專利名稱：一種靶向性特異性治療肝癌的基因藥物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用藥物，具體涉及基因藥物，尤其是治療肝癌的基因藥物及其制備方法。
背景技術：
肝癌是五大常見的惡性腫瘤之一，在全球發(fā)病率日益上升，嚴重危害著人類的生命健康。和其它腫瘤一樣，肝癌的治療多采用手術治療和化療，但療效不甚理想。隨著基因的分子生物學理論和技術的逐步完善，基因治療給肝癌的治療帶來了希望。如何實現(xiàn)基因治療的靶向性？這是基因治療研究者首先需考慮的問題。
直接殺傷腫瘤細胞是肝癌基因治療的主要策略之一。治療基因是否僅僅針對肝癌細胞而不損傷正常的肝細胞，是值得關注的首要問題。也就是需選擇腫瘤特異性的治療基因。近幾年來，來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白因其獨特凋亡誘導效應而倍受研究者的青睞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療肝癌的基因藥物，使其具有良好的肝細胞靶向性，對肝癌細胞具有極大的殺傷能力，且不誘導正常細胞的凋亡等特點。同時，本發(fā)明還提供了該藥物的制備方法。
以下是實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案。
本發(fā)明提供的靶向性特異性治療肝癌的基因藥物，它是脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物和含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體組成的復合物；所述的真核表達載體為pcDNA3或pcDNA3.1；脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物與含雞貧血病毒VP3基因的真核表達載體的質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為3-6∶1。
本發(fā)明提供的治療肝癌的基因藥物的制備方法，包括以下步驟a.以人血漿為原料制備脫唾液酸粘蛋白(Asor)；[參見Whitehead P.H，SammonsH.G.et al Asimple technique for the isolation of orosomucoid from normal and pathological sera.Biochim.Bioiphy.Acta，1966；124209-211]。
b.用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑水溶性碳二亞胺(EDC)將脫唾液酸粘蛋白(Asor)同多聚左旋賴氨酸(PLL)連接，制備脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物(Asor-PLL)，具體是將Asor、PLL、EDC按質(zhì)量比1∶1∶0.5混合后用蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，37℃下攪拌反應72小時，再經(jīng)透析、凍干后得粉末狀Asor-PLL連接物。
c.采用PCR方法擴增雞貧血病毒標準株的vp3基因，將vp3基因克隆于真核表達載體，得到含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體；d.將上述制得的Asor-PLL連接物與含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體分別溶解于0.9％NaCl溶液中，兩溶液的濃度均為1-10μg/μl，將兩溶液按質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為3-6∶1的比例充分混合后，37℃放置16小時以上，經(jīng)過濾除菌，制得本發(fā)明藥物。所述的以人血漿為原料制備脫唾液酸粘蛋白(Asor)的方法，是通過DEAE-纖維素為填料的離子交換層析和硫酸銨分級分離技術[參見Whitehead P.H，Sammons H.G et al Asimple technique for the isolation of orosomucoid from normal andpathological sera.Biochim.Bioiphy.Acta，1966；124209-211]，從人血漿中提取人血清粘蛋白(Orosomucoid，OR)，然后通過酸水解的方式除去人血清粘蛋白中的唾液酸制得脫唾液酸粘蛋白(Asor)。所述的真核表達載體是pcDNA3或pcDNA3.1。所述的Asor-PLL連接物與含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體的質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為3∶1。
本發(fā)明還提供了一種治療肝癌的基因藥物制劑，該制劑含有有效量的脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物(Asor-PLL)與含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3或pcDNA3.1真核表達載體組成的復合物和制藥學上可接受的載體。如以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液為溶劑的注射液，其所含脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物和含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體復合物的濃度為100-400μg/ml，優(yōu)選濃度為200μg/ml。以含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體的質(zhì)量計算的濃度為200μg/ml。
基因藥物Asor-PLL-pcDNA3-vp3，利用Asor受體介導的內(nèi)吞作用，實現(xiàn)CAV vp3基因的靶向性轉移，同時利用CAV VP3蛋白僅誘導具有致瘤性表型或轉化表型細胞的凋亡，而不誘導正常細胞的凋亡的“腫瘤細胞靶向性”，實現(xiàn)CAV VP3在體內(nèi)特異誘導肝組織中肝癌細胞的凋亡效應以實現(xiàn)肝癌的特異性基因治療。


圖1為尾靜脈注射Asor-PLL-vp3復合物后裸鼠各組織的RT-PCR結果M表示分子量標準，A表示實驗鼠肝組織RT-PCR結果，B表示實驗鼠肝癌組織RT-PCR結果，C表示實驗鼠心肌組織RT-PCR結果，D表示實驗鼠肺組織RT-PCR結果，E表示實驗鼠腎組織RT-PCR結果，F(xiàn)表示實驗鼠脾組織RT-PCR結果。圖中實驗鼠肝組織和肝癌組織的RT-PCR結果為陽性，顯示本發(fā)明藥物具有顯著的肝細胞靶向性。
圖2為Asor-PLL-vp3復合物抑瘤效應。
1表示第一組的實驗組和對照組實驗裸鼠的瘤塊大小平均值統(tǒng)計學直框圖。2表示第二組的實驗組和對照組實驗裸鼠的瘤塊大小平均值統(tǒng)計學直框圖。圖中深色直框圖代表對照組實驗裸鼠瘤塊大小平均值，淺色直框圖代表實驗組實驗裸鼠瘤塊大小平均值。經(jīng)統(tǒng)計學分析，第一組實驗結果P＜0.05，第二組實驗結果P＜0.01，顯示本發(fā)明藥物具有顯著的抑瘤效應。
具體實施例方式
實施例1(1)Asor-PLL連接物的制備以人血漿為原料制備脫唾液酸粘蛋白(Asor)通過DEAE-纖維素為填料的離子交換層析和硫酸銨分級分離技術[參見Whitehead P.H，Sammons H.G.et al Asimpletechnique for the isolation of orosomucoid from normal and pathological sera.Biochim.Bioiphy.Acta，1966；124209-211]，從人血漿中提取人血清類粘蛋白(Orosomucoid，OR)，然后通過酸水解的方式除去人血清粘蛋白中的唾液酸，制得脫唾液酸粘蛋白(Asor)。
人血清類粘蛋白(Orosomucoid，OR)↓酸水解，除唾液酸脫唾液酸粘蛋白(Asor)用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑水溶性碳二亞胺(EDC)將脫唾液酸粘蛋白(Asor)同多聚左旋賴氨酸(PLL)連接，制得脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物(Asor-PLL)，具體是將Asor、PLL、EDC按質(zhì)量比1∶1∶0.5混合后用蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，37℃下攪拌反應72小時，再經(jīng)透析、凍干后得粉末狀Asor-PLL連接物。
(2)采用PCR方法擴增雞貧血病毒標準株的vp3基因，將vp3基因裝入真核表達載體，得到含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體；a.雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)病毒標準株Cux-1由中國獸醫(yī)監(jiān)察所提供。
b.PCR引物vp3基因克隆引物P1為5′CGGGATCCGCTTAGCCGAGAGGGGC3′；BamH Ivp3基因克隆引物P2為5′CGGAATTCGAGCTCTTGCCATC3′；EcoR I5′端分別含有限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I的限制性內(nèi)切酶位點。擴增的目的片段為雞貧血病毒vp3基因的編碼序列及部分調(diào)控序列。
c.PCR擴增反應條件循環(huán)參數(shù)為95℃變性5min，94℃1min、50℃1min、72℃2min，循環(huán)擴增次數(shù)35次，最后72℃延伸10min。
回收純化的PCR產(chǎn)物、載體pcDNA3分別用BamHI和EcoRI進行雙酶切，分別回收0.4Kb和5.0Kb大小的片段。連接和轉化按常規(guī)進行。挑取若干個單菌落，分別進行質(zhì)粒擴增、提取，經(jīng)BglII酶切分析，篩選出含插入片段的重組質(zhì)粒。
vp3基因的測序結果如下(由北京賽百盛公司完成)CGGGATCCGCTTAGCCGAGAGGGGCAACCTGGGCCCAGCGGAGCCGCGCAGGGGCAAGTAATTTCAAATGAACGCTCTCCAAGAAGATACTCCACCCGGACCATCAACGGTGTTCAGGCCACCAACAAGTTCACGGCCGTTGGAAACCCCTCACTGCAGAGAGATCCGGATTGGTATCGCTGGAATTACAATCACTCTATCGCTGTGTGGCTGCGCGAATGCTCGCGCTCCCACGCTAAGATCTGCAACTGCGGACAATTCAGAAAGCACTGGTTTCAAGAATGTGCCGGACTTGAGGACCGATCAACCCAAGCCTCCCTCGAAGAAGCGATCCTGCGACCCCTCCGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAAAGAAAGCTTGATTACCACTACTCCCAGCCGACCCCGAACCGCAAGAAGGCGTATAAGACTGTAAGATGGCAAGACGAGCTCGAATTCCGBglIIAGATCT HindIIIAAGCTT HaeIIIGGCCBamHIGGATCC EcoRIGAATTC ATG起始密碼 TAA終止密碼克隆結果與標準株一致。
(3)將上述制得的Asor-PLL連接物與含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體分別溶解于0.9％NaCl溶液中，兩溶液的濃度均為1-10μg/μl，將兩溶液按質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為3∶1充分混合后，37℃放置16小時，經(jīng)過濾除菌，制得濃度為200μg/ml(以0.9％NaCl溶液中含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體的質(zhì)量計算的濃度)本發(fā)明藥物注射液制劑。
實施例2將脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物和含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體分別溶解于0.9％NaCl溶液中，將兩溶液按質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為4∶1充分混合后，37℃放置16小時，經(jīng)過濾除菌，制得濃度為200μg/ml(以0.9％NaCl溶液中含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體的質(zhì)量計算的濃度)本發(fā)明藥物注射液制劑。
實施例3將脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物和含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體分別溶解于磷酸鹽緩沖液(其組成為0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)中，將兩溶液按質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為3∶1充分混合后，37℃放置16小時，經(jīng)過濾除菌，制得濃度為200μg/ml(以磷酸鹽緩沖液中含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體的質(zhì)量計算的濃度)本發(fā)明藥物注射液制劑。
實施例4藥效學實驗一、實驗材料本發(fā)明基因藥物Asor-PLL-pcDNA3-vp3的生理鹽水(0.9％NaCl)靜脈注射液，其所含脫唾液酸粘蛋白(Asor)一多聚左旋賴氨酸(PLL)連接物和含雞貧血病毒VP3基因的pcDNA3真核表達載體復合物的濃度為200μg/ml。
二、實驗動物裸鼠購置華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，5-6周齡，體重16-24g。
三、建立人肝癌裸鼠原位移植瘤模型首先建立皮下人肝癌荷瘤裸鼠模型，形成人肝癌實體瘤，將瘤體取出，切碎。行皮下瘤肝移植手術建立人肝癌裸鼠原位移植瘤模型。2周后，隨機將存活裸鼠分成實驗組和對照組。
四、實驗方法(1)實驗組尾靜脈注射Asor-PLL-pcDNA3-vp3的生理鹽水靜脈注射液。每克鼠重注射0.1ml。對照組尾靜脈注射等量的生理鹽水作為空白對照。
(2)5天后，處死動物，進行體內(nèi)瘤體及各主要臟器vp3基因分布及表達水平的檢測。通過RT-PCR技術驗證該復合物體內(nèi)的肝細胞靶向性。
a.TRIzol法提取總RNA。(按美國Introvigen公司TRIzol試劑盒說明書進行操作)b.RT(逆轉錄)反應按常規(guī)方法進行。(《分子克隆實驗指南》，J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，科學出版社，1992)c.PCR擴增反應條件PCR引物vp3檢測引物P1為5′CAAGAAGATACTCCACCCG 3′；vp3檢測引物P2為5′TTTAGCTCGCTTACCCTGT 3′；循環(huán)參數(shù)為95℃變性5min；94℃50sec、50℃45sec、72℃1min；循環(huán)擴增次數(shù)35次；72℃10min。PCR產(chǎn)物長度為290bp。
(3)通過觀察腫瘤塊的大小，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，驗證vp3基因的體內(nèi)抑瘤效應。
五、實驗結果腫瘤組織總RNA的RT-PCR結果表明vp3基因在組織中得以表達，且通過裸鼠各主要臟器總RNA的RT-PCR結果，證實了該復合物的肝細胞靶向性，見圖1。第一組實驗組瘤塊平均體積為1.21±0.28mm3，對照組瘤塊平均體積14.33±5.51mm3，經(jīng)統(tǒng)計學分析，P＝0.02682，P＜0.05，見表1。第二組實驗組瘤塊平均體積為1.73±0.72mm3，對照組瘤塊平均體積20.76±7.07mm3，經(jīng)統(tǒng)計學分析，P＝0.006050，P＜0.01，見圖2和表2。
兩組實驗瘤塊體積表表1第一組 單位mm3

P＜0.05，A對照組(3只裸鼠)，B實驗組(3只裸鼠)
表2第二組單位mm3

P＜0.01，A對照組(4只裸鼠)，B實驗組(4只裸鼠)實施例5以磷酸鹽緩沖液(其組成為0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)為溶劑的本發(fā)明藥物注射液取代生理鹽水注射液進行實施例4的藥效學實驗，結果與實施例4一致。
以下為序列表，其中序列1為vp3基因核酸序列；序列2為vp3結構基因?qū)陌被嵝蛄?；序?為vp3基因克隆引物P1；序列4為vp3基因克隆引物P2；序列5為vp3檢測引物P1；序列6為vp3檢測引物P2。
序列表<110>華中科技大學同濟醫(yī)學院<120>一種靶向性特異性治療肝癌的基因藥物及其制備方法<130>1<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>458<212>DNA<213>Chicken anemia virus<220>
<221>CDS<222>(68)..(433)<223>
<400>1cgggatccgc ttagccgaga ggggcaacct gggcccagcg gagccgcgca ggggcaagta 60atttcaa atg aac gct ctc caa gaa gat act cca ccc gga cca tca acg 109Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr1 5 10gtg ttc agg cca cca aca agt tca cgg ccg ttg gaa acc cct cac tgc 157Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys15 20 25 30aga gag atc cgg att ggt atc gct gga att aca atc act cta tcg ctg 205Arg Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu35 40 45tgt ggc tgc gcg aat gct cgc gct ccc acg cta aga tct gca act gcg 253Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala50 55 60gac aat tca gaa agc act ggt ttc aag aat gtg ccg gac ttg agg acc 301Asp Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr65 70 75gat caa ccc aag cct ccc tcg aag aag cga tcc tgc gac ccc tcc gag 349Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu80 85 90tac agg gta agc gag cta aaa gaa agc ttg att acc act act ccc agc 397Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser95 100 105 110cga ccc cga acc gca aga agg cgt ata aga ctg taa gatggcaaga 443Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu115 120cgagctcgaa ttccg 458<210>2<211>121<212>PRT<213>Chicken anemia virus<400>2Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe1 5 10 15Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu20 25 30
Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly35 40 45Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn50 55 60Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln65 70 75 80Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg85 90 95Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro100 105 110Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Arg Leu115 120<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>3cgggatccgc ttagccgaga ggggc 25<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>4cggaattcga gctcttgcca tc 22<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5caagaagata ctccacccg 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>6tttagctcgc ttaccctgt 19
權利要求
1.一種靶向性特異性治療肝癌的基因藥物，它是脫唾液酸粘蛋白Asor-多聚左旋賴氨酸PLL連接物和含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體組成的復合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的治療肝癌的基因藥物，其特征在于所述的真核表達載體是pcDNA3或pcDNA3.1。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的治療肝癌的基因藥物，其特征在于脫唾液酸粘蛋白Asor-多聚左旋賴氨酸PLL連接物與含雞貧血病毒VP3基因的真核表達載體的質(zhì)量比蛋白∶核酸為3-6∶1，優(yōu)選為3∶1。
4.制備權利要求1所述的靶向性特異性治療肝癌基因藥物的方法，包括以下步驟a.以血漿為原料制備脫唾液酸粘蛋白Asor；b.用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑水溶性碳二亞胺EDC將脫唾液酸粘蛋白Asor同多聚左旋賴氨酸PLL連接，制備脫唾液酸粘蛋白Asor-多聚左旋賴氨酸PLL連接物Asor-PLL；c.采用PCR方法擴增雞貧血病毒標準株的vp3基因，將vp3基因克隆于真核表達載體，得到含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體；d.將上述制得的Asor-PLL連接物和含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體分別溶解于0.9％NaCl溶液中，兩溶液的濃度均為1-10μg/μl，將兩溶液按質(zhì)量比蛋白∶核酸為3-6∶1的比例充分混合后，37℃放置16小時，經(jīng)過濾除菌，制得本發(fā)明藥物。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備靶向性特異性治療肝癌基因藥物的方法，其特征在于，所述的以人血漿為原料制備脫唾液酸粘蛋白Asor的方法，是通過DEAE-纖維素為填料的離子交換層析和硫酸銨分級分離技術，從人血漿中提取人血清粘蛋白，然后通過酸水解的方式除去人血清粘蛋白中的唾液酸。
6.根據(jù)權利要求4所述的制備靶向性特異性治療肝癌基因藥物的方法，其特征在于，所述的真核表達載體是pcDNA3或pcDNA3.1。
7.根據(jù)權利要求4所述的制備靶向性特異性治療肝癌基因藥物的方法，其特征在于所述的Asor-PLL連接物與含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體的質(zhì)量比即蛋白∶核酸為3∶1。
8.一種治療肝癌的基因藥物制劑，含有有效量的脫唾液酸粘蛋白Asor-多聚左旋賴氨酸PLL連接物Asor-PLL與含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3或pcDNA3.1真核表達載體組成的復合物和制藥學上可接受的載體。
9.根據(jù)權利要求8所述的治療肝癌的基因藥物制劑，其特征在于它是以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液為溶劑的注射液，其所含脫唾液酸粘蛋白Asor-多聚左旋賴氨酸PLL連接物和含雞貧血病毒vp3基因的pcDNA3真核表達載體復合物的濃度為100-400μg/ml，優(yōu)選濃度為200μg/ml。
10.雞貧血病毒vp3基因或脫唾液酸粘蛋白Asor-多聚左旋賴氨酸PLL連接物與含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體復合物在制備用于治療肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種靶向性特異性治療肝癌的基因藥物及其制備方法，它是脫唾液酸粘蛋白—多聚左旋賴氨酸連接物和含雞貧血病毒vp3基因的真核表達載體組成的復合物；所述的真核表達載體為pcDNA3或pcDNA3.1；脫唾液酸粘蛋白—多聚左旋賴氨酸連接物與含雞貧血病毒VP3基因的真核表達載體的質(zhì)量比(蛋白∶核酸)為3－6∶1，本發(fā)明藥物具有顯著的肝細胞靶向性和顯著的抑瘤效應。
文檔編號A61P35/00GK1762496SQ20051000696
公開日2006年4月26日 申請日期2005年1月14日 優(yōu)先權日2004年10月22日
發(fā)明者屈伸 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院