專利名稱：一種生物修復材料及其制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物修復材料及其制備方法與應用。
背景技術(shù)：
脊髓是連接外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的橋梁，它將身體的感覺(如痛覺、溫度覺、觸覺)刺激傳導至中樞(大腦)，也將大腦的指令傳導到運動肌群而產(chǎn)生隨意的運動。另外，還負責一些神經(jīng)反射。由于各種因素(外傷、炎癥、腫瘤等)引起了的脊髓橫貫性損害被稱為脊髓損傷(SCI)，這種疾病造成了損害平面以下的脊髓神經(jīng)功能(運動、感覺、括約肌及植物神經(jīng)功能)的障礙。
如何促進SCI后的神經(jīng)再生和功能恢復，一直是醫(yī)學界一大難題。很長一段時間，人們認為受損的中樞神經(jīng)是無法再生的。直到1981年，神經(jīng)科學家才在基礎(chǔ)研究中證實中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復是可能的，然而有效的治療手段依舊缺乏。常規(guī)的手術(shù)手段已被證實功效甚微，只能使這些傷者中的極少數(shù)人徹底康復。目前公認的最有效的藥物只有甲基強的松龍(methylprednisone)，它是一種消炎藥物，已被大量的臨床實驗證實可以使脊髓受損狀況減輕，但是它必須在脊髓損傷后立即使用，對于24小時以后的脊髓病人則效果不佳。這種治療手段匱乏的狀況，在很長時間都沒有得到改變。
隨著組織工程學科的興起，許多方法被嘗試用來治療脊髓損傷，如移植方法修復，包括周圍神經(jīng)、胚胎中樞神經(jīng)、多種細胞都被證實能夠改善脊髓損傷部位的微環(huán)境，促進損傷脊髓的再生和修復。一些營養(yǎng)因子與藥物，如cAMP與NGF等也被證實能促進軸突的長出與延伸。但眾所周知，脊髓損傷后很短的時間，在受損部位形成了空洞和疤痕，在這樣一個不利的環(huán)境下，軸突即使能夠生長，但也很難逾越這樣的一個障礙。于是人們嘗試使用支架材料，在促進軸突延伸的同時，給軸突生長提供支持，如膠原凝膠及一種由poly[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide](PHPMA)為原料的NeuroGel[2，3]，它們都能夠給神經(jīng)元的生長提供良好的支持，但存在著一個共同問題沒有解決，即如何定向這些延伸的軸突。因為在人體內(nèi)，脊髓神經(jīng)纖維(軸突)的生長是有方向的，正是這種定向，才使得準確有效的傳送神經(jīng)脈沖。所以在利用各種藥物和移植物時，需要專門的指引措施定向神經(jīng)元生長，否則軸突會無方向性生長，而不能起到準確傳送信號的作用。
在這樣的需求下，神經(jīng)導向生物材料應運而生。一般而言，理想的神經(jīng)導向材料需具備以下幾個特點(1)有序的結(jié)構(gòu)以定向神經(jīng)元的生長，并提供足夠的細胞生長空間；(2)良好的生物相容性，即能支持細胞正常生長，并且沒有免疫原性；(3)管狀的結(jié)構(gòu)已形成一個相對封閉的空間，保護神經(jīng)元的生長不受其它細胞的干擾；(4)具有生物可降解性。
目前，神經(jīng)導向材料主要由化學合成的材料制成，如poly(lactic-co-glycolicacid)](PLGA)及poly(2-hydroxyethylmethacrylate)(PHEMA)等，但它們存在著細胞相容性不好及易引起免疫排斥的問題?，F(xiàn)今用于脊髓損傷修復的膠原支架，主要從酸溶的膠原制備，工藝復雜，步驟較多，而且主要以無序的管狀和膠原凝膠為主。
筋膜(aponeurosis)是存在于肌肉表面的保護組織，屬于肌腱的延伸部分，它的主要成分與肌腱一樣，由I型與III型膠原纖維構(gòu)成，其宏觀圖如圖1A、圖1B(圖1A為筋膜與肌肉相連的內(nèi)層圖，圖1B為筋膜與肌肉相連的外層圖)。但是，天然的筋膜結(jié)構(gòu)緊密，并不適合于細胞的貼附和生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)構(gòu)有序的生物修復材料及其制備方法。
本發(fā)明所提供的生物修復材料，是按如下步驟處理得到的1)將筋膜用體積百分濃度為1-1.5％的磷酸三丁酯溶液處理24-72小時；2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl/的25-100mmol/L、pH為7.6-8.5的Tris-HCl緩沖液處理24-72小時；3)接著，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理48-96小時，所述緩沖液為25-100mmol/L Tris-HCl，pH為7-8；得到所述生物修復材料；上述處理的溫度均為2-8℃。
為了能夠進一步改善材料的細胞相容性，得到的生物修復材料還經(jīng)過濃度為0.5-1.5mol/L強堿溶液處理5-10分鐘。常用強堿有NaOH、KOH等。
步驟1)所述磷酸三丁酯溶液的溶劑通?？蛇x用為PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
本發(fā)明生物修復材料的優(yōu)選制備方案，包括如下步驟1)將筋膜用體積百分濃度為1％的磷酸三丁酯溶液處理48小時，溶劑為50mmol/LTris-HCl，pH為8；2)然后，用含有1mol/L NaCl的50mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液處理48小時；3)接著，用1g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理72小時，所述緩沖液為50mmol/LTris-HCl，pH為8；4)以1mol/L NaOH處理5分鐘，得到所述生物修復材料；上述處理的溫度均為4℃。
為了保證材料的質(zhì)量，筋膜在處理前還要去除內(nèi)層粘附的肌肉組織和外層粘附的脂肪。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明生物修復材料的應用。
本發(fā)明發(fā)明人通過實驗證實，在體外生長時，神經(jīng)元可以很好的在本發(fā)明生物修復材料上生長，軸突沿著纖維有序生長，并能開始相互連接，可以作為體外修復神經(jīng)元的材料。
本發(fā)明創(chuàng)造性的以天然筋膜為基礎(chǔ)，經(jīng)過一系列獨特的處理方法得到一種新型具有有序表面結(jié)構(gòu)的生物修復材料，該材料對細胞具有良好的親和力，低免疫原；而且它可以定向神經(jīng)元沿著纖維的方向有序生長，這對于體內(nèi)脊髓損傷的恢復是十分重要的；此外，該材料可以根據(jù)不同需要很容易做出片狀、有序管狀支架或纖維。其中，由有序纖維構(gòu)成的管狀支架具有很好的應用前景，將膠原纖維填充入管中以后，不僅可以有效的增加神經(jīng)元生長面積，定向神經(jīng)元的延伸，而且形成了神經(jīng)元生長相對封閉的空間，防止非神經(jīng)類細胞的入侵。


圖1為筋膜的宏觀圖；圖2為本發(fā)明生物修復材料的照片；圖3為皮層神經(jīng)元在天然筋膜和本發(fā)明生物修復材料上的生長照片。
具體實施例方式
實施例1、生物修復材料的制備一、取材與處理1、預處理筋膜取新鮮帶有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去離子水沖洗3遍；用鑷子和手術(shù)刀分離出筋膜，盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織，和外層的脂肪等組織。
2、材料制備將預處理筋膜按如下步驟處理1)1％TnBP(磷酸三丁酯)溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，體積百分比)中48小時；2)50mM Tris-Cl buffer(pH＝8.0，含有1M NaCl)中處理48小時；3)1g胰蛋白酶/100ml(50mM Tris-HCl緩沖液，pH＝8.0)中處理72小時；4)1M NaOH中處理5分鐘，充分清洗直至中性；凍干，即得到本發(fā)明的生物修復材料，命名為apo-collagen。
二、材料的形態(tài)所得apo-collagen為白色片狀形態(tài)，還可以將其制備為有序的管狀或者膠原纖維。apo-collagen的形態(tài)圖如圖2所示，圖2a、圖2b和圖2c分別表示片狀的、管狀的及纖維狀的apo-collagen，標尺長＝1cm；圖2d為apo-collagen的掃描電鏡照片。由圖2表明，apo-collagen保持了天然膠原纖維的結(jié)構(gòu)，其電鏡照片顯示了它具有有序的表面結(jié)構(gòu)，其粗糙的表面結(jié)構(gòu)也利于細胞的貼附。
實施例2、生物修復材料的制備按照實施例1的方法預處理筋膜，將預處理筋膜按如下步驟處理1)1.5％TnBP溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，體積百分比)中24小時；2)80mM Tris-Cl buffer(pH＝7.8，含有0.8M NaCl)中處理72小時；3)0.5g胰蛋白酶/100ml(80mM Tris-HCl緩沖液，pH＝7.8)中處理96小時；凍干后，即得到本發(fā)明的生物修復材料。
材料的特性與實施例1所得材料相同。
實施例3、按照實施例1的方法預處理筋膜，將預處理筋膜按如下步驟處理1)1％TnBP溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，體積百分比)中48小時；2)100mM Tris-Cl buffer(pH＝8.0，含有1.3M NaCl)中處理24小時；3)1.4g胰蛋白酶/100ml(30mM Tris-HCl緩沖液，pH＝7.0)中處理48小時；4)0.5M KOH中處理5分鐘，充分清洗直至中性；凍干，即得到本發(fā)明的生物修復材料。
材料的特性與實施例1所得材料相同。
實施例4、神經(jīng)元在apo-collagne上的生長分離大鼠的皮層神經(jīng)元，然后分別接種在膠原膜和實施例1所得材料上(apo-collagen)上，37℃及5％CO2條件下培養(yǎng)，5天后以二醋酸酯熒光素染色，觀測培養(yǎng)結(jié)果，如圖3所示圖3a為皮層神經(jīng)元在膠原膜上的生長；圖3b、圖3c和圖3d是皮層神經(jīng)元在apo-collagen上的生長。
如圖3a所示，神經(jīng)元在膠原膜上軸突生長較少，而且軸突延伸方向很隨機；而在apo-collagen上，神經(jīng)元生長良好，軸突沿著纖維有序生長(圖3b)，而且神經(jīng)元的軸突開始相互連接(圖3c、圖3d)。
權(quán)利要求
1.一種生物修復材料，是按如下步驟處理得到的1)將筋膜用體積百分濃度為1-1.5％的磷酸三丁酯溶液處理24-72小時；2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH為7.6-8.5的Tris-HCl緩沖液處理24-72小時；3)接著，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理48-96小時，所述緩沖液為25-100mmol/L Tris-HCl，pH為7-8；得到所述生物修復材料；上述處理的溫度均為2-8℃。
2.權(quán)利要求1所述生物修復材料的制備方法，包括如下步驟1)將筋膜用體積百分濃度為1-1.5％的磷酸三丁酯溶液處理24-72小時；2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol、pH為7.6-8.5的Tris-HCl緩沖液處理24-72小時；3)接著，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理48-96小時，所述緩沖液為25-100mmol/L Tris-HCl，pH為7-8；得到所述生物修復材料；上述處理的溫度均為2-8℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述得到的生物修復材料還經(jīng)過濃度為0.5-1.5mol/L強堿溶液處理5-10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述磷酸三丁酯溶液的溶劑為PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述制備步驟包括1)將筋膜用體積百分濃度為1％的磷酸三丁酯溶液處理48小時，溶劑為50mmol/LTris-HCl，pH為8；2)然后，用含有1mol/L NaCl的50mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液處理48小時；3)接著，用1g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理72小時，所述緩沖液為50mmol/LTris-HCl，pH為8；4)以1mol/L NaOH處理5分鐘，得到所述生物修復材料；上述處理的溫度均為4℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一所述的制備方法，其特征在于所述筋膜在處理前還要去除內(nèi)層粘附的肌肉組織和外層粘附的脂肪。
7.權(quán)利要求1所述生物修復材料在體外修復神經(jīng)元的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物修復材料及其制備方法與應用。本發(fā)明生物修復材料，是按如下步驟處理得到的1)將筋膜用體積百分濃度為1－1.5％的磷酸三丁酯溶液處理24－72小時；2)然后，用含有0.5－1.5mol/L NaCl的25－100mmol/L、pH為7.6－8.5的Tris－HCl緩沖液處理24－72小時；3)接著，用0.5－1.5g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理48－96小時，所述緩沖液為25－100mmol/L Tris－HCl，pH為7－8；得到所述生物修復材料；上述處理的溫度均為2－8℃。本發(fā)明生物修復材料是以天然筋膜為基礎(chǔ)，經(jīng)過一系列獨特的處理方法得到的，它對細胞具有良好的親和力，低免疫原；而且它可以定向神經(jīng)元沿著纖維的方向有序生長，這對于體內(nèi)脊髓損傷的恢復是十分重要的。
文檔編號A61L27/00GK1751747SQ20051009873
公開日2006年3月29日 申請日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月7日
發(fā)明者林航, 陳冰, 戴建武 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所