專利名稱：一種抗肝癌的樟芝膠囊及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠囊及其制備方法，尤其涉及一種抗肝癌的樟芝膠囊及其制備方法。
背景技術(shù)：
樟芝(Antrodia camphorata)又稱牛樟菇。一般生長(zhǎng)在小葉黃樟樹的中空心材內(nèi)壁上，鐘狀；子實(shí)層呈桔紅色、味苦。樟芝新品種菌絲體經(jīng)培養(yǎng)后呈桔紅色，肉粉色。顯微鏡觀察，菌絲細(xì)長(zhǎng)、有隔、具有鎖狀聯(lián)合，并有大量的分生孢子，分生孢子因培養(yǎng)條件不同呈桔紅色、肉粉色或黃色。
關(guān)于樟芝菌絲體培養(yǎng)物的粗提物或是其多糖的藥理學(xué)或生物活性研究近來取得了一些進(jìn)展，中國(guó)專利01123613.2《樟芝的固體培養(yǎng)方法，所得固體培養(yǎng)物及其產(chǎn)品與用途》；200410008046.4《來自牛樟芝菌絲體的新混合物和化合物及其用途》和200410011142.4《牛樟芝擔(dān)子菌類的多糖體及其用途》均涉及了樟芝的功效及用途，但是，在所述的專利中，卻未見有通過衛(wèi)星搭載改良品種，以提高其藥理功效的報(bào)道，也未見利用樟芝改良品種制備提取物，用于制作抗肝癌的樟芝膠囊的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種抗肝癌的樟芝膠囊及其制備方法。
本發(fā)明涉及的抗肝癌的樟芝膠囊，由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物20～100；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精200～480。
本發(fā)明涉及的抗肝癌的樟芝膠囊，優(yōu)選由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物50～100；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精200～450。
本發(fā)明涉及的抗肝癌的樟芝膠囊，最優(yōu)選由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物50；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精450。
在本發(fā)明所述的抗肝癌的樟芝膠囊中，樟芝菌絲體發(fā)酵提取物由下述方法制得(1)取樟芝菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；(2)用體積百分比為60～95％的乙醇對(duì)上述濃縮的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60～90％；(3)50～70℃條件下，加熱1～2小時(shí)；(4)以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；(5)將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；(6)用體積百分比為95％的、4～8倍乙醇濃縮液體積量的乙醇，對(duì)上述濃縮乙醇提取液進(jìn)行12～24小時(shí)沉淀處理；(7)以常規(guī)方法分離出沉淀物；(8)將沉淀物以常規(guī)方式真空干燥或低溫冷凍干燥，得樟芝菌絲體發(fā)酵提取物；
其中，所述樟芝菌絲體為CGMCCNo.1460，該菌株名為樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏編號(hào)為CGMCC No.1460。
上述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460是通過樟芝子實(shí)體分離到的樟芝菌種，送國(guó)家航天航空部東方紅宇航中心，對(duì)其進(jìn)行了衛(wèi)星搭載，搭載的條件為衛(wèi)星質(zhì)量為2100公斤，衛(wèi)星溫度為5～28℃，微重力量級(jí)10-3～10-5，近地點(diǎn)高度200～210公里，遠(yuǎn)地點(diǎn)高度300～400公里，軌道周期為90分鐘，航天飛行18天；在衛(wèi)星搭載誘變后，經(jīng)多次活化培養(yǎng)后獲得的。
上述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將樟芝菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20～35℃溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80～280r/min，pH 3～8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7～15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5～4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20～35℃，發(fā)酵罐滅菌壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7～15天，即可利用樟芝菌絲體發(fā)酵全液制備取物。
其中，所述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460的發(fā)酵培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)溫度最適是28～30℃，培養(yǎng)pH最適為6。
其中，上述樟芝菌絲體發(fā)酵全液是指菌絲體和發(fā)酵液的濾液。
其中，上述種子或發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是玉米淀粉 1％ 葡萄糖 1％蛋白胨0.2％酵母膏 0.2％硫酸鎂0.1％磷酸二氫鉀 0.05％本發(fā)明所述抗肝癌的樟芝膠囊的制備方法是，以所述重量份分別稱取樟芝菌絲體發(fā)酵提取物、不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精；均研碎為小于200目的細(xì)粉，干燥條件下充分混勻；以每粒膠囊裝0.5克的量裝入0號(hào)膠囊。
其中，所述玉米淀粉或藥用糊精的含水量要求在質(zhì)量百分比9％以下。
本發(fā)明所述的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物在制備對(duì)乙型肝炎病毒HBsAg、e抗原HBeAg及HBV DNA分泌的抑制作用的藥物中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明所述的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物研究其抗乙型肝炎病毒的作用；實(shí)驗(yàn)采用乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系2.2.15，研究其對(duì)細(xì)胞的毒性和對(duì)乙型肝炎病毒HBsAg、e抗原HBeAg及HBV DNA分泌的抑制效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樟芝菌絲體發(fā)酵提取物稀釋3倍，加入細(xì)胞培養(yǎng)8天，對(duì)細(xì)胞半數(shù)中毒濃度TC50為0.153mg/ml。最大無(wú)毒濃度TCO為0.039mg/ml。樟芝發(fā)酵液提取物最大無(wú)毒濃度0.039mg/ml對(duì)HBVDNA的抑制率為59.0％，其半數(shù)抑制濃度IC50為0.0086mg/ml，對(duì)乙型肝炎病毒HBsAg的抑制率為36.1％，其半數(shù)抑制濃度IC50為0.026mg/ml，而對(duì)e抗原HBeAg的抑制率為49.8％，其半數(shù)抑制濃度IC50為0.022mg/ml。
本發(fā)明所述的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物特別在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明所述的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物進(jìn)行抗腫瘤動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果表明各計(jì)量組的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物對(duì)S180小鼠肉瘤和H22小鼠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定抑制作用，抑瘤活性一般在30～45％之間。其中，對(duì)S180小鼠肉瘤的抑制率最高可達(dá)43.37％(1000mg/kg體重)，對(duì)H22小鼠肝癌細(xì)胞的最高抑制率可達(dá)48.88％(160mg/kg體重)。通過實(shí)驗(yàn)分析，該類受試藥物的抑瘤活性可能是通過對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)解而產(chǎn)生抑瘤作用。


本發(fā)明所述的樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，地址北京市中關(guān)村中國(guó)科學(xué)院微生物所內(nèi)，郵政編碼為100080，保藏編號(hào)為CGMCC No.1460。
圖1樟芝Ac001菌株衛(wèi)星搭載后電鏡觀察2樟芝Ac001出發(fā)菌株電鏡觀察3樟芝不同菌種菌絲體干重比較圖4樟芝不同品種液體發(fā)酵多糖含量比較圖5樟芝不同菌種酯酶(EST)同工酶譜圖6樟芝菌絲體發(fā)酵提取物多糖高效液相色譜圖7樟芝菌絲體發(fā)酵提取物糖組成分析具體實(shí)施方式
實(shí)施例1將樟芝(Antrodia camphorata)通過樟芝子實(shí)體分離到的樟芝菌種，送國(guó)家航天航空部東方紅宇航中心，對(duì)其進(jìn)行衛(wèi)星搭載，搭載的條件為衛(wèi)星質(zhì)量為2100公斤，衛(wèi)星溫度為5～28℃，微重力量級(jí)10-3～10-5，近地點(diǎn)高度200～210公里，遠(yuǎn)地點(diǎn)高度300～400公里，軌道周期為90分鐘，航天飛行18天，進(jìn)行衛(wèi)星搭載誘變。
樟芝菌種經(jīng)衛(wèi)星搭載誘變后，以常規(guī)方法對(duì)其多次活化培養(yǎng)后，觀察形態(tài)，比較誘變前后菌株的差異。
①菌絲體形態(tài)觀察樟芝菌絲體經(jīng)平板培養(yǎng)后，通過光鏡及環(huán)境掃描電鏡觀察，可以觀察到有初生菌絲和次生菌絲存在，初生菌絲壁薄，透明，胞徑2.7μm～3.5μm；次生菌絲薄壁、透明微黃，具鎖狀聯(lián)合，有分枝，胞徑3.1μm～3.9μm；而出發(fā)菌株菌絲體寬度僅為2.4～2.7um。
②分生孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察通過光鏡及ESEM觀察發(fā)現(xiàn)樟芝菌絲體在平板培養(yǎng)階段能夠產(chǎn)生分生孢子。
樟芝菌絲體培養(yǎng)階段產(chǎn)生的分生孢子屬內(nèi)生芽殖型(blastic)中的瓶梗孢子(phialospore)，這類孢子是從一個(gè)專門的瓶狀產(chǎn)孢細(xì)胞上產(chǎn)生的，這個(gè)瓶狀細(xì)胞稱為瓶梗(phialide)。產(chǎn)孢細(xì)胞的外壁不形成分生孢子的壁。分生孢子淡橘紅色，橢圓形，外壁光滑，胞徑2.7～3.5μm×5.7～7.7μm；而出發(fā)菌株孢子大小僅為4.0～5.2um(見圖1、圖2)。
可見出發(fā)菌株經(jīng)衛(wèi)星搭載后，從菌絲形態(tài)到孢子大小都產(chǎn)生了較大的變異。
把衛(wèi)星搭載誘變后樟芝菌株命名為樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，送“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.1460。
上述樟芝Ac001菌株菌絲體培養(yǎng)平板培養(yǎng)將樟芝Ac001菌株菌絲體接種于平板上，置28℃培養(yǎng)10天。
搖瓶培養(yǎng)取平板培養(yǎng)的樟芝菌絲體5～10塊(1cm2/塊)移入500ml三角瓶?jī)?nèi)，其中裝有用下述培養(yǎng)基配方制作的液體培養(yǎng)基，在28℃、pH6的條件下，置于旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)速為110轉(zhuǎn)/分鐘。
所述培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是玉米淀粉 1％ 葡萄糖 1％蛋白胨0.2％酵母膏 0.2％硫酸鎂0.1％磷酸二氫鉀 0.05％發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基同上。將上述三角瓶培養(yǎng)所得到的菌種接種于50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中，在28℃、pH6、發(fā)酵罐滅菌壓力0.15公斤/平方厘米，通氣量以1∶1.0vvw的速率、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，培養(yǎng)7天，即得到樟芝菌絲體發(fā)酵全液，其中包括菌絲體及過濾液。
結(jié)果每50升發(fā)酵罐發(fā)酵完畢后可得發(fā)酵全液30～35升。其中菌絲體干重為0.3公斤。發(fā)酵全液的比重為1.02。利用樟芝菌絲體發(fā)酵全液可制備其提取物。
實(shí)施例2樟芝搭載前與搭載后的菌株培養(yǎng)特性比較(1)溫度比較試驗(yàn)分析試驗(yàn)結(jié)果表明樟芝Ac001菌絲體的萌發(fā)溫度范圍為6-36℃，比出發(fā)菌株(10-32℃)溫度范圍擴(kuò)大；樟芝Ac001菌絲體生長(zhǎng)的適宜溫度范圍在24℃-32℃之間(菌落呈橘紅色)，而出發(fā)菌株適宜的培養(yǎng)溫度為28-30℃(菌落呈橘紅色)。
(2)pH比較試驗(yàn)經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)；當(dāng)起始pH在pH3～pH12范圍內(nèi)時(shí)，樟芝Ac001菌絲體都能夠生長(zhǎng)；適宜樟芝菌絲體生長(zhǎng)的pH范圍是pH5～7；當(dāng)pH＝7時(shí)，培養(yǎng)性狀良好。
而出發(fā)菌株起始pH在pH4和pH10時(shí)菌絲體生長(zhǎng)很弱，適宜樟芝菌絲體生長(zhǎng)的pH范圍是pH6左右。
(3)菌絲體干重比較樟芝不同品種液體培養(yǎng)過程中，每天取樣測(cè)其菌絲體干重，結(jié)果表明，樟芝Ac001菌株菌絲體日生長(zhǎng)量明顯高于樟芝原始種，在培養(yǎng)第六、七天兩菌株的菌絲體干重達(dá)到最高；Ac001菌株平均干重比樟芝原始種高出22.8mg/100ml。(見圖3)(4)多糖含量比較樟芝不同品種液體培養(yǎng)過程中，每天取樣測(cè)其多糖含量，結(jié)果表明，Ac001菌株在培養(yǎng)第八天多糖含量達(dá)到最高峰，而在第十天樟芝原始種才達(dá)到高峰；從多糖含量比較看來，Ac001菌株最高可達(dá)到28.4mg/ml，樟芝原始種最高只有21.7mg/ml。(見圖4)(5)酯酶同工酶比較采用樟芝不同品種菌絲體進(jìn)行酯酶同工酶分析，結(jié)果顯示，兩個(gè)品種都具有四條相同的酶帶，Rf值分別在0.25、0.55、0.60、0.75期間，Ac001菌株在Rf值0.375處有一條新的酶帶。(見圖5)實(shí)施例3樟芝菌絲體發(fā)酵提取物的制備(1)取樟芝菌絲體發(fā)酵全液(菌絲體和發(fā)酵液的濾液)，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/4；(2)用體積百分比為70％的乙醇對(duì)上述濃縮的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍；(3)70℃條件下，加熱1小時(shí)；(4)以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；(5)將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5；(6)用體積百分比為95％的、5倍乙醇濃縮液體積量的乙醇，對(duì)上述濃縮乙醇提取液進(jìn)行20小時(shí)沉淀處理；(7)以常規(guī)方法分離出沉淀物；(8)將沉淀物以常規(guī)方式真空干燥或低溫冷凍干燥，得樟芝菌絲體發(fā)酵提取物。
實(shí)施例4樟芝菌絲體發(fā)酵提取物的制備(1)取樟芝菌絲體發(fā)酵全液(菌絲體和發(fā)酵液的濾液)，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2；(2)用體積百分比為75％的乙醇對(duì)上述濃縮的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍；(3)60℃條件下，加熱2小時(shí)；(4)以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；(5)將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5；(6)用體積百分比為95％的、7倍乙醇濃縮液體積量的乙醇，對(duì)上述濃縮乙醇提取液進(jìn)行16小時(shí)沉淀處理；(7)以常規(guī)方法分離出沉淀物；(8)將沉淀物以常規(guī)方式真空干燥或低溫冷凍干燥，得樟芝菌絲體發(fā)酵提取物。
實(shí)施例5樟芝菌絲體發(fā)酵提取物的制備取樟芝發(fā)酵全液30L，在濃縮罐中濃縮至原體積的1/3，接著乘熱加入4倍量的80％的乙醇加熱萃取，溫度控計(jì)制在50℃左右，真空度為0.02公斤/平方厘米。
乙醇萃取后，接著采用真空泵將萃取液經(jīng)180目的過濾器過濾，將原發(fā)酵液中的菌絲與液體分離，用純凈水反復(fù)沖洗菌絲體3次后，合并濾液，接著在濃縮器中回收萃取液中的乙醇。此時(shí)真空度控制在0.02公斤/平方厘米，溫度控制在80℃左右。
乙醇回收后剩余的即為樟芝發(fā)酵全液萃取液，接著將其進(jìn)行減壓濃縮，濃縮罐溫度為50℃，真空度為0.01公斤/平方厘米。將萃取液濃縮至原體積的1/10，比重控制在1.06.
濃縮液冷卻至25℃以下時(shí)，將其放出，量其體積并置于100L不銹缸桶內(nèi)，并加入95％的乙醇，加入量是濃縮液體積的6倍，室溫下靜置24小時(shí)。然后用移液管移出乙醇上清液，將固液分離后即可得到樟芝發(fā)酵全液乙醇提取物，隨即放入真空干燥箱干燥，溫度控制在50℃以下，真空度為0.02公斤/平方厘米以下。
干燥后的提取物，粉碎，過200目篩，置低溫干燥處保存?zhèn)溆谩?br> 上述樟芝菌絲體液體發(fā)酵后活性成分的提取與分離是從發(fā)酵全液中經(jīng)萃取后分離所得。
實(shí)施例6樟芝菌絲體發(fā)酵提取物多糖分子量及糖組分測(cè)試測(cè)試方法(1)純度及分子量測(cè)定(2)糖組成測(cè)定取樣品10mg溶于2mol/l三氟乙酸中，封管，在氮氧保護(hù)下100℃水解2h，水解液加甲醇后真空濃縮至干，再加甲醇如上法再反復(fù)兩次，少量水溶解，分二部份，一份薄板層析檢查有否糖醛酸存在，另一份用硼氫化鈉還原，然后乙?；?，氣相層析。
測(cè)試者中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所多糖實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果糖組成分析(見圖7)樟芝菌絲體發(fā)酵提取物樣品含阿拉伯糖，木糖，半乳糖及葡糖糖；其摩爾比為1∶1.5∶0.4∶10.5。
樣品純度檢測(cè)及分子量根據(jù)HPLC結(jié)果(測(cè)定條件見圖6)該樣品至少含五個(gè)以上組分；其中RT為30.38之分子量為51萬(wàn)RT為34.05之分子量為7.7萬(wàn)RT為38.20之分子量為1.7萬(wàn)RT為38.70之分子量為1.5萬(wàn)RT為42.07之分子量為0.5萬(wàn)實(shí)施例7樟芝菌絲體發(fā)酵提取物總?cè)坪?，總生物堿含量測(cè)定測(cè)試者中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所多糖實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方法常規(guī)方法(略)測(cè)試結(jié)果總?cè)坪?％)總生物堿含量樟芝菌絲體發(fā)酵提取物 0.32％0.22mg/ml實(shí)施例8樟芝菌絲體發(fā)酵提取物氨基酸測(cè)定測(cè)試者萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室樣品處理方法鹽酸水解分析儀器日立835-50型高速氨基酸分析儀測(cè)試結(jié)果
ASP天門冬氨酸2.13％；ILE異亮氨酸1.54％；THR蘇氨酸 1.15％；LEU亮氨酸1.72％；SER絲氨酸 1.27％；TYR酪氨酸 0.79％；GLU谷氨酸2.84％；PHE苯丙氨酸0.97％；GLY甘氨酸 1.66％；LYS賴氨酸1.08％；ALA丙氨酸 1.53％；NH3氨(不計(jì))0.59％；CYS胱氨酸0.32％；HIS組氨酸 0.40％；VAL纈氨酸 1.20％；ARG精氨酸1.26％；MET蛋氨酸 0.61％；PRO脯氨酸 1.27％。
氨基酸總和21.74。
實(shí)施例9樟芝膠囊的制作樟芝膠囊的原料為樟芝菌絲體發(fā)酵提取物，輔料為玉米淀粉。
稱取樟芝菌絲體發(fā)酵提取物(無(wú)吸潮，無(wú)結(jié)塊)50公斤；不含蛋白玉米淀粉(食品公司購(gòu)買，純白色，含水量在9％以下)450公斤。均研碎為小于200目的細(xì)粉，干燥條件下充分混勻；以每粒膠囊裝0.5克的量裝入0號(hào)膠囊。
膠囊內(nèi)組份按樟芝菌絲體發(fā)酵提取物50mg/粒，玉米淀粉450mg/粒的配方進(jìn)行配制，球磨機(jī)混合均勻后用全自動(dòng)膠囊罐裝機(jī)灌裝。拋光后用全自動(dòng)膠囊分裝機(jī)分裝封口(每瓶30粒)，貼標(biāo)簽后即為樟芝膠囊成品。
實(shí)施例10樟芝膠囊的制作樟芝膠囊的原料為樟芝菌絲體發(fā)酵提取物，輔料為藥用糊精。
稱取樟芝菌絲體發(fā)酵提取物(無(wú)吸潮，無(wú)結(jié)塊)100公斤；藥用糊精400公斤。均研碎為小于200目的細(xì)粉，干燥條件下充分混勻；以每粒膠囊裝0.5克的量裝入0號(hào)膠囊。
膠囊內(nèi)組份按樟芝菌絲體發(fā)酵提取物100mg/粒，玉米淀粉400mg/粒的配方進(jìn)行配制，球磨機(jī)混合均勻后用全自動(dòng)膠囊罐裝機(jī)灌裝。拋光后用全自動(dòng)膠囊分裝機(jī)分裝封口(每瓶30粒)，貼標(biāo)簽后即為樟芝膠囊成品。
實(shí)施例11應(yīng)用樟芝菌絲體發(fā)酵提取物樣品在乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞2.2.15細(xì)胞系培養(yǎng)中，檢測(cè)其對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)分泌和HBV DNA的影響。
測(cè)試單位中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所材料和方法一.藥物樟芝發(fā)酵液提取物是萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院藥用真菌研究所提供的液體制劑，淺棕色混懸液。實(shí)驗(yàn)時(shí)母液4℃保存，使用時(shí)用2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液配成所需濃度。
二.2.2.15細(xì)胞乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HepG2)的2.2.15細(xì)胞系，美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，本室引進(jìn)后自行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞用含胎牛血清10％，3％谷氨酰胺1％，G418 380pg/ml，卡那霉素50U/ml的Eagle’sMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2溫箱中培養(yǎng)，大約一周傳代一次。
三.試劑及儀器HBsAg，HBeAg固相放射免疫測(cè)定盒，購(gòu)自中國(guó)同位素公司北方免疫試劑研究所；放射性同位素α32P dCTP為亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司，比活度111TBq/nmol；探針標(biāo)記用的隨機(jī)引物試劑盒購(gòu)自Promerga公司。
酶標(biāo)儀BIO-RAO 3550型；Y-計(jì)數(shù)儀為美國(guó)DPC公司產(chǎn)品。
四.實(shí)驗(yàn)方法1.藥物對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)藥物樟芝發(fā)酵液提取物的母液，用2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液10倍稀釋配成開始濃度，然后用培養(yǎng)液從開始3倍稀釋共8個(gè)濃度，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度4孔，每4天換同濃度藥液，設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組.以觀察細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，8天顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無(wú)病變?yōu)?。計(jì)算每濃度藥液平均細(xì)胞病變程度和抑制％。按Reed & Muench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度(TC50)，最大無(wú)毒濃度(TCO)2.藥物對(duì)HBeAg、HBsAg抑制試驗(yàn)每毫升10萬(wàn)個(gè)2.2.15細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200ul，37℃ 5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，加無(wú)毒濃度以下3倍稀釋試驗(yàn)藥液，4個(gè)稀釋度分別為最大無(wú)毒濃度及其以下3倍稀釋的3個(gè)濃度，每濃度4孔，設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組，37℃ 5％CO2培養(yǎng)，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，第8天時(shí)收獲培養(yǎng)液，-20℃凍存。一批實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定HBsAg和HBeAg。實(shí)驗(yàn)設(shè)HBsAg、HBeAg陽(yáng)性和陰性對(duì)照及細(xì)胞對(duì)照。用HBsAg和HBeAg固相放射免疫測(cè)定盒測(cè)定，方法見說明書，用γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔cpm值，4孔平行孔取均值后計(jì)算抑制率。按Reed & Muench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度(IC50)。
A＝log＞50％藥物濃度 B＝log＜50％藥物濃度 C＝log稀釋倍數(shù)3.藥物對(duì)HBV DNA的抑制試驗(yàn)各濃度組藥液的及各對(duì)照組的2.2.15細(xì)胞上清夜和細(xì)胞按分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法提取其HBV DNA、各樣品斑點(diǎn)雜交、放射自顯影、測(cè)量各雜交點(diǎn)的A值后，計(jì)算抑制率。按Reed & Muench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度(IC50)。
A＝log＞50％藥物濃度 B＝log＜50％藥物濃度 C＝log稀釋倍數(shù)4.選擇指數(shù)(SI)SI＝TC50/IC50結(jié)果(1)樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性為觀察樟芝發(fā)酵液提取物樣品對(duì)乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染的人肝癌2.2.15細(xì)胞的毒性，在接種2.2.15細(xì)胞后24小時(shí)加3倍稀釋藥液，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。4天換一次藥液，維持8天，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變，按公式計(jì)算半數(shù)有毒濃度(TC50)，最大無(wú)毒濃度(TC0)，做一批實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1.樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性

注細(xì)胞病變完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無(wú)病變?yōu)?(2)樣品在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用樣品最大無(wú)毒濃度及其以下3倍稀釋的3個(gè)濃度，加入2.2.15細(xì)胞中培養(yǎng)，第8天對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制效果見表2和表3。
表2.樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞中第8天對(duì)HBsAg的抑制作用

表3.樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞中第8天對(duì)HBeAg的抑制作用

(3)樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBV DNA的抑制作用樟芝發(fā)酵液提取物樣品最大無(wú)毒濃度及其以下3倍稀釋的3個(gè)濃度，加入2.2.15細(xì)胞中培養(yǎng)8天，樟芝發(fā)酵液提取物樣品對(duì)HBV DNA作用的結(jié)果見表4。
表4.樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞中第8天對(duì)HBV DNA的抑制作用

結(jié)論樟芝發(fā)酵液提取物樣品對(duì)2.2.15細(xì)胞毒性和在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HBV DNA的抑制作用的結(jié)果見表5。陽(yáng)性藥1μM的拉米夫定(3TC)在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HBV DNA的抑制率為46。4％。樟芝發(fā)酵液提取物樣品在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用見表6，7。
表5.樟芝發(fā)酵液提取物樣品對(duì)2.2.15細(xì)胞毒性和HBV DNA的抑制作用總結(jié)表

表6.樟芝發(fā)酵液提取物樣品對(duì)2.2.15細(xì)胞毒性和對(duì)HBsAg的抑制作用總結(jié)表

表7.樟芝發(fā)酵液提取物樣品對(duì)2.2.15細(xì)胞毒性和對(duì)HBeAg的抑制作用總結(jié)表

實(shí)施例12應(yīng)用樟芝菌絲體發(fā)酵提取物樣品進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè)測(cè)試單位山東大學(xué)藥學(xué)院新藥藥理研究所1.材料1.1受試樣品樟芝菌絲體發(fā)酵提取物，為褐色粉末狀，由萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院藥用真菌研究所提供，干燥保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)以蒸餾水制成混懸液。
呋喃氟脲嘧啶(T207)齊魯制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)0306007。
1.2腫瘤細(xì)胞株S180小鼠肉瘤，H22小鼠肝癌，來源于山東省醫(yī)科學(xué)院藥物研究所。腹水傳代保存。
1.3動(dòng)物昆明種小鼠，體重19～22g，雌雄兼用，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證生產(chǎn)許可(魯)20030004。
2.方法無(wú)菌抽取傳代后5～7天的小鼠腫瘤腹水，經(jīng)過稀釋、計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2～5×106/ml(H22為1～2×107/ml)，每只小鼠右側(cè)腹部皮下接種0.2ml。小鼠隨機(jī)分組，每組10只，分別為大計(jì)量組(1000mg/kg)，中計(jì)量組(400mg/kg)，小劑量組(160mg/kg)，陽(yáng)性對(duì)照組(FT207 120ml/kg)，對(duì)照組動(dòng)物數(shù)14～18只。種瘤后次日給藥，灌胃體積0.8ml/只，對(duì)照組給與同等體積蒸餾水。每日上午給藥，連續(xù)12～15天，末次給藥24h后處死小鼠，取瘤稱重，計(jì)算抑瘤率。
3.結(jié)果以樟芝提取物，分別對(duì)S180小鼠肉瘤和H22小鼠肝癌進(jìn)行不同批次抑瘤試驗(yàn)，總結(jié)結(jié)果。
4.結(jié)果說明(1)連續(xù)灌胃樟芝菌株提取物12～15天。各計(jì)量組對(duì)動(dòng)物的一般狀況及體重增長(zhǎng)均明顯好于陽(yáng)性對(duì)照組。
(2)各計(jì)量組的樟芝菌株提取物對(duì)S180小鼠肉瘤和H22小鼠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定抑制作用，抑瘤活性一般在30～45％之間。其中，對(duì)S180小鼠肉瘤的抑制率最高可達(dá)43.37％(1000mg/kg體重)，對(duì)H22小鼠肝癌細(xì)胞的最高抑制率可達(dá)48.88％(160mg/kg體重)。通過實(shí)驗(yàn)分析，該類受試藥物的抑瘤活性可能是通過對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)解而產(chǎn)生抑瘤作用。
權(quán)利要求
1.一種抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物20～100；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精200～480。
2.如權(quán)利要求1所述的抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物50～100；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精200～450。
3.如權(quán)利要求2所述的抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物50；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精450。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，所述樟芝菌絲體發(fā)酵提取物由下述方法制得(1)取樟芝菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；(2)用體積百分比為60～95％的乙醇對(duì)上述濃縮的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～5倍，以能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60～90％；(3)50～70℃條件下，加熱1～2小時(shí)；(4)以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級(jí)過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；(5)將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；(6)用體積百分比為95％的、4～8倍乙醇濃縮液體積量的乙醇，對(duì)上述濃縮乙醇提取液進(jìn)行12～24小時(shí)沉淀處理；(7)以常規(guī)方法分離出沉淀物；(8)將沉淀物以常規(guī)方式真空干燥或低溫冷凍干燥，得樟芝菌絲體發(fā)酵提取物；其中，所述樟芝菌絲體發(fā)酵全液是指菌絲體和發(fā)酵液的濾液；所述樟芝菌絲體為CGMCCNo.1460，該菌株名為樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保臧在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1460。
5.如權(quán)利要求4所述的抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，所述樟芝(Antrodiacamphorata)Ac001 CGMCC No.1460的發(fā)酵培養(yǎng)方法是，將樟芝菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20～35℃溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80～280r/min，pH 3～8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7～15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5～4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20～35℃，發(fā)酵罐滅菌壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7～15天，即可利用樟芝菌絲體發(fā)酵全液制備取物。
6.如權(quán)利要求5所述的抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，所述種子或發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是玉米淀粉1％ 葡萄糖 1％蛋白胨 0.2％酵母膏 0.2％硫酸鎂 0.1％磷酸二氫鉀 0.05％。
7.如權(quán)利要求5所述的抗肝癌的樟芝膠囊，其特征是，所述樟芝(Antrodiacamphorata)Ac001 CGMCC No.1460的發(fā)酵培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)溫度是28～30℃，培養(yǎng)pH為6。
8.權(quán)利要求1、2或3所述抗肝癌的樟芝膠囊的制備方法，其特征是，以所述重量份分別稱取樟芝菌絲體發(fā)酵提取物、不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精；均研碎為小于200目的細(xì)粉，干燥條件下充分混勻；以每粒膠囊裝0.5克的量裝入0號(hào)膠囊。
9.如權(quán)利要求9所述抗肝癌的樟芝膠囊的制備方法，其特征是，所述玉米淀粉或藥用糊精的含水量要求在質(zhì)量百分比9％以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗肝癌的樟芝膠囊，由下述組分及重量份組成樟芝菌絲體發(fā)酵提取物20～100；不含蛋白玉米淀粉或藥用糊精200～480。其中所述樟芝菌絲體發(fā)酵提取物，由乙醇提取并干燥后制得；所用菌株為樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏編號(hào)為CGMCC No.1460。本發(fā)明抗肝癌的樟芝膠囊中的樟芝菌絲體發(fā)酵提取物在對(duì)乙型肝炎病毒HBsAg、e抗原HBeAg及HBV DNA分泌的抑制以及在抗癌特別是抗肝癌中有明顯作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1799560SQ20051004480
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者宋愛榮, 趙晨, 田雪梅, 黃芳 申請(qǐng)人:萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院