液或兩者的液體。術(shù)語“溶液/懸液”指液體組合物，其中第一部分活性劑存在于溶液中而第二部分活性劑表現(xiàn)為顆粒的形式，所述顆粒在液體基質(zhì)中懸浮。液體組合物也包括凝膠體。液體組合物可以是含水的或是以軟膏劑的形式。進(jìn)一步，組合物可采用固體物的形式，可將該固體物放入眼睛中，例如放入眼和眼瞼之間或結(jié)膜囊中，在這里釋放VEGF捕獲劑。VEGF一般從這種物體釋放至角膜，通過淚液，或直接傳至角膜本身，固體物一般與角膜直接接觸。適合植入眼睛的固體物通常主要由生物溶蝕或非生物溶蝕聚合物組成。水溶液和/或懸液可以是滴眼液的形式。理想的活性劑的劑量可以通過施用已知數(shù)量的滴數(shù)至眼中測量。例如，對于25μl體積一滴，施用1-6滴將遞送25-150μl組合物。
用于實踐本發(fā)明方法的含水懸液或溶液/懸液可包含一種或多種作為助懸劑的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物，如纖維素聚合物，和不可水溶的聚合物如交聯(lián)的含有羧基的聚合物。本發(fā)明的含水懸液或溶液/懸液優(yōu)選地是粘性的或粘膜粘附性的，或更優(yōu)選地兩者都是粘性的或兩者都是粘膜粘附性的。
在另外的實施方案中，用于實踐本發(fā)明方法的組合物是原位能形成凝膠的含水組合物。這種組合物含有膠凝劑，該膠凝劑的濃度在與眼睛或淚液接觸時能有效促使形成凝膠。合適的膠凝劑包括但不限于熱固性聚合物。如此處所用的術(shù)語“可原位形成凝膠的”不僅包括在與眼睛或淚液接觸時形成凝膠的低黏度液體，也包括更有粘性的液體如在施用至眼睛時表現(xiàn)出相當(dāng)大增加的黏度或凝膠硬度的半流體的和觸變的凝膠。
診斷和篩選方法本發(fā)明VEGF捕獲劑可作診斷性使用和/或用于篩選方法。例如，該捕獲劑可用于在臨床研究階段監(jiān)控VEGF的水平來評價治療效率。在另外的實施方案中，本發(fā)明方法和組合物可用于篩選個體進(jìn)入臨床研究來鑒定具有例如太高或太低VEGF水平的個體。該捕獲劑能用于在涉及VEGF的定位和活性例如診斷方法中的成像、在合適的生理學(xué)樣品中檢測其水平等的領(lǐng)域中已知的方法。
本發(fā)明捕獲劑可用于體內(nèi)和體外篩選檢測法來定量存在的非結(jié)合的VEGF的量，例如可用于篩選方法來鑒定能降低VEGF的表達(dá)的檢測試劑。更一般地，本發(fā)明捕獲劑可以用于在其中期望定量和/或分離VEGF的任意檢測法或方法。
藥物組合物本發(fā)明也提供包含本發(fā)明VEGF小捕獲劑的藥物組合物。這種組合物包含治療有效量的一種或多種小捕獲劑和可藥用載體。術(shù)語“可藥用的”指用于動物以及更特別是用于人的經(jīng)過聯(lián)邦政府或州政府核準(zhǔn)的或在美國藥典或其它一般公認(rèn)的藥典中列出的。術(shù)語“載體”指與藥物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這種藥用載體可以是無菌液體如水或油，包括源于石油的、動物的、植物的或合成的那些油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等形式。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、干脫脂乳、甘油、丙烯、二元醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物也可包含小量的潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采取溶液、懸液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋制劑等形式。合適的藥用載體的實例由E.W.Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述。
本發(fā)明的VEGF小捕獲劑可配制成中性形式或鹽的形式。可藥用鹽包括與自由氨基基團(tuán)形成的那些鹽，如源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些鹽，和那些與自由羧基基團(tuán)形成的那些鹽，如源于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些鹽。
此外，用于實踐本發(fā)明方法的含水組合物具有與眼睛相容的pH值和摩爾滲透壓濃度?？蓪⒁环N或多種眼睛可接受的pH值調(diào)節(jié)劑和/或緩沖劑包含于本發(fā)明組合物中，其包括酸如乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸和鹽酸；堿如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、醋酸鈉、乳酸鈉；以及緩沖液如檸檬酸鹽/葡萄糖、碳酸氫鈉和氯化銨。將使組合物的pH值維持在眼睛可接受的范圍內(nèi)所需要的量的這些酸、堿和緩沖液包含于組合物內(nèi)。可將足夠能使組合物的摩爾滲透壓濃度達(dá)到眼睛可接受范圍的量的一種或多種眼睛可接受鹽包含于組合物內(nèi)。這種鹽包括具有鈉、鉀或銨陽離子和氯、檸檬酸根、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子的那些鹽。
能有效用于其預(yù)期的治療用途的捕獲劑的量可通過基于本描述的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測定。而且，可任選地采用體外檢測法來幫助鑒定最佳的劑量范圍。通常，用于靜脈內(nèi)施用的合適的劑量范圍一般是每千克體重約50-5000微克活性化合物。用于鼻內(nèi)施用的合適的劑量范圍一般是約0.01pg/kg體重到1mg/kg體重。從來自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線外推可得到有效的劑量。
對于全身施用，可從體外檢測法初步估計治療有效劑量。例如，在動物模型中可配制劑量來獲得循環(huán)濃度范圍，包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定的IC50值。這種信息可用來在人中更有效地確定有用的劑量。也可用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法從體內(nèi)數(shù)據(jù)例如從動物模型得到數(shù)據(jù)估計初始的劑量。本技術(shù)領(lǐng)域中一般水平的技術(shù)人員可基于動物數(shù)據(jù)便利地優(yōu)化對人的施用。
可個別調(diào)整劑量和施用的時間間隔以提供足夠用以保持治療效果的血液中化合物的濃度水平。在局部施用或選擇性攝取的情況下，有效的化合物局部濃度可能與血漿濃度不相關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠優(yōu)化治療有效量的局部劑量而不需要過多的試驗。
當(dāng)然施用的化合物的量將取決于受試者、取決于他的體重，病痛的嚴(yán)重性、施用方式和主治醫(yī)生的判斷。治療可在檢測到癥狀時或甚至在檢測不到癥狀時間歇性的重復(fù)。治療可單獨(dú)進(jìn)行或與其它藥物結(jié)合進(jìn)行。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因治療本發(fā)明包括使用編碼本發(fā)明融合多肽的核酸來在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？蓪⑦@些核酸插入至任意數(shù)量的熟知的載體來轉(zhuǎn)染靶標(biāo)細(xì)胞和生物體。通過載體和靶標(biāo)細(xì)胞之間的相互作用，可將核酸離體和體內(nèi)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。將組合物以足夠引起治療反應(yīng)的量施用(例如通過注射進(jìn)肌肉中)至受試者。將足夠達(dá)到引起治療反應(yīng)的量定義為“治療有效劑量或量”。
在另外的方面，本發(fā)明提供在人或其它動物中減少VEGF水平的方法，方法包括用編碼本發(fā)明融合多肽的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中核酸包含有效地連接至編碼融合多肽或小捕獲劑的核酸上的可誘導(dǎo)啟動子。有關(guān)治療或預(yù)防人的疾病的基因治療方法，參見例如Van Brunt(1998年)Biotechology 61149-1154頁。
試劑盒本發(fā)明也提供生產(chǎn)的商品，該商品包括包裝材料和包含于包裝材料中的藥劑，其中藥劑包含至少一種由兩種或多種本發(fā)明融合多肽組成的VEGF捕獲劑，并且其中所述的包裝材料包含標(biāo)簽或說明書，標(biāo)簽或說明書說明該VEGF特異性融合多肽能用于治療VEGF介導(dǎo)的疾病或病癥。
轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明包括表達(dá)本發(fā)明捕獲劑的非人類轉(zhuǎn)基因動物?？捎扇缤ㄟ^微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將核酸引入受精卵母細(xì)胞的雄性原核中并讓卵母細(xì)胞在假孕的雌性代育動物中發(fā)育而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。任何有調(diào)節(jié)作用的或其它在表達(dá)載體中有用的序列可構(gòu)成轉(zhuǎn)基因序列的一部分?？蓪⒔M織特異性調(diào)控序列有效地連接至轉(zhuǎn)基因以在特定的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)該轉(zhuǎn)基因。表達(dá)本發(fā)明融合多肽或小捕獲劑的非人類轉(zhuǎn)基因動物可用于多種應(yīng)用，包括作為產(chǎn)生這種融合多肽的手段。而且，可將轉(zhuǎn)基因處于可誘導(dǎo)啟動子的控制下，這樣融合多肽或小捕獲劑的表達(dá)可由例如施用小分子來控制。
特定的實施方案在下面描述的試驗中，小VEGF捕獲劑得以產(chǎn)生并且研究了它們結(jié)合VEGF的能力。這種小捕獲劑優(yōu)選地用于特定的應(yīng)用中。例如，某種病癥或疾病可優(yōu)選地通過局部施用VEGF捕獲劑至特定的器官、組織或細(xì)胞中而不是通過全身施用來治療。在本發(fā)明小捕獲劑的一個范例中，通過直接切割二聚化的VEGF捕獲劑而產(chǎn)生更小的VEGF捕獲劑，所述的二聚化VEGF捕獲劑具有產(chǎn)生于Fc結(jié)構(gòu)域中的切割區(qū)域(C-區(qū))(實施例2)。截短的捕獲劑表現(xiàn)出與完整的母體捕獲劑相當(dāng)?shù)腣EGF親和性和半衰期。實施例3-5描述了具有VEGF受體組分和含有一個或兩個半胱氨酸殘基的多聚化組分的融合多肽的構(gòu)建。親和性測定表明在大腸桿菌中表達(dá)的非糖基化融合多肽或在CHO細(xì)胞中表達(dá)的糖基化多肽具有與完整的母體捕獲劑相當(dāng)?shù)腣EGF親和性。實施例6進(jìn)一步闡述了能結(jié)合并抑制VEGF的由(R1R2)2組成的單體VEGF捕獲劑。實施例7描述了VEGF小捕獲劑(SEQ ID NO26)的構(gòu)建，該捕獲劑表現(xiàn)出與完整捕獲劑(SEQ ID NO10)相當(dāng)?shù)母叩慕Y(jié)合VEGF的親和性。
本發(fā)明其它的特征在隨后對作為范例的實施例的描述期間將變得顯而易見，其中作為范例的實施方案是給出來作為本發(fā)明的例子并且用意不在于用來限制。
實施例提出下面的實施例以給本領(lǐng)域一般技術(shù)人員提供完全的公開內(nèi)容和描述怎樣獲得和使用本發(fā)明的方法和組合物，并且用意不在于限制發(fā)明者認(rèn)定的他們的發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保使用的數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)的精確性，但應(yīng)該說明一些試驗的誤差和偏差。除非另外說明，份數(shù)是基于重量的份數(shù)，分子量是平均分子量，溫度是攝氏溫度，以及壓強(qiáng)是大氣壓或接近大氣壓。
實施例1.Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的構(gòu)建母體VEGF捕獲劑，即Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO7-8)、VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)(SEQ ID NO12-13)的構(gòu)建在PCT出版物WO/0075319中詳細(xì)描述，這里特別通過全文引用作為參考。在WO/0075319中也描述了構(gòu)建方法和表達(dá)編碼VEGF捕獲劑的核酸構(gòu)建體的方法、檢測和測量與VEGF結(jié)合的VEGF捕獲劑的方法、通過BIAcore分析法和藥代動力學(xué)分析法測定結(jié)合VEGF的化學(xué)定量關(guān)系的方法。
實施例2凝血酶切割的二聚體VEGF小捕獲劑通過在Fc結(jié)構(gòu)域的CPPC(SEQ ID NO1)后插入凝血酶切割位點(diǎn)修飾VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)構(gòu)建體。將純化的VEGF捕獲劑(5μg)與凝血酶(Novagen公司)在20mM Tris-HCl(pH 8.4)、50mM NaCl、2.5mM CaCl2中于37℃孵育16小時。對照包括不與凝血酶孵育的切割對照蛋白(CCP)和母體VEGF捕獲劑蛋白。用SDS-PAGE分析(Tris-甘氨酸4-20％凝膠；每泳道5μg蛋白)證實了正確的切割(結(jié)果沒有展示)。
親和性測定。如WO/0075319中描述，每個VEGF捕獲劑與hVEGF165結(jié)合的Kd值得以測定，即測定了母體VEGF捕獲劑、含有凝血酶切割位點(diǎn)的未切割的VEGF捕獲劑(“未切割的VEGF捕獲劑”)、經(jīng)切割的VEGF小捕獲劑和重組的單體R1R2-myc myc his的Kd值。更特別地，使用原代人類內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)測定了捕獲劑阻斷依賴VEGF165的受體磷酸化的能力。在不同濃度的測試捕獲劑存在時孵育VEGF165，并將該混合物加至HUVECs以刺激VEGFR2的酪氨酸磷酸化。處于VEGF捕獲劑的亞化學(xué)劑量濃度時，未結(jié)合的VEGF誘導(dǎo)受體磷酸化。然而，當(dāng)VEGF捕獲劑對配體大于1∶1的摩爾比時，觀察到受體信號傳導(dǎo)作用完全被阻斷，因而確定單個分子的捕獲劑二聚體能阻斷單個分子的人VEGF165。因此，VEGF捕獲劑對VEGF的高度的結(jié)合親和性導(dǎo)致復(fù)合物的形成，該復(fù)合物阻止VEGF與細(xì)胞表面受體相互作用。對母體VEGF捕獲劑、未切割的VEGF捕獲劑和經(jīng)切割的VEGF小捕獲劑進(jìn)行相同的磷酸化抑制試驗時可觀察到相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。結(jié)果在表1中顯示。
表1
實施例3.編碼VEGF小捕獲劑的質(zhì)粒的構(gòu)建從母體VEGF捕獲劑前體即VEGFR1R2.FcΔC1(a)構(gòu)建VEGF小捕獲劑，其中三個氨基酸甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸作為Flk1D3和FcΔC1(a)之間的連接序列。可將pTE115這種質(zhì)粒用于VEGF小捕獲劑的構(gòu)建，因為連接區(qū)DNA序列包含Srf I限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，這有助于改造VEGF捕獲劑。在所有其它方面，由pTE115編碼的VEGF捕獲劑與在PCT出版物WO/0075319中描述的VEGF捕獲劑、VEGFR1R2.FcΔC1(a)(SEQ ID NO9-10)相同。
構(gòu)建具有多聚化結(jié)構(gòu)域的兩個VEGF小捕獲劑，其中所述的多聚化結(jié)構(gòu)域包括接在受體組分Flt1D2.Flk1D3的C-端的一個半胱氨酸(R1R2C)(SEQ ID NO2)或氨基酸序列ACGC(SEQ ID NO4)(R1R2ACGC)(SEQ ID NO5)。這兩種構(gòu)建體都能形成同型二聚體分子，所述的二聚體由一個(R1R2C)或兩個(R1R2ACGC)分子間的二硫鍵穩(wěn)定。
通過除去由用Srf I和Not I消化pTE115產(chǎn)生的690bp片段并插入通過退火寡聚R1R2NC(SEQ ID NO14)和R1R2CC(SEQ ID NO15)形成的合成DNA片段而得到質(zhì)粒pTE517。
得到的質(zhì)粒編碼R1R2C，R1R2C包括以一個半胱氨酸結(jié)尾的Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO23)。同樣，通過除去由用SrfI和Not I消化pTE115DNA產(chǎn)生的690bp片段并隨后連接通過退火寡聚R1R2NACGC(SEQ ID NO16)和R1R2CACGC(SEQ ID NO17)形成的合成DNA片段而得到質(zhì)粒pTE 518。得到的質(zhì)粒編碼R1R2ACGC，R1R2ACGC包括以氨基酸ACGC結(jié)尾的Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO25)。
也構(gòu)建質(zhì)粒來指導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)這些小捕獲劑。將引物R1R2N-Ncol(SEQ ID NO18)和R1R2CNot1(SEQ ID NO19)用于從pTE115擴(kuò)增DNA片段，相對于母體VEGF捕獲劑所述的DNA片段編碼氨基酸G30-K231(SEQ ID NO10)。擴(kuò)增該片段導(dǎo)致5’端的起始甲硫氨酸的融合和3’端的半胱氨酸的密碼子的融合(SEQ ID NO2)，隨后是終止密碼子。然后將該DAN片段克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pRG663的NcoI和Not I位點(diǎn)中以產(chǎn)生pRG1102，這樣使得R1R2C的表達(dá)取決于從噬菌體T7φ1.1啟動子的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)pRG1102的基因表達(dá)導(dǎo)致R1R2cys在大腸桿菌宿主株RFJ238的細(xì)胞質(zhì)中的積聚。同樣，將啟動子R1R2N-Nco1(SEQ ID NO18)和R1R2ACGC-Not1(SEQ ID NO20)用于擴(kuò)增編碼氨基酸G30-K231的pTE115的DNA片段(SEQ ID NO10)，導(dǎo)致5’端的起始的甲硫氨酸密碼子和ACGC密碼子(SEQ ID NO4)的融合，隨后是3’端的終止密碼子(SEQ ID NO5)。然后將該片段克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pRG663的NcoI和Not I位點(diǎn)中以產(chǎn)生pRG1103，這樣以至于R1R2ACGC的表達(dá)取決于從噬菌體T7φ1.1啟動子的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)pRG1102和pRG1103的基因表達(dá)分別導(dǎo)致R1R2c或R1R2ACGC在大腸桿菌宿主株RFJ238的細(xì)胞質(zhì)中的積聚。
實施例4.來自大腸桿菌的VEGF小捕獲劑的純化和表征R1R2c和R1R2ACGC都作為細(xì)胞質(zhì)蛋白在大腸桿菌中得以表達(dá)并通過相同方法純化。誘導(dǎo)大腸桿菌宿主株K12株RFJ238中的pRG1102或pRG1103上的噬菌體T7φ1.1啟動子導(dǎo)致蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的積聚。誘導(dǎo)后，通過離心收集細(xì)胞，將其再懸浮于50mMTris-HCl(pH 7.5)、20mM EDTA中，并通過將細(xì)胞穿過Niro-Soavi細(xì)胞勻漿器進(jìn)行裂解。通過離心從裂解的細(xì)胞中收集包涵體，在蒸餾水中洗滌一次，然后溶解于8M胍-HCl、50mM Tris-HCl(pH為8.5)、100mM亞硫酸鈉、10mM連四硫酸鈉中，并室溫下孵育16小時。將澄清的上清液在用6M胍-HCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的S300柱上分級，含有R1R2C的級分被收集并用6M脲、50mM Tris-HCl(pH7.5)透析。將經(jīng)透析的蛋白稀釋至2M脲、50mM Tris-HCl(pH 8.5)、2mM半胱氨酸中，然后4℃下緩慢攪拌7天。將重新折疊的蛋白用50mM Tris-HCl(pH 7.5)透析，然后上樣到用50mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡的SP-瓊脂糖柱上并用50mM Tris-HCl(pH 7.5)中的0-1M的NaCl梯度洗脫。合并含有R1R2c的級分，將其濃縮并上樣至用50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl平衡的Superdex 200柱上。收集并合并含有小捕獲劑二聚體的級分。純化的小捕獲劑的分子量通過SDS-PAGE估計為約46kD。
將BIAcore檢測法用于(如WO/0075319中描述)檢測捕獲劑對VEGF的親和性，結(jié)果顯示R1R2c和R1R2ACGC小捕獲劑具有與全長VEGF捕獲劑相當(dāng)?shù)腣EGF親和性(表2)。
表2
實施例5.VEGF小捕獲劑在CHO K1中的表達(dá)由pTE517和pTE518編碼的VEGF小捕獲劑的表達(dá)取決于從人CMV-MIE啟動子的轉(zhuǎn)錄，并當(dāng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)時導(dǎo)致小捕獲劑分泌至培養(yǎng)基中。當(dāng)作為分泌蛋白在CHO K1中表達(dá)時，兩種小捕獲劑都能在條件培養(yǎng)基中找到，并通過SDS-PAGE顯示估計它們的分子量，正如期望的，這些蛋白是糖基化的。通過SDS-PAGE分析也表示小捕獲劑能形成同型二聚體分子，該二聚體分子通過C-端半胱氨酸之間的分子間二硫鍵穩(wěn)定。特別地，當(dāng)在CHO細(xì)胞中作為分泌蛋白表達(dá)時，R1R2c小捕獲劑有效地形成共價二聚體。
實施例6.單鏈VEGF小捕獲劑的構(gòu)建和表達(dá)不需要多聚化結(jié)構(gòu)域的VEGF小捕獲劑(SEQ ID NO24)也得以構(gòu)建。這種小捕獲劑可通過將一個Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域(R1R2)(SEQID NO24的氨基酸30-231)直接融合至第二個Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域(R1R2)(SEQ ID NO24的氨基酸234-435)上而構(gòu)建，在這些串聯(lián)受體結(jié)構(gòu)域之間有一Gly-Pro的連接序列(SEQ ID NO24的氨基酸232-233)。
為了構(gòu)建編碼串聯(lián)的Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域的基因，合成了一段DNA片段(Blue Heron Biotechnology)，該DNA片段編碼一個Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域，其與在pTE115中發(fā)現(xiàn)的編碼Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域的DNA有最小的DNA同源性。將合成的DNA片段作為Srf I-NotI片段克隆進(jìn)pTE115的Srf I-Not I位點(diǎn)以產(chǎn)生pTE570，pTE570從CMV-MIE啟動子表達(dá)R1R2-R1R2 VEGF小捕獲劑。當(dāng)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHOK1細(xì)胞中時，R1R2-R1R2 VEGF小捕獲劑在培養(yǎng)基中積聚。
實施例7.VEGF小捕獲劑的構(gòu)建和表達(dá)如上面描述，通過直接將一個Flt1D2.Flk1D3結(jié)構(gòu)域(R1R2)(SEQID NO26的氨基酸30-231)與以CPPC終止的C-端九個氨基酸的序列融合構(gòu)建VEGF小捕獲劑。當(dāng)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO K1細(xì)胞中時，SEQID NO26的VEGF小捕獲劑分泌至培養(yǎng)基中。用非還原SDS-PAGE電泳進(jìn)行隨后的純化，自然光散射分析鑒定了一種分子量為約64kDa的捕獲劑分子。該分子量說明在兩個SEQ ID NO26的融合多肽之間形成了共價二聚體。對編碼SEQ ID NO27和28的融合多肽的質(zhì)粒進(jìn)行類似的試驗，并同樣表明這些分子形成了同型二聚體捕獲劑。對人VEGF-165結(jié)合至包括SEQ ID NO10和SEQ ID NO26的二聚體的EGF捕獲劑的親和性測定結(jié)果顯示在表3中。
表3
序列表<110>Regeneron Pharmaceuticals.Inc.
<120>VEGF捕獲劑及其治療用途<130>RGE 710D2<140>To Be Assigned<141>2004-06-29<150>10/609,775<151>2003-06-30<160>29<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>智人<400>1Cys Pro Pro Cys1<210>2<211>200<212>PRT<213>智人<400>2Met Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile1 5 10 15His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser20 25 30Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile35 40 45Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile50 55 60
Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr65 70 75 80Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Gln Thr Asn Thr85 90 95Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val100 105 110Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val115 120 125Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys130 135 140Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys145 150 155 160Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln165 170 175Gly Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr180 185 190Phe Val Arg Val His Glu Lys Cys195 200<210>3<211>4<212>PRT<213>智人<220>
<221>變體<222>1，3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>3Xaa Cys Xaa Cys1<210>4<211>4<212>PRT<213>智人<400>4Ala Cys Gly Cys1
<210>5<211>203<212>PRT<213>智人<400>5Met Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile1 5 10 15His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser20 25 30Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile35 40 45Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile50 55 60Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr65 70 75 80Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr Gln Thr Asn Thr85 90 95Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val100 105 110Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val115 120 125Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys130 135 140Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys145 150 155 160Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln165 170 175Gly Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr180 185 190Phe Val Arg Val His Glu Lys Ala Cys Gly Cys195 200<210>6<211>6<212>PRT<213>智人<400>6Leu Val Pro Arg Gly Ser1 5
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Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys65 70 75 80Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr85 90 95Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His100 105 110Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile115 120 125Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys225 230 235 240<210>28<211>237<212>PRT<213>智人<400>28Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro20 25 30Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu35 40 45Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr50 55 60Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys65 70 75 80Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr85 90 95Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His100 105 110
Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile115 120 125Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu130 135 140Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile145 150 155 160Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu165 170 175Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe180 185 190Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu195 200 205Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr210 215 220Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys225 230 235<210>29<211>434<212>PRT<213>智人<400>29Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu1 5 10 15Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val20 25 30Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr35 40 45Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe50 55 60Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu65 70 75 80Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg85 90 95Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile100 105 110Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr115 120 125Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys130 135 140His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr165 170 175Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met180 185 190Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Glu Ser Lys195 200 205Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly210 215 220Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile225 230 235 240Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu245 250 255Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His260 265 270Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg275 280 285Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys290 295 300Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu305 310 315 320Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr325 330 335Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu340 345 350Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp355 360 365Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val370 375 380Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp385 390 395 400Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His405 410 415Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu420 425 430Gly Lys
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其編碼由組分(R1R2)x或(R1R3)Y及融合配偶體(FP)組成的融合多肽，其中，X≥1，Y≥1，R1是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體組分Flt-1的Ig結(jié)構(gòu)域2，R2是Flk-1的Ig結(jié)構(gòu)域3，R3是Flt-4的Ig結(jié)構(gòu)域3。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述的融合配偶體(FP)是能與另外的MC相互作用形成多聚體結(jié)構(gòu)的多聚化組分(MC)。
3.如權(quán)利要求3所述的分離的核酸，其中所述的MC選自(i)含有可切割區(qū)域(C-區(qū))的多聚化組分，(ii)截短的多聚化組分，(iii)具有至少一個半胱氨酸殘基且長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列，(iV)亮氨酸拉鏈，(V)螺旋環(huán)基序，(Vi)卷曲-卷曲基序，以及(Vii)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
4.融合多肽，其由權(quán)利要求1-3所述的核酸分子編碼。
5.如權(quán)利要求4所述的融合多肽，其具有SEQ ID NO26、27或28的氨基酸序列。
6.能在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中復(fù)制的表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1-3所述的核酸分子。
7.產(chǎn)生VEGF融合多肽的方法，其中所述的方法包括將權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體引入合適的表達(dá)系統(tǒng)，并實現(xiàn)VEGF融合多肽的表達(dá)。
8.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)捕獲劑，其包含兩個或多個如權(quán)利要求4所述的融合多肽的多聚體。
9.如權(quán)利要求8所述的VEGF捕獲劑，其是二聚體。
10.二聚體VEGF捕獲劑，其包含兩個含有SEQ ID NO26、27或28的氨基酸序列的融合多肽。
11.藥物組合物，其包含權(quán)利要求8或9所述的融合多肽和可藥用載體。
12.治療疾病或病癥的方法，所述的疾病或病癥通過除去或抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)得以改善、減輕或抑制，其中所述的方法包括施用如權(quán)利要求11所述的藥物組合物至需要治療的受試者。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的疾病或病癥是眼睛的疾病或病癥。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的眼睛的疾病或病癥是年齡相關(guān)的黃斑變性。
15.分離的核酸分子，其編碼由受體組分(R1R2)x或(R1R3)Y及能與另外的MC相互作用形成多聚體結(jié)構(gòu)的多聚化組分(MC)組成的融合多肽，其中，X≥1，Y≥1，R1是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體組分Flt-1的Ig結(jié)構(gòu)域2，R2是Flk-1的Ig結(jié)構(gòu)域3，R3是Flt-4的Ig結(jié)構(gòu)域3，其中多聚化組分(MC)選自(i)含有可切割區(qū)域(C-區(qū))的多聚化組分，(ii)截短的MC，(iii)具有至少一個半胱氨酸殘基且長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列，(iV)亮氨酸拉鏈，(V)螺旋環(huán)基序，(Vi)卷曲-卷曲基序，以及(Vii)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的核酸分子，其中受體組分是(R1R2)x，多聚化組分是具有至少一個半胱氨酸殘基且長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求16所述的分離的核酸分子，其中受體組分是R1R2，X是1，并且多聚化組分是具有1-2個半胱氨酸殘基且長度為1-15個氨基酸的氨基酸序列。
18.能結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的融合多肽，其中所述的融合多肽由如權(quán)利要求15-17所述的核酸分子編碼。
19.如權(quán)利要求18所述的融合多肽，其包含SEQ ID NO26、27或28的氨基酸序列。
20.融合多肽，其由受體組分(R1R2)x或(R1R3)Y及能與另外的多聚化組分(MC)相互作用形成多聚體結(jié)構(gòu)的MC組成，其中，X≥1，Y≥1，R1是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體組分Flt-1的Ig結(jié)構(gòu)域2，R2是Flk-1的Ig結(jié)構(gòu)域3，R3是Flt-4的Ig結(jié)構(gòu)域3，其中多聚化組分(MC)選自(i)含有可切割區(qū)域(C-區(qū))的MC，(ii)截短的MC，(iii)具有至少一個半胱氨酸殘基且長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列，(iV)亮氨酸拉鏈，(V)螺旋環(huán)基序，(Vi)卷曲-卷曲基序，以及(Vii)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
21.如權(quán)利要求20所述的融合多肽，其中所述的受體組分是(R1R2)x，多聚化組分是具有至少一個半胱氨酸殘基且長度在1-約200個氨基酸之間的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的融合多肽，其中所述的受體組分是R1R2，X是1，并且多聚化組分是具有1-2個半胱氨酸殘基且長度為1-15個氨基酸的氨基酸序列。
23.二聚體VEGF捕獲劑，其由兩個如權(quán)利要求20-22所述的融合多肽組成。
24.生產(chǎn)的商品，其包括(a)包裝材料；和(b)容納于所述包裝材料中的藥劑；其中所述的藥劑包含至少一種VEGF捕獲劑，其中所述的捕獲劑由受體組分(R1R2)x或(R1R3)Y及能與另外的多聚化組分(MC)相互作用形成多聚體結(jié)構(gòu)的MC組成，其中，X≥1，Y≥1，并且，其中所述的包裝材料包含標(biāo)簽或說明書，該標(biāo)簽或說明書說明該VEGF特異性融合多肽能用于治療VEGF介導(dǎo)的疾病或病癥。
全文摘要
核酸分子和能結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的多聚化蛋白質(zhì)。公開了在治療上用于治療VEGF相關(guān)的病癥和疾病的VEGF捕獲劑，并且將其特定地設(shè)計用于局部施用至特定的器官、組織和/或細(xì)胞中。
文檔編號A61K38/00GK1816566SQ200480018573
公開日2006年8月9日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者T·J·戴雷, J·P·凡德爾, N·J·帕帕佐普羅斯 申請人:瑞澤恩制藥公司