專利名稱：轉鐵蛋白(Tf)－超氧化物歧化酶(SOD )偶聯(lián)物及制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物藥物特別是轉鐵蛋白(Tf)-超氧化物歧化酶(SOD)偶聯(lián)物及其制備工藝領域。
背景技術：
自從1968年美國學者McCord和Fridovich等人首先發(fā)現(xiàn)了超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase SOD，以下簡稱SOD)、并闡述了陰離子超氧化物自由基的生物學意義以來，人們已經(jīng)從分子水平發(fā)現(xiàn)和揭示了體內自由基水平與臨床各種疾病的發(fā)生密切相關，同時也發(fā)現(xiàn)了SOD對自由基的清除作用，例如血管硬化、腎炎、類風濕等疾病、特別是腦部疾病如帕金森氏病、老年性癡呆等病，均明顯存在由于超氧化物自由基損傷導致的細胞變性、凋亡。SOD是一種高效的自由基清除劑，由于其為非親脂性生物大分子，難以進入細胞，尤其難以通過腦毛細血管壁內皮的血腦屏障(Blood Brain Barrier BBB)，這給用SOD防治這些疾病帶來了困難。目前由轉鐵蛋白(Transferrin Tf，以下簡稱Tf)及其受體(Transferrin ReceptorTfR)介導的胞體轉運作用已被證實。近年來對以Tf或其受體的抗體為載體偶聯(lián)藥物作為腫瘤導向治療的方法展開了廣泛研究，并取得了一定的效果。但一直沒有發(fā)現(xiàn)有療效比較顯著、技術比較成熟的有關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是針對病因與自由基損害密切相關的帕金森氏等疾病，提供一種有效發(fā)揮SOD的臨床疾病防治作用的藥物及其制備方法。
本發(fā)明以如下技術方案解決上述技術問題將轉鐵蛋白Tf與超氧化物歧化酶SOD進行偶聯(lián)形成Tf-SOD偶聯(lián)物。
Tf-SOD偶聯(lián)物的制備方法是第一步，分別從動物血漿及血液紅細胞中用生化方法提取純化Tf及SOD。
第二步，用蛋白偶合劑使Tf與SOD偶聯(lián)形成Tf-SOD偶聯(lián)物，用層析法清除偶合劑及非結合部分的Tf、SOD，得Tf-SOD偶聯(lián)物純品，經(jīng)濾菌，檢測SOD活性，檢驗合格即得產(chǎn)品。
Tf-SOD偶聯(lián)物具有與Tf受體結合及SOD的生物活性，可將Tf作為一種轉運因子與血管內皮細胞上的受體結合介導大分子藥物SOD進入細胞及器官腦、心、肝、腎等，穿越血腦屏障，有效地發(fā)揮SOD臨床疾病的防治作用，主要用于防治腦、心、肝、腎、血管等疾病，特別是大分子藥物難以透過的帕金森氏病等腦部疾病。
具體實施例方式
本發(fā)明生產(chǎn)的能有效發(fā)揮SOD臨床疾病防治作用的藥物，是將轉鐵蛋白Tf與超氧化物歧化酶SOD進行偶聯(lián)形成的Tf-SOD偶聯(lián)物。
將Tf與SOD進行偶聯(lián)形成Tf-SOD偶聯(lián)物的制備工藝步驟為a.分別從動物血漿及血液紅細胞中用生化方法提取純化Tf及SOD。
b.用蛋白偶合劑使Tf與SOD偶聯(lián)形成Tf-SOD偶聯(lián)物，另將部分SOD標記上同位素碘125再與Tf偶聯(lián)形成Tf-SOD-I125偶聯(lián)物。分別用層析法清除偶合劑及非結合部分的Tf、SOD、I125。得Tf-SOD偶聯(lián)物、Tf-SOD-I125偶聯(lián)物純品，經(jīng)濾菌，檢測SOD活性，檢驗合格的Tf-SOD偶聯(lián)物，可供疾病動物模型進行藥效實驗用。
用生產(chǎn)出的Tf-SOD偶聯(lián)物進行小鼠血腦屏障穿透試驗時，分別用SOD-I125、Tf-SOD-I125偶聯(lián)物進行鼠頸動脈灌注，10分鐘后用生理鹽水對動物灌流，沖洗腦血管內殘留的SOD-I125、Tf-SOD-I125，取出腦組織測定同位素含量。腦組織中Tf-SOD-I125組I125含量大于SOD-I125組。
結果如下表 腦組織中Tf-SOD-I125組I125含量大于SOD-I125組約7倍。
制造鼠帕金森氏病動物模型時，用親神經(jīng)性自由基損害劑甲基-苯基-四氫吡啶(MPTP)注射試驗鼠。再用上述Tf-SOD偶聯(lián)物對模型治療組試驗鼠進行保護性治療，用免疫組織化學、電子顯微技術及生化分析等手段，均可觀察到實驗動物腦組織、黑質膽堿能神經(jīng)細胞等受到良好的保護。如黑質部位TH陽性細胞計數(shù)顯示MPTP組885.0±167.5，Tf-SOD偶聯(lián)物組2230.0±210.3，正常對照組2423.0±178.0。實驗表明，Tf-SOD偶聯(lián)物組細胞存活數(shù)顯著高于MPTP組，而Tf-SOD偶聯(lián)物組與正常對照組的細胞存活數(shù)不存在顯著性差異。
以下是制備Tf-SOD偶聯(lián)物的實施例實施例1一.Tf提取純化1.鹽析取血漿200ml，加入0.1M NaHCO354ml，混勻，滴加三氨乙酸-Cl35.4ml，25℃攪拌5小時，再加入硫酸銨63克，25℃放置3小時。然后7000rpm離心30分鐘，棄上清液，取沉淀用30ml PH7.8 0.02M Tris-HCl緩沖液溶解，裝入透析袋中，對上述緩沖液透析12小時，中間換液三次。
2.柱層析取上述鹽析提取物上DEAE-sephacell柱，用PH7.8 0.02M Tris-HC緩沖液平衡洗脫，再用含0.05～0.5M NaCl的緩沖液作線性梯度洗脫，收集得到5個組份，第3組份為Tf。將第3組份對蒸餾水透析、凍干保存。
二.SOD提取純化1.有機溶劑提取取紅細胞200克，用生理鹽水洗滌2次，用2倍體積蒸餾水攪拌溶解細胞30分鐘，然后緩慢加入0.25倍體積95％乙醇和0.15倍體積氯仿，攪拌15分鐘，離心去血紅蛋白沉淀，取上清液裝透析袋中，對PH7.6 0.02M磷酸緩沖液透析24小時，中間換液三次。
2.層析取上述提取液上DEAE-sephacell柱，用PH7.8 0.02M Tris-HC緩沖液平衡洗脫，再用含0.05～0.5M NaCl的緩沖液作線性梯度洗脫，收集得到4個組份，第3組份為SOD。將第3組份對蒸餾水透析、凍干保存。
三.Tf-SOD偶聯(lián)物制備1.SOD活化反應取SOD 400mg用含0.001M EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16M硼酸緩沖液溶解，滴加用7ml同樣緩沖液溶解的2-亞氨氫氯化硫醇12mg。攪拌反應1.5小時，加入37mg甘氨酸終止反應。反應液上sephadex G-25柱，用0.001M EDTA的PH7.40.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，收集第1組份。
2.Tf活化反應取Tf 400mg用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液溶解，滴加用3ml二甲亞砜溶解的45mgN-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應1.5小時，反應液上sephadex G-25柱，用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，收集第1組份。
3.Tf、SOD結合反應將上述活化反應后的Tf及SOD組份相混合，攪拌反應3小時。反應液經(jīng)濃縮上sephadex G-200柱，用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，第1組份為Tf-SOD偶聯(lián)物。進一步濾菌、凍干保存。
實施例2一.Tf提取純化同實施例1；二.SOD提取純化同實施例1；三.Tf-SOD偶聯(lián)物制備1.SOD活化反應取SOD 400mg用含0.001M EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16M硼酸緩沖液溶解，滴加用7ml同樣緩沖液溶解的2-亞氨氫氯化硫醇27mg。攪拌反應1.5小時，加入37mg甘氨酸終止反應。反應液上sephadex G-25柱，用0.001M EDTA的PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，收集第1組份。
2.Tf活化反應取Tf400mg用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液溶解，滴加用3ml二甲亞砜溶解的30mg N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應1.5小時，反應液上sephadex G-25柱，用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，收集第1組份。
3.Tf、SOD結合反應將上述活化反應后的Tf及SOD組份相混合，攪拌反應3小時。反應液經(jīng)濃縮上sephadex G-200柱，用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，第1組份為Tf-SOD偶聯(lián)物。進一步濾菌、凍干保存。
實施例3一.Tf提取純化同實施例1；二.SOD提取純化同實施例1；三.Tf-SOD偶聯(lián)物制備1.SOD活化反應取SOD 400mg用含0.001M EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16M硼酸緩沖液溶解，滴加用7ml同樣緩沖液溶解的2-亞氨氫氯化硫醇43mg。攪拌反應1.5小時，加入37mg甘氨酸終止反應。反應液上sephadex G-25柱，用0.001M EDTA的PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，收集第1組份。
2.Tf活化反應取Tf400mg用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液溶解，滴加用3ml二甲亞砜溶解的13mg N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應1.5小時，反應液上sephadex G-25柱，用PH7.4 0.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，收集第1組份。
3.Tf、SOD結合反應將上述活化反應后的Tf及SOD組份相混合，攪拌反應3小時。反應液經(jīng)濃縮上sephadex G-200柱，用PH7.40.01M磷酸緩沖液平衡洗脫，其中第1組份為Tf-SOD偶聯(lián)物。進一步濾菌、凍干保存。
以下是Tf-SOD偶聯(lián)物的應用實例本發(fā)明Tf-SOD偶聯(lián)物對小鼠帕金森病模型的藥理效應選用40日齡小鼠(14-16克)隨機分成3組1、MPTP實驗組(制造帕金森模型)；2、Tf-SOD治療組(針對帕金森模型治療)；3、對照組(注射生理鹽水)。實驗結果實驗進行30天后將實驗小鼠用戊巴比妥鈉麻醉，依次用生理鹽水和4％多聚甲醛作動脈灌流，取腦組織進行實驗觀察。HE染色光鏡分析和電鏡分析，分別顯示MPTP實驗組腦組織神經(jīng)元胞核固縮，出現(xiàn)空泡變性，Nissl體溶解；大量明顯的髓鞘脫落。而在正常對照組及Tf-SOD治療組中未見上述病理改變的形成。免疫組化分析腦黑質部位多巴胺細胞計數(shù)顯示，Tf-SOD治療組細胞存活數(shù)顯著高于MPTP實驗組(P＜0.05)，而與正常對照組不存在顯著性差異(P＞0.05)。實驗結果表明Tf-SOD偶聯(lián)物可以通過血腦屏障，對小鼠帕金森病模型能產(chǎn)生良好的藥理效應。
權利要求
1.一種轉鐵蛋白(Tf)-超氧化物歧化酶(SOD)偶聯(lián)物，含有超氧化物歧化酶SOD，其特征是將轉鐵蛋白Tf與SOD進行偶聯(lián)形成Tf-SOD偶聯(lián)物。
2.一種轉鐵蛋白(Tf)-超氧化物歧化酶(SOD)偶聯(lián)物的制備方法，其特征是工藝步驟為a.分別從動物血漿及血液紅細胞中用生化方法提取純化Tf及SOD；b.用蛋白偶合劑使Tf與SOD偶聯(lián)形成Tf-SOD偶聯(lián)物，用層析法清除偶合劑及非結合部分的Tf、SOD，得Tf-SOD偶聯(lián)物純品，經(jīng)濾菌，檢測SOD活性，檢驗合格即得產(chǎn)品。
全文摘要
一種轉鐵蛋白(Tf)－超氧化物歧化酶(SOD)偶聯(lián)物，將轉鐵蛋白Tf與SOD進行偶聯(lián)形成Tf－SOD偶聯(lián)物。其制備工藝是首先分別從動物血漿及血液紅細胞中用生化方法提取純化Tf及SOD，再用蛋白偶合劑使Tf與SOD偶聯(lián)形成Tf－SOD偶聯(lián)物，用層析法清除偶合劑及非結合部分的Tf、SOD，得Tf－SOD偶聯(lián)物純品。該偶聯(lián)物具有與Tf受體結合及SOD的生物活性，可將Tf作為一種轉運因子與血管內皮細胞上的受體結合介導大分子藥物SOD進入細胞及器官腦、心、肝、腎等，能有效發(fā)揮SOD臨床疾病的防治作用，主要用于防治腦、心、肝、腎、血管等疾病。
文檔編號A61P25/00GK1762489SQ200510018948
公開日2006年4月26日 申請日期2005年6月16日 優(yōu)先權日2005年6月16日
發(fā)明者廖共山 申請人:廣西醫(yī)科大學