專利名稱：去乙酰車葉草酸在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以從黃毛耳草中分離的物質(zhì)—去乙酰車葉草酸的新用途，特別是在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
去乙酰車葉草酸(asperuloside)其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。
去乙酰車葉草酸可以從黃毛耳草(Hedyotis chrysotricha)、杜仲(Eucommia ulmoidesOliver)等植物中分離，去乙酰車葉草酸也可以從其他植物中分離。去乙酰車葉草酸作為一種已經(jīng)有的物質(zhì)，盡管有確切的分子式和結(jié)構(gòu)式，但其研究的活躍性不高，作為單體在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用還沒有見報(bào)道。
RA是Rheumatoid arthritis的簡(jiǎn)稱。
RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性自身免疫性疾病，目前仍無治療良策。RA的早期病變主要在滑膜，由于感染或創(chuàng)傷等因素的刺激，滑膜細(xì)胞迅速增殖，合成多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等。各種細(xì)胞因子聯(lián)合介導(dǎo)RA炎癥和組織損傷，其中以TNF-α的作用較為突出，TNF-α是能夠引起腫瘤組織出血壞死、并具有多方面的細(xì)胞因子。在活動(dòng)性RA中，TNF-α參與三種主要病理過程(1)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，在關(guān)節(jié)炎時(shí)，血液中的白細(xì)胞正是通過與黏附分子互相作用被匯集到關(guān)節(jié)腔的。(2)刺激結(jié)締組織細(xì)胞和多形核細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素等小分子炎癥介質(zhì)。(3)通過刺激滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，減少糖蛋白合成，增加蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和軟骨的破壞及骨關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)障礙。因此通過抑制TNF-α的產(chǎn)生，從而阻止滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖是RA治療的可取途徑之一。
另外IL-1β的作用也較為突出，幾乎各種有核細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-1β，但大多數(shù)細(xì)胞在正常時(shí)并不合成IL-1β，只在激活后才被誘導(dǎo)合成IL-1β和IL-1β前體蛋白。脂多糖(LPS)是最有效的IL-1β誘導(dǎo)劑，能快速誘導(dǎo)多種細(xì)胞表達(dá)IL-1β。IL-1β能刺激滑膜成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞高度增殖，構(gòu)成RA特征性血管翳；刺激軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素(PGE2)以及膠原酶等多種蛋白水解酶；激活中性粒細(xì)胞，釋放溶酶體酶、自由基等炎性遞質(zhì)，引起關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)等組織破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎粘連以及后期關(guān)節(jié)畸形。因此通過抑制IL-1β的產(chǎn)生；從而阻止滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖是RA治療的可取途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供去乙酰車葉草酸的新用途，去乙酰車葉草酸在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
去乙酰車葉草酸的獲得首先用黃毛耳草(Hedyotis chrysotricha)藥材重量5倍的乙醇將藥材回流提取3次，每次1小時(shí)；然后將提取液離心或過濾，濾液在55℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml，再過濾，取上清液；將上清液拌入硅膠，進(jìn)行硅膠柱層析，用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分別洗脫，收集丙酮洗脫液，減壓濃縮至干；取丙酮提取物用乙醇溶解，拌入3倍量的硅膠，干燥后用硅膠柱色譜分離，硅膠色譜柱分離的洗脫溶劑為等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脫流速為500毫升/小時(shí)。薄層色譜檢查，合并相同部分，再進(jìn)行一次反相硅膠柱色譜分離，為等比例重量的甲醇∶水混合液洗脫，洗脫流速為60毫升/小時(shí)，薄層色譜檢查，合并相同部分，得到去乙酰車葉草酸，去乙酰車葉草酸的得率是0.377％。
或者，首先用黃毛耳草(Hedyotis chrysotricha)藥材重量5倍的乙醇將藥材回流提取3次，每次1小時(shí)；然后將提取液離心或過濾，濾液在55℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml，再過濾，取上清液；將上清液進(jìn)行大孔樹脂柱層析，用等比例重量的乙醇-水洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓濃縮至干；取乙醇洗脫物用甲醇溶解，拌入3倍量的硅膠，干燥后用硅膠柱色譜分離，硅膠色譜柱分離的洗脫溶劑為氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脫流速為500毫升/小時(shí)。薄層色譜檢查，合并相同部分，進(jìn)行凝膠柱色譜純化，等比例重量的甲醇∶水混合液洗脫，薄層色譜檢查，合并相同部分，洗脫液合并后再進(jìn)行一次硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇混合液洗脫，洗脫流速為200毫升/小時(shí)，得到去乙酰車葉草酸，去乙酰車葉草酸的得率是0.285％。
去乙酰車葉草酸還可以采用其他方法獲得。
在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物領(lǐng)域，有很多文獻(xiàn)報(bào)道藥物成分對(duì)對(duì)滑膜細(xì)胞分泌TNF-α，PGE2和IL-1β的影響，用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)來考察藥物治療RA的效果。這些文獻(xiàn)有[1]鞠大宏，賈紅偉，吳皓，等，鹿瓜多肽注射液對(duì)C II誘導(dǎo)的免疫性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α、IL-6以及C II抗體活性的影響，中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，9(11)17。[2]何金華，梁清華，張花先，等，痹腫消湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠血漿TNF-α的影響，湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27(5)524。[3]黃清春，張聲鵬，徐秋英，復(fù)方丹參對(duì)II型膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠模型滑膜細(xì)胞分泌及腫瘤壞死因子的影響，現(xiàn)代康復(fù)，2001，5(10)54-55。[4]鄭治鋼，細(xì)胞因子及其檢測(cè)方法和臨床意義，陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2001，16(2)59。[5]周軍，方素萍，齊云，等，葛根湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)液炎癥介質(zhì)的影響，中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2001，7(3)29。[6]馬驥，盧秉久，朱曉明，等，通痹顆粒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效學(xué)研究，中醫(yī)藥學(xué)刊，2001，19(6)734。[7]朱江，謝文利，晉玉章，等，梔子對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β和TNF α的影響，中成藥，2005，27(7)801。[8]黃清春，張聲鵬，黃偉毅，等，復(fù)方丹參注射液對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞IL-1βmRNA表達(dá)的影響，安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21(5).-39-41。
取本發(fā)明方法獲得的去乙酰車葉草酸，按文獻(xiàn)[3]提供的方法進(jìn)行模型制備、藥物分組、大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)及上清液的制備。
按文獻(xiàn)[3]提供的方法考察藥物成分對(duì)對(duì)滑膜細(xì)胞分泌TNF-α，PGE2的影響。按文獻(xiàn)[8]提供的方法考察藥物成分對(duì)對(duì)滑膜細(xì)胞分泌IL-1β的影響。
去乙酰車葉草酸大劑量組(20mg/kg.d)；去乙酰車葉草酸小劑量組(10mg/kg.d)與正常對(duì)照、氯化鈉組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表1滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量(x±s，ng/ml)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與氯化鈉組比較，△P＜0.05表2滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β含量(x±s，ng/ml)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與氯化鈉組比較，△P＜0.05表3滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2的含量(x±s，ng/ml)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與氯化鈉組比較，△P＜0.05本發(fā)明采用文獻(xiàn)1、2、3、4、5、6、7、8提供的方法考察去乙酰車葉草酸成分對(duì)對(duì)滑膜細(xì)胞分泌TNF-α，PGE2、IL-1β的影響。也有類似趨勢(shì)。
本發(fā)明以大鼠為人類RA動(dòng)物模型，采用滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，觀察了去乙酰車葉草酸對(duì)滑膜細(xì)胞分泌TNF-α，PGE2和IL-1β的影響，結(jié)果表明，大劑量組、小劑量組均能顯著下調(diào)TNF-α，PGE2和IL-1β的含量，與空白組存在顯著性差異，不能恢復(fù)至空白組水平，且三組間無顯著性差異，這表明去乙酰車葉草酸能抑制TNF-α的產(chǎn)生，減少IL-1β的產(chǎn)生，從而減少PGE2等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，達(dá)到減輕致骨和軟骨的破壞恢復(fù)關(guān)節(jié)活動(dòng)功能，發(fā)揮治療RA效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、首先用黃毛耳草(Hedyotis chrysotricha)藥材重量5倍的乙醇將藥材回流提取3次，每次1小時(shí)；然后將提取液離心或過濾，濾液在55℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml，再過濾，取上清液；將上清液拌入硅膠，進(jìn)行硅膠柱層析，用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分別洗脫，收集丙酮洗脫液，減壓濃縮至干；取丙酮提取物用乙醇溶解，拌入3倍量的硅膠，干燥后用硅膠柱色譜分離，硅膠色譜柱分離的洗脫溶劑為等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脫流速為500毫升/小時(shí)。薄層色譜檢查，合并相同部分，再進(jìn)行一次反相硅膠柱色譜分離，為等比例重量的甲醇∶水混合液洗脫，洗脫流速為60毫升/小時(shí)，薄層色譜檢查，合并相同部分，得到去乙酰車葉草酸，去乙酰車葉草酸的得率是0.377％。
實(shí)施例2、首先用黃毛耳草(Hedyotis chrysotricha)藥材重量5倍的乙醇將藥材回流提取3次，每次1小時(shí)；然后將提取液離心或過濾，濾液在55℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml，再過濾，取上清液；將上清液進(jìn)行大孔樹脂柱層析，用等比例重量的乙醇-水洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓濃縮至干；取乙醇洗脫物用甲醇溶解，拌入3倍量的硅膠，干燥后用硅膠柱色譜分離，硅膠色譜柱分離的洗脫溶劑為氯仿∶甲醇∶水混合液，洗脫流速為500毫升/小時(shí)。薄層色譜檢查，合并相同部分，進(jìn)行凝膠柱色譜純化，等比例重量的甲醇∶水混合液洗脫，薄層色譜檢查，合并相同部分，洗脫液合并后再進(jìn)行一次硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇混合液洗脫，洗脫流速為200毫升/小時(shí)，得到去乙酰車葉草酸，去乙酰車葉草酸的得率是0.285％。
實(shí)施例3、取按實(shí)施例1的方法獲得的去乙酰車葉草酸200克，低取代羥丙纖維素20克，PEG 6000 20克，微晶纖維素210克，PVP 50克，乳糖440克，硬脂酸鎂60克分別粉碎均勻后，混合壓制成1000片。
治療方法類風(fēng)濕病人每天服用兩次，每次1-2片。療程7-21天。
實(shí)施例4、取按實(shí)施例2的方法獲得的去乙酰車葉草酸100克，低取代羥丙纖維素20克，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮30克，微晶纖維素100克，蔗糖650克，硬脂酸鎂50克分別粉碎均勻后，混合壓制成1000片。
治療方法類風(fēng)濕病人每天服用兩次，每次2-4片。療程7-21天。
權(quán)利要求
1.去乙酰車葉草酸在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可以從黃毛耳草中分離的物質(zhì)—去乙酰車葉草酸的新用途，特別是在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明以大鼠為人類RA動(dòng)物模型，采用滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，觀察了去乙酰車葉草酸對(duì)滑膜細(xì)胞分泌TNF－α，PGE
文檔編號(hào)A61P29/00GK1915235SQ20051001932
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者李斌 申請(qǐng)人:李斌