專利名稱：粗枝藻甲素的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從中國海洋紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中提取分離得到的化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)，經(jīng)過生物活性測試，結(jié)果表明該化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的活性。該化合物可作為PTP1B抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療各種糖尿病、肥胖癥及其由此引起的并發(fā)癥。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水、和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。在糖尿病人群中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。
目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90％以上是II型糖尿病。WHO預(yù)計，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。
I型糖尿病病人由于第6對染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學(xué)毒性物質(zhì)刺激的反應(yīng)異常，直接或間接通過自身免疫反應(yīng)，引起胰島β細胞破壞，以致胰島素不足，必須依賴胰島素治療維持生命。
II型糖尿病也有很強的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異?？偟膩碚f可概括為胰島素分泌的相對不足和胰島素抵抗。對II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究證實，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。在研究脂肪細胞和肌肉細胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，設(shè)計開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗狀態(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點，也是其主要方向之一。
II型糖尿病的特征是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵抗。雖然其具體機制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷必定是直接因素。胰島素通過與其受體胞外α亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)β亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過磷酸化其底物將信號傳遞下去。隨著對細胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認識的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基去磷酸化，從而負調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強和延長胰島素信號，成為越來越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。
PTPases包括一大家族跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能在胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)影響正常胰島素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2和PTP1B。
PTP1B是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蜍卵母細胞中，將減少胰島素誘導(dǎo)的卵母細胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達；用滲透休克的方法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC-7肝細胞經(jīng)胰島素刺激時DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實驗中也對IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細胞中PTP1B的高表達能明顯降低配體誘導(dǎo)的IR磷酸化水平；用腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細胞L6肌細胞和Fao細胞中高表達PTP1B，明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并從而顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復(fù)合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導(dǎo)的糖原合成也被抑制[Egawa K.et al.J.Biol.Chem.276(13)，10207-10211.]。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細胞3T3-L1細胞中高表達PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44MAPK磷酸化水平也明顯降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影響[Venable C.L.et al.J.Biol.Chem.275(24)，18318-18326.]。PTP1B的高表達對基本的、中等的及最大量胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運無影響，對轉(zhuǎn)運的EC50胰島素濃度無影響。這些研究證明PTP1B能夠負調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并主要作用于胰島素受體。更為重要的實驗證據(jù)來自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報道，運用同源重組的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠生長正常，有生殖力，對胰島素敏感性顯著增強，而且這一增強作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物1磷酸化水平的增強相關(guān)[Elchebly M.，et al.Science，283，1544-1548.]。這些實驗更加有力地證明了PTP1B在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療二型糖尿病和肥胖癥的一個潛在藥物作用靶點。
紅藻的藻體呈紫色或紫紅色，大多數(shù)為多細胞，有絲狀、片狀和分枝狀。形態(tài)多姿，有圓形、橢圓形、帶形。紅藻多數(shù)喜居深海，生長在低潮線附近和低潮線以下30～60米處，少數(shù)種類可在200米的海底生長。紅藻類約有2500多種，其中最為常見的種類有紫菜、石花菜、紅毛藻、海索面、雞毛藻、粘管藻、海蘿、蜈蚣藻、海頭紅、多管藻、鷓鴣菜等。其中在浙江南麂一帶分部較多。
粗枝藻甲素(Crassicaulisine)是首次從紅藻粗枝軟骨藻(Chondriacrassicaulis Harv.)中分離得到的新型糖脂類化合物，經(jīng)文獻檢索，未見有相同結(jié)構(gòu)和活性方面的報道。經(jīng)多次蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B實驗研究表明，該化合物具有抑制PTP1B的顯著活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的用途。
本發(fā)明的化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式

該化合物系首次從紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中分離得到，故命名為粗枝藻甲素(Crassicaulisine)。粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的理化性狀如下白色粉末狀，光學(xué)活性{[α]D+43.0(c 0.13，MeOH)}；負離子模式電噴霧離子質(zhì)譜m/z 789(M+H)+，m/z 811(M+Na)+；分子式為C39H73O12SNa。1H與13C NMR譜數(shù)據(jù)見表1。
表1 化合物Crassicaulisine的1H，13C NMR數(shù)據(jù)對照表

從紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中提取化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的方法，其步驟如下將風(fēng)干的粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)用工業(yè)甲醇室溫浸泡提取完全。減壓濃縮提取液得甲醇浸膏。將甲醇浸膏溶于水中，成混懸液后用CH2Cl2提取，濃縮萃取液得到CH2Cl2浸膏。CH2Cl2浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇，洗脫梯度逐漸增大，收集用MeOH∶EtOAc＝1∶4時洗脫下來的流分，然后再上硅膠柱，用CHCl3∶MeOH＝9∶1洗脫，得到化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)。
參考文獻Z.-Y.Shao，J.-N.Cai，Q.-Z.Ye and Y.-W.Guo.J.Nat.Prod.，2002，Vol.4(3)，pp.205-209。
本發(fā)明對所得化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)進行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性實驗，表明其有明顯的抑制活性。
測試原理利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTP1B)催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后的hPTP1B重組蛋白能水解底物pNPP的磷酯鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強的光吸收，因此可以通過直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標準的測活體系如下10mM Tris.Cl，PH7.6，10mM PNPP，2％ DMSO，100nMhPTP1B。

觀察指標動態(tài)測定波長為410nm處的光吸收，時間為3分鐘，其動力學(xué)曲線一級反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標。
實驗結(jié)果的評判與解釋篩選結(jié)果是當(dāng)化合物的濃度為10μg/ml時對酶活性的百分抑制率，抑制活性高于50％時，按常規(guī)篩選得出IC50，陽性對照正釩酸鈉的IC50為2μM。

具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施實例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
1H-NMR用Bruker DRX-400型儀測定；MS用VG ZAB-HS或VG-7070型儀測定，除注明外均為EI源(70ev)；所使用的硅膠，包括200-300目和GF254為青島海洋化工廠或煙臺緣博硅膠公司生產(chǎn)；所使用的Shephadex LH-20為E.Merck公司生產(chǎn)；實施例一化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的制備(1)提取將風(fēng)干的粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)4.6(kg)用工業(yè)甲醇室溫浸泡提取完全。減壓濃縮提取液得甲醇浸膏。將甲醇浸膏溶于水中，成混懸液后用CH2Cl2提取，濃縮萃取液得到CH2Cl2浸膏(70g)。
(2)分離CH2Cl2浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇，洗脫梯度逐漸增大，收集用MeOH∶EtOAc＝1∶4時洗脫下來的流份，然后再上硅膠柱，用CHCl3∶MeOH＝9∶1洗脫，得到化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)(538mg)。
實施例二化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)的PTP1B抑制活性實驗實驗方法用于篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B基因通過分子克隆的方法構(gòu)建到pGEX-KG載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達并破胞后經(jīng)glutathione agarose親和層析柱純化得到GST融合蛋白。經(jīng)12％SDS-PAGE膠分離鑒定，其純度均達到90％以上。進一步分析其酶學(xué)性質(zhì)(Km、kcat)均與文獻報道的重組蛋白一致。
采用紫外底物pNPP(發(fā)明內(nèi)容中測試原理)，PTP1B水解底物pNPP中的磷酯鍵得到的產(chǎn)物在410nm處有很強的光吸收，可以直接監(jiān)測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化，考察粗枝藻甲素對重組酶的活性的抑制情況，以初步評價化合物的生物活性。陽性對照正釩酸鈉的IC50為2μM。實驗結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的粗枝藻甲素的用途在制備預(yù)防、治療蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B活性亢進引起的疾病的藥物中應(yīng)用
2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的粗枝藻甲素的用途，其特征在于在制備預(yù)防、治療各種糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所示的粗枝藻甲素的用途，其特征在于在它作為胰島素增敏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一類從中國海洋紅藻粗枝軟骨藻(Chondria crassicaulis Harv.)中提取、分離獲得的新型的具有蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性的化合物粗枝藻甲素(Crassicaulisine)，結(jié)構(gòu)如上。經(jīng)多次體外蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制實驗表明，該類化合物具有明顯的PTP1B抑制活性，可在制備糖尿病、肥胖癥及并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。對開發(fā)利用中國的藥用植物資源具有重要意義。
文檔編號A61P3/10GK1903210SQ20051002828
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者郭躍偉, 李佳, 邵志宇, 南發(fā)俊, 姚勵功 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所