專利名稱：一種具有靶向功能的超抗原,其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有靶向功能的超抗原，具體地說(shuō)涉及一種含有二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體的靶向超抗原，還涉及該超抗原的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
葡萄球菌腸毒素A(staphylococcalenterotoxinA SEA)是金黃色葡萄球菌的產(chǎn)物，是一種重要的細(xì)菌性超抗原。由于SEA誘導(dǎo)的CTL(cytotoxic Tlymphocytes)對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)大的殺傷作用(Kalland T，Dohlsten M，AbrahmsenL，et al.Targeting of superantigens.Cell Biophys.1993 Jan-Jun；22(1-3)147-164；Hansson J，Ohlsson L，Persson R，et al.Genetically engineered superantigens astolerable antitumor agents.Proc Natl Acad Sci USA.1997 Mar 18；94(6)2489-2494；Dohlsten M.，Hedlund G.，Akerblom E.，et al.antibody-targeted superantigensadifferent class of anti-tumor agents.Proc Natl Acad Sci USA.1991 October 15；88(20)9287-9291)。因此應(yīng)用SEA的抗腫瘤治療得到了人們的熱切關(guān)注。但是SEA在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也具有毒性，并且只能對(duì)MHCII+的腫瘤分子進(jìn)行殺傷。單克隆抗體制備技術(shù)為腫瘤的導(dǎo)向治療帶來(lái)了希望。單克隆抗體B3是對(duì)應(yīng)于LeY家族中一種糖類抗原的鼠源抗體，這種抗原在許多腫瘤細(xì)胞表面都有表達(dá)，包括結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及一些表皮癌細(xì)胞。由于mAb B3只與極少部分的正常細(xì)胞發(fā)生作用，因此是一種很理想的進(jìn)行腫瘤導(dǎo)向治療的抗體(Brinkmann U，Pai LH，F(xiàn)itzGerald DJ，Willingham M，Pastan I.B3(Fv)-PE38KDEL，a single-chain immunotoxin that causescomplete regression of a human carcinoma in mice.Proc Natl Acad Sci USA.1991 Oct1；88(19)8616-8620.)。但單克隆抗體分子量大、穿透力差，限制了其導(dǎo)向治療的效果。而小分子基因工程抗體的出現(xiàn)較好的解決了上述問(wèn)題，國(guó)外源于mAbB3的小分子抗體導(dǎo)向的免疫毒素(B3-PE)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)(Pai LH，BatraJK，F(xiàn)itzGerald DJ，Willingham MC，Pastan I.Antitumor effects of B3-PE andB3-LysPE40 in a nude mouse model of human breast cancer and the evaluation ofB3-PE toxicity in monkeys.Cancer Res.1992 Jun 1；52(11)3189-3193.)，如單鏈抗體(ScFv)，二硫鍵穩(wěn)定抗體(dsFv)(Rajagopal V，Pastan I，Kreitman RJ.A form ofanti-Tac(Fv)which is both single-chain and disulfide stabilizedcomparison with itssingle-chain and disulfide-stabilized homologs.Protein Eng.1997Dec；10(12)1453-1459.)。前者是由一條Linker連接VH和VL分子，后者VH和VL的連接則是通過(guò)一對(duì)鏈間二硫鍵(Reiter Y，Brinkmann U，Jung SH，Lee B，Kasprzyk PG，King CR，Pastan I.Improved binding and antitumor activity of arecombinant anti-erbB2 immunotoxin by disulfide stabilization of the Fv fragment.JBiol Chem.1994 Jul 15；269(28)18327-18331.)。然而，VH和VL短暫的分離導(dǎo)致ScFv的不穩(wěn)定進(jìn)而影響了與其連接的毒素的穩(wěn)定性；dsFv相對(duì)于ScFv較穩(wěn)定，但是復(fù)性后的低產(chǎn)量限制了它的臨床應(yīng)用。而二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體sc-dsFv是近期報(bào)道的一種新型基因工程抗體，其VH和VL之間同時(shí)由一條Linker和一對(duì)二硫鍵進(jìn)行連接，兼具ScFv產(chǎn)量高和dsFv穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，因而更具優(yōu)勢(shì)(Bera TK，Onda M，Brinkmann U，Pastan I.A bivalentdisulfide-stabilized Fv with improved antigen binding to erbB2.J Mol Biol.1998 Aug21；281(3)475-483.)。
到目前為止，尚未有可與LeY家族糖類抗原結(jié)合的源于B3單克隆抗體的基因工程抗體，與葡萄球菌腸毒素A(D227A)融合表達(dá)，制備靶向超抗原的報(bào)道。也未見(jiàn)B3二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體sc-dsFv與其它蛋白(毒素、超抗原)融合的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服葡萄球菌腸毒素A抗腫瘤治療中對(duì)正常細(xì)胞具有毒性，且殺傷腫瘤細(xì)胞種類少的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種高效的具有靶向功能的超抗原。
本發(fā)明的具有靶向功能的超抗原由兩部分組成，其特征在于靶向部分為可與LeY家族糖類抗原結(jié)合的源于B3單克隆抗體的基因工程抗體，超抗原部分為葡萄球菌腸毒素A或其突變體(D227A)。所述基因工程抗體為B3二硫鍵穩(wěn)定抗體(dsFv)、單鏈抗體(scFv)或二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體(ds-scFv)。其中靶向功能部分優(yōu)選源于B3單克隆抗體的二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體B3ds-scFv，超抗原部分為葡萄球菌腸毒素A(SEA)，兩部分結(jié)合為B3ds-scFv-SEA。
本發(fā)明還公開(kāi)了上述具有靶向功能的超抗原的制備方法，包括以下步驟首先是通過(guò)重疊PCR技術(shù)，連接B3抗體的VH和VL片段，并將PCR產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體，如pET22b，構(gòu)建B3ds-scFv-pET22b重組表達(dá)載體；將測(cè)序正確的SEA(D227A)基因片段經(jīng)酶切連接亞克隆至上述獲得的重組表達(dá)載體B3ds-scFv-pET22b，構(gòu)建包含B3ds-scFv-SEA-pET22b片段的重組表達(dá)載體；然后經(jīng)酶切鑒定B3ds-scFv與SEA兩片段連接正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌如BL21(DE3)，可以經(jīng)過(guò)不同表達(dá)方式如IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，獲得包涵體，然后將表達(dá)的包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性，復(fù)性產(chǎn)物可以通過(guò)陽(yáng)離子柱SP-Sepharose等純化方法進(jìn)行初步純化，獲得B3ds-scFv-SEA融合蛋白。
經(jīng)鑒定，重疊PCR擴(kuò)增得到了B3ds-scFv單鏈抗體基因，并通過(guò)酶切連接成功構(gòu)建了B3ds-scFv和SEA(D227A)兩段融合基因，成功構(gòu)建了B3ds-scFv-SEA-pET表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，占總蛋白量的33％左右；ELISA測(cè)定此融合蛋白中單鏈抗體的結(jié)合活性以及其在37℃的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示復(fù)性后的B3ds-scFv-SEA融合蛋白保持了單鏈抗體的結(jié)合活性，37℃孵育數(shù)小時(shí)后，經(jīng)ELISA測(cè)定，蛋白仍能保持大部分活性；采用MTT法檢測(cè)其對(duì)B3抗原表面陽(yáng)性細(xì)胞如結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞具有一定的殺傷作用。
本發(fā)明還公開(kāi)了具有靶向功能的超抗原在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用，其中的腫瘤為在腫瘤細(xì)胞表面有與單克隆抗體B3相對(duì)應(yīng)的LeY家族糖類抗原表達(dá)的腫瘤，包括結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及一些表皮癌等。
在眾多的惡性腫瘤的生物療法中，抗體的導(dǎo)向治療具有毒副作用小、選擇性強(qiáng)、效果持久等優(yōu)點(diǎn)?？贵w的Fv片段保留了特異的抗原結(jié)合能力，并且能較快的穿透腫瘤(Kuan CT，Pastan I.Improved antitumor activity of a recombinantanti-Lewis(y)immunotoxin not requiring proteolytic activation.Proc Natl Acad Sci USA.1996Feb 6；93(3)974-978)，由于其具有以上優(yōu)點(diǎn)，因此，近年來(lái)出現(xiàn)了各種形式的Fv，ScFv和dsFv就是其中的兩種，然而，ScFv的不穩(wěn)定性和dsFv的低復(fù)性率成為它們?cè)谂R床應(yīng)用上的障礙。本發(fā)明所采用的二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體B3ds-scFv抗體，克服了以上的不足。
本發(fā)明采用重疊PCR及人為引入鏈間二硫鍵B3VH(Cys44)和B3VL(Cys105))首次構(gòu)建了新型抗體B3ds-cFv，并同SEA(D227A)進(jìn)行了融合表達(dá)，目的是彌補(bǔ)SEA在腫瘤治療中的不足，在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷的同時(shí)減少其對(duì)正常細(xì)胞的傷害，同時(shí)提高整個(gè)重組毒素的穩(wěn)定性以達(dá)到理想的治療效果。
本發(fā)明對(duì)融合蛋白進(jìn)行了高效的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，產(chǎn)量可達(dá)到總蛋白量的30％以上，相對(duì)于可溶表達(dá)的低產(chǎn)量，包涵體的高表達(dá)量更有利于B3ds-scFv-SEA的應(yīng)用。在包涵體的復(fù)性方法上，我們采用了稀釋復(fù)性法，并且對(duì)復(fù)性液的配方進(jìn)行了摸索，結(jié)果表明，在高濃度的促溶劑精氨酸和少量GSSG存在的條件下，10℃復(fù)性效果最好。研究表明復(fù)性液中存在的復(fù)性劑和低濃度鹽酸胍對(duì)腫瘤細(xì)胞就具有一定的殺傷作用，為了檢測(cè)B3ds-scFv-SEA對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，我們對(duì)復(fù)性后的產(chǎn)物進(jìn)行了純化，由于復(fù)性后的溶液體積較大，我們用中空纖維濃縮換液柱對(duì)樣品進(jìn)行濃縮和換液處理，整個(gè)過(guò)程僅需2-3個(gè)小時(shí)，解決了傳統(tǒng)的透析換液費(fèi)時(shí)且除鹽不徹底的缺點(diǎn)，大大加快了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。二硫鍵的形成是影響整個(gè)蛋白穩(wěn)定的關(guān)鍵問(wèn)題，我們將復(fù)性純化后的產(chǎn)物進(jìn)行了還原和非還原SDS-PAGE分析并進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，蛋白在非還原狀態(tài)下的遷移率略大于還原狀態(tài)，將B3ds-scFv-SEA在37℃孵育，其活性無(wú)明顯降低，說(shuō)明了通過(guò)復(fù)性形成了二硫鍵。
在以往靶向超抗原的研究過(guò)程中，同時(shí)獲得抗體結(jié)合活性和抗腫瘤活性良好的超抗原雙功能分子是困難的。在抗體和超抗原的融合過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的結(jié)合活性和超抗原免疫激活特性會(huì)部分甚至完全喪失。我們?cè)猛瑯臃椒ㄖ苽銪3基因工程抗體與葡萄球菌B型腸毒素(SEB)的融合蛋白，結(jié)果該蛋白對(duì)B3抗體針對(duì)的腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用。本研究的活性實(shí)驗(yàn)證明，制備的融合蛋白對(duì)B3表面陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞具有良好的結(jié)合活性，證實(shí)其具備了良好的腫瘤導(dǎo)向作用，且能夠成功的激活T淋巴細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29進(jìn)行殺傷，蛋白濃度為1μg/ml時(shí)，最大抑制率可達(dá)95％，其對(duì)腫瘤的殺傷力與天然SEA相當(dāng)。
本發(fā)明首次構(gòu)建了源于B3單克隆抗體的二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體B3ds-scFv，并在此基礎(chǔ)上與SEA(D227A)基因通過(guò)原核表達(dá)載體進(jìn)行了高效的融合表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明了融合蛋白穩(wěn)定性良好，37℃孵育數(shù)小時(shí)仍能保持大部分活性，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的單鏈抗體的穩(wěn)定性；與B3抗原表面陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞結(jié)合良好，并對(duì)表達(dá)B3抗原的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞具有一定的殺傷作用。本發(fā)明所獲得的B3(ds-scFv)-SEA重組超抗原具備了導(dǎo)向和殺傷腫瘤細(xì)胞的雙重功能，可以成為有效的腫瘤免疫治療靶向藥物。


圖1為B3dsscFv-SEA-pET質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2為陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定圖譜。
圖3為融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)圖譜。
圖4為B3ds-scFv-SEA與不同腫瘤細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果圖。
圖5為融合蛋白穩(wěn)定性分析6為融合蛋白的純化和二硫鍵分析圖7為融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 B3ds-scFv-SEA融合蛋白的制備1.材料
B3ds-scFv-pET及SEA(D227A)-pET質(zhì)粒按照常規(guī)方法構(gòu)建，B3ds-scFv基因片段由上海博亞生物技術(shù)公司人工合成，SEA(D227A)片段由金黃色葡萄球菌FRI100A(ATCC)釣取，并按常規(guī)方法誘變。人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、大腸桿菌TOP10均為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株，市購(gòu)；表達(dá)載體pET22b為市購(gòu)；LA TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Takara公司；T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、Non-RadioactiveCell Proliferation Assay試劑盒購(gòu)自Promega公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自道普公司，羊抗兔IgG購(gòu)自北京欣經(jīng)科，AKTA蛋白純化系統(tǒng)、Hitrap-SP-Sepharose純化柱系A(chǔ)mersham公司產(chǎn)品；中空纖維濃縮柱購(gòu)自北京旭邦公司。其他試劑均為市購(gòu)，為分析純。引物合成及DNA測(cè)序，由上海博亞生物工程公司完成。
2.方法2.1 B3VH和B3VL的PCR連接B3VH和B3VL中二硫鍵突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)(Jung SH，Pastan I，Lee B.Design of interchain disulfide bonds in the framework region of the Fv fragment of themonoclonal antibody B3.Proteins.1994 May；19(1)35-47；Brinkmann U，Reiter Y，Jung SH，Lee B，Pastan I.A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv fragment.ProcNatl Acad Sci USA.1993 Aug 15；90(16)7538-7542.)，即B3VH(Cys44)和B3VL(Cys105)。由于模板質(zhì)粒B3ds-scFv-pET32a經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)VH和VL之間的linker GGGGSGGGGSGGGGS中第六個(gè)堿基G突變成了S(G→S)，為了不影響單鏈抗體的活性以及保持整個(gè)融合蛋白的空間構(gòu)象，我們通過(guò)重疊PCR對(duì)此突變進(jìn)行了糾正，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了B3VH和B3VL的連接。根據(jù)GeneBank中B3VH和B3VL的基因序列及l(fā)inker的序列設(shè)計(jì)了四條引物(見(jiàn)表1)，下劃線先后標(biāo)明了酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI，其中P2和P3中包含了部分linker序列。以B3ds-scFv-pET32a為模板，分別以P1和P2為上下游引物擴(kuò)增B3VH；以P3和P4擴(kuò)增B3VL，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，再以回收后等比例混合的B3VH和B3VL為模板，以P1和P4為上下游引物擴(kuò)增B3ds-scFv，電泳鑒定并回收PCR產(chǎn)物。
表1.構(gòu)建載體B3ds-scFv-SEA-pET寡核苷酸引物

2.2 B3ds-scFv-pET的構(gòu)建將回收的B3ds-scFv PCR產(chǎn)物連入pMD-18T-Vector測(cè)序，NdeI、BamHI雙酶切測(cè)序正確后的質(zhì)粒，與用相同酶切的載體pET22b連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒B3ds-scFv-pET，并對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。
2.3 B3ds-scFv與SEA(D227A)的酶切連接以rSEA為模板擴(kuò)增SEA(D227A)，分別以P5和P6(見(jiàn)表1)為上下游引物擴(kuò)增SEA(D227A)，并在上游引入酶切連接的位點(diǎn)BamHI。將回收的PCR產(chǎn)物連入pMD-18T-Vector測(cè)序，測(cè)序后正確的質(zhì)粒以BamHI和SalI酶切，并與用相同酶切的表達(dá)載體B3ds-scFv-pET連接，實(shí)現(xiàn)B3ds-scFv和SEA(D227A)基因的融合，構(gòu)成表達(dá)載體B3dsscFv-SEA-pET，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1。
2.4 B3ds-scFv-SEA融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)NdeI和SalI雙酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，挑取單菌落于TB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600＝0.5，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)3h。收集菌體，將菌體用包含50mmol/L pH8.5的Tris-Hcl，5mmol/L的EDTA，0.8％NaCl的緩沖液重懸，超聲破菌，5000g，4℃離心15min，分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。
2.5 表達(dá)產(chǎn)物的western blot鑒定將破碎后的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE后，用半干轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以封閉液封閉后依次與兔抗SEA一抗，羊抗兔IgG二抗共孵育，DAB顯色觀察結(jié)果。
2.6 包涵體的洗滌及變復(fù)性將超聲后的到的沉淀以50mmol/L pH8.5的Tris-HCl，5mmol/L的EDTA洗滌兩次后加入變性劑(6mol/L鹽酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-HclpH8.5，10mmol/L DTT)室溫放置3h，離心分離出上清，將變性后的上清1∶30稀釋至包含100mmol/LTris-HCl pH8.0，0.5mol/L L-Arg，2mmol/L EDTA和0.9mmol/L GSSG的復(fù)性液中，10℃復(fù)性48h。
2.7 復(fù)性產(chǎn)物的純化將復(fù)性后的溶液經(jīng)中空纖維超濾柱濃縮并換成pH5.8，5mmol/L的磷酸鹽緩沖液(BufferA)，過(guò)SP-Sepharose陽(yáng)離子交換柱純化，以含0.5mol/LNaCl的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(BufferB)線性洗脫，目的蛋白在達(dá)到50％ BufferB時(shí)被洗脫，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物。
3.結(jié)果3.1 B3ds-scFv表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定以B3ds-scFv-pET32a為模板，通過(guò)重疊PCR連接獲得B3dsscFv，大小為750bp，連入T-Vector測(cè)序結(jié)果說(shuō)明成功糾正了模板中的點(diǎn)突變；對(duì)陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行了NdeI和BamHI雙酶切鑒定，2％瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，結(jié)果表明切下的片段與目的片段大小一致，見(jiàn)圖2。
3.2 B3ds-scFv-SEA融合表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將測(cè)序正確的SEA(D227A)-T-Vector經(jīng)BamHI和SalI酶切鑒定后連入經(jīng)過(guò)相同酶切的B3ds-scFv-pET構(gòu)成B3ds-scFv-SEA-pET22b表達(dá)載體，再對(duì)此表達(dá)載體進(jìn)行NdeI和BamHI雙酶切鑒定，結(jié)果表明切下的片段為1500bp左右，與B3ds-scFv-SEA融合基因大小一致，證明成功構(gòu)建了B3ds-scFv-SEA-pET22b表達(dá)載體，見(jiàn)圖2。
3.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將B3ds-scFv-SEA-pET表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑單菌落于TB培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)后收集菌體，超聲破碎后分離上清和沉淀，SDS-PAGE結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在(圖3)，大小約為50KD，經(jīng)TotalLab軟件掃描分析占總表達(dá)量的30％左右。
3.4 表達(dá)產(chǎn)物的western blot鑒定將表達(dá)的包涵體SDS-PAGE鑒定后進(jìn)行western blot鑒定，結(jié)果表明所顯示條帶為目的蛋白，見(jiàn)圖3。
3.5 復(fù)性產(chǎn)物的純化復(fù)性后的產(chǎn)物經(jīng)濃縮換液后過(guò)sp-sepharose陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE分析，可見(jiàn)蛋白在非還原狀態(tài)下的遷移率略大于還原狀態(tài)，初步說(shuō)明蛋白復(fù)性過(guò)程中可能形成了二硫鍵，見(jiàn)圖6。
實(shí)施例二 B3ds-scFv-SEA融合蛋白檢測(cè)1.材料同實(shí)施例一。
2.方法2.1ELISA鑒定B3ds-scFv-SEA中單鏈抗體的活性用含血清的1640將腫瘤細(xì)胞濃度調(diào)至5×104/ml鋪于96孔板，每孔100uL置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，取出，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗一遍，然后每孔加入100ul預(yù)冷的細(xì)胞固定液(V甲醇∶V丙酮＝1∶1)固定30min后再加入阻斷液(含1％H2O2的PBS)阻斷10min后用PBS洗三遍；加入用含3％BSA的PBST梯度稀釋的蛋白溶液(初始濃度為100μg)，37℃反應(yīng)1h，PBST洗滌后加入1∶1000稀釋的兔源抗SEA一抗，37℃結(jié)合1h；PBST洗滌后再加入1∶1000稀釋的羊抗兔IgG二抗，37℃結(jié)合30min；PBST洗滌后加入OPD底物液顯色至適當(dāng)強(qiáng)度，以2M的H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)A450值。
2.2 融合蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將蛋白樣品置于37℃孵育，并分別于不同的時(shí)間間隔取樣，用樣品對(duì)HT-29腫瘤細(xì)胞的結(jié)合力來(lái)衡量其剩余活性進(jìn)而確定其穩(wěn)定性。
2.3 MTT法測(cè)定復(fù)性純化后的B3dsscFv-SEA對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性參照文獻(xiàn)方法(Dohlsten M，Lando PA，Bjork P，Abrahmsen L，Ohlsson L，Lind P，Kalland T.Immunotherapy of human colon cancer by antibody-targeted superantigens.CancerImmunol Immunother.1995 Sep；41(3)162-168.)，并做如下改進(jìn)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入HT-29細(xì)胞及外周血淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝8∶1)和系列稀釋的B3ds-scFv-SEA，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)5d。然后采用Non-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒分析殺傷結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果以腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(TGI)表示。TGI(％)＝(1-Atest/AC)×100％。Atest指在含效應(yīng)細(xì)胞和不同濃度的B3ds-scFv-SEA的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞的吸收值，AC指僅含效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的吸收值。
3.結(jié)果3.1 細(xì)胞ELISA檢測(cè)B3dsscFv-SEA的結(jié)合活性ELISA測(cè)定B3ds-scFv-SEA與不同腫瘤細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出B3ds-scFv-SEA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的結(jié)合力優(yōu)于其它兩種細(xì)胞，這可能是因?yàn)锽3抗原在MCF-7細(xì)胞上的表達(dá)量較高的緣故(Pastan I，Lovelace ET，Gallo MG，Rutherford AV，Magnani JL，Willingham MC.Characterization of monoclonalantibodies B1 and B3 that react with mucinous adenocarcinomas.Cancer Res.1991 Jul15；51(14)3781-3787.)。
3.2 融合蛋白穩(wěn)定性分析通過(guò)將蛋白在37℃孵育不同的時(shí)間并測(cè)活來(lái)確定其穩(wěn)定性。在37℃孵育了16h后，蛋白仍保持了85％以上的活性，初步說(shuō)明了B3ds-scFv-SEA具有較好的穩(wěn)定性，見(jiàn)圖5。
3.3 融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)在效靶比為8∶1時(shí)，隨著蛋白濃度的增加，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的抑制率逐漸增大，在蛋白濃度為1μg/ml時(shí)，最大抑制率可達(dá)95％，不加效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，B3ds-scFv-SEA對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)殺傷作用。B3ds-scFv-SEA對(duì)腫瘤的抑制力略低于天然SEA(圖7中起始蛋白濃度均為1μg/ml)。
權(quán)利要求
1.一種具有靶向功能的超抗原，包括靶向部分和超抗原部分，其特征在于靶向部分為可與LeY家族糖類抗原結(jié)合的源于B3單克隆抗體的基因工程抗體，超抗原部分為葡萄球菌腸毒素A(SEA)或其突變體(SEAD227A)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有靶向功能的超抗原，其特征在于所述基因工程抗體為B3二硫鍵穩(wěn)定抗體(dsFv)、單鏈抗體(scFv)或二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體(ds-scFv)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有靶向功能的超抗原，其特征在于所述基因工程抗體為B3的二硫鍵穩(wěn)定單鏈抗體(B3ds-scFv)。
4.權(quán)利要求3所述具有靶向功能的超抗原的制備方法，包括以下步驟(1)通過(guò)PCR連接B3抗體的VH和VL片段；(2)將PCR產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體，構(gòu)建包含B3ds-scFv單鏈抗體基因片段的重組表達(dá)載體；(3)將SEA(D227A)基因片段亞克隆至上述重組表達(dá)載體，構(gòu)建包含B3ds-scFv-SEA片段的重組表達(dá)載體；(4)將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并誘導(dǎo)表達(dá)，獲得包涵體；(5)將包涵體變性、復(fù)性并純化，得到B3ds-scFv-SEA(D227A)融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其中所述表達(dá)載體為pET22b，所述大腸桿菌為BL21(DE3)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其中所述誘導(dǎo)表達(dá)方法為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述具有靶向功能的超抗原在制備腫瘤免疫治療藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其中所述腫瘤為在腫瘤細(xì)胞表面有與單克隆抗體B3相對(duì)應(yīng)的LeY家族糖類抗原表達(dá)的腫瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其中所述腫瘤為結(jié)腸癌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有靶向功能的超抗原，還公開(kāi)了該超抗原的制備方法及用途。該超抗原包括靶向部分和超抗原部分，其中靶向部分為可與LeY家族糖類抗原結(jié)合的源于B3單克隆抗體的基因工程抗體，超抗原部分為葡萄球菌腸毒素A。該超抗原的制備方法，包括連接B3抗體的VH和VL片段，含有抗體基因片段的重組載體的構(gòu)建，含有抗體及超抗原基因片段重組載體的構(gòu)建，具有靶向功能的超抗原融合蛋白的表達(dá)，純化等步驟。本發(fā)明所獲得的重組超抗原具備了導(dǎo)向和殺傷腫瘤細(xì)胞的雙重功能，有可能發(fā)展為有效的腫瘤免疫治療靶向藥物。
文檔編號(hào)A61K39/085GK1884301SQ20051007773
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者姜永強(qiáng), 鄭玉玲, 王建麗, 馬茹, 寧保安 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所