專利名稱：一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法及其應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
1971年用酶代替同位素制備了酶標(biāo)記試劑，建立了酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)。 該方法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨 床診斷、生化分析、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等各生物檢測(cè)領(lǐng)域，原則上適用于檢測(cè)一切抗原、抗 體及半抗原，可直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。其基本模式是將已知的抗原或抗體吸 附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使抗原-抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法 將固相上的抗原_抗體合物與液相中的游離成分分開(kāi)。 ELISA常用的方法主要包括雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法(1)雙抗體夾心法，是 檢測(cè)抗原最常用的方法，利用兩種一抗對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時(shí) 大大提高了反應(yīng)的特異性，檢測(cè)靈敏度可提高到pg級(jí)的水平，適用于測(cè)定2價(jià)或2價(jià)以上 的大分子抗原，但不適用于測(cè)定不能形成兩位點(diǎn)夾心的半抗原及小分子單價(jià)抗原。(2)間接 法，是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體， 這種方法操作簡(jiǎn)單，只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)二抗建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法， 其成功的關(guān)鍵在于抗原的純度以及正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體，因此常因高 背景而特異性較差，目前已逐漸被夾心法取代。(3)競(jìng)爭(zhēng)法，可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定 抗體；當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特 異性抗體，其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原的結(jié)合，如抗原為 高純度的，可直接包被于固相，如抗原中有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被 法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原，洗滌除去抗原中的雜 質(zhì)，然后再加入標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)；小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夾 心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)而不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式，其原理是 標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在 固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。用抗原包被來(lái)與液相抗原間接競(jìng)爭(zhēng)的方法是 一種低靈敏度的方法，而包被抗體，目標(biāo)抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)的方法能顯著提高靈敏度。
對(duì)于小分子抗原來(lái)說(shuō)，由于其抗體是聯(lián)接載體蛋白免疫得到的，產(chǎn)生的抗體除了 針對(duì)抗原的，還有針對(duì)載體蛋白與抗原-載體聯(lián)接部位的，即便是針對(duì)抗原，也有可能因?yàn)?載體蛋白的導(dǎo)向作用使其對(duì)偶聯(lián)蛋白比游離小分子具有更高的親和力。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一 般會(huì)使用偶聯(lián)蛋白進(jìn)行包被或小分子標(biāo)記HRP，所以會(huì)有抗體對(duì)固相抗原或標(biāo)記抗原的親 和力強(qiáng)，而加入抗原后的抑制作用弱。如果檢測(cè)系統(tǒng)使用的偶聯(lián)物的偶聯(lián)位點(diǎn)改變一下，就 會(huì)出現(xiàn)效價(jià)下降的現(xiàn)象。所以需要篩選合適的，對(duì)偶聯(lián)物及小分子親和力一致的單抗用于 檢測(cè)，并需要從抗體質(zhì)量及抗原抗體比例等多方面進(jìn)行探索，可見(jiàn)小分子抗原的ELISA方 法建立并不容易實(shí)現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法及其應(yīng)用，其檢測(cè)方法建立周 期短、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于生物檢測(cè)中靶標(biāo)的分析，尤其適用于小分子抗原或半抗 原的測(cè)定。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于它為利用核酸適體
作為親和配體，與標(biāo)記的靶標(biāo)一起建立的競(jìng)爭(zhēng)分析方法，包括以下步驟 (1)靶標(biāo)核酸適體包被； (2)與標(biāo)記的靶標(biāo)分子孵育結(jié)合； (3)加入靶標(biāo)樣品競(jìng)爭(zhēng)分析； (4)洗滌后，加入底物進(jìn)行分析。 上述所說(shuō)的步驟(1)中的核酸適體包被是由核酸適體通過(guò)直接或間接的方式以 共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵形式包被在固相基質(zhì)上。
上述所說(shuō)的步驟(1)中的核酸適體既能與標(biāo)記的靶標(biāo)結(jié)合，也能與靶標(biāo)結(jié)合，但 其與靶標(biāo)結(jié)合的能力高于與標(biāo)記靶標(biāo)結(jié)合的能力，耙標(biāo)可競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記靶標(biāo)結(jié)合核酸適體。
上述所說(shuō)的核酸適體為單鏈DNA即ssDNA或RNA。 上述所說(shuō)的核酸適體是通過(guò)指數(shù)富集配體進(jìn)化系統(tǒng)即SELEX技術(shù)體外篩選獲得
的與靶標(biāo)有特異結(jié)合的核酸序列。 上述所說(shuō)的核酸適體的篩選包括以下步驟 ①合成制備ssDNA或RNA文庫(kù)； ②以標(biāo)記的靶標(biāo)作為篩選分子，富集與其特異親和的核酸序列； ③用靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)洗脫，獲得靶標(biāo)特異的多克隆核酸適體，制備次級(jí)文庫(kù)； ④篩選數(shù)輪，克隆測(cè)序，獲得靶標(biāo)的單克隆核酸適體。 上述所說(shuō)的靶標(biāo)是生物檢測(cè)中靶標(biāo)，包括生物大分子或生物小分子。 上述所說(shuō)的靶標(biāo)分子的標(biāo)記方法采用放射性同位素標(biāo)記法、熒光素標(biāo)記法、生物
素標(biāo)記法、納米材料標(biāo)記法、用于ELISA檢測(cè)或電化學(xué)分析的酶類標(biāo)記法或電化學(xué)活性物
質(zhì)標(biāo)記法；其中用于ELISA檢測(cè)或電化學(xué)分析的酶類標(biāo)記法中的酶類包括辣根過(guò)氧化物
酶、堿性磷酸酶、P半乳糖苷酶、過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶或葡萄糖6磷酸脫氫酶。 上述所說(shuō)的步驟(4)中進(jìn)行分析的方法為比色法、放射性同位素分析法、熒光分
析法、化學(xué)發(fā)光分析法或電化學(xué)檢測(cè)法。 —種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法可以應(yīng)用于致病物質(zhì)在體內(nèi)體外的檢測(cè)分析、體液生 物分子實(shí)驗(yàn)研究、食品安全監(jiān)測(cè)、生物防恐監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。 本發(fā)明的有益效果分析適體(即tamer)是與靶分子高特異性、高親和力結(jié) 合的寡核苷酸配基，系通過(guò)SELEX (systematic evlution of ligandby exponential enrichment)技術(shù)從人工合成的大容量單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選并富集而得。文庫(kù) 中的寡核苷酸單鏈存在隨機(jī)序列，通過(guò)WatsonCrick堿基配對(duì)原則和分子內(nèi)交互作用， 每一條核苷酸單鏈均可有不同的三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾(haipin)、假結(jié)(pseudoknot)、凸環(huán) (bulge) 、 G四聚體(G tetramer)等。由于篩選文庫(kù)的容量可達(dá)1015左右，因此理論上應(yīng) 用SELEX技術(shù)能篩選到自然界幾乎所有靶分子的適體。適體的作用有如抗體，但它在敏感 性、特異性等很多方面往往優(yōu)于抗體。適體系體外篩選，可克服免疫原性弱的抗原所受的限
4制，耙分子范圍廣，蛋白、糖、脂類等生物大分子以及毒素、抗生素、農(nóng)藥、獸藥、染料、離子等 生物小分子均可篩選得到核酸適體；適體的標(biāo)記更容易實(shí)現(xiàn)，可以精確、定點(diǎn)、隨意連接其 他功能基團(tuán)和分子，如巰基、氨基和同位素、熒光素、生物素、納米材料、用于ELISA檢測(cè)或 電化學(xué)分析的酶類(包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、P半乳糖苷酶、過(guò)氧化物酶、葡萄 糖氧化酶或葡萄糖6磷酸脫氫酶)、電化學(xué)活性物質(zhì)等，因此可以實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)方法包括比色 法、放射性同位素分析法、熒光分析法、化學(xué)發(fā)光分析法或電化學(xué)檢測(cè)法等；適體能夠分辨 出靶分子結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差別，如一個(gè)取代基的有或無(wú)，因此適體能夠區(qū)別靶分子標(biāo)記與否。 另外，核酸適體性質(zhì)更穩(wěn)定，篩選更快速，制備更簡(jiǎn)單，無(wú)批間差異，因此具有良好的應(yīng)用價(jià) 值。 本發(fā)明的技術(shù)效果1、上述生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其檢測(cè)方法建立周期短、靈敏 度高、特異性強(qiáng)，用于生物檢測(cè)中靶標(biāo)的分析，尤其適用于小分子抗原或半抗原的測(cè)定；2、 該方法可廣泛應(yīng)用于致病物質(zhì)在體內(nèi)體外的檢測(cè)分析、體液生物分子實(shí)驗(yàn)研究、食品安全 監(jiān)測(cè)、生物防恐監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，即以核酸適體為親和配體的氯霉素競(jìng)爭(zhēng) 分析方法 文庫(kù)的合成及擴(kuò)增 ssDNA文庫(kù)通過(guò)化學(xué)合成法制備，其兩端為固定序列，中間為35個(gè)堿基的隨機(jī)序 列5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT3，，庫(kù)容量1014以上； 引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文庫(kù)為模板，以引物1、引物2不對(duì)稱擴(kuò)增ssDNA文庫(kù)，即采用 不對(duì)稱PCR，引物1/引物2濃度比100 : l，擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性3min，然后94。C變性 30s，65t:退火45s，循環(huán)35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。將獲得的產(chǎn)物主要為 ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室溫放置10min，即為ssDNA文庫(kù)。
氯霉素核酸適體的篩選 購(gòu)買偶聯(lián)有羧基的磁珠，與標(biāo)記了 FITC的氯霉素之羥基反應(yīng)，將其固定于磁珠， 加入以上擴(kuò)增的ssDNA文庫(kù)，一同孵育后洗滌，然后用未經(jīng)FITC標(biāo)記的氯霉素競(jìng)爭(zhēng)洗脫并 收集ssDNA，作為次級(jí)文庫(kù)參與下一輪篩選。篩選15輪后，將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，采用SPR 進(jìn)行親和力分析。選擇親和力高于0.5nmo1的核酸序列，用于氯霉素的競(jìng)爭(zhēng)分析。
氯霉素的競(jìng)爭(zhēng)分析 合成上述高親和力核酸適體，并將3'端用氨基修飾；購(gòu)買偶聯(lián)有氨基的酶標(biāo)板， 通過(guò)PDITC溶液的介導(dǎo)，將3' -NH2-SSDNA核酸適體固定于酶標(biāo)板，封閉過(guò)剩的活性位點(diǎn)； 加入FITC標(biāo)記的氯霉素，與適體孵育，洗滌，干燥后備用；向處理好的酶標(biāo)板中加入稀釋好 的靶標(biāo)氯霉素(濃度可低至O. 5nmol/L)，孵育10-30分鐘，洗滌后，檢測(cè)熒光信號(hào)，即可指示 待測(cè)樣品中氯霉素的濃度。 實(shí)施例2 :—種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，即以核酸適體為親和配體的人CRP競(jìng)爭(zhēng)分 析方法采用組合化學(xué)法合成含30個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA文庫(kù)5' -GTCACTGTCTTCATAGGTTG-N30-GAATCAGT GAGACATCCC 3'，經(jīng)8 %變性聚丙烯酰胺膠純化后，通過(guò)引物 1(5' -GTCACTGTCTTCATAGGTTG-3，)和引物2(5' -TTCTAATACGACTCACTATAGGGATGTCTCACTG ATTC-3')擴(kuò)增；用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成RNA， DNA模板用無(wú)RNA酶的DNA酶消化， 酚_氯仿_異戊醇抽提，乙醇沉淀RNA，溶解后用8%變性聚丙烯酰胺膠純化，即為初級(jí)RNA 文庫(kù)。 按蛋白膠體金=30iig : 1ml的量用膠體金標(biāo)記人CRP，離心去除未結(jié)合部分， 洗滌并重懸后將膠體金標(biāo)記的人CRP包被于96孔板，與以上制備的初級(jí)RNA文庫(kù)作用，洗 去未結(jié)合的部分，然后用未經(jīng)膠體金標(biāo)記的人CRP競(jìng)爭(zhēng)洗脫，收集RNA，作為次級(jí)文庫(kù)參與 下一輪篩選。篩選15輪后，將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，采用SPR進(jìn)行親和力分析。選擇親和力 高于0. 5nmo1的核酸序列，用于人CRP的競(jìng)爭(zhēng)分析。 合成上述高親和力核酸適體，以其包被經(jīng)紫外線照射處理(30W紫外燈，75cm照射 12小時(shí))的聚苯乙烯板，封閉后，加入膠體金標(biāo)記的人CRP作用適當(dāng)時(shí)間，洗滌，干燥后備 用；向處理好的酶標(biāo)板中加入含人CRP的待測(cè)樣品，孵育10-30分鐘，洗滌后，用銀增強(qiáng)法顯 色；采用比色分析即可指示待測(cè)樣品中人CRP的濃度。 實(shí)施例3 :—種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，即以核酸適體為親和配體的雙酚A競(jìng)爭(zhēng)分 析方法 文庫(kù)的合成及擴(kuò)增 ssDNA文庫(kù)通過(guò)化學(xué)合成法制備，其兩端為固定序列，中間為35個(gè)堿基的隨機(jī)序 列5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT3，，庫(kù)容量1014以上； 引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文庫(kù)為模板，以引物1、引物2不對(duì)稱擴(kuò)增ssDNA文庫(kù)，即采用 不對(duì)稱PCR，引物1/引物2濃度比100 : l，擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性3min，然后94。C變性 30s，65t:退火45s，循環(huán)35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。將獲得的產(chǎn)物主要為 ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室溫放置10min，即為ssDNA文庫(kù)。
雙酚A核酸適體的篩選 將亞甲蘭標(biāo)記的雙酚A固定于羧基磁珠，加入以上擴(kuò)增的ssDNA文庫(kù)， 一 同孵育后 洗滌，然后用未標(biāo)記的雙酚A競(jìng)爭(zhēng)洗脫并收集ssDNA，作為次級(jí)文庫(kù)參與下一輪篩選。篩選 15輪后，將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，采用SPR進(jìn)行親和力分析。選擇親和力高于O. 5nmo1的核酸 序列，用于雙酚A的競(jìng)爭(zhēng)分析。
雙酚A的競(jìng)爭(zhēng)分析 合成上述高親和力核酸適體，并將3'端用巰基修飾；以金電極為基體電極，采用 自組裝法將3' -SH-ssDNA核酸適體固定于電極，封閉過(guò)剩的活性位點(diǎn)；加入亞甲蘭標(biāo)記的 雙酚A，與適體孵育，適體構(gòu)象發(fā)生改變，使得電化學(xué)活性標(biāo)記物亞甲蘭更接近電極表面，有 利于電子在活性物與電極之間的轉(zhuǎn)移，電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)；加入含雙酚A的待測(cè)樣品，使亞甲 蘭標(biāo)記的雙酚A競(jìng)爭(zhēng)解離，電化學(xué)信號(hào)減弱；電化學(xué)信號(hào)的變化量即可指示待測(cè)樣品中雙 酚A的濃度。 實(shí)施例4:一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，即以核酸適體為親和配體的黃曲霉毒素
Bl競(jìng)爭(zhēng)分析方法 文庫(kù)的合成及擴(kuò)增
ssDNA文庫(kù)通過(guò)化學(xué)合成法制備，其兩端為固定序列，中間為35個(gè)堿基的隨機(jī)序 列5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT3，，庫(kù)容量1014以上； 引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文庫(kù)為模板，以引物1、引物2不對(duì)稱擴(kuò)增ssDNA文庫(kù)，即采用 不對(duì)稱PCR，引物1/引物2濃度比100 : l，擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性3min，然后94。C變性 30s，65t:退火45s，循環(huán)35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。將獲得的產(chǎn)物主要為 ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室溫放置10min，即為ssDNA文庫(kù)。
黃曲霉毒素Bl核酸適體的篩選 將標(biāo)記了辣根過(guò)氧化物酶的黃曲霉毒素Bl固定于酶標(biāo)板，加入以上擴(kuò)增的ssDNA 文庫(kù)，一同孵育后洗滌，然后用未經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1競(jìng)爭(zhēng)洗脫并收集 ssDNA，作為次級(jí)文庫(kù)參與下一輪篩選。篩選15輪后，將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，采用SPR進(jìn)行 親和力分析。選擇親和力高于0.5nmo1的核酸序列，用于黃曲霉毒素Bl的競(jìng)爭(zhēng)分析。
黃曲霉毒素Bl的競(jìng)爭(zhēng)分析 合成上述高親和力核酸適體，并將3'端用生物素標(biāo)記；酶標(biāo)板用鏈霉親和素包被 后，通過(guò)鏈霉親和素與生物素間的相互作用，將3' -Bio-ssDNA核酸適體固定于酶標(biāo)板，封 閉過(guò)剩的活性位點(diǎn)；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1，與適體孵育，洗滌，干燥后 備用；向處理好的酶標(biāo)板中加入含黃曲霉毒素B1的待測(cè)樣品，孵育10-30分鐘，洗滌后，再 加入發(fā)光底物魯米諾』202檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，即可指示待測(cè)樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。
權(quán)利要求
一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于它為利用核酸適體作為親和配體，與標(biāo)記的靶標(biāo)一起建立的競(jìng)爭(zhēng)分析方法，包括以下步驟(1)靶標(biāo)核酸適體包被；(2)與標(biāo)記的靶標(biāo)分子孵育結(jié)合；(3)加入靶標(biāo)樣品競(jìng)爭(zhēng)分析；(4)洗滌后，加入底物進(jìn)行分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的步驟(1)中 的核酸適體包被是由核酸適體通過(guò)直接或間接的方式以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵形式包被在固 相基質(zhì)上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的步驟(1)中 的核酸適體既能與標(biāo)記的靶標(biāo)結(jié)合，也能與靶標(biāo)結(jié)合，但其與靶標(biāo)結(jié)合的能力高于與標(biāo)記 靶標(biāo)結(jié)合的能力，耙標(biāo)可競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記靶標(biāo)結(jié)合核酸適體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的核酸適體為 單鏈DNA即ssDNA或RNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的核酸適體是 通過(guò)指數(shù)富集配體進(jìn)化系統(tǒng)即SELEX技術(shù)體外篩選獲得的與靶標(biāo)有特異結(jié)合的核酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的核酸適體的 篩選包括以下步驟① 合成制備ssDNA或RNA文庫(kù)；② 以標(biāo)記的靶標(biāo)作為篩選分子，富集與其特異親和的核酸序列；③ 用靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)洗脫，獲得靶標(biāo)特異的多克隆核酸適體，制備次級(jí)文庫(kù)； 篩選數(shù)輪，克隆測(cè)序，獲得靶標(biāo)的單克隆核酸適體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、3、5或6所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的靶 標(biāo)是生物檢測(cè)中靶標(biāo)，包括生物大分子或生物小分子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的靶標(biāo)分 子的標(biāo)記方法采用放射性同位素標(biāo)記法、熒光素標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、納米材料標(biāo)記法、 用于ELISA檢測(cè)或電化學(xué)分析的酶類標(biāo)記法或電化學(xué)活性物質(zhì)標(biāo)記法；其中用于ELISA檢 測(cè)或電化學(xué)分析的酶類標(biāo)記法中的酶類包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、P半乳糖苷酶、 過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶或葡萄糖6磷酸脫氫酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于所說(shuō)的步驟(4)中 進(jìn)行分析的方法為比色法、放射性同位素分析法、熒光分析法、化學(xué)發(fā)光分析法或電化學(xué)檢 測(cè)法。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于它可以用于致病 物質(zhì)在體內(nèi)體外的檢測(cè)分析、體液生物分子實(shí)驗(yàn)研究、食品安全監(jiān)測(cè)、生物防恐監(jiān)測(cè)、環(huán)境 監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。
全文摘要
一種生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法，其特征在于它為利用核酸適體作為親和配體，與標(biāo)記的靶標(biāo)一起建立的競(jìng)爭(zhēng)分析方法，包括以下步驟(1)靶標(biāo)核酸適體包被；(2)與標(biāo)記的靶標(biāo)分子孵育結(jié)合；(3)加入靶標(biāo)樣品競(jìng)爭(zhēng)分析；(4)洗滌后，加入底物進(jìn)行分析。該方法尤其適用于小分子抗原或半抗原的測(cè)定。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述生物分子競(jìng)爭(zhēng)分析方法的應(yīng)用，可廣泛用于致病物質(zhì)在體內(nèi)體外的檢測(cè)分析、體液生物分子實(shí)驗(yàn)研究、食品安全監(jiān)測(cè)、生物防恐監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101782570SQ200910224150
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者吳淑慶, 弓景波, 楊在明 申請(qǐng)人:國(guó)家納米技術(shù)與工程研究院