專利名稱：黃芩總黃酮提取物及黃芩苷在抗骨質(zhì)疏松藥物制備中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療和/或預防骨質(zhì)疏松的藥物，具體的說涉及黃芩總黃酮提取物及黃芩苷在治療和/或預防骨質(zhì)疏松藥物制備中的用途。
背景技術：
骨質(zhì)疏松癥(有時也簡稱為骨質(zhì)疏松)是全身骨骼成分減少的一種骨骼疾病，主要表現(xiàn)為骨組織內(nèi)單位體積中骨量減少，骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)隨年齡的增加(或婦女絕經(jīng)后)等比例的減少，骨組織的顯微結構發(fā)生改變而致其骨組織的正常荷載功能發(fā)生變化。骨質(zhì)疏松在臨床上表現(xiàn)為腰背疼、病理性骨折、椎體變形、體態(tài)變形致“龜背”出現(xiàn)，伴有周身骨骼的疼痛等癥狀。
原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥占骨質(zhì)疏松癥的90％。它是老年人的一種常見病，一種全身性骨病。主要表現(xiàn)是骨組織的礦物質(zhì)和骨基質(zhì)均有減少、骨量低和骨的微細結構有破壞，導致骨的脆性增加和容易發(fā)生骨折。女性較男性多見，常見于絕經(jīng)后婦女和老年人，在輕微外傷或無外傷的情況下都容易發(fā)生骨折，75歲以上的婦女骨折發(fā)生率高達80％以上。
骨質(zhì)疏松癥是骨骼代謝異常的疾病，它的產(chǎn)生原因至今尚未明確，但醫(yī)學界認為與下列因素有關內(nèi)分泌因素，其中雌激素降低是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因，此外與營養(yǎng)、遺傳、營養(yǎng)狀況、生活方式等密切相關。
目前臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物有維生素D類藥物、甲狀旁腺素(PHT)、氟化物、同化激素、雙磷酸鹽類等。這些藥物長期應用均產(chǎn)生嚴重的毒副作用，同時一些患者因禁忌癥不能應用這些藥物，因此研制安全、有效地治療骨質(zhì)疏松癥的天然藥物具有其重要的社會和經(jīng)濟價值。
黃芩(Scutellaria baicalensi.s Georgi)為常用中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。其主要有效成分為黃酮類化合物。
目前從黃芩中已發(fā)現(xiàn)41種黃酮類化合物，其中含量較高并具有明顯藥理作用的是黃芩甙、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩甙?，F(xiàn)代藥理研究證明黃芩不僅具有明顯的抗菌消炎、抗過敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒的作用，而且對心血管也具有一定作用。目前，對其藥理學的具體研究如下1.抗氧化和清除自由基作用多數(shù)黃酮類化合物具有一定的抗氧化作用，黃酮結構中的2，3雙鍵和4位羰基以及3或5位羥基對黃酮的抗氧化作用有重要貢獻。黃芩中已知的黃酮大都具有酚羥基結構，因此是較好的抗氧化劑。黃芩素可抑制由鐵誘導的鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化，對前腦勻漿脂質(zhì)過氧化水平的抑制能力及二苯基苦味肼(DPPH)誘導的自由基的清除能力與槲皮素相當。作為治療癲癇的日本和漢藥TJ一960中的成分之一，黃芩素是其中已知主要成分中最強的自由基清除劑。在鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化實驗中，黃芩素減少了抗壞血酸與FeCL3體系中硫化巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARs)的產(chǎn)生(Gao D，Sakuraik，kotohM，黃芩素鐵復合物對微粒體脂質(zhì)過氧化反應的抑制作用Biochem Mol Int.1996，39(2)215)，譚廷華等的研究表明(譚廷華、劉愛芳、王新英等，黃芩甙與蕓香甙對·OH的清除作用[J].西安醫(yī)科大學學報，1997，18(1)41～43)，黃芩給藥劑量為50和100mg·kg時均可顯著抑制cch所致小鼠肝脂質(zhì)過氧化損傷作用。黃芩苷對Fenton反應生成的OH自由基清除率高于·OH自由基特異性清除劑甘露醇。漢黃芩素能夠抑制還原型輔酶II(NADPH)和Fe。黃芩甙可抑制大鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，并對乙酰氨基酚和四氯化碳引起的肝脂質(zhì)過氧化損傷具有保護作用(參見張永欽，周井炎，徐輝碧.黃芩甙的抗氧化作用[J].華中理工大報，1999，27(4)111～113)。黃芩甲醇提取物可明顯抑制肝脯氨酸和MDA的生成，提示黃芩甲醇提取物可抑制由BDL或cch誘導的大鼠肝纖維化和脂質(zhì)過氧化(參見Nan J X，Park EJ，Kim Y C，et al，黃芩對膽管結扎及四氯化碳大鼠誘導的肝臟纖維化的抑制作用[J].Pharmacy and pharmacology，2002，54(4)555～563)。
2.抗菌、抗病毒作用黃芩具有廣譜的抗菌和抗病毒作用。呂小迅等(參見呂小迅、周玉珍、呂華沖，黃芩、黃精抗真菌作用活性部位實驗研究[J].廣東藥學院學報，1995，11(3)180～182)研究了黃芩醇溶性部分和水溶性部分的抗真菌作用，發(fā)現(xiàn)黃芩的醇溶性部分對Tr的抑制作用較強，對其他供試菌種抑制作用則較弱；其水溶性部分對Tr，Tg，Ef，Cn和Ca等5種供試菌種均有較強抑制作用；同時證明黃芩的有效成分主要存在于其水溶性部分。
1988年陳鴻珊等首次發(fā)現(xiàn)，黃芩甙與黃芩素對人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性有抑制作用，并觀察到黃芩甙在H9細胞培養(yǎng)中能抑制HIV-1的復制，此研究結果引起了學者們的關注。近幾年來，最令人感興趣的是黃芩甙和黃芩素的抗艾滋病病毒作用。趙晶的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素抑制HIV-RT活性較黃芩甙強(參見趙晶，兩種抗人免疫缺陷病毒天然產(chǎn)物結構修飾的研究[D].北京中國協(xié)和醫(yī)科大學，1998[13])。從黃芩中提取的異黃芩素.8-甲醚能顯著抑制流感病毒。黃芩甙對人T細胞白血病病毒I型(HTLV-I)的抑制呈劑量效應關系。因此，黃芩黃酮類化合物有望開發(fā)成為新的抗艾滋病藥物。
Nagai發(fā)現(xiàn)(參見Nagai T.黃芩根中抗流感A(H3N2)和B病毒的黃酮類成分5，7，4′ 三羥基8甲氧基黃酮F 36[J].國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊，1996，18(3)46)，黃芩黃酮F36(5，7，4 trihydrox-y-8-methoxyflavone)可抗流感病毒A和B。永井隆之(參見永井隆之.生物中類黃酮藥抗流感病毒活性產(chǎn)生的作用機制(2)[J].國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊，1995，17(6)40～42)認為，F(xiàn)36對流感病毒(IFV)的唾液酸酶有特異的抑制活性，可有效抑制小鼠感染IFV，并抑制IFV的膜融合及脫殼。
3.抗炎、抗變態(tài)作用致病菌激活宿主免疫細胞產(chǎn)生各種炎性介質(zhì)，如IL-113、PGE2和LTB4，它們與牙齦炎和牙槽骨吸收有著非常密切的關系。Chung評價了黃芩甲醇提取物及其黃酮類化合物的消炎和激活齦成纖維細胞作用，提示黃芩甲醇提取物、黃芩甙、黃芩素和漢黃芩素均無細胞毒性，可使脂多糖誘導的IL-18的合成降低50％以上。這3種黃酮類化合物對炎癥的抑制作用幾乎與作為標準抗炎類固醇的強的松龍一樣強。Lin和Shieh E報道(參見Lin CC，ShiehDE，The anti-inflammatory activity of Scutellaria rivularis extracts and itsactivator and plas minogen activator-1 prodution in cultured human umbilical veinendothelial cells[J].phytother Res，1997，11(5)363)，黃芩提取物中的3種主要黃酮(黃芩素、黃芩甙、漢黃芩甙)對由角叉藻膠誘導的爪水腫有強烈的抗炎活性。
4抗腫瘤作用Shinichi I等(參見Shinichi Ikemoto，kaiunobu Sugimuka，Naomasa Yoshida，et al.黃芩根及其主要成分黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素對膀胱癌細胞珠的抗腫瘤作用[J].Urology，2000，55(6)951-955)研究了黃芩及其化合物黃芩素、黃芩甙、漢黃芩甙對膀胱癌細胞鏈的抗腫瘤作用。結果證實，所有藥物均可抑制癌細胞的增殖，且存在量效依賴關系，黃芩素表現(xiàn)出最大的抗增殖活性。在活體實驗中，C3H/HeN老鼠每天每只口服黃芩甙10mg，可顯著抑制腫瘤增長，預示中草藥可能成為治療膀胱癌的有潛力和有前途的藥物。袁榴娣等(參見袁榴娣，徐紅，杜肇宗.黃芩甙對艾氏腹水瘤細胞影響的初步探討[J].南京鐵道醫(yī)學院學報，1997，16(4)231～233)的研究結果顯示，黃芩甙可增強小鼠的體液和細胞的免疫功能，抑制荷瘤小鼠腹水脂加氧酶活性。抑制艾氏腹水瘤細胞的生長；但無論是在體內(nèi)還是體外，對生長后期的瘤細胞的抑制作用均不明顯。
5.免疫藥理作用賀海平等(參見賀海平、秦菁、陳明等.一種新的黃芩類黃酮3，5，6，7四羥基2，8二甲氧基黃酮的體外免疫作用[J].廣西醫(yī)科大學學報，2000，17(3)353～355；賀海平、秦箐、陳明.黃芩類黃酮對人免疫細胞化學發(fā)光及淋巴細胞增殖的影響[J].中國免疫學雜志，2000，16(2)84～86)分別對新發(fā)現(xiàn)的一種黃芩類黃酮3，5，6，7-四羥基-2，8-二甲氧基黃酮(TDF)和黃芩中純化的3，5，6，7-四羥基2，8-二甲氧基黃酮、2，5-二羥基6，6，7，8-四甲氧基黃酮、5，7，8-三羥基黃酮、(2R，3R)-2，3，5，6，7-五羥基黃烷醇、黃芩甙和黃芩酮6種類黃酮成分的免疫藥理作用進行了研究，該實驗j結果顯示黃芩素對PKC有特異性抑制作用，還可改善由右旋糖苷硫酸鹽誘導的大腸炎的所有炎性癥狀。
綜上所述，黃芩及其所含黃酮有其廣泛的藥理作用，但對其抗骨質(zhì)疏松的研究，在國內(nèi)外相關文獻，均無抗骨質(zhì)疏松及其相關的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供化合物黃芩苷在制備治療或預防骨質(zhì)疏松藥物中的用途；本發(fā)明的另一個目的在于提供黃芩總黃酮提取物在制備治療或預防骨質(zhì)疏松藥物中的用途。
黃芩苷即Baicalin，C21H18O11，分子量為446，為5，6-二羥基黃酮-7-O-葡糖糖醛酸苷。
黃芩總黃酮提取物，即從黃芩中經(jīng)水提、有機溶劑提取(乙醇、甲醇)的總黃酮提取物或在此基礎上進一步經(jīng)過精制(如大孔樹脂、酸堿方法、萃取方法)等所得的總黃酮提取物，其主要成分是黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)、漢黃芩素(wogonin)、漢黃芩苷wogonoside)、黃芩新素(neobaicalein)等。
成骨細胞是參與骨代謝的重要細胞，它與破骨細胞共同維持著骨代謝重建的平衡。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建過程中無法完全修復破壞的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少、骨質(zhì)量下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關鍵措施之一是促進成骨細胞的成骨過程，緩解破骨細胞的破骨過程。
對骨組織的溶解吸收是破骨細胞主要的生理功能。體外培養(yǎng)一定時間的破骨細胞可在骨片上形成吸收陷窩，吸收陷窩的數(shù)量可反映破骨細胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺蘭染色技術對骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進行顯示，可以定量這種溶解吸收能力。
本發(fā)明實施例1觀察了黃芩苷及黃芩總黃酮提取物對新生大鼠成骨細胞增殖及分化的影響，探討該藥是否存在促進成骨細胞分化、增殖的作用。
結果表明，與對照組相比，10％黃芩總黃酮提取物血清及5％黃芩苷血清對成骨細胞增殖具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與對照組相比，20％黃芩總黃酮提取物血清及10％黃芩苷血清對成對成骨細胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；10％、20％含藥血清中黃芩總黃酮組及5％、10％的黃芩苷對成骨細胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進作用(P＜0.01)。
本發(fā)明在成功培養(yǎng)出成骨細胞基礎上，觀察了大鼠灌胃給藥后得到的血清對成骨細胞增殖、分化的影響。AKP約40％～75％由成骨細胞產(chǎn)生，其活性可反映成骨細胞功能的強弱，也是成骨細胞分化的標志之一。結合成骨細胞的生長及分化指標對供試品藥物進行了評價，結果是黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對成骨細胞的增殖及分化均有顯著的促進作用。
本發(fā)明實施例2觀察了黃芩苷及黃芩總黃酮提取物新生大鼠破骨細胞功能的影響，探討該藥是否存在抑制破骨細胞功能的作用。
與對照組相比，20％黃芩總黃酮提取物血清及10％黃芩苷血清對成骨細胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；10％、20％中黃芩總黃酮血清組及5％、10％的黃芩苷血清對成骨細胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進作用(P＜0.01)；本發(fā)明利用原代培養(yǎng)的破骨細胞進行骨吸收試驗。結果顯示黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對破骨細胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。
以上通過黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對成骨細胞和破骨細胞的研究，表明對成骨細胞的增殖及分化均有顯著促進作用及對破骨細胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。從而通過促進成骨細胞的成骨過程，緩解破骨細胞的破骨過程。
本發(fā)明的另一方面，以黃芩苷及黃芩總黃酮提取物為藥效成分，添加藥學上可接受的藥用輔料，并通過常規(guī)方法可以制備藥物組合物或單體制備成藥物制劑時，藥物制劑的劑型可以是口服給藥的劑型諸如片劑、膠囊(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊和微囊)、粉劑、顆粒劑和糖漿劑；非口服給藥的劑型諸如注射劑、栓劑、丸劑、凝膠劑和貼劑。除這些常規(guī)劑型外，還可以將口服的速釋固體制劑(例如片劑、顆粒劑等)和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑(片劑、顆粒、精細顆粒、丸劑、膠囊、糖漿、乳劑、懸浮液、溶液)。本發(fā)明中的制劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。
本發(fā)明中的藥用輔料包括用于固體制劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、包衣劑等，或用于半固體制劑、液體制劑的溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、潤膚劑、乳化劑等，此外，也可以根據(jù)需要使用其它藥用添加劑諸如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑和調(diào)味劑等。


圖1為采用甲苯胺蘭染色技術對骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進行顯微放大拍照圖。原代成骨細胞培養(yǎng)1周，細胞成多角狀。
圖2為采用甲苯胺蘭染色技術對骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進行顯微放大拍照圖。原代成骨細胞培養(yǎng)3周，可見骨節(jié)結形成。
具體實施例方式
下面用實施例對本發(fā)明作進一步說明，但并不對本發(fā)明構成限制。
實施例1黃芩苷及黃芩總黃酮提取物對大鼠成骨細胞生長、分化的影響
1.試驗材料(1)受試藥物供試樣品黃芩苷(大于95％，HPLC法)、黃芩總黃酮提取物I(含量70％，uv法，大孔樹脂制備方法)、黃芩總黃酮提取物II(含量50％，uv法，酸堿制備方法)、黃芩總黃酮提取物III(含量30％，uv法，乙醇提取)、黃芩總黃酮提取物IV(含量25％，uv法，水提取)。
性狀均為淺黃色粉末，氣微，味苦保存條件避光、密閉配制方法稱取一定量待試藥物，用1％羧甲基纖維素鈉溶液制成混旋液。
(2)動物品系SD大鼠來源上海斯萊克實驗動物有限公司(中國科學院上海實驗動物中心)體重200g(三月齡)性別雌雄各半等級清潔級合格證號中科動管第004號；許可證號SCXK(滬)2002-0010飼料中國科學院上海實驗動物中心提供。
生產(chǎn)合格證號中科滬動管字第99-0010號飼養(yǎng)場所第二軍醫(yī)大學實驗動物中心等級清潔級合格證號醫(yī)動字第02-64號。
2、試驗方法(1)含藥血清的制備參見(劉建民、張依山、馬錦富，活絡骨康丸對成骨細胞作用的研究，中醫(yī)正骨，2004，16(9)3-4； 張巧艷、秦路平、田野萍等，蛇床子素對新生大鼠顱蓋骨成骨細胞的作用，第二軍醫(yī)大學學報，2000，21(10)935-937)。
選擇SD 3月齡大鼠，按體重隨機分為8組，即為對照組(CMC)、尼爾雌醇組、強骨膠囊組、黃芩苷組、黃芩總黃酮提取物I組、黃芩總黃酮提取物II組、黃芩總黃酮提取物III組、黃芩總黃酮提取物IV組。尼爾雌醇組、強骨膠囊組。分別給予1％CMC、200mg/kg的黃芩總黃酮提取物組I、220mg/kg黃芩總黃酮提取物II、230mg/kg黃芩總黃酮提取物III、250mg/kg黃芩總黃酮提取物IV、100mg/kg的黃芩苷組、強骨膠囊90mg/kg灌胃給藥，每日給藥2次，連續(xù)給藥1周；尼爾雌醇1mg/kg每周給藥一次，末次給藥1h后，心臟采血，2500r/min離心20min，合并收集同組血清，56℃水浴滅活30min，-20℃保存?zhèn)溆?。使用前培養(yǎng)基稀釋，過濾膜除菌(濾膜孔徑為0.22mm)。
(2)細胞培養(yǎng)參見(王永東、武曉蓉，黃芪對成骨細胞成骨能力的血清藥理學實驗，廣東藥學院學報，2004，20(5)512-514)。
新生大鼠顱蓋骨成骨細胞培養(yǎng)方法。24小時內(nèi)出生的新生SD大鼠拉頸處死，75％酒精浸泡后取頭蓋骨，剔除軟組織后剪碎，加入0.2％的I型膠原酶，消化5個循環(huán)，每次20min，收集第3、4、5次消化的細胞懸液，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀的細胞用10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，吹打均勻，接種至培養(yǎng)瓶，于37℃5％CO2孵箱孵育，24小時換液，待細胞60％～70％貼壁后，用0.25％胰酶消化，即為本實驗的原代成骨細胞。原代細胞長成致密單層后，用0.25％胰蛋白酶進行消化，以1∶3比例傳代，以后每2天換液1次，長成致密單層后用于實驗。
(3)細胞鑒定倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)第2天大部分細胞貼壁，貼壁后主要為梭形、圓形或鱗片狀；3～4天時細胞突起伸展，相互搭連成片，長滿瓶底時，細胞為梭形及立方塊狀，排列緊密，并可見圓形及鱗片狀細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，可見成骨細胞呈多層生長。
(4)細胞增殖實驗參見(任艷玲、鄭洪新、杜松，補腎健脾藥物血清對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖與分化的影響。中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(9)772-774)。
96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細胞懸液(1×105個/ml)，在37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，使細胞貼壁，換含不同濃度、種類的含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，并于結束培養(yǎng)前4小時，每孔加入10mg/ml的MTT。培養(yǎng)結束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100μl的DMSO，振搖15min，酶標儀于490nm處檢測各空OD值。
(5)堿性磷酸酶活性測定參見(史鳳芹.于世鳳.體外破骨細胞分離培養(yǎng)方法的建立.中華骨科雜志.1994，14(1)43-45)。
96孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1ml細胞懸液(1×106個/ml)，貼壁后加藥方法同前，細胞培養(yǎng)2d后，取細胞培養(yǎng)液50l，各孔均加堿性磷酸酶試劑盒新鮮配制的底物2.55ml，37℃孵育30min，雙蒸水空白調(diào)零，在722分光光度計520nm波長處檢測其吸光度A值。
3.統(tǒng)計處理各組結果以x±SD表示，采用ANOVA比較給藥前后各組間變化差值的顯著性。
4、結果4.1成骨細胞形態(tài)如圖1所示原代成骨細胞培養(yǎng)1周，細胞成多角狀。
如圖2所示原代成骨細胞培養(yǎng)3周，可見骨節(jié)結形成。
4.2供試藥物血清對成骨細胞增殖的影響從表1可以看出，與對照組相比，10％黃芩總黃酮提取物血清I、10％黃芩總黃酮提取物血清II、10％黃芩總黃酮提取物血清III、10％黃芩總黃酮提取物血清IV及5％黃芩苷血清對成骨細胞增殖具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與.對照組相比，20％黃芩總黃酮提取物血清I、20％黃芩總黃酮提取物血清II、20％黃芩總黃酮提取物血清III、20％黃芩總黃酮提取物血清IV及10％黃芩苷血清對成對成骨細胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
表1.含供試藥物血清對成骨細胞增殖的影響A490nm(n＝7，x±SD)

*p＜0.05；**p＜0.01vs NS；從表2可以看出，與對照組相比，10％、20％含藥血清中黃芩總黃酮各組及黃芩苷對成骨細胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進作用(P＜0.01)，在我們的實驗條件下，與強骨膠囊的作用相似，比尼爾雌醇稍好。
表2.含供試藥物血清對成骨細胞AKP的影響A570nm(n＝7，x±s)

p＜0.05；**p＜0.01vs對照組本試驗結合成骨細胞的生長及分化指標對黃芩系列藥物進行了評價，結果顯示它們對成骨細胞的增殖及分化均有一定的促進作用。
結論黃芩苷及黃芩總黃酮提取通過促進成骨細胞的增殖和分化，對骨質(zhì)疏松的防治具有積極意義。
實施例2黃芩苷及黃芩總黃酮提取物對對新生大鼠破骨細胞功能的影響1、試驗材料(1)受試藥物供試樣品黃芩苷(大于95％，HPLC法)、黃芩總黃酮提取物(大于70％，uv法，大孔樹脂制備方法)、黃芩總黃酮提取物II(含量50％，uv法，酸堿制備方法)、黃芩總黃酮提取物III(含量30％，uv法，乙醇提取)、黃芩總黃酮提取物IV(含量25％，uv法，水提取)。
性狀淺黃色粉末，氣微，味苦保存條件避光、密閉配制方法稱取一定量待試藥物，用1％羧甲基纖維素鈉溶液制成混旋液(2)動物品系SD大鼠來源上海斯萊克實驗動物有限公司(中國科學院上海實驗動物中心)體重200g(三月齡)性別雌雄各半等級清潔級合格證號中科動管第004號；許可證號SCXK(滬)2002-0010，飼料中國科學院上海實驗動物中心提供生產(chǎn)合格證號中科滬動管字第99-0010號飼養(yǎng)場所第二軍醫(yī)大學實驗動物中心等級清潔級合格證號醫(yī)動字第02-64號。
2、試驗方法(1)骨磨片的制備取新鮮牛股骨，用鋸式切片機(Leitz 1600)切割成厚度約50mm的薄切片，剪成6mm×6mm大小，于滅菌的雙蒸水中超聲(SB2200，80W)清洗(50Hz×5min)，連續(xù)3次后，紫外燈照射8小時(每面4小時)，備用。參見(張煒真、于世鳳、鄭麟蕃.大鼠破骨細胞體外分離培養(yǎng)和鑒定.解剖學報.1995，26(3)291-293；史鳳芹.于世鳳.張潤荃.龐淑珍.大黃對破骨細胞性骨吸收作用的研究.現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志.1995，9(4)193-195)(2)含藥血清的制備選擇SD 3月齡大鼠12只，雌雄各半，按體重隨機分為5組，即為對照組(CMC)、黃芩苷、黃芩總黃酮提取物組、尼爾雌醇組、強骨膠囊組。分別給予1％CMC、200mg/kg的黃芩總黃酮提取物組I、220mg/kg黃芩總黃酮提取物II、230mg/kg黃芩總黃酮提取物III、250mg/kg黃芩總黃酮提取物IV、100mg/kg的黃芩苷組、強骨膠囊90mg/kg灌胃給藥，每日給藥2次，連續(xù)給藥1周；尼爾雌醇1mg/kg每周給藥一次，末次給藥1h后，心臟采血，2500r/min離心20min，合并收集同組血清，56℃水浴滅活30min，-20℃保存?zhèn)溆?。使用前培養(yǎng)基稀釋，過濾膜除菌(濾膜孔徑為0.22mm)。
(3)破骨細胞分離與培養(yǎng)參見(任艷玲、鄭洪新、杜松，補腎健脾藥物血清對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖與分化的影響。中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(9)772-774)。
取1日齡SD大鼠，拉頸處死，75％酒精浸泡5min，無菌分離四肢長骨，剔凈軟組織，用MEM培養(yǎng)液清洗2次，用解剖刀縱向剖開骨干，將骨質(zhì)內(nèi)表面刮入培養(yǎng)液(MEM全培養(yǎng)液，含20％胎牛血清，100g/ml硫酸鏈霉素、100U/ml青霉素鈉，pH 7.2)。再以圓頭吸管吹打骨碎片5min，靜置30s，吸取上層細胞懸液均勻接種于預置有象牙薄片的24孔培養(yǎng)板中，37℃5％CO2孵箱孵育30分鐘，以MEM培養(yǎng)液沖去未貼壁的細胞，更換全培養(yǎng)液至每孔2ml，繼續(xù)培養(yǎng)，3天更換一次培養(yǎng)液。
(4)骨吸收陷窩觀察與計數(shù)培養(yǎng)8小時后，更換為加有含藥血清或?qū)φ昭宓呐囵B(yǎng)液，培養(yǎng)至第7天，取出所有象牙薄片，2.5％戊二醛固定，于0.25mol/L氫氧化銨超聲波清洗5min×3次，系列梯度酒精脫水，自然晾干，1％甲苯胺藍染液室溫染色，3～4min，蒸餾水清洗，于光鏡100倍下對整張象牙薄片上的吸收陷窩計數(shù)，結果以陷窩數(shù)/片計。
3統(tǒng)計處理各組結果以x±SD表示，采用ANOVA比較給藥前后各組間變化差值的顯著性。
4結果4.1供試品對破骨細胞骨吸收功能的影響從表3中可以看出，與對照組相比，20％含藥血清黃芩總黃酮提取物各組及10％黃芩苷對成對成骨細胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；10％、20％含藥血清中黃芩總黃酮各組及5％、10％的黃芩苷對成骨細胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進作用(P＜0.01)；表3對骨片骨陷窩計數(shù)的影響(n＝6，x±s)

p＜0.05；**p＜0.01vs對照組結果與結論對骨組織的溶解吸收是破骨細胞主要的生理功能。體外培養(yǎng)一定時間的破骨細胞可在骨片上形成吸收陷窩，吸收陷窩的數(shù)量可反映破骨細胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺蘭染色技術對骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進行顯示，可以定量這種溶解吸收能力。破骨細胞與成骨細胞共同維持著骨代謝重建的平衡。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建過程中無法完全修復破壞的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少、骨質(zhì)量下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關鍵措施包括促進成骨細胞的成骨過程，緩解破骨細胞的破骨過程等。
總之，成骨細胞是參與骨代謝的重要細胞，它與破骨細胞共同維持著骨代謝重建的平衡。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機制是骨形成落后于骨溶解，在骨的重建過程中無法完全修復破壞的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少、骨質(zhì)量下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關鍵措施之一是促進成骨細胞的成骨過程，緩解破骨細胞的破骨過程。
本試驗在成功培養(yǎng)出成骨細胞基礎上，觀察了大鼠灌胃給藥后得到的血清對成骨細胞增殖、分化的影響。AKP約40％～75％由成骨細胞產(chǎn)生，其活性可反映成骨細胞功能的強弱，也是成骨細胞分化的標志之一。本試驗結合成骨細胞的生長及分化指標對黃芩系列藥物進行了評價，結果顯示黃芩總黃酮及黃芩苷對成骨細胞的增殖及分化均有一定的促進作用。
對骨組織的溶解吸收是破骨細胞主要的生理功能。體外培養(yǎng)一定時間的破骨細胞可在骨片上形成吸收陷窩，吸收陷窩的數(shù)量可反映破骨細胞溶解吸收的能力。采用甲苯胺蘭染色技術對骨片上產(chǎn)生的吸收陷窩進行顯示，可以定量這種溶解吸收能力。
因此，治療骨質(zhì)疏松的關鍵措施包括促進成骨細胞的成骨過程，緩解破骨細胞的破骨過程等。
本研究利用原代培養(yǎng)的破骨細胞進行骨吸收試驗。結果顯示黃芩總黃酮及黃芩苷對破骨細胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。說明其防治骨質(zhì)疏松作用，部分是通過抑制破骨細胞的功能實現(xiàn)的。
以上充分說明了黃芩總黃酮提取物及黃芩苷治療和預防骨質(zhì)疏松的作用，可開發(fā)成抗骨質(zhì)疏松新藥。
權利要求
1.黃芩苷在制備治療或預防骨質(zhì)疏松癥藥物中的用途。
2.黃芩總黃酮提取物在制備治療或預防骨質(zhì)疏松癥藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃芩總黃酮提取物及黃芩苷在治療和/或預防骨質(zhì)疏松藥物制備中的用途。黃芩苷即5，6－二羥基黃酮－7－0－葡糖糖醛酸苷。黃芩總黃酮提取物其主要成分是黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩新素等。通過對新生大鼠成骨細胞增殖及分化的影響和新生大鼠破骨細胞功能的影響的藥理試驗研究，結果表明黃芩苷和黃芩總黃酮提取物對成骨細胞的增殖及分化均有顯著的促進作用，對破骨細胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。
文檔編號A61P19/10GK1742746SQ200510036678
公開日2006年3月8日 申請日期2005年8月25日 優(yōu)先權日2005年8月25日
發(fā)明者嚴啟新, 趙金華, 張麗娟 申請人:深圳海王藥業(yè)有限公司