專利名稱：二倍體細(xì)胞狂犬疫苗及純化狂犬疫苗，劑型凍干及水針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種狂犬病純化疫苗，特別是在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗。
背景技術(shù)：
目前世界大量生產(chǎn)的狂犬疫苗有四種第一種以美國為代表的二倍體細(xì)胞，經(jīng)過濃縮超離制備的狂犬疫苗；第二種以法國為代表的Vero細(xì)胞為培養(yǎng)基質(zhì)的，生產(chǎn)凍干滅活疫苗，但不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致瘤和細(xì)胞的DNA。第三種和第四種以中國為代表的地鼠腎和日本的雞胚、鴨胚這幾種疫苗細(xì)胞來源于普通動物無法保證細(xì)胞不攜帶外源因子也不能保證細(xì)胞基質(zhì)的致瘤性和細(xì)胞的DNA。
人二倍體細(xì)胞疫苗(HDCV)1964年Wiktor在Wistar研究所首次描述HDCV，并進(jìn)一步通過比較度驗(yàn)最終將來源于Semple疫苗生產(chǎn)用PM狂犬病毒株適應(yīng)到WI-38人二倍體細(xì)胞株(后來又適應(yīng)到MRC-5細(xì)胞株)。培養(yǎng)病毒經(jīng)澄清、加熱和β-丙內(nèi)酯滅活、凍干制備成疫苗。該疫苗于1974年首次獲準(zhǔn)生產(chǎn)，并于1978年開始商品化。HDCV不含任何神經(jīng)毒因子，并不含任何外源動物雜質(zhì)，因而可以解釋它在重復(fù)注射后較好的耐受。采用NIH法檢測疫苗的穩(wěn)定性證實(shí)，疫苗在4℃和37℃放置一個月后，無明顯差異。進(jìn)一步將5批效價4.3～5.6的疫苗4℃存放3年半，所有批號滴度均大于2.5IU/劑。
早期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，HDCV預(yù)防接種后1月或3月達(dá)到抗體峰值(10IU左右)，隨后便逐漸降低，但1～2年內(nèi)滴度始終大于0.5IU，通過1～3年內(nèi)加強(qiáng)免疫后，抗體滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途徑相近。
HDCV的問世使人們對傳統(tǒng)疫苗免疫原性的評價有了根據(jù)。Shah等證實(shí)2～4針HDCV接種人體后獲得的抗體反應(yīng)與14針Semple疫苗相當(dāng)，Cost-Berger通過志愿者分別注射3針HDCV和SMBV，發(fā)現(xiàn)前者誘生的抗體反應(yīng)是后者的5倍。通過HDCV和DEV比較也證實(shí)后者僅具有限的效力。Bahmanyar在當(dāng)時得出的結(jié)論是，在人體試驗(yàn)中所使用的任何疫苗的免疫原性都無法和HDCV相比。人二倍體細(xì)胞(HDC)為正常核型細(xì)胞，無致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫原性和良好的耐受性，目前在美國、加拿大、大多數(shù)歐洲國家和幾個亞洲國家使用，這使其成為評價任何一種人用新疫苗的標(biāo)準(zhǔn)疫苗。
HDCV的缺點(diǎn)在于HDC不太容易培養(yǎng)，而且狂犬病毒在HDC上培養(yǎng)的病毒滴度相對較低，僅能在空間有限的細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)，這使得疫苗的價格非常昂貴。在美國，用HDCV暴露后處理一個療程費(fèi)用高達(dá)一千多美元；而在巴基斯坦，用Semple疫苗進(jìn)行全療程處理只需2.5美元，這樣就限制了該疫苗在發(fā)展中國家的使用。同時用該方法制備狂犬病疫苗的詳細(xì)描述未見報(bào)道。由于狂犬病疫苗的特殊性和復(fù)雜性，制備該疫苗具有相當(dāng)?shù)碾y度，特別是在分離和純化方面。原代細(xì)胞培養(yǎng)疫苗地鼠腎細(xì)胞疫苗(PHKCV)用地鼠腎細(xì)胞組織培養(yǎng)狂犬病毒發(fā)展滅活疫苗首先由Kissling提出并由Fenje進(jìn)一步發(fā)展，將SAD狂犬病毒固定毒適應(yīng)到地鼠腎細(xì)胞(PHKC)上生產(chǎn)滅活的疫苗，并獲得成功。1968年該疫苗在加拿大批準(zhǔn)用于人體加強(qiáng)和暴露前接種。
我國的PHKCV由衛(wèi)生部武漢生物制品研究所林放濤領(lǐng)導(dǎo)的小組研制而成。開始實(shí)驗(yàn)所用毒種為北京株兔腦固定毒，經(jīng)″混合細(xì)胞培養(yǎng)法″在PHKC上適應(yīng)，連續(xù)傳50～60代適應(yīng)成功；再經(jīng)豚鼠腦和PHKC交替3次傳代的毒株稱為aG株。aG株病毒在PHKC上培養(yǎng)收獲，福爾馬林滅活，加Al(OH)3佐劑。疫苗規(guī)定效價為1.3～2.5IU，經(jīng)超濾濃縮后，濃縮疫苗效價須≥2.5IU。經(jīng)臨床試驗(yàn)證明，各種劑型的PHKCV在人體中的抗體反應(yīng)均優(yōu)于羊腦Semple疫苗。
該疫苗于1980年在我國獲得國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的生產(chǎn)文號，取代Semple疫苗。在過去的十多年里，我國生產(chǎn)的PHKCV是世界上累計(jì)生產(chǎn)量最大的狂犬病疫苗，高峰年份每年此類疫苗的產(chǎn)銷量超過500萬人份。目前，我國各生產(chǎn)單位正逐步采用改進(jìn)的濃縮-精制PHKCV。
雞胚細(xì)胞疫苗Kando 1965年將Flay HEP株適應(yīng)到雞胚細(xì)胞，培養(yǎng)病毒經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活、濃縮、凍干(后采用區(qū)帶離心純化加以改進(jìn))制備成疫苗并在日本商品化生產(chǎn)。1983年Barth等從上述日本疫苗分化出一種用Flary LEP株適應(yīng)到雞胚細(xì)胞上的純化雞胚細(xì)胞疫苗(PCECV)。培養(yǎng)病毒采用β-丙內(nèi)酯滅活、并經(jīng)蔗糖梯度區(qū)帶離心純化和濃縮。該疫苗目前由德國Chiro Behring GmbH公司生產(chǎn)。人體暴露前后的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗的免疫效果和HDCV相當(dāng)，并且不會誘生針對雞細(xì)胞蛋白的抗體，使用該疫苗僅產(chǎn)生輕微的局部反應(yīng)。PCECV現(xiàn)已在歐、亞、非、南美20多個國家獲準(zhǔn)使用。1997年10月FDA批準(zhǔn)該疫苗進(jìn)入美國市場。
上述原代細(xì)胞培養(yǎng)疫苗具有的一個優(yōu)點(diǎn)是不必冷凍保存細(xì)胞種。但每批疫苗檢查培養(yǎng)器官源的雜質(zhì)(細(xì)菌、支原體、病毒)，并且動物器官的可用量是限制工業(yè)化生產(chǎn)的因素。
傳代細(xì)胞系疫苗Vero細(xì)胞疫苗1984年由法國Merieun研究所研制成功。制備過程中采用了使細(xì)胞貼附在微載體上懸浮培養(yǎng)的微載體技術(shù)以便進(jìn)行工業(yè)化大罐培養(yǎng)。該疫苗使用的病毒株與HDCV相同，為PM1503-3M。收獲的病毒經(jīng)超濾濃縮、密度梯度離心、β-丙內(nèi)酯滅活制成凍干疫苗。早期研究證實(shí)，在100個接種的實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)沒有腫瘤和轉(zhuǎn)移，每劑疫苗的殘余細(xì)胞DNA量小于50pg，疫苗的穩(wěn)定性極好，和HDCV相似。80年代和最近的大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)無論用作暴露前人體免疫或暴露后處理，Vero疫苗均獲得很好的免疫效果。
由于該疫苗進(jìn)口價相對較高，因此，我國從1995年開始進(jìn)行色譜純化的人用Vero細(xì)胞疫苗的研制。制備過程中使用的病毒株是適應(yīng)到Vero細(xì)胞的狂犬病毒(CTN-1V)。目前已有包括衛(wèi)生部上海生物制品研究所在內(nèi)的多家生物制品研究所研制成功，并得到生產(chǎn)文號，以逐步取代我國現(xiàn)行的PHKCV。
Vero細(xì)胞較HDC能生產(chǎn)較高的狂犬病毒滴度，并可利用微載體技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化大罐培養(yǎng)，因而其價格較HDCV便宜。目前使用Vero細(xì)胞已累積生產(chǎn)1億劑脊髓灰質(zhì)炎疫苗，2000萬劑狂犬病疫苗和100萬劑口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，證實(shí)該細(xì)胞疫苗的安全性。但是用Vero細(xì)胞制備疫苗須在低細(xì)胞代數(shù)使用以確保無致瘤性，且殘余細(xì)胞DNA量須小于100pg/劑。
在發(fā)展中國家常常發(fā)生停電或難以保證液氮供應(yīng)，保存細(xì)胞種源比較困難。因而限制了這種疫苗的使用，發(fā)展新型的人用狂犬病疫苗以降低成本，特別是找到難以解決的純化工藝，是一項(xiàng)重要課題，本發(fā)明經(jīng)過研究，找到了一種在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗，這些人用二倍體細(xì)胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，所得到的疫苗，價格低廉，使用方便，純度高，適合大規(guī)模生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人用二倍體細(xì)胞狂犬病純化疫苗，該疫苗是在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的狂犬病純化疫苗的制備方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明采用的人用二倍體細(xì)胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5，優(yōu)選的是WI-38。經(jīng)過全面的研究鑒定，WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5細(xì)胞具有胞核學(xué)穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性對病毒敏感的優(yōu)點(diǎn)，符合中國藥典2005版關(guān)于生物制品的傳代細(xì)胞的規(guī)程要求。
本發(fā)明提供一種人用二倍體細(xì)胞狂犬病純化疫苗，該疫苗是在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒種，經(jīng)分離純化得到的狂犬疫苗。所述疫苗病毒毒種選自狂犬毒種SNK-CTN株或SNK-aG株，優(yōu)選的是SNK-CTN株。本發(fā)明的疫苗是凍干注射劑或水針劑。
本發(fā)明的純化疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)、人用二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇；(2)、人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增；(3)、在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種；(4)、收獲病毒液；(5)、病毒液的滅活；(6)、澄清超濾；(7)、純化；(8)、稀釋分裝。
所述純化可以包括以下步驟病毒液先經(jīng)過超濾純化除去部分雜蛋白，再經(jīng)過DEAE-SepharoseFF陰離子交換或區(qū)帶超速離心，然后經(jīng)過Sepharose4FF柱或其他凝膠柱層析。所述人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在細(xì)胞營養(yǎng)液中進(jìn)行的，細(xì)胞營養(yǎng)液由199培養(yǎng)液加入2-10％牛血清配制而成。細(xì)胞營養(yǎng)液在必要時還可加入適量的卡那霉素和慶大霉素。所述人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)培養(yǎng)。本發(fā)明的制備方法，還包括佐劑吸附步驟或/和加保護(hù)劑人血白蛋白的步驟。其中加入人血白蛋白的量優(yōu)選的是使其濃度為0.2-0.5％。
本發(fā)明的狂犬病純化疫苗的制備工藝中，細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是199培養(yǎng)基，采用超濾純化初步純化，蔗糖密度梯度離心法和Sepharose4FF凝膠過濾層析進(jìn)行更純提純。測試結(jié)果表明，經(jīng)過本發(fā)明的三步提純后，可使疫苗總蛋白含量減少約99％以上，牛血清殘余量均符合中國藥典2005版關(guān)于生物制品規(guī)程的要求，加入氫氧化鋁佐劑后使疫苗的效價提高20％，穩(wěn)定性同時大大提高，接種時減緩病毒釋放的速度，保持良好的抗體水平。通過純化疫苗加入佐劑能增加疫苗的持久性，疫苗能夠持久刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。
純化工藝包括以下步驟(1)、滅活病毒后制成粗疫苗；(2)、澄清過濾；(3)、超濾純化；(4)、蔗糖密度梯度離心；(或采用DEAE-SepharoseFF)陰離子交換)(5)、Sepharose4FF柱層析純化；(6)、佐劑吸附加保護(hù)劑人血白蛋白(或不加佐劑吸附)；(7)、稀釋分裝。
本工藝使用的人用二倍體細(xì)胞種來源于中國疾病預(yù)防控制中心，首先建立人用二倍體胞種子庫和人用二倍體細(xì)胞工作庫，并對細(xì)胞庫細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的檢定。在制備疫苗之前，需先進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和擴(kuò)增，以達(dá)到生產(chǎn)批量的需要?？墒褂脛游锛?xì)胞培養(yǎng)液加入牛血清配制而成的細(xì)胞營養(yǎng)液，所說的培養(yǎng)液可以選擇199培養(yǎng)液、平恒鹽培養(yǎng)液等，其中以使用199培養(yǎng)液效果較為理想，細(xì)胞營養(yǎng)液中最好含有2-10％的牛血清，PH7.0-7.6，在37±0.5℃進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。
各種用于制備疫苗的哺乳動物細(xì)胞均為附著依賴性細(xì)胞，細(xì)胞在一定的載體上生長，本工藝中細(xì)胞的培養(yǎng)方式為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。
為防止細(xì)菌污染，在配制細(xì)胞營養(yǎng)液的同時可加入適量的卡那霉素和慶大霉素。
培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分種率根據(jù)生產(chǎn)批量的需要確定，一般可以是1∶2～1∶4當(dāng)細(xì)胞長成致密單層后，即可接種狂犬病毒，細(xì)胞維持液中最好加入0.4～0.5％(W/W)的人血白蛋白，同時調(diào)整PH7.2～7.8，培養(yǎng)溫度32～37℃，并可加入適量的氨基酸和抗生素，可供使用的培養(yǎng)液包括199液、平恒鹽液等，接種過程包括先用培養(yǎng)液如Earle氏液等沖洗細(xì)胞表面，去除殘留的牛血清，然后在已經(jīng)生長成致密單層的人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種MOL0.1～0.01及上述細(xì)胞維持液，培養(yǎng)72小時左右，即可收獲病毒。
本工藝在人用二倍體細(xì)胞上接種的狂犬病毒為在傳代的人用二倍體狂犬病毒種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，狂犬病毒在人用二倍體細(xì)胞上能夠很好地生長繁殖，在人用二倍體細(xì)胞傳代狂犬病毒10代以內(nèi)很穩(wěn)定，并且制備人用二倍體細(xì)胞狂犬疫苗方面，10代以內(nèi)的細(xì)胞傳代毒種的免疫原性沒有明顯改變，而10代以后的毒種的免疫原性則有明顯的下降，也就是說，制備疫苗最好選用10代以內(nèi)的傳代毒種，10代以后的毒種不宜用于制備純化疫苗。至于毒種則優(yōu)選狂犬毒種SNK-CTN株在人用二倍體細(xì)胞的傳代毒種。
狂犬病毒在人用二倍體細(xì)胞上的生長繁殖可維持較長時間，因此病毒的收獲可采取多次收取的方式，最好是第3～4天收獲一次，對收獲的病毒液及時測定病毒滴度，要求每批所收獲病毒液病毒滴度均應(yīng)在105.0LD50/ml以上，因?yàn)橹挥懈叩味鹊牟《疽翰拍鼙ＷC疫苗的高效力。
收獲的病毒液用β-丙內(nèi)酯滅活病毒得到的是粗疫苗。
滅活后的粗疫苗需要進(jìn)行濃縮提純制備成純疫苗制品，本工藝選用超濾濃縮的方法對得到的粗疫苗進(jìn)行濃縮，一般是用截留10萬～30萬分子量的超濾器濃縮疫苗，濃縮至20倍以上，然后純化疫苗。
以人用二倍體細(xì)胞制備生物制品安全性的關(guān)鍵是殘余牛血清殘留量的含量。按中國藥典2005版有關(guān)生物制品的規(guī)程要求，疫苗的牛血清殘留量必須小于50ng/ml。有關(guān)疫苗的純化方法包括化學(xué)方法和物理方法等可以有多種，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)和研究，本工藝提出純化方法超濾純化、超離純化和Sepharose 4FF柱層析純化。另外采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可以直接排除血清對制品的影響。
超濾純化疫苗即把疫苗超濾濃縮到一定倍數(shù)，然后加入適量的PBS沖洗，再濃縮到原倍數(shù)，再加入適量的PBS沖洗如此反復(fù)5～6次，牛血清殘留量可以去除93％以上，再經(jīng)過蔗糖密度梯度離心法參考石慧穎1998年發(fā)表的大規(guī)模區(qū)帶離心純化的方法純化人用二倍體細(xì)胞乙腦疫苗的方法，用36％和45％(W/W)的蔗糖密度梯度，23000rpm超速離心4小時，經(jīng)過對紫外吸收峰的抗原含量，蛋白濃度的分析，確定了病毒所在的位置。然后再經(jīng)過Sepharose 4FF純化，而凝膠過濾層析是層析技術(shù)中最簡單，條件最溫和，對保持生物大分子的活性最有利的方法，適合分離分子量懸殊的物質(zhì)，狂犬病毒的分子量在400萬以上，與疫苗中的雜蛋白分子量相差較大，故使用凝膠柱層析可以非常方便有效地去除濃縮疫苗中殘留的小分子雜質(zhì)，該凝膠過濾柱可以是Sepharose 4FF柱或其他凝膠，而檢測結(jié)果表明，經(jīng)三步層析柱純化后，疫苗總蛋白含量減少約99％以上，牛血清的殘余量均符合中華人民共和國藥典的有關(guān)規(guī)程要求，而且比規(guī)程所要求的含量更低。純化疫苗制成成品(即水針劑型)，加入保護(hù)劑人血白蛋白和氫氧化鋁佐劑。用人用二倍體細(xì)胞作為疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，并且以人用二倍體細(xì)胞的傳代毒種代替現(xiàn)有的地鼠腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞毒種，通過相應(yīng)的工藝方法生產(chǎn)制備出高質(zhì)量的狂犬疫苗。用本工藝制備的狂犬病純化疫苗中不含外源因子，純度高，免疫效果大大提高，使用安全性高，并能實(shí)現(xiàn)狂犬疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
本工藝與目前使用的來自地鼠腎細(xì)胞或Vero細(xì)胞疫苗相比，最主要的優(yōu)點(diǎn)如下(1)人用二倍體細(xì)胞已被證明不含任何污染因子和致瘤性，作為生產(chǎn)疫苗的基質(zhì)，明顯優(yōu)于現(xiàn)行疫苗的地鼠腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞；(2)人用二倍體細(xì)胞狂犬疫苗的毒種是人用二倍體細(xì)胞培養(yǎng)的毒種，從根本上更新了地鼠腎提純疫苗和Vero細(xì)胞疫苗；(3)用人用二倍體細(xì)胞生產(chǎn)疫苗工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)批量的均質(zhì)疫苗，這是現(xiàn)行的地鼠腎細(xì)胞疫苗和Vero細(xì)胞疫苗辦不到的，(4)本工藝制備的疫苗經(jīng)提純后抗原活性明顯提高，雜蛋白減少99％以上，疫苗的純度大大提高。


圖1為本發(fā)明制備方法的方框流程圖。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1二倍體細(xì)胞來自中國疾病預(yù)防控制中心，細(xì)胞營養(yǎng)液為199培養(yǎng)基中含有2-10％牛血清和25IU/ml慶大霉素和25IU/ml卡那霉素，并調(diào)整PH到7.2，用3L轉(zhuǎn)瓶37℃培養(yǎng)成致密單層后按照12分種率擴(kuò)增，擴(kuò)增到生產(chǎn)批量時，經(jīng)過4天左右，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層，棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，用PH7.2的Earl’s液沖洗細(xì)胞面，接種二倍體細(xì)胞狂犬病毒，使用狂犬毒種SNK-CTN株在二倍體細(xì)胞上傳代的第二代工作毒種，毒種濃度MOI0.05，細(xì)胞維持液為含0.4-0.5％(W/W)人血白蛋白的199培養(yǎng)液，PH7.6，35℃下培養(yǎng)，24小時后換以新鮮細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)2天，開始收獲病毒，每3-4天收獲一次，共收3次，每批病毒液均取樣進(jìn)行病毒滴定和無菌試驗(yàn)，要求收獲病毒液的病毒液的病毒滴度達(dá)到105.0LD50/ml以上；合并病毒液加入β-丙內(nèi)酯(終濃度1/4000)置于4±1℃，24小時滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成60倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗過蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱Sepharose4FF，經(jīng)三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護(hù)劑和氫氧化鋁佐劑制成純化疫苗成品，分裝，制成狂犬病純化疫苗為水針劑型5ml規(guī)格。
檢定疫苗效力達(dá)到了中國狂犬疫苗參考品和美國狂犬疫苗參考品要求，其他各項(xiàng)檢定均合中華人民共和國藥典2005版生物制品規(guī)程的疫苗要求。
實(shí)施例2二倍體細(xì)胞來自中國疾病預(yù)防控制中心，細(xì)胞營養(yǎng)液為199培養(yǎng)基中含有2-10％牛血清和25IU/ml慶大霉素和25IU/ml卡那霉素，并調(diào)整PH到7.2，用3L轉(zhuǎn)瓶37℃培養(yǎng)成致密單層后按照1∶2分種率擴(kuò)增，擴(kuò)增到生產(chǎn)批量時，經(jīng)過4天左右，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層，棄去細(xì)胞營養(yǎng)液，用PH7.2的Earl’s液沖洗細(xì)胞面，接種二倍體細(xì)胞狂犬病毒，使用狂犬毒種SNK-CTN株在二倍體細(xì)胞上傳代的第二代工作毒種，毒種濃度MOI0.05，細(xì)胞維持液為含0.4-0.5％(W/W)人白蛋白的199培養(yǎng)液，PH7.6，35℃下培養(yǎng)，24小時后換以新鮮細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)2天，開始收獲病毒，每3-4天收獲一次，共收3次，每批病毒液均取樣進(jìn)行病毒滴定和無菌試驗(yàn)，要求收獲病毒液的病毒液的病毒滴度達(dá)到105.0LD50/ml以上；合并病毒液加入β-丙內(nèi)酯(終濃度1/4000)置于4±1℃，24小時滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成60倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗過蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱Sepharose4FF，經(jīng)三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護(hù)劑和氫氧化鋁佐劑制成純化疫苗成品，分裝，制成狂犬純化疫苗為水針劑型0.5ml規(guī)格。
檢定疫苗效力達(dá)到了中國狂犬疫苗參考品和美國狂犬疫苗參考品要求，其他各項(xiàng)檢定均合中華人民共和國藥典2005版生物制品規(guī)程的疫苗要求。
實(shí)施例3用權(quán)利要求1方法制備的狂犬滅活疫苗，給未接種過狂犬疫苗者接種狂犬病純化疫苗14天后，中和抗體陽轉(zhuǎn)率高于95.0％，且無副反應(yīng)發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種人用二倍體細(xì)胞狂犬病純化疫苗，其特征是，該疫苗是在人用二倍體細(xì)胞上接種SNK-CTN毒種，經(jīng)分離純化得到的狂犬疫苗。
2.權(quán)利要求1的純化疫苗，其特征在于，所述狂犬病毒毒種選自狂犬毒種CTN株或aG株，所述人用二倍體細(xì)胞是WI-38、CCC-HPF-1P5、MRC-5。
3.權(quán)利要求1的純化疫苗，其特征在于，是凍干注射劑或水針劑。
4.權(quán)利要求1的純化疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、人用二倍體細(xì)胞的復(fù)蘇；(2)、人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增；(3)、在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種；(4)、收獲病毒液；(5)、病毒液的滅活；(6)、純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述純化包括以下步驟(1)、滅活病毒后制成粗疫苗；(2)、澄清過濾；(3)、超濾純化；(4)、蔗糖密度梯度離心或采用DEAE-SepharoseFF陰離子交換；(5)、Sepharose4FF柱層析純化；(6)、佐劑吸附，加保護(hù)劑人血白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在細(xì)胞營養(yǎng)液中進(jìn)行的，細(xì)胞營養(yǎng)液由199培養(yǎng)液加入2-10％牛血清配制而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，細(xì)胞培養(yǎng)液中還加入適量的卡那霉素和慶大霉素。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述人用二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增是在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，還包括佐劑吸附步驟或/和加保護(hù)劑人血白蛋白的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，加入人血白蛋白使其濃度為0.2--0.5％。
全文摘要
本發(fā)明涉及二倍體細(xì)胞狂犬病純化疫苗，其劑型為凍干注射劑及水針劑，該疫苗是在人用二倍體細(xì)胞上接種狂犬病毒毒種得到的狂犬病純化疫苗。
文檔編號A61K39/205GK1712068SQ200510080058
公開日2005年12月28日 申請日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者崔棟 申請人:崔棟