專利名稱：一種增強免疫力的保健食品及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于保健食品領域，涉及一種增強免疫力的保健食品，本發(fā)明還涉及該保健食品的制備工藝。
背景技術：
蜂膠是蜜蜂從植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂，再混以蜜蜂舌腺、蠟腺等腺體的分泌物，經蜜蜂加工轉化而成的一種膠狀物質。蜜蜂將這些物質涂布在整個蜂巢的表面，一方面起防腐、抗氧化作用，另一方面來粘合蜂巢，堵塞縫隙等，使眾多病菌無法在蜂巢內滋生。蜂膠能起到全面調理，平衡機體免疫功能的作用，據(jù)《中華本草》記載蜂膠對糖尿病、高血脂、高血壓、腫瘤、息肉、多種炎癥、病菌引起的疾病等有很好的輔助治療作用。
靈芝[Ganoderma Lucidum(Leyss ex Fr)kast]又稱為瑞草、靈芝草，李時珍認為靈芝“主治耳聾，利關節(jié)，保神，益精氣，堅筋骨，好顏色，久服輕身不老，延年，療虛勞，治痔”。
近40年來，對靈芝進行了大量科研及臨床應用工作，已確認的靈芝成分有多糖，主要有免疫調節(jié)的功能，并且有解毒、保肝等作用。
靈芝對人體有扶正固本的效果，有多方面的藥理活性，從歷代名醫(yī)用藥和近代醫(yī)療臨床都可佐證，凡是與血液循環(huán)不暢、機體虛弱、抗病力下降有關的疾病，靈芝對其皆有一定的治療效果。本配方選用靈芝提取物為原料，其富含多糖等功效成分，具有增強免疫力的功能。
蟲草菌絲體補肺益腎，填精益氣、鎮(zhèn)咳平喘、止血、化痰。對體弱多病、年老體弱、過度疲勞有強力補益作用，能提高人體的免疫作用。
蜂膠加靈芝提取物及蟲草菌絲體，具有增強免疫力的功效，而且，由于蜂膠的抵菌作用，對產品的保質也起到一定的作用。
目前尚沒有采用此三種原料組方制備的提高機體免疫力的保健食品。
參考文獻
1、林志彬，靈芝的現(xiàn)代研究，北京醫(yī)科大學出版社，2001年3月。
2、國家中醫(yī)藥管理局，《中華本草》，上海科學技術出版社。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種增強免疫力的保健食品。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述保健食品的制備工藝。
本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的一種增強免疫力的保健食品，其配方含有下列重量份的原料蜂膠50-60份，靈芝提取物30-40份，蟲草菌絲體5-15份。
所述的保健食品，其中靈芝提取物是通過下列方法制備得到的靈芝經切片后加入8-12倍量水，提取2-3次，每次4-6小時，合并提取液，濃縮后噴霧干燥；靈芝提取物的質量要求為多糖≥8.0％，水分≤8.0％，灰分≤10.0％。靈芝提取物的外觀為深棕色粉末，干燥，無雜質，具有靈芝固有香味。
本發(fā)明所述的具有增強免疫力作用的保健食品可以添加藥學上允許的任意一種輔料，其制劑可以是藥學上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、糖漿劑、丸劑等，本發(fā)明保健食品中還可以添加其他不減弱本發(fā)明保健食品功效的物質制成復合功能的保健食品。
所述的保健食品的制備工藝，包含下列步驟按配方取蟲草菌絲體粉碎，過80目篩，與靈芝提取物混合均勻，110-130℃干熱滅菌1-2小時，再加入經粉碎過80目篩的蜂膠，混合均勻，常規(guī)工藝制成所需制劑。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明動物實驗一、材料和方法1、樣品蟲草蜂靈膠囊，0.25g/粒，人體推薦攝入量為內容物凈重1000mg/人/日，由南京中科生化技術有限公司提供，批號20040518。
2、實驗動物I組18.9-23.7g ICR健康雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，進行二硝基氟苯誘導小鼠DTH試驗；II組18.5-23.4g健康雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗；
III組18.3-23.5g健康雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，進行小鼠碳廓清試驗；IV組20.0-23.9g健康雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，進行小鼠抗體生成細胞及半數(shù)溶血值(HC50)試驗；V組20.3-23.9g BALB/C健康雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，進行小鼠ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化、NK細胞活性試驗。
3、劑量根據(jù)每人(按60kg體重計)每日推薦攝入量為1000mg，相當于16.7mg/d/kg·bw，分別按人體推薦攝入量5倍、10倍、30倍設計低(84mg/kg·bw)、中(167mg/kg·bw)、高(500mg/kg·bw)三個劑量組，另設對照組(0mg/kg·bw)以無菌水代替受試物。經口每日一次給予小鼠相應劑量的受試物，連續(xù)灌胃30天后測各項增強免疫力功能指標。小鼠灌胃量為10ml/kg·bw。
4、主要試劑二硝基氟苯(DNFB)、綿羊紅細胞(SRBC)、豚鼠血清、印度墨汁、RPMI1640、ConA、MTT、異丙醇、SA緩沖液、都氏試劑、YAC-1細胞、LDH基質液。
5、主要儀器打孔器、T1000型電子動物秤、JA2003型電子天平、722型分光光度計、超凈工作臺、酶標儀、二氧化碳培養(yǎng)箱。
6、試驗方法按《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范-2003版》之增強免疫力功能檢驗方法進行。
6.1ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗(MTT法)各組動物連續(xù)灌胃30天，頸椎脫臼處死動物，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾臟，制成單個細胞懸液，經200目篩網過濾，用Hank’s液洗3次，每次離心10min(1000r/min)，然后將細胞懸浮于1ml RPMI1640完全培養(yǎng)液中，臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95％以上)，調整細胞濃度為3×106個/ml。將細胞懸液分兩孔加入24培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液，另一孔作對照，置5％CO237℃孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。將溶解液移入96孔培養(yǎng)板中，波長570nm，酶標儀測定光密度計值。
6.2二硝基氟苯(DNFB)誘導小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(DTH)(耳腫脹法)
各劑量組連續(xù)灌胃30天，每鼠用剪刀將腹部毛剪去，范圍約3cm×3cm，用1％DNFB溶液50μl均勻涂抹致敏。5日后用1％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊，同時用不含DNFB的溶液10μl均勻涂抹于小鼠左耳(兩面)作對照。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm耳片，稱重。同時取小鼠脾臟、胸腺并稱重，計算臟/體比值。
6.3血清溶血素測定各劑量組連續(xù)灌胃30天，制備2％(v/v)的綿羊紅細胞(SRBC)懸液，每只鼠腹腔注射0.2ml進行免疫，4天后摘除眼球取血于離心管內，放置1h，2000r/min離心10min，分離并收集血清。血清200倍稀釋后，按檢驗方法測定樣品管及SRBC半數(shù)溶血時的光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示。
6.4抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)各組動物連續(xù)灌胃30天，每只鼠腹腔注射2％(v/v)的綿羊紅細胞(SRBC)懸液0.2ml進行免疫，4天后小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾臟，制成細胞懸液，經200目篩網過濾，離心(1000r/min)10min，用Hank’s液洗2次，最后將細胞懸浮于5ml RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)細胞數(shù)，調整細胞濃度為5×106個/ml。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量pH7.2-7.4、2倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內加50μl 10％(v/v，用SA液配制)SRBC，20μl脾細胞懸液(5×106個/ml)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后將制備好的補體1∶10稀釋后加入到玻片架凹槽內，繼續(xù)孵育1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。
6.5小鼠碳廓清試驗各劑量組連續(xù)灌胃30天，每鼠尾靜脈注入3倍稀釋的印度墨汁(0.1ml/10g·bw)，待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2min及10min分別從眼內眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，用722分光光度計在600nm波長處測光密度值。
6.6小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗(半體內法)各組動物連續(xù)灌胃30天，制備20％(v/v)的雞紅細胞懸液，每只鼠腹腔注射1ml，間隔30min，頸椎脫臼處死小鼠，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經腹腔注入生理鹽水2ml，轉動鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內，移置37℃溫箱孵育30min，然后于生理鹽水中漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干，光鏡下觀察。
6.7NK細胞活性測定(乳酸脫氫酶測定法)各組動物連續(xù)灌胃30天，頸椎脫臼處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾臟，制成單細胞懸液，經200目篩網過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心(1000r/min)10min，棄上清交將細胞漿彈起，加入0.5ml滅菌水洗20秒，裂解紅細胞后再加入0.5ml 2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，離心(1000r/min)10min，用1ml含10％小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1％冰乙酸稀釋后計數(shù)，臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95％以上)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×107個/ml。
試驗前24h將靶細胞(YAC-1細胞)傳代培養(yǎng)，應用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為4×105個/ml。取YAC-1細胞和脾細胞各100μl(效靶比50∶1)加入U型96孔培養(yǎng)板中，YAC-1細胞自然釋放孔加YAC-1細胞和培養(yǎng)液各100μl，YAC-1細胞最大釋放孔加YAC-1細胞和1％NP40各100μl，上述各項均設三個平行孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質液100μl，反應5min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶標儀490nm處測定光密度值。
7、飼養(yǎng)條件小鼠在溫度為18-22℃、相對濕度為40-70％的屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。
8、數(shù)據(jù)分析用SPSS10.0軟件對各實驗原始數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求的數(shù)據(jù)資料用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理；對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)資料進行適當?shù)淖兞哭D換，待滿足正態(tài)方差齊要求后，用轉換所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。
二、結果1、蟲草蜂靈膠囊對小鼠體重的影響由表1可見，小鼠的初始體重在低、中、高三個劑量組與對照組相比較，差異均無顯著性。小鼠的初始體重在各組間較為均衡。經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，各劑量組體重進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性的要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表2結果可見低、中、高三個劑量組與對照組相比較，差異均無顯著性。即蟲草蜂靈膠囊對小鼠體重增長無影響。
表1各組小鼠的初始體重(n＝10，x±SD)

注各組P值均為1.000。
表2蟲草蜂靈膠囊對小鼠體重的影響(n＝10，x±SD)

注各組P＞0.05。
2、蟲草蜂靈膠囊對胸腺、脾臟器官的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定的胸/體比、脾/體比值進行正態(tài)分布、方差齊性檢驗，滿足正態(tài)分布、方差齊性的要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表3結果可見低、中、高三個劑量組與對照組相比較，差異均無顯著性。
表3蟲草蜂靈膠囊對胸腺、脾臟器官的影響(n＝10，x±SD)

3、蟲草蜂靈膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定值進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表4結果可見低、中、高三個劑量組小鼠加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值顯著高于對照組。
表4蟲草蜂靈膠囊對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(n＝10，x±SD)

4、蟲草蜂靈膠囊對DNFB誘導小鼠DTH的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定值進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表5結果可見高劑量組小鼠耳殼增重顯著高于對照組。
表5蟲草蜂靈膠囊對DNFB誘導小鼠DTH的影響(n＝10，x±SD)

5、蟲草蜂靈膠囊對小鼠血清溶血素形成的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定值進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表6結果可見高劑量組小鼠血清溶血素含量顯著高于對照組。
表6蟲草蜂靈膠囊對小鼠血清溶血素形成的影響(n＝10，x±SD)

6、蟲草蜂靈膠囊對抗體生成細胞(溶血空斑數(shù))的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定值進行正態(tài)分布、方差齊性檢驗，滿足正態(tài)分布要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表7結果可見中、高二個劑量組小鼠溶血空斑數(shù)顯著高于對照組。
表7蟲草蜂靈膠囊對小鼠抗體生成細胞(溶血空斑數(shù))的影響(n＝10，x±SD)


7、蟲草蜂靈膠囊對小鼠碳廓清作用的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定值進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表8結果可見低、中、高三個劑量組與對照組相比較，差異均無顯著性。
表8蟲草蜂靈膠囊對小鼠碳廓清作用的影響(n＝10，x±SD)

8、蟲草蜂靈膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率及吞噬指數(shù)的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定吞噬率、吞噬指數(shù)進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表9結果可見低、中、高三個劑量組與對照組相比較，差異均無顯著性。
表9蟲草蜂靈膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率及吞噬指數(shù)的影響(n＝10，x±SD)

9、蟲草蜂靈膠囊對小鼠NK細胞活性的影響經口給予小鼠不同劑量的蟲草蜂靈膠囊30天，所測定值進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法和多個實驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行了統(tǒng)計處理。由表10結果可見高劑量組小鼠NK細胞活性顯著高于對照組。
表10蟲草蜂靈膠囊對小鼠NK細胞活性的影響(n＝10，x±SD)


具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
實施例中采用的原料來源及質量標準說明靈芝提取物是通過下列方法制備得到的靈芝經切片后加入8-12倍量水，提取2-3次，每次4-6小時，合并提取液，濃縮后噴霧干燥；靈芝提取物的質量要求為多糖≥8.0％，水分≤8.0％，灰分≤10.0％。外觀為深棕色粉末，干燥，無雜質，具有靈芝固有香味。
實施例1取蜂膠55g，靈芝提取物35g，蟲草菌絲體10g，蟲草菌絲體粉碎，過80目篩，與靈芝提取物混合均勻，110-130℃干熱滅菌1-2小時，再加入經粉碎過80目篩的蜂膠，加入膠囊劑常用輔料，混合均勻，按膠囊劑常規(guī)工藝制成1000粒膠囊。
實施例2蜂膠50g，靈芝提取物40g，蟲草菌絲體10g，蟲草菌絲體粉碎，過80目篩，與靈芝提取物混合均勻，110-130℃干熱滅菌1-2小時，再加入經粉碎過80目篩的蜂膠，加入片劑常用輔料，混合均勻，按片劑常規(guī)工藝制成1000片。
實施例3蜂膠60g，靈芝提取物30g，蟲草菌絲體10g，蟲草菌絲體粉碎，過80目篩，與靈芝提取物混合均勻，110-130℃干熱滅菌1-2小時，再加入經粉碎過80目篩的蜂膠，加入顆粒劑常用輔料，混合均勻，按顆粒劑常規(guī)工藝制成1000包顆粒。
實施例4蜂膠55g，靈芝提取物30g，蟲草菌絲體15g，蟲草菌絲體粉碎，過80目篩，與靈芝提取物混合均勻，110-130℃干熱滅菌1-2小時，再加入經粉碎過80目篩的蜂膠，加入膠囊劑常用輔料，混合均勻，按膠囊劑常規(guī)工藝制成1000粒膠囊。
權利要求
1.一種增強免疫力的保健食品，其特征在于配方含有下列重量份的原料蜂膠50-60份，靈芝提取物30-40份，蟲草菌絲體5-15份。
2.根據(jù)權利要求1所述的保健食品，其特征在于靈芝提取物是通過下列方法制備得到的靈芝經切片后加入8-12倍量水，提取2-3次，每次4-6小時，合并提取液，濃縮后噴霧干燥；靈芝提取物的質量要求為多糖≥8.0％，水分≤8.0％，灰分≤10.0％。
3.根據(jù)權利要求1所述的保健食品，其特征在于其制劑是藥學上允許的任意一種劑型
4.根據(jù)權利要求3所述的保健食品，其特征在于其劑型為片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、糖漿劑或丸劑。
5.如權利要求1所述的保健食品的制備工藝，其特征在于包含下列步驟按配方取蟲草菌絲體粉碎，過80目篩，與靈芝提取物混合均勻，110-130℃干熱滅菌1-2小時，再加入經粉碎過80目篩的蜂膠，混合均勻，常規(guī)工藝制成所需制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強免疫力的保健食品及其制備工藝。該保健食品由蜂膠、靈芝提取物、蟲草菌絲體制備而成。該保健食品具有較好的增強免疫力的功能，且安全性好，其制備工藝簡單易行。
文檔編號A61P37/00GK1785055SQ200510095630
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月25日 優(yōu)先權日2005年11月25日
發(fā)明者陳曉紅, 陳亮, 華克偉 申請人:南京中科集團有限公司