專利名稱：基于nsp4基因的輪狀病毒基因疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型疫苗的研制。具體而言，本發(fā)明涉及基于NSP4基因的輪狀病毒基因疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
A組輪狀病毒(Rotavirus，RV)是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒急性腹瀉的最主要病原。最新數(shù)字表明，在發(fā)展中國(guó)家，輪狀病毒引起的兒童嚴(yán)重腹瀉占腹瀉住院病例的1/3，每年引起5歲以下兒童死亡的人數(shù)為87.3萬(wàn)人，相當(dāng)于每天死亡2000-2400人。我國(guó)多次流行病學(xué)調(diào)查表明，秋冬季嬰幼兒腹瀉有大約50％是由A組輪狀病毒引起的。輪狀病毒腹瀉關(guān)系到國(guó)家的公共安全、社會(huì)穩(wěn)定以及人口素質(zhì)。鑒于輪狀病毒危害嚴(yán)重且缺乏有效治療手段，世界衛(wèi)生組織將輪狀病毒疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項(xiàng)目之一。
RV的基因組由11個(gè)雙鏈RNA節(jié)段組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5)。RV的衣殼分為3層，其外殼由VP7和VP4組成，內(nèi)殼由VP6和VP2組成。RV的外殼蛋白中含有中和抗原表位。但是與其它RNA病毒相似，RV外殼蛋白的變異性很強(qiáng)，根據(jù)VP7的變異性可將RV分為至少14個(gè)不同的血清型，根據(jù)VP4的變異可將其分為至少20個(gè)亞型，目前RV疫苗中一般只包含了一個(gè)血清型，最多不超過(guò)4個(gè)血清型，而自然界中流行的輪狀病毒是錯(cuò)綜復(fù)雜、不斷變換的，因此現(xiàn)有RV疫苗沒(méi)有解決輪狀病毒基因變異的有效對(duì)抗問(wèn)題，嚴(yán)重影響了免疫效果。因此如何應(yīng)對(duì)病毒變異是RV疫苗研制中必須要考慮的問(wèn)題。
傳統(tǒng)的病毒疫苗設(shè)計(jì)(滅活疫苗或減毒活疫苗)主要是模擬病毒自然感染過(guò)程，疫苗成分進(jìn)入體內(nèi)，被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要是病毒的外殼蛋白，其非結(jié)構(gòu)蛋白和病毒內(nèi)部抗原往往不能被免疫系統(tǒng)高效遞呈，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)很弱或不能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并且這種疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)以針對(duì)表面抗原的中和抗體為主，多為型特異性免疫反應(yīng)，保護(hù)范圍比較局限，往往不能形成對(duì)病毒變異株的保護(hù)。針對(duì)HIV、人丙型肝炎病毒以中和抗原為免疫原的疫苗沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果的原因可能也與此有關(guān)(參見(jiàn)http://www.genetide.com/news/shownews.asp？id＝120088)。篩選具有交叉保護(hù)性的病毒抗原無(wú)疑是解決病毒變異的一條重要途徑。由于病毒的大部分非結(jié)構(gòu)蛋白或內(nèi)部抗原保守性較強(qiáng)，病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白在交叉免疫保護(hù)性及病毒疫苗設(shè)計(jì)中的地位逐漸受到重視。作為病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白，也會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，如免疫缺陷病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶便具有CTL表位(參見(jiàn)De Berardinis P，et al.Phage display of peptide epitopesfrom HIV-1 elicits strong cytolytic responses.Nat Biotechnol，2000；18(8)873-876.)，而且非結(jié)構(gòu)蛋白較為保守，針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫反應(yīng)可能具有更為廣泛的交叉免疫保護(hù)性。在病毒自然過(guò)程中，非結(jié)構(gòu)蛋白或內(nèi)部蛋白(非中和抗原)未充分暴露于免疫系統(tǒng)之下，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較弱，但是經(jīng)過(guò)人為改造，可以大大增強(qiáng)其免疫原性，產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)反應(yīng)。例如，丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3蛋白可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)；含有HIV非結(jié)構(gòu)蛋白Tat的疫苗能在恒河猴引起高滴度的交叉免疫保護(hù)反應(yīng)；流感病毒的非中和抗原NP在小鼠可以同時(shí)引起CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及CD8+CTL反應(yīng)，并能誘發(fā)針對(duì)異型病毒的保護(hù)作用(參見(jiàn)Brinster C，et al.Hepatitis C virusnon-structural protein 3-specific cellular immune responses followingsingle or combined immunization with DNA or recombinant SemlikiForest virus particles.J Gen Virol，2002，83(Pt 2)369-81.Cafaro A，et al.Control of SHIV-89.6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tatprotein vaccine.Nat Med，1999，5(6)5643-5650.Richardson MW，et al.Immunogenicity of HIV-1 IIIB and SHIV 89.6P Tat and Tat toxoids inrhesus macaquesinduction of humoral and cellular immune responses.DNA Cell Biol，2002，21(9)637-651.Ulmer JB，Influenza DNA vaccines.Vaccine，2002，20S74-S76)。這些非結(jié)構(gòu)蛋白或非中和抗原已經(jīng)成為相應(yīng)病毒的重要疫苗候選基因，并顯示出良好的應(yīng)用前景，成為疫苗研制中新的亮點(diǎn)和突破點(diǎn)。
本發(fā)明利用RV基因10編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4研制了基因疫苗，有望在輪狀病毒腹瀉預(yù)防中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征是利用表達(dá)人RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或其免疫原性片段的不同表達(dá)載體作為新型輪狀病毒基因疫苗。
NSP4基因全長(zhǎng)750或751個(gè)核苷酸，編碼175個(gè)氨基酸，含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)。NSP4是重要的RV調(diào)節(jié)蛋白，在RV的復(fù)制成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
NSP4可作為新型輪狀病毒疫苗的候選基因，是因?yàn)樗c輪狀病毒其它抗原相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4較為保守，除了其主要集中于131-145位氨基酸的“高變區(qū)”，其它區(qū)域即使在不同血清型間仍然較為保守，我國(guó)不同地區(qū)A組輪狀病毒不同血清型間全長(zhǎng)NSP4基因(包括高變區(qū))的同源性均高于80％，并且NSP4的變異與病毒分布地區(qū)無(wú)關(guān)，不同地區(qū)間NSP4氨基酸序列的同源性可高達(dá)99％(參見(jiàn)王大燕，王健偉，于修平等.中國(guó)輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4基因變異特征的分析.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2003，17(1)10-14)。因此有可能產(chǎn)生較好的交叉免疫保護(hù)作用，有助于解決病毒的高變異問(wèn)題；(2)NSP4在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它作為跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜糖蛋白，可作為胞漿中單殼顆粒的細(xì)胞內(nèi)受體，NSP4與單殼顆粒結(jié)合促使其以出芽方式進(jìn)入ER腔。NSP4還與病毒的外殼蛋白VP4和VP7結(jié)合，促進(jìn)外殼蛋白的獲得。因而針對(duì)NSP4的免疫反應(yīng)有可能在病毒復(fù)制的早期階段便可發(fā)揮作用；(3)NSP4在輪狀病毒致病中發(fā)揮重要作用，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與輪狀病毒腹瀉發(fā)生直接相關(guān)的輪狀病毒蛋白。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)輪狀病毒NSP4在病毒致腹瀉的機(jī)制中扮演重要角色，最近在禽RV NSP4的研究中也發(fā)現(xiàn)其有致腹瀉作用(Mori Y，et al.Diarrhea-inducing activity ofavian rotavirus NSP4 glycoproteins，which differ greatly from mammalianrotavirus NSP4 glycoproteins in deduced amino acid sequence in sucklingmice.J Virol，2002，76(11)5829-34.)?，F(xiàn)有的研究表明，NSP4可激活某些信號(hào)傳導(dǎo)通路，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，Ca2+濃度增高將引發(fā)腸粘膜細(xì)胞內(nèi)Cl-外泌而導(dǎo)致腹瀉。NSP4這種導(dǎo)致腹瀉的機(jī)制類似于細(xì)菌腸毒素，目前看來(lái)這可能是輪狀病毒導(dǎo)致腹瀉的主要原因之一，因此抗輪狀病毒腹瀉藥物和疫苗應(yīng)當(dāng)考慮NSP4的作用；(4)已有的研究表明，RV自然感染后有針對(duì)NSP4蛋白的免疫反應(yīng)，在血清中可以檢測(cè)到抗NSP4抗體，并且NSP4蛋白具有T、B細(xì)胞表位，因此有望成為疫苗設(shè)計(jì)的靶位，通過(guò)人為改造，可以使針對(duì)NSP4的免疫反應(yīng)增強(qiáng)。
要研制輪狀病毒的疫苗必須要考慮病毒的感染特征，由于輪狀病毒主要感染腸道并在局部繁殖，因此粘膜免疫以及細(xì)胞免疫等對(duì)于病毒清除可能發(fā)揮重要作用。要利用NSP4誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，還必須要考慮疫苗的實(shí)現(xiàn)形式。NSP4作為單一病毒成分，只能研制基因工程疫苗。作為基因工程病毒疫苗，目前主要包括亞單位疫苗、多肽疫苗、活載體(病毒或細(xì)菌)疫苗、DNA疫苗(采用質(zhì)粒載體)、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等，其中載體疫苗和DNA疫苗均屬于基因疫苗范疇。
本發(fā)明采用基因疫苗的形式，是因?yàn)槠渚哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)(1)基因疫苗可以采用黏膜免疫途徑。研制輪狀病毒基因工程疫苗必須考慮輪狀病毒的生物學(xué)與免疫學(xué)特點(diǎn)，即輪狀病毒經(jīng)腸道感染且繁殖局限在腸道，因此粘膜免疫起主要保護(hù)作用。理論上講，腺病毒、皰疹病毒、EB病毒、腺病毒伴隨病毒(AAV)、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦病毒、登革病毒、噬菌體等多種病毒、細(xì)菌載體或各種質(zhì)粒載體均可作為NSP4的表達(dá)載體，通過(guò)滴鼻、口服、透皮、噴霧等免疫途徑，誘導(dǎo)黏膜免疫，不經(jīng)過(guò)包裝處理或輔以佐劑，由于過(guò)敏、降解等原因，重組蛋白、多肽或從轉(zhuǎn)基因植物提取的蛋白很難直接誘導(dǎo)較強(qiáng)的粘膜免疫反應(yīng)；(2)基因疫苗可激發(fā)多種免疫反應(yīng)。目前研究表明，病毒載體或質(zhì)粒載體疫苗可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原，從而不僅可誘導(dǎo)體液免疫、黏膜免疫，而且可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，后者在疫苗保護(hù)中往往具有更重要的作用。而亞單位疫苗、多肽疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗往往只能誘導(dǎo)以體液免疫為主的反應(yīng)。
(3)基因疫苗免疫效率高。目前病毒載體疫苗等本身就有良好的免疫刺激作用，不需要添加佐劑，而亞單位疫苗、多肽疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗往往需要有佐劑才能激發(fā)有效的免疫反應(yīng)，但是目前廣泛使用的鋁佐劑并不適用于黏膜免疫，其它佐劑尚無(wú)廣泛使用，并且絕大部分尚未用于人體，因此疫苗可能因無(wú)合適佐劑而失敗。
(4)生產(chǎn)成本低，容易制備。由于基因疫苗是以重組病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒的形式體現(xiàn)的，其制備相對(duì)容易，尤其是作為口服疫苗，無(wú)須純化，因此成本較低。而亞單位疫苗需要復(fù)雜的純化過(guò)程；合成肽成本高，本身免疫原性很弱，需要偶聯(lián)擔(dān)體；轉(zhuǎn)基因植物目的抗原的表達(dá)量低，提取困難，其致敏性、安全性目前尚無(wú)定論。
縱上所述，本發(fā)明利用輪狀病毒NSP4研制基因疫苗，具有可有效應(yīng)對(duì)病毒變異、針對(duì)病毒致病環(huán)節(jié)、給藥方便、可有效誘導(dǎo)體液免疫、黏膜免疫和細(xì)胞免疫、制備方便等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明一方面提供了一種輪狀病毒基因疫苗，其中含有輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因，所述NSP4或者其免疫原性片段的基因插入病毒、細(xì)菌或者質(zhì)粒中，并能夠在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)多肽從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗中所述病毒選自以下腺病毒、皰疹病毒、EB病毒、腺病毒伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦病毒、登革病毒、噬菌體或者其任何組合。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒為腺病毒。最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因疫苗為rvAdEasyNSP4。
本發(fā)明所述基因疫苗中，質(zhì)粒可以為復(fù)制型或非復(fù)制型質(zhì)粒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因疫苗為pCI-NSP4。
本發(fā)明的基因疫苗可以制成注射劑、口服劑、滴鼻劑、噴霧劑或透皮劑形式，以合適的方式給藥。
基于本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因來(lái)開(kāi)發(fā)各種用于預(yù)防或者治療由輪狀病毒引起的疾病。因此，本發(fā)明也公開(kāi)了輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因作為疫苗的用途。
本發(fā)明的基因疫苗可以用于免疫動(dòng)物，制備預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體制劑。
本發(fā)明也公開(kāi)了預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體的生產(chǎn)方法，包括用本發(fā)明中公開(kāi)的基因疫苗免疫動(dòng)物，在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體并分離出該抗體。所述動(dòng)物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的可以用來(lái)制備抗體的動(dòng)物，例如牛、馬、兔、羊、鼠或者禽類。


圖1為重組腺病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果。
1野生型腺病毒Ad52rvAdEasyNSP4(全長(zhǎng)基因)3DL2000 DNA分子量標(biāo)記4rvAdEasyNSP4(編碼區(qū)基因)圖2為重組腺病毒rvAdEasyNSP4中特異性NSP4基因片段Southernblot檢測(cè)。
1Ad5/BamH I陰性對(duì)照2rvAdEasyNSP4/BamH I圖3為重組腺病毒中NSP4基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。
1陰性對(duì)照
2DL2000 DNA分子量標(biāo)記3rAdEasyNSP4圖4為rAdEasyNSP4表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析。
1rAdEasyNSP4(293細(xì)胞沉淀)2野生型Ad53rAdEasyNSP4(293細(xì)胞培養(yǎng)上清)圖5為重組腺病毒rvAdEasyNSP4免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的測(cè)定。
Ein滴鼻實(shí)驗(yàn)組Eis灌胃實(shí)驗(yàn)組Cin滴鼻對(duì)照組Cis灌胃對(duì)照組對(duì)照組野生型5型腺病毒圖6為重組腺病毒rvAdEasyNSP4各次免疫后血清IgG抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率。
1vacc第1次免疫2vacc第2次免疫3vacc第3次免疫Ad5野生型腺病毒rvAdEasyNSP4重組腺病毒圖7為輪狀病毒SA11病毒攻擊后乳鼠的腹瀉百分率。
Control對(duì)照組Ein滴鼻實(shí)驗(yàn)組Eis灌胃實(shí)驗(yàn)組橫坐標(biāo)數(shù)字代表病毒攻擊后的天數(shù)圖8為SA11病毒攻毒后灌胃組的腹瀉評(píng)分。
Control對(duì)照組Eis灌胃實(shí)驗(yàn)組橫坐標(biāo)數(shù)字代表病毒攻擊后的天數(shù)圖9為SA11病毒攻毒后滴鼻組的腹瀉評(píng)分。
Control對(duì)照組Ein滴鼻實(shí)驗(yàn)組橫坐標(biāo)數(shù)字代表病毒攻擊后的天數(shù)圖10為pCI-NSP4在293細(xì)胞表達(dá)的間接免疫熒光檢測(cè)。
ApCI質(zhì)粒對(duì)照轉(zhuǎn)染293細(xì)胞BpCI-NSP4轉(zhuǎn)染293細(xì)胞圖11為DNA疫苗pCI-NSP4免疫后血清特異性抗NSP4 IgG抗體的平均滴度。
系列1pCI系列2pCI-NSP具體實(shí)施方式
下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Sambrook，et al.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。
實(shí)施例1本實(shí)施例的內(nèi)容是以腺病毒為載體，表達(dá)人輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4，在小鼠模型上對(duì)重組腺病毒的免疫效果進(jìn)行了研究，在動(dòng)物水平上證明該重組腺病毒有望作為新型輪狀病毒疫苗。具體步驟如下1.將NSP4基因克隆入穿梭載體pShuttle-CMV用內(nèi)切酶Sal I和Not I(New England Biolabs)分別雙酶切pGEM-11zf-NSP4質(zhì)粒(參見(jiàn)王大燕，王健偉等.人輪狀病毒NSP4蛋白的表達(dá)及其致小鼠腹瀉模型的初步建立.中國(guó)病毒學(xué)，2003，18(3)217-220；王大燕，王健偉，于修平等.中國(guó)輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4基因變異特征的分析.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2003，17(1)10-14)和穿梭質(zhì)粒pAdShuttle-CMV(參見(jiàn)He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system for generating recombinantadenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，952509-14)pShuttle-CMV 1μl，NSP4片段14μl，10×連接酶緩沖液2μl，DNA連接酶1μl，補(bǔ)水至20μl，12-16℃連接過(guò)夜。取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH10B(Invitrogen)。挑取氨芐青霉素(Amp)抗性克隆，用含Amp的LB培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)后，以堿裂解法小量制備質(zhì)粒，用Sal I和Not I雙酶切鑒定，得到插入有NSP4的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-NSP4。
2.重組腺病毒的獲得用堿裂解法小量制備上述克隆有外源基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-NSP4及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，并溶解于70μlddH2O中備用。取約500ng重組穿梭質(zhì)粒，用Pme I單酶切以線性化，無(wú)水乙醇沉淀，溶解于6μl無(wú)菌去離子中，與約100ng pAdEasy-1(見(jiàn)He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplifiedsystem for generating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，952509-14)轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183(Stratagen)，取細(xì)菌懸液分別涂入含50μg/ml卡那霉素(Kan)的培養(yǎng)板中，于37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)，挑選單菌落，接種至2ml含有Kan(25μg/ml)的培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃搖床培養(yǎng)10-15小時(shí)，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，獲得了重組腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasyNSP4。所得重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳初篩后用Pac I(New England Biolabs)酶切進(jìn)一步鑒定，可產(chǎn)生4.5Kb左右的片段。將所得重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以氯化鈣法制備的宿主菌DH10B(rec A1，endA1)感受態(tài)細(xì)胞，在此宿主菌中可產(chǎn)生高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，挑取目的克隆，經(jīng)酶切鑒定后，-70℃保存菌種備用。
用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)提取重組腺病毒質(zhì)粒，Pac I酶切，無(wú)水乙醇沉淀回收片段，溶于無(wú)菌去離子水中。在T-12.5培養(yǎng)瓶(Nunc)中培養(yǎng)293細(xì)胞(美國(guó)ATCC)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的豐度應(yīng)為50％-70％。將Pac I酶切線性化后的重組腺病毒DNA 20μl及8μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen公司產(chǎn)品)分別與100μl M液(無(wú)抗生素、無(wú)血清的含有谷氨酰胺及NaHCO3的DMEM培養(yǎng)液)充分混勻，室溫下溫育15分鐘，混合兩種懸液室溫繼續(xù)作用30分鐘。在上述等候的時(shí)間里，移去293細(xì)胞的原培養(yǎng)液，用2ml M液洗細(xì)胞2次。補(bǔ)加800μl M液至Lipofectamine2000-DNA的復(fù)合物中，輕輕混勻后接種293細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱，溫育3-5小時(shí)。吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，補(bǔ)加含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后6-7天，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變圓等細(xì)胞病變(CPE)，收集細(xì)胞與上清液一起-70℃、37℃反復(fù)凍融3次(也可以超聲破碎)，取適量的凍溶液接種293細(xì)胞，以含2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，按上述方法收病毒傳代一次。所得重組腺病毒命名為rvAdEasyNSP4。
3.重組腺病毒的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定293細(xì)胞培養(yǎng)rvAdEasyNSP4重組腺病毒，待細(xì)胞病變完全后，反復(fù)凍融3次，15000rpm，離心10分鐘，取上清，磷鎢酸負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為70nm，具有典型的腺病毒形態(tài)。
(2)PCR分析將重組腺病毒rvAdEasyNSP4接種293細(xì)胞，約3天后離心收集細(xì)胞沉淀，用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)提取DNA，分別用NSP4全長(zhǎng)引物和編碼區(qū)引物，對(duì)經(jīng)反復(fù)凍融后獲得的重組腺病毒模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃滅活3分鐘，開(kāi)始PCR循環(huán)，條件為94℃60秒，54℃60秒，72℃60秒，共30次，最后72℃延伸7分鐘。
PCR引物由上海生工生物工程公司合成NSP4全長(zhǎng)引物BegRV10F 5’GGCTTTTAAAAGTTCTGTTC3’(SEQ ID NO1)EndRV10R 5’GGTCACGCTAAGACCATTCC3’(SEQ ID NO2)NSP4編碼區(qū)引物
BegRV10F0203 5’TGCGAATTCATGGATAAGCTTGCCGAC3’(SEQ ID NO3)EndRV10R0203 5’AACCTCGAGCATGGATGCAGTCACTTC3’(SEQ ID NO4)分別用NSP4全長(zhǎng)引物和編碼區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以檢測(cè)到750bp和525bp的特異性擴(kuò)增條帶，野生型腺病毒Ad5為陰性，說(shuō)明重組腺病毒基因組中整合有NSP4基因(見(jiàn)圖1)。
(3)Southern Blotting采用Roche公司探針標(biāo)記與雜交試劑盒，按說(shuō)明書操作進(jìn)行。結(jié)果表明在重組腺病毒中確有特異性的RV NSP4基因穩(wěn)定整合。實(shí)驗(yàn)中使用了野生型Ad5作為陰性對(duì)照(見(jiàn)圖2)。
(4)外源基因的表達(dá)檢測(cè)1)RT-PCR檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄收取重組腺病毒及野生型Ad5感染的293細(xì)胞，用800μl Trizol試劑(Invitrogen)處理細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明提取總RNA，溶于20μl DEPC處理水中，用0.5μl DNase I(Takara)處理RNA樣品，除去污染的痕量DNA。加入DMSO 1μl，上下游引物各1μl，RNA 5μl，dNTP 4μl，10×PCRbuffer 5μl，Rnasin 0.5μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)1μl，補(bǔ)加DEPC水至50μl，42℃反應(yīng)1小時(shí)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后補(bǔ)加1μl Taq酶(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同前。用野生型Ad5作為陰性對(duì)照，經(jīng)RT-PCR獲得的cDNA，與預(yù)計(jì)的大小一致，而Ad5則為陰性，表明重組腺病毒在293細(xì)胞內(nèi)均能有效轉(zhuǎn)錄(見(jiàn)圖3)。
2)Western blotting分析目的蛋白表達(dá)待293細(xì)胞生長(zhǎng)至70％-80％豐度時(shí)，接種重組腺病毒，收獲感染的細(xì)胞，離心，分別取上清和細(xì)胞沉淀，取上清80μl，細(xì)胞沉淀用80μl PBS重懸，分別加入20μl 5×上樣緩沖液，15％SDS-PAGE電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)?？梢?jiàn)上清和沉淀在30KD附近均檢測(cè)到特異的條帶，Ad5對(duì)照無(wú)特異條帶產(chǎn)生，說(shuō)明腺病毒攜帶的NSP4基因得到表達(dá)(見(jiàn)圖4)。
4.免疫效果觀察(1)免疫方法將6-8周齡雌性BalB/c純系小鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)隨機(jī)分組，接種前，通過(guò)小鼠尾部采取基礎(chǔ)血，輪狀病毒抗體檢測(cè)均為陰性。鼻腔接種時(shí)，先用乙醚麻醉小鼠，然將100μl[2×108熒光形成單位(IFU)]的重組腺病毒滴入小鼠鼻腔；口服接種時(shí)直接用注射器將200μl(2×108IFU)的重組腺病毒注入小鼠胃內(nèi)。4周和8周后，再次經(jīng)尾部采血，并用與初次免疫時(shí)等量的病毒加強(qiáng)免疫，對(duì)照組，接種等量的野生型5型腺病毒，其它處理完全相同。
(2)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的檢測(cè)免疫后小鼠(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別滴鼻免疫5只，灌胃免疫5只)摘眼球處死，在75％乙醇中浸泡后，超凈臺(tái)中取脾臟，200目篩網(wǎng)研磨，加入5ml 1640無(wú)血清培養(yǎng)液中，離心去上清，加入氯化銨輕輕混勻1分鐘后，馬上離心，1500轉(zhuǎn)，6分鐘，去上清，加入4ml無(wú)血清1640，1500轉(zhuǎn)，10分鐘，洗滌一次，加入1ml 1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，以2×106/ml濃度加入到96孔板中，100μl/孔，5小時(shí)后，待細(xì)胞貼壁，去上清，每孔再加入①含有NSP4蛋白的1640完全培養(yǎng)液，用量為1μg/孔；②相應(yīng)的對(duì)照孔僅加入1640完全培養(yǎng)液，取培養(yǎng)72小時(shí)的上清50μl用于檢測(cè)IFN-γ。
使用小鼠IFN-γ檢測(cè)試劑盒進(jìn)行(Amsham Pharmacia公司)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)系列稀釋的IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA 450nm吸光度值(A450)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的分泌量。發(fā)現(xiàn)滴鼻組能夠產(chǎn)生IFN-γ最高可達(dá)138.2pg/ml，平均為57.1pg/ml，而對(duì)照組沒(méi)有顯著性差別，證明重組腺病毒可誘導(dǎo)針對(duì)NSP4的細(xì)胞免疫反應(yīng)。(見(jiàn)圖5)(3)小鼠血清標(biāo)本中NSP4的特異性IgG抗體檢測(cè)用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋純化的GST-NSP4T(見(jiàn)王大燕，王健偉等.人輪狀病毒NSP4蛋白的表達(dá)及其致小鼠腹瀉模型的初步建立.中國(guó)病毒學(xué)，2003，18(3)217-220)蛋白包被96孔平底酶標(biāo)板(Costar)，每孔100μl(1μg)，4℃過(guò)夜，用含0.05％Tween的PBS(PBST)，pH7.4，洗板4次，以PBST配制含1％BSA的封閉液，按350μl/孔，封閉抗原包被孔，37℃1小時(shí)，洗板。加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的待檢小鼠血清標(biāo)本(抗體稀釋液為PBST中加入BSA，終濃度為0.1％)，100μl/孔，做復(fù)孔，37℃1小時(shí)，洗板5分鐘×4次。加入1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)，37℃1小時(shí)，洗板5分鐘×6次。加入TMB及H2O2底物，37℃作用15分鐘，每孔加入50μl 2mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)，讀取A450值。以P＞0.1且P/N≥2.1判為陽(yáng)性。P待測(cè)孔A值，N陰性對(duì)照組A值(在本實(shí)驗(yàn)中以野生型腺病毒免疫組測(cè)得的A值作為N值)。
結(jié)果表明，初次免疫后血清抗體的滴度可達(dá)1∶1000，陽(yáng)轉(zhuǎn)率為28.5％；再次免疫后，最高血清抗體滴度仍為1∶1000，但是血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率有了較大幅度的提高，達(dá)到了85.7％；第三次免疫后，血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到100％(見(jiàn)圖6)。第三次免疫后42.9％的小鼠血清抗體滴度達(dá)到了1∶10,000。證明重組腺病毒可誘導(dǎo)針對(duì)NSP4的特異性體液免疫。
(4)小鼠血清中特異性抗NSP4 IgA抗體的檢測(cè)方法同上，二抗為1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的抗鼠IgA抗體(Sigma公司產(chǎn)品)。在第三次加強(qiáng)免疫后，血清IgA的滴度為1∶50-100，陽(yáng)轉(zhuǎn)率可以達(dá)到71.4％，證明重組腺病毒可有效誘導(dǎo)針對(duì)NSP4的黏膜免疫。
(5)乳鼠攻毒試驗(yàn)為了評(píng)價(jià)針對(duì)NSP4免疫的保護(hù)效果及其作用機(jī)制，我們將小鼠免疫3次后與雄性小鼠(輪狀病毒抗體陰性)合籠，使其懷孕，對(duì)生產(chǎn)的乳鼠(4日齡)通過(guò)灌胃途徑用SA11株輪狀病毒攻擊，觀察腹瀉的產(chǎn)生情況并進(jìn)行腹瀉評(píng)級(jí)，即將腹瀉分為4級(jí)，1級(jí)為松軟的黃色糞便，4級(jí)為完全的水樣便。2級(jí)(水樣粘液便帶有固體松軟糞便)以上的才判為腹瀉。為了保證評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的一致性，腹瀉的判斷由同一人完成。圖7、圖8、圖9顯示rvAdEasyNSP4免疫組的腹瀉的百分率和腹瀉評(píng)分(反應(yīng)腹瀉嚴(yán)重程度)均較對(duì)照組低，表明表達(dá)NSP4的重組腺病毒免疫小鼠后能產(chǎn)生針對(duì)SA11株輪狀病毒的免疫保護(hù)作用。
上述實(shí)施實(shí)例表明，我們獲得的人輪狀病毒NSP4基因非復(fù)制型重組腺病毒rvAdEasyNSP4，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的針對(duì)輪狀病毒NSP4的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫，滴鼻和灌胃途徑免疫小鼠均能產(chǎn)生針對(duì)SA11株輪狀病毒的免疫保護(hù)作用，能降低腹瀉的百分率和腹瀉的嚴(yán)重程度。由此推之，本發(fā)明的思路也適用于其他的粘膜表達(dá)載體。
本發(fā)明證明，在重組腺病毒rvAdEasyNSP4免疫過(guò)的母鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)之后，其產(chǎn)下的乳鼠對(duì)輪狀病毒攻擊有抵抗作用，這提示抗NSP4的IgG具有保護(hù)作用——因?yàn)橐阎挥蠭gG可以通過(guò)胎盤，活化T細(xì)胞、IgA等不能通過(guò)胎盤。因此有理由相信，基于NSP4的基因疫苗也可以用于免疫多種動(dòng)物，如牛、羊、馬、兔、鼠等，或雞等禽類，生產(chǎn)抗NSP4抗體用于預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉；也可以通過(guò)給動(dòng)物注射基因疫苗的方式，通過(guò)誘導(dǎo)母體的免疫反應(yīng)來(lái)預(yù)防幼仔的輪狀病毒腹瀉。
實(shí)施例2本實(shí)施例中我們構(gòu)建了表達(dá)不同基因型NSP4蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)肌肉注射法免疫小鼠，對(duì)免疫學(xué)效果進(jìn)行了檢測(cè)。本內(nèi)容也適用于其他真核表達(dá)載體。具體步驟如下1.真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-NSP4的構(gòu)建EcoR I和Kpn I分別雙酶切質(zhì)粒pFastBacHTa-NSP4(見(jiàn)王大燕，王健偉等.我國(guó)人輪狀病毒不同基因型NSP4的致病性研究，中國(guó)病毒學(xué)，發(fā)表中)和pCI載體(Promega公司)，經(jīng)T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，堿裂解法小提質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Kpn I雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，可以切下約750bp的目的片段。對(duì)經(jīng)酶切鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定(由上海生工生物工程公司完成)。
2.NSP4基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)測(cè)試用QIAGEN plasmid Midi Kit(Qiagen公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒DNA，溶于無(wú)內(nèi)毒素水中備用。質(zhì)粒提取操作方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。在T-25培養(yǎng)瓶(Nunc公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)293細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的豐度應(yīng)為50％-70％(24小時(shí)內(nèi))。pCI-NSP4質(zhì)粒20μl(約5μg)及10μl的Lipofectamine2000(Invitrogen)分別與100μl M溶液(M溶液為無(wú)抗生素、無(wú)血清的含有谷氨酰胺及NaHCO3的DMEM培養(yǎng)液)充分混勻，室溫下溫育15分鐘，輕輕混合兩種懸液，室溫繼續(xù)作用30分鐘。移去293細(xì)胞的原培養(yǎng)液，用2ml M溶液洗細(xì)胞2次。補(bǔ)加800μlM溶液至Lipofectamine2000-DNA的復(fù)合物中，輕輕混勻后，接種293細(xì)胞，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，溫育3-5小時(shí)。補(bǔ)加4ml含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，溫育過(guò)夜。約24小時(shí)后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，補(bǔ)加5ml DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染3天后刮取293細(xì)胞，涂抗原片，用風(fēng)扇吹干(低倍鏡下觀察是否有足夠的細(xì)胞且分布均勻，可保存于-80℃?zhèn)溆?。按常規(guī)方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)觀察熒光，可以看到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞漿內(nèi)有NSP4抗原的表達(dá)，而pCI空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見(jiàn)到特異性的熒光(見(jiàn)圖10)，證明我們構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中有效表達(dá)NSP4蛋白，可用于基因免疫。
3.DNA疫苗的制備將800ml含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物利用QIAGENEndofree plasmid Mega kit(Qiagen公司)大量提取DNA，操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，DNA溶于試劑盒中提供的無(wú)內(nèi)毒素的TE(pH8.0)中。
(1)濃度測(cè)定測(cè)定核酸溶液在260nm的光密度。1A≈50μg雙鏈DNA。
(2)純度測(cè)定1)分光光度法樣品的A260/A280應(yīng)在1.8～2.0之間。
2)瓊脂糖凝膠電泳法應(yīng)為單一的條帶，無(wú)RNA條帶存在。
3)酶切鑒定法酶切片段與預(yù)期的酶切結(jié)果相符。
4.動(dòng)物免疫試驗(yàn)(1)免疫方法選取6周齡BalB/C雌性小鼠，分為2組①pCI(5只)；②pCI-NSP47只)。注射用DNA的濃度為1μg/μl，每只小鼠每次肌肉注射100μg，每間隔4周免疫1次，共免疫5次，在每次免疫前采鼠尾血進(jìn)行抗體測(cè)試，在最后一次免疫后4周將小鼠放血處死。給小鼠注射時(shí)在注射器的針頭上加套一個(gè)小管，使針頭僅外漏2-3毫米，以保證每次注射時(shí)針頭扎入的深度一致，并注射到肌肉中。將針頭垂直扎入脛骨前肌，把100μl 0.25％的無(wú)菌蔗糖溶液注射入肌肉內(nèi)。將針頭保持3-5秒，防止泄漏，然后將針拔出。間隔24小時(shí)后，在同一部位按照相同方法將100μl濃度為1μg/μl的DNA溶液注射到脛骨前肌內(nèi)。
(2)特異性抗體檢測(cè)用ELISA測(cè)定抗體的效價(jià)，具體方法如下用表達(dá)純化的NSP4蛋白(見(jiàn)王大燕，王健偉等.人輪狀病毒NSP4蛋白的表達(dá)及其致小鼠腹瀉模型的初步建立.中國(guó)病毒學(xué)，2003，18(3)217-220)為抗原包被酶標(biāo)板(Costar公司)，每孔100μl(10ng/μl)，4℃過(guò)夜，酶標(biāo)板用PBS-T洗3×5分鐘后，每孔加入不同稀釋度的待測(cè)血清100μl(用含0.1％BSA的PBST作為抗體稀釋液)，37℃反應(yīng)1小時(shí)，PBS-T洗3×5分鐘，加入HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(用抗體稀釋液作1∶5000稀釋)，每孔100μl，37℃1小時(shí)，PBS-T洗5×5分鐘，加入底物TMB溶液，每孔100l，37℃15-30分鐘，加入50μl 2mol/L硫酸作為終止液，在450nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。以P/N≥2.1為陽(yáng)性。(P為實(shí)驗(yàn)組血清A值，N為pCI空載體免疫組相應(yīng)稀釋度血清A值)。
IgG抗體滴度的檢測(cè)方法如下第一次免疫后血清樣品從1∶16開(kāi)始作倍比稀釋，第二次和第三次免疫后從1∶64開(kāi)始作倍比稀釋，第四次、第五次免疫后從1∶100開(kāi)始倍比稀釋至1∶800，對(duì)陽(yáng)性血清進(jìn)一步進(jìn)行1∶1,000和1∶10,000稀釋。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定每孔的吸光度值。結(jié)果取兩個(gè)復(fù)孔的吸光度值的平均值，空白對(duì)照調(diào)零。血清最高稀釋度的倒數(shù)即為免疫小鼠血清IgG抗體滴度。
我們一共進(jìn)行了5次免疫。以每一組所有小鼠的抗體滴度的幾何平均值作為平均抗體滴度，圖11顯示了免疫小鼠血清的特異性抗NSP4 IgG抗體滴度。免疫前血清為陰性結(jié)果，小鼠第一次免疫后即能檢測(cè)到特異性抗體，但是抗體滴度較低，加強(qiáng)免疫后，特異性結(jié)合抗體逐步升高，尤其在第三次免疫后滴度迅速升高。第四次免疫后抗體滴度達(dá)到1∶800的比例為85.7％，第五次免疫后滴度達(dá)到1∶1000的比例為100％。
由于在實(shí)施例1中，我們已證明抗NSP4的IgG具有良好的保護(hù)作用，因此我們主要檢測(cè)了NSP4 DNA疫苗誘導(dǎo)IgG抗體的情況，結(jié)果表明DNA免疫可以有效誘導(dǎo)針對(duì)NSP4的抗體，這提示表達(dá)NSP4的DNA疫苗也可以有效激發(fā)免疫反應(yīng)。
序列表<110>王健偉王大燕洪濤<120>基于NSP4基因的輪狀病毒基因疫苗<130>CP1050016<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1ggcttttaaa agttctgttc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2ggtcacgcta agaccattcc 20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3tgcgaattca tggataagct tgccgac 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4aacctcgagc atggatgcag tcacttc 2權(quán)利要求
1.一種輪狀病毒基因疫苗，其中含有輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因，所述基因插入作為疫苗載體的病毒、細(xì)菌或者質(zhì)粒中，并能夠在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)多肽而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的基因疫苗，其中所述病毒選自以下腺病毒、皰疹病毒、EB病毒、腺病毒伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦病毒、登革病毒、噬菌體或其任何組合。
3.權(quán)利要求2的基因疫苗，其中所述病毒為腺病毒。
4.權(quán)利要求3的基因疫苗，其為rvAdEasyNSP4。
5.權(quán)利要求1的基因疫苗，其中所述質(zhì)粒為復(fù)制型或非復(fù)制型質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求5的基因疫苗，其為pCI-NSP4。
7.權(quán)利要求1-6之一的基因疫苗，其為注射劑、口服劑、滴鼻劑、噴霧劑或透皮劑形式。
8.輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因作為疫苗的用途。
9.權(quán)利要求1-7之一的基因疫苗用于免疫動(dòng)物制備預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體制劑的用途。
10.預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的抗體的生產(chǎn)方法，包括用權(quán)利要求1-7之一的基因疫苗免疫動(dòng)物，在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體并分離出該抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型疫苗的研制。具體而言，本發(fā)明涉及基于NSP4基因的輪狀病毒基因疫苗及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/12GK1663616SQ20051000740
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月5日
發(fā)明者王健偉, 王大燕, 洪濤 申請(qǐng)人:王健偉, 王大燕, 洪濤