專利名稱：一種肝特異性超超微型順磁性mri造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑，并提供了該造影劑的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磁共振成像(MRI)是二十世紀(jì)醫(yī)學(xué)成像最重要的進(jìn)展之一，也是世界上最先進(jìn)的大型醫(yī)學(xué)診斷設(shè)備，它在醫(yī)療診斷方面一個(gè)最突出的特點(diǎn)是對(duì)軟組織的顯像特別清晰。1946年美國(guó)哈佛大學(xué)的Purcell和美國(guó)斯坦福大學(xué)的Block各自獨(dú)立地同時(shí)發(fā)現(xiàn)了核磁共振現(xiàn)象，兩人因此獲1952年諾貝爾物理獎(jiǎng)。1971年工程物理學(xué)家Damadian發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的縱向弛豫時(shí)間(T1)、橫向弛豫時(shí)間(T2)值比正常組織長(zhǎng)。1980年Hawkes等證實(shí)了MRI多平面成像的優(yōu)點(diǎn)，并首次報(bào)告了用MRI檢查顱內(nèi)病變的結(jié)果。同年商品MRI機(jī)出售，開(kāi)始應(yīng)用于臨床，這一新的影像技術(shù)迅速在各個(gè)國(guó)家的醫(yī)療中心和大醫(yī)院開(kāi)展起來(lái)。為加強(qiáng)病變組織與正常組織密度差別的顯示，進(jìn)一步明確診斷，在MRI檢查中常使用造影劑作增強(qiáng)檢查。1983年首次試用于臨床的順磁性造影劑為釓一二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA，商品名magnevist)，由Weinmann博士發(fā)明、德國(guó)先靈公司生產(chǎn)，1988年德國(guó)衛(wèi)生管理部門和美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)后廣泛使用。
MRI的成像與傳統(tǒng)的CT成像原理完全不同，它是依靠人體內(nèi)部的大量氫質(zhì)子所形成的雜亂無(wú)章的小磁矩，在強(qiáng)大的靜磁場(chǎng)的作用下所形成的總磁矩，在射頻脈沖作用下所形成的射頻磁場(chǎng)的激勵(lì)下而發(fā)生進(jìn)動(dòng)，出現(xiàn)馳豫現(xiàn)象。當(dāng)射頻脈沖撤離之后，氫質(zhì)子即將射頻脈沖所提供的激勵(lì)能量釋放出來(lái)，這種被釋放出來(lái)的無(wú)線電信號(hào)，被體外的接收線圈所接收，人們將被接收的無(wú)線電信號(hào)再轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的灰度，從而獲取人體不同斷層的灰度像，對(duì)于不同斷層的空間位置及其每個(gè)斷層上每個(gè)提供不同灰度像素的氫質(zhì)子的空間位置，則由梯度磁場(chǎng)來(lái)完成。人體內(nèi)部凡是有水分子存在的地方，即存在著氫質(zhì)子，磁共振成像即建立在分子量級(jí)的基礎(chǔ)之上，其成像的清晰度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了CT圖像，是目前能用于發(fā)現(xiàn)肝等軟組織占位性病變的唯一成像設(shè)備。
MRI成像較CT有更高的安全性，掃描快捷方便的優(yōu)點(diǎn)，極大地改善了對(duì)心血管形態(tài)功能的診斷和軟組織占位性病變的分辨率。在MRI發(fā)展的早期，一般認(rèn)為無(wú)需使用造影劑即可完成MRI檢查診斷。隨著臨床上MRI的廣泛應(yīng)用，人們希望MRI能顯示一些較小的病變，使一部分疑難病變得以確診，這就需要進(jìn)一步提高M(jìn)RI影像的對(duì)比度。臨床檢查時(shí)MRI掃描最基本、最常用的是自旋回波脈沖程序并采用T1加權(quán)成像。為提高M(jìn)RI影像的對(duì)比度，一方面力求選擇適當(dāng)?shù)拿}沖程序與時(shí)間參數(shù)，以更好地反映病變組織的實(shí)際大小、程度及病變特征；另一方面則致力于人為地改變病變組織的MR特征參數(shù)，這方面的努力主要集中在通過(guò)使用MRI造影劑以縮短弛豫時(shí)間T1及T2，加速弛豫速率。為確保臨床診斷的準(zhǔn)確性，目前臨床上30％以上的MRI檢查使用了造影劑來(lái)提高圖像對(duì)比度。上世紀(jì)末全球年消耗含釓造影劑即達(dá)30噸以上。設(shè)計(jì)、合成更為安全有效的造影劑也一直是MRI領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。作為一種成功的造影劑應(yīng)具備以下的基本條件1.低毒性。在體內(nèi)穩(wěn)定且易排出體外。MRI造影劑以靜脈注射為主要給藥方式，對(duì)其安全要求就更高。造影劑對(duì)人體的毒性與其在體內(nèi)的穩(wěn)定性及排出體外的速率有關(guān)。
2.高弛豫效能。所用造影劑應(yīng)能顯著提高靶組織被觀測(cè)核的弛豫速率，能使弛豫速率提高10％以上的試劑，方可用于MRI。
3.良好水溶性。造影劑為靜脈注射液，應(yīng)有較好的水溶性，一般其溶解度應(yīng)大于0.5mol/L，如市售造影劑Magnevist、Dotarem等即為0.5mol/L。
4.靶組織選擇性。造影劑進(jìn)入人體后能選擇性分布，在靶組織富集并停留一段時(shí)間，使靶區(qū)域被觀測(cè)核的弛豫速率比其它部位有更大的增強(qiáng)，從而增加正常組織與病變組織的成像對(duì)比度。
MRI造影劑的現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題根據(jù)磁性中心的不同，MRI造影劑可分為1)順磁性物質(zhì)特點(diǎn)是磁化率小，無(wú)外界磁場(chǎng)時(shí)磁性不能保留。順磁性物質(zhì)的存在加劇了組織內(nèi)部雜散磁場(chǎng)，是縮短T1的關(guān)鍵。它們通常是過(guò)渡族金屬離子，如Fe3+、Mn2+、Gd3+，這些金屬離子有未成對(duì)電子，多個(gè)未成對(duì)電子自旋產(chǎn)生的局部磁場(chǎng)能縮短鄰近水分子中氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間，主要表現(xiàn)為縮短T1，增大造影劑鄰近區(qū)域的磁共振信號(hào)，提高影像的對(duì)比。它們?cè)诘蜐舛葪l件下就能明顯地縮短T1值，但是只有在高濃度下才能對(duì)T2值起到一定的縮短效應(yīng)。順磁性物質(zhì)數(shù)目眾多，又可再分為小分子順磁性螯合物、大分子順磁性螯合物和穩(wěn)定自由基等幾類。2)超順磁性物質(zhì)在磁學(xué)中，當(dāng)鐵磁性粒子的體積減少到磁能小于熱能時(shí)，熱運(yùn)動(dòng)引起的磁疇隨機(jī)起伏，使磁性微粒的行為和順磁性粒子一樣，此時(shí)微粒呈現(xiàn)的鐵磁性，稱為超順磁性。當(dāng)外加磁場(chǎng)消失后，超順磁性材料磁性消失，這一點(diǎn)同順磁性材料相似，區(qū)別在于超順磁性微粒的磁矩要大得多。它們對(duì)T1值沒(méi)有明顯地改變，但是在較低濃度下能明顯縮短T2值。3)鐵磁性物質(zhì)具有較高的磁化率，在無(wú)外界磁場(chǎng)時(shí)仍能保存其磁性，鐵磁性微粒具有較順磁性物質(zhì)更高的磁矩，對(duì)鄰近組織中氫核的馳豫有明顯的加速效應(yīng)，能顯著降低T2，用于成像所需的濃度遠(yuǎn)低于順磁性物質(zhì)，這些磁性微粒都是水不溶性微粒，只能采用勻漿或載體形式給藥，適用于胃腸道的口服制劑。它們對(duì)T1值沒(méi)有明顯地改變，但是在較低濃度下能極大地縮短T2值。
現(xiàn)有四種商品化小分子釓配合物MRI造影劑用于臨床，它們分別是(NMG)2[Gd(DTPA)(H2O)](Magnevist)，(NMG)[Gd(DOTA)(H2O)](Dotarem)，Gd(DTPA-BMA)(Omniscan)和Gd(DO3A-HP)(Prohance)，其中NMG為N-甲基葡萄糖胺)。這四種造影劑均為胞外試劑，在體內(nèi)呈非特異性分布，適用于腦、腎和血液系統(tǒng)的成像，但對(duì)肝膽道等系統(tǒng)的成像效果差，這使得它們不能用作選擇性(靶向性)造影劑。
Gd-DTPA是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的MRI造影劑，具有以下特征①弛豫性強(qiáng)；②毒性??；③安全系數(shù)大；④細(xì)胞外分布；⑤不通過(guò)正常的血腦屏障；⑥迅速由腎臟排出；⑦在人體內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；⑧具有高溶解度。Gd-DTPA作為T1加權(quán)造影劑常用于SE序列，其快速?gòu)?qiáng)化掃描作用受到一定的限制，對(duì)肝臟和病灶同時(shí)具有正性強(qiáng)化作用，有時(shí)對(duì)等密度病灶容易混淆。目前使用的Gd-DTPA濃度為0.5mol/L，通常按0.1mmol/kg靜脈給藥，即進(jìn)行增強(qiáng)后掃描，其增強(qiáng)效果只可維持45分鐘。它經(jīng)血管分布于組織間液中，不通過(guò)細(xì)胞膜而不被任何組織細(xì)胞攝取，因而也不具有生物學(xué)特異性。
針對(duì)肝臟器官特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的造影劑主要有肝細(xì)胞特異性造影劑和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑兩類。肝細(xì)胞特異性造影劑包括Teslascan(mangafodipir，Mn-DPDP，Amersham Health)，Multi-Hance(gadobenate，Gd-BOPTA，Bracco)、Eovist(gadoxetate，Gd-EOB-DTPA，Schering AG)、馬根維顯(Gadopentetate Dimeglumine，Magnevist)等。Teslascan是第一個(gè)作為臨床使用的含錳復(fù)合物造影劑，錳離子是很強(qiáng)的T1馳豫造影劑。該造影劑由肝細(xì)胞吸收，經(jīng)代謝后從腎臟排泄，其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的錳離子能在肝、胰以及心肌中積累，能有效地正性增強(qiáng)肝的造影效果，持續(xù)時(shí)間15min～數(shù)小時(shí)，使用量為5mmol/kg。目前臨床上最常用的肝特異性造影劑是釓的螯合物，屬于順磁性造影劑。Gd3+具有7個(gè)不成對(duì)電子，為一順磁性很強(qiáng)的金屬離子，能顯著縮短T1、T2的馳豫時(shí)間，尤以T1更為明顯，在濃度0～1mmol/L的范圍內(nèi)馳豫時(shí)間呈直線下降，從而影響MRI的信號(hào)強(qiáng)度。50～100mmol/kg的Multi-Hance注射后40min～120min內(nèi)，在延遲相掃描中能夠看見(jiàn)顯著的肝臟增強(qiáng)作用。Eovist與Multi-Hance的效果相似，但使用劑量可以更少，為10～25mmol/kg，研究顯示500mmol/kg的劑量仍未觀察到顯著的不良反應(yīng)。馬根維顯靜脈注射后5min行增強(qiáng)成像，其增加效果可維持45min。靜脈給藥后很快彌散到體內(nèi)各組織的細(xì)胞外液內(nèi)，然后經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)以原形排出。有少量分泌于胃腸道后隨糞便排出。不良反應(yīng)顯著低于碘造影劑，主要是輕微的一過(guò)性頭痛(8.7％)。這一類造影劑能夠進(jìn)入到細(xì)胞外空間，對(duì)肝臟病變的診斷起到一定的幫助，但是檢出率還需要提高。然而，它們并非真正的肝特異性造影劑，對(duì)身體的其他部位有著相似的造影增強(qiáng)作用。
網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑能較大幅度地減小T2馳豫時(shí)間，在標(biāo)準(zhǔn)的T2增強(qiáng)掃描序列中3mgFe/g肝就能降低50％的肝信號(hào)強(qiáng)度。根據(jù)其顆粒大小這類造影劑可分為超順磁性氧化鐵(superparamagnetic ironoxides，SPIO)和超微型順磁性氧化鐵顆粒(ultrasmallsuperparamagnetic iron oxides，USPIO)。SPIO一般直徑40～400nm不等。常見(jiàn)制劑是Schering公司開(kāi)發(fā)的SHU-555A(商品名為Resovist)。它是由Fe3O4和Fe2O3組成，外包碳氧葡聚糖，氧化鐵核心由若干個(gè)單晶體構(gòu)成，每個(gè)單一的晶體的直徑約為4.2nm，整個(gè)親水性顆粒的直徑約為62nm。Advanced Magnetics公司開(kāi)發(fā)的AMI-25(Ferumoxides，商品名為Feridex)，直徑為(50±29)nm，其核心氧化鐵顆粒的直徑約為20nm。AMI-25在美國(guó)、歐洲及日本等國(guó)已完成臨床試驗(yàn)。另外還有Nycomed公司開(kāi)發(fā)的MSM和NSP 430等。因?yàn)楸砻姘涣舜蠓肿游镔|(zhì)，SPIO顆粒地尺寸和電性均發(fā)生改變，最終導(dǎo)致了藥效地顯著差異。USPIO最大直徑約30nm，如Advanced Magnetics公司的開(kāi)發(fā)的AMI-227(Ferumoxtran)和Nycomed公司開(kāi)發(fā)的FeO-BPA就屬于這類制劑。
網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑顆粒被體內(nèi)Kuffer氏細(xì)胞攝取，在肝臟主要可以降低其組織的背景信號(hào)，從而達(dá)到突出顯示病灶的目的(因?yàn)椴糠植≡顑?nèi)的Kuffer氏細(xì)胞的含量與正常肝組織相比有較大差異)，有利于病灶尤其是小的肝臟局灶性病變的檢出。這類造影劑的另一影像特征是強(qiáng)化效果持久，根據(jù)已有的研究顯示，強(qiáng)化峰值一般在第10～40min之間，強(qiáng)化作用可維持40小時(shí)以上。此外網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑作為T2加權(quán)造影劑用于梯度回波序列，能在較短的時(shí)間獲得良好的病灶信噪比。梯度回波的快速掃描和造影劑顆粒對(duì)肝臟的負(fù)性強(qiáng)化作用對(duì)提高肝臟病灶檢出率是十分有利的，特別對(duì)于與肝臟等密度病灶，其作用尤為明顯。
然而，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑都是由生物大分子(主要是葡聚糖)包被而成，因此顆粒的電磁學(xué)性質(zhì)也發(fā)生了改變，磁響應(yīng)性減弱，影響了造影效果，從而加大了造影劑的使用量，因此容易發(fā)生不良反應(yīng)。另外，具有一定細(xì)胞毒性的生物大分子也帶來(lái)了毒副作用，產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，如以Feridex為例，輕度副作用的發(fā)生率為10％～15％，其中腰痛比較常見(jiàn)，發(fā)生率約為3～4％，其他副反應(yīng)還包括潮紅、皮疹和呼吸困難等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由生物小分子包被而成的、無(wú)不良反應(yīng)的肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供該造影劑的制備方法。
本發(fā)明提供的新型肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑的結(jié)構(gòu)式為 其中R1＝CH3，R2＝CH2-COOH。
為了解決網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑目前存在的問(wèn)題，我們改進(jìn)了目前所使用生物大分子包被氧化鐵顆粒的策略，成功利用甜菜堿有機(jī)小分子與氧化鐵制備出直徑為4.6±0.96nm的超超微型順磁性氧化鐵顆粒(Super-ultrasmall superparamagnetic iron oxides，SUSPIO)。具體而言包括包括如下步驟第一步將溶解在2M的鹽酸中，濃度為1M的FeCl3溶液和濃度為2M的FeCl2溶液均勻混合，然后加入甜菜堿，渦旋振蕩溶解；第二步滴加3M的NaOH，邊加邊震蕩，直至pH達(dá)到11，劇烈振蕩，形成氧化鐵納米均勻顆粒。
第三步滴加2M的HCl，邊加邊震蕩，直至pH達(dá)到4，繼續(xù)振蕩，純化得到肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑。
本發(fā)明提供的新型肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑不僅粒子粒度比USPIO小5倍左右，且具更好的生物安全性、更強(qiáng)的馳豫性和磁響性效能以及更有效的肝占位性病變的早期診斷價(jià)值。研究表明，本發(fā)明所創(chuàng)制的SUSPIO具有如下顯著效果(1)不團(tuán)聚，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(室溫下放置數(shù)月無(wú)沉淀現(xiàn)象)，溶解度好。由于所包被的小有機(jī)分子為一種表面活性劑，其不僅與氧化鐵顆粒結(jié)合度好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不團(tuán)聚，且水溶性好。這些特性為該產(chǎn)品的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
(2)生物安全性高。包被所用有機(jī)小分子已被臨床應(yīng)用于治療高脂血癥等疾病，SUSPIO較包被以生物大分子的SPIO和USPIO更為安全。同時(shí)，SUSPIO整體粒子大大小于USPIO，其免疫原性大小降低，這亦有助于提高產(chǎn)品安全性。采用MRI亦未檢出其跨越正常血腦屏障。此外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明該產(chǎn)品濃度達(dá)到5mM Fe時(shí)仍沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。靜脈注射SUSPIO在短時(shí)間內(nèi)(三天內(nèi))及長(zhǎng)時(shí)程(三月內(nèi))均未發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品有任何毒副作用；實(shí)驗(yàn)大鼠病理尸檢結(jié)果進(jìn)一步支持體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明當(dāng)產(chǎn)品濃度在體達(dá)到0.18mmol/kg體重時(shí)，所有大鼠均沒(méi)有表現(xiàn)出可見(jiàn)的不良反應(yīng)。上述研究結(jié)果均證明該SUSPIO具有很好的生物安全性高。
(3)馳豫性強(qiáng)，磁響性高，大幅度降低肝臟背景信號(hào)，顯著提高病變檢出率。溶液中該產(chǎn)品在較低的濃度(0.1mM)下就能縮短T1和T2值，尤其是能極大地縮短T2值，理論上說(shuō)明了該產(chǎn)品具備很好的造影效果。在大鼠肝癌模型實(shí)際應(yīng)用中，SUSPIO在0.18mmol/kg體重的濃度下即能大大降低肝臟的背景信號(hào)。根據(jù)病理學(xué)尸檢結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的腫瘤體從1毫米到25毫米都可以用MRI檢查出來(lái)，因而SUSPIO能顯著地提高病變檢出率，對(duì)肝占位性病變的早期診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
(4)強(qiáng)化效果長(zhǎng)，作用可維持24小時(shí)以上。目前臨床廣泛使用的Gd-DTPA其增強(qiáng)效果只可維持45分鐘。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，大鼠肝癌模型在接受SUSPIO靜脈注射24小時(shí)后仍能清晰顯示1-25毫米大小的原發(fā)性肝癌瘤體。
(5)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，材料價(jià)廉。BUSPIO制備所采用的小分子有機(jī)物可以方便地在實(shí)驗(yàn)室中用植物提取或化學(xué)合成，生產(chǎn)所用的其他原料易得、價(jià)廉，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便易行，故使本產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用具可行性。
概而言之，本產(chǎn)品為新型網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特異性造影劑，較之于目前臨床廣泛使用的Gd-DTPA具有更好的安全性、更強(qiáng)的效能和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可作為一種新型肝臟特異性造影劑。
肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑的性能檢測(cè)(1)透射電鏡觀察取制備好的樣品，經(jīng)過(guò)一定倍數(shù)的稀釋，在專用銅網(wǎng)上點(diǎn)樣。放入干燥箱內(nèi)過(guò)夜干燥，高倍電鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示本發(fā)明制備的MRI造影劑顆粒呈圓形、大小均勻、無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，解決了以往制備類似產(chǎn)品普遍遇到的顆粒不均和團(tuán)聚問(wèn)題。同時(shí)，通過(guò)對(duì)電鏡圖片的統(tǒng)計(jì)，我們可以得到制備的納米顆粒大小在5nm左右(SD＝4.6±0.96nm)。
(2)X-射線衍射分析將制備的干燥固體樣品進(jìn)行X-射線衍射分析。根據(jù)圖譜，我們可以觀察到六個(gè)很明顯的衍射特征峰，其中典型氧化鐵的特征峰在311處，對(duì)應(yīng)的2θ＝35.6。從這個(gè)典型的氧化鐵圖譜上我們可以知道，制備的納米顆粒成分為四氧化三鐵晶體顆粒。X-衍射圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式d＝0.89λ/B Cos°θ，其中d為顆粒晶體的直徑，λ為X-射線的波長(zhǎng)，B是典型特征峰的半峰寬，θ是典型特征峰相對(duì)應(yīng)的角度。根據(jù)實(shí)際測(cè)量的數(shù)據(jù)，我們計(jì)算出了顆粒的直徑為d＝0.89*1.54056/
＝94.4A＝9.4nm。因?yàn)閄-射線衍射所采用的樣品沒(méi)有進(jìn)行高速離心，所以計(jì)算出來(lái)的顆粒直徑大小較電鏡結(jié)果大，這與實(shí)際結(jié)果基本相符，說(shuō)明納米顆粒的形態(tài)是真實(shí)的。
(3)傅立葉變換紅外光譜分析(FT-IR)為了對(duì)制備的氧化鐵納米顆粒的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，我們對(duì)其液體樣品用溴化鉀稀釋，干燥后進(jìn)行傅立葉變換紅外光譜分析，位于3386cm-1處大而寬的透射峰是O-H的伸縮振動(dòng)峰，另外一個(gè)較大的透射峰位于1628cm-1處，是C-N伸縮振動(dòng)峰。根據(jù)紅外分析圖譜，結(jié)合我們所使用的化合物，圖中顯示的2926cm-1和2846cm-1兩處的透射峰可能是亞甲基和甲基。由此我們可以推斷，制備的樣品表面包被了我們使用的甜菜堿有機(jī)小分子表面活性劑。
(4)磁性分析為了檢查樣品的磁性能指標(biāo)，本發(fā)明使用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)在室溫下對(duì)液體樣品進(jìn)行了測(cè)量，其磁滯洄線中顯示制備的氧化鐵納米顆粒具有超順磁性行為，是屬于超順磁性納米顆粒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出制備的樣品矯頑力接近于0，飽和磁化強(qiáng)度為56.8emu/g。
(5)鐵濃度測(cè)量將定量的樣品溶解在過(guò)量的濃鹽酸中。在pH＝4.2的醋酸緩沖液中，加入過(guò)量的鹽酸羥胺將溶液中所有的Fe3+還原成Fe2+離子，以進(jìn)行下一步顯色反應(yīng)。還原5min后，在此反應(yīng)液中加入過(guò)量的1，10-鄰二氮菲中顯色20min，并稀釋至指定體積，在510nm下讀取吸光度值。同時(shí)，取鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一系列濃度梯度，按照以上方法測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出鐵濃度。
(6)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)這個(gè)實(shí)驗(yàn)主要是檢測(cè)SUSPIO的細(xì)胞毒性和生物相容性的。將SMMC-7721和HL-7702這兩種細(xì)胞分別植入96孔板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔。在37℃、5％CO2下培養(yǎng)36小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到90％左右。然后，在每孔中分別加入不同濃度梯度的SUSPIO顆粒和醫(yī)院現(xiàn)在廣泛使用的造影劑Gd-DTPA，使其終濃度達(dá)到0.2、1和5mM，在無(wú)血清無(wú)雙抗條件下培養(yǎng)四小時(shí)。用PBS清洗細(xì)胞三次，將未吸收的氧化鐵納米顆粒洗凈，然后每孔加入200μL含10％小牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基(20μL，5mg/ml MTT)，再連續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四小時(shí)。除去含有MTT的培養(yǎng)基，每孔加入150μl的DMSO，溶解活細(xì)胞氧化MTT產(chǎn)生的藍(lán)紫色結(jié)晶。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm下讀取每孔的吸光度。每個(gè)濃度做四個(gè)相同的復(fù)管，以SD來(lái)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性[OD490(樣品)/OD490(對(duì)照)]×100(Fig.5.)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，兩種造影劑均無(wú)明顯的細(xì)胞毒害作用，說(shuō)明我們制備的樣品具有較好的生物相容性。
(7)細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吸收能力將SMMC-7721和HL-7702這兩種細(xì)胞分別植入96孔板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔。36小時(shí)后細(xì)胞密度達(dá)到90％左右，在每孔中分別加入不同濃度梯度的氧化鐵納米顆粒，使其終濃度達(dá)到0.2、1和5mM，同時(shí)做陰性空白對(duì)照，并在無(wú)血清無(wú)雙抗條件下培養(yǎng)4小時(shí)。用PBS清洗細(xì)胞三次，將未吸收的氧化鐵納米顆粒洗凈，然后每孔加入100μL 4％的多聚甲醛，在4℃下靜置半小時(shí)以固定細(xì)胞。除去多聚甲醛，用蒸餾水洗滌三次(80rpm，每次20min)之后，每孔加入2％的亞鐵氰化鉀(溶于6％的鹽酸)染色20min。繼續(xù)用蒸餾水洗滌三次(80rpm，每次20min)，每孔加入2～3滴0.5％伊紅然液染色3min左右，最后用蒸餾水洗滌三次(80rpm，每次20min)后在顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果顯示這兩種細(xì)胞均對(duì)納米顆粒有一定地吸收作用。但在氧化鐵納米顆粒較高濃度地情況下細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吸收能力相對(duì)下降，可能由于細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吸收飽以及顆粒大量吸附在細(xì)胞表面等原因。
(8)靜脈注射氧化鐵顆粒對(duì)大鼠血細(xì)胞的影響為進(jìn)一步確定該產(chǎn)品的安全性，靜脈注射SUSPIO(10mg/kg體重)以觀察其對(duì)大鼠的毒性反應(yīng)。尾靜脈注射后24小時(shí)后，取全血觀察血紅細(xì)胞數(shù)量的變化。并計(jì)數(shù)拍照，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞在形態(tài)上沒(méi)有改變，紅細(xì)胞數(shù)目維持正常水平繼續(xù)觀察大鼠的反應(yīng)直至三個(gè)月后，大鼠依然健康存活，無(wú)明顯不良反應(yīng)。
(9)體外MRI測(cè)試1).T1和T2馳豫時(shí)間的測(cè)量以純水和Gd-DTPA為對(duì)照，將SUSPIO按一定濃度溶解于水中，然后在NMR儀器上測(cè)量并擬合出信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算T1和T2馳豫時(shí)間值。通過(guò)對(duì)三者的比較研究發(fā)現(xiàn)，我們制備的納米氧化鐵在較低的濃度下就能大大降低T1和T2馳豫時(shí)間值，尤其是它能極大地降低T2馳豫時(shí)間值。
2).體外MRI成像SUSPIO能引起T1和T2馳豫時(shí)間值的減少，其就可能引起成像上的改變，并主要表現(xiàn)在T1成像上的正性信號(hào)增強(qiáng)以及T2成像上的負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)。為了考察該產(chǎn)品的增強(qiáng)造影效果，本發(fā)明對(duì)一系列不同濃度的SUSPIO溶膠，進(jìn)行體外成像效果的檢測(cè)，結(jié)果顯示Gd-DTPA能引起T1像上的正性信號(hào)增強(qiáng)，濃度為10-3M時(shí)增強(qiáng)效果較好，氧化鐵納米顆粒溶膠對(duì)T1像的影響不大，大劑量會(huì)引起負(fù)性增強(qiáng)；氧化鐵納米顆粒溶膠和Gd-DTPA均能引起T2像上的負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)。我們制備的產(chǎn)品在濃度為10-3M時(shí)就能顯著引起T2像的負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)。
為證明SUSPIO是否具有引起T2W成像負(fù)信號(hào)增強(qiáng)的功能我們進(jìn)一步測(cè)定了SUSPIO溶膠和Gd-DTPA水溶液在體外的T2W值成像圖，我們的結(jié)果表明，兩者均能引起T2W像上的負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)，濃度為10-3-10-4M之間增強(qiáng)效果較好，以SUSPIO水溶膠的效果更顯著，同時(shí)我們還測(cè)試了不同濃度SUSPIO在全血中的T1、T2和T2W值成像效能。結(jié)果表明，隨著納米顆粒濃度增加，信號(hào)強(qiáng)度均有減弱的趨勢(shì)，尤其是在T2和T2W值成像圖上的負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)更為明顯。并且，濃度為5×10-4M時(shí)就能引起一定的信號(hào)改變，當(dāng)濃度為1×10-3M時(shí)能引起T2像上極其顯著的負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了我們研制USPIO在T2W成像應(yīng)用上的可能性。


圖1是氧化鐵納米顆粒X-射線衍射圖譜圖2是氧化鐵納米顆粒的傅立葉變換紅外光譜3是氧化鐵納米顆粒的磁滯洄線圖4是SMMC-7721和HL7702兩種細(xì)胞分別暴露在不同濃度的造影劑下的相對(duì)細(xì)胞活性，設(shè)置對(duì)照的細(xì)胞活性為100
圖5是NMR/MRI系統(tǒng)(0.3T)測(cè)量濃度為0.1mM的氧化鐵納米顆粒溶膠的信號(hào)曲線(測(cè)量溫度23℃)圖6是不同濃度SUSPIO水溶膠和Gd-DTPA水溶液在體外的T1和T2值成像7是不同濃度氧化鐵納米顆粒溶膠和Gd-DTPA溶液的體外成像8是顯示正常wistar大鼠在注射SUSPIO前(A)和注射SUSPIO(0.18mmolFe/kg體重)40min后(B)的肝T2W掃描圖像。圖中顯示SUSPIO在TW2條件下大鼠整個(gè)肝臟的背景信號(hào)降低，表現(xiàn)為“黑肝”現(xiàn)象。
圖9是顯示肝癌大鼠模型(6號(hào))MRI檢查24小時(shí)后病理解剖圖及在無(wú)造影劑、Gd-DTPA和SUSPIO三種情況下T 1和TW2掃描圖象。結(jié)果顯示，在不使用造影劑的情況下，通過(guò)肝臟T1像和T2像掃描圖像我們還是可以分辨出比較大的肝占位性病變。病變組織在肝臟T1像中呈稍低信號(hào)分布，在T2像掃描圖像中呈稍高信號(hào)分布。
具體實(shí)施例方式
肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑的制備方法分別稱取FeCl3和FeCl2溶解在2M的鹽酸中，終濃度分別為1M和2M。兩者按一定比例混合均勻，加入適量的甜菜堿有機(jī)小分子表面活性劑，振蕩3min溶解。然后慢慢滴加3MNaOH，直至pH達(dá)到11左右，劇烈持續(xù)振蕩5min，使氧化鐵納米顆粒均勻形成。接著慢慢滴加2M HCl，直至pH達(dá)到4左右，繼續(xù)振蕩5min，使甜菜堿有機(jī)小分子能充分包被氧化鐵顆粒。產(chǎn)生的黑色沉淀經(jīng)永久磁鐵分離，除去上清以及無(wú)磁性物質(zhì)，沉淀用6ml蒸餾水溶解。溶解液經(jīng)3500rpm離心5min后，透析除去所有其他雜質(zhì)，包括小分子鹽類、未包被的有機(jī)小分子等。這一步一部分產(chǎn)物用于繼續(xù)純化，另一部分真空干燥(50～60℃)后用于XRD分析。進(jìn)一步純化過(guò)程如下上述步驟得到的溶液經(jīng)高速離心(10,000rpm)10min，除去較大的氧化鐵顆粒，純化產(chǎn)物；經(jīng)過(guò)220nm濾膜過(guò)慮，用于TEM觀察、FT-IR分析、VSM測(cè)試、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)外MRI實(shí)驗(yàn)。
為了證明制備的USPIO是否具有良好的造影劑效果以及對(duì)肝臟病變的診斷效果，我們對(duì)大鼠模型進(jìn)行了磁共振掃描成像和分析。肝癌大鼠模型由本室建立，并經(jīng)尸檢和病理分析切片和分子生物學(xué)手段等確認(rèn)。掃描參數(shù)控制如下T1成像掃描參數(shù)為回波時(shí)間TE＝9.0ms，重復(fù)時(shí)間TR＝440ms，ET＝0；T2像掃描參數(shù)為回波時(shí)間TE＝69.6ms，重復(fù)時(shí)間TR＝3000.0ms，ET＝17。T1W加權(quán)像掃描參數(shù)為回波時(shí)間TE＝9.0ms，重復(fù)時(shí)間TR＝420ms，ET＝0；T2W加權(quán)像掃描參數(shù)為回波時(shí)間TE＝17ms，重復(fù)時(shí)間TR＝340ms，ET＝0。掃描區(qū)域均為8.0*8.0cm。具體實(shí)驗(yàn)步驟是對(duì)正常大鼠和肝癌大鼠進(jìn)行了SUSPIO定量尾靜脈注射，以相同劑量的釓噴酸葡胺造影劑作為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，40分鐘和24小時(shí)后分別進(jìn)行肝臟磁共振掃描診斷。實(shí)驗(yàn)所用影像診斷儀為高場(chǎng)強(qiáng)1.5T雙梯度核磁共振成像儀(GE公司1.5T TweenSpeed，上海腫瘤醫(yī)院)。
當(dāng)大鼠靜脈注射SUSPIO后，在T2W掃描圖象中肝占位性病變很明顯地顯示出高信號(hào)，而正常肝臟組織則因?yàn)槲樟嗽煊皠┒憩F(xiàn)為極低信號(hào)。而醫(yī)院目前廣泛使用的造影劑Gd-DTPA的造影效果主要表現(xiàn)為在TIW上起正性加強(qiáng)作用，病變組織表現(xiàn)為暗信號(hào)，這能起到一定的輔助診斷作用，但是對(duì)于較小的病變組織，其分辨率還是有待于提高。我們的研究證明，SUSPIO馳豫性強(qiáng)，磁響性高，在較低的濃度(0.1mM)下就能縮短T1和T2值，尤其是能極大地縮短T2值，大幅度降低肝臟背景信號(hào)。根據(jù)病理學(xué)尸檢結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的腫瘤體從1毫米到25毫米都可以用MRI檢查出來(lái)。因而SUSPIO對(duì)肝占位性病變的早期診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
綜上所述，本產(chǎn)品是一種新型網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)肝特異性造影劑，具備作為一種成功的MRI造影劑的基本條件。較之于目前臨床廣泛使用的Gd-DTPA具有更好的效能，且安全性好，診斷時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)肝占位性病變的早期診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，有望成為一種新型肝臟特異性造影劑。
權(quán)利要求
1.一種新型肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑，其特征在于結(jié)構(gòu)式為 其中R1＝CH3，R2＝CH2-COOH。
2.一種新型肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟第一步將溶解在2M的鹽酸中，濃度為1M的FeCl3溶液和濃度為2M的FeCl2溶液均勻混合，然后加入甜菜堿，渦旋振蕩溶解；第二步滴加3M的NaOH，邊加邊震蕩，直至pH達(dá)到11，劇烈振蕩，形成氧化鐵納米均勻顆粒。第三步滴加2M的HCl，邊加邊震蕩，直至pH達(dá)到4，繼續(xù)振蕩，純化得到肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑，并提供了該造影劑的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明改進(jìn)了目前所使用生物大分子包被氧化鐵顆粒的策略，成功利用甜菜堿有機(jī)小分子與氧化鐵制備出直徑為4.6±0.96nm的超超微型順磁性氧化鐵顆粒，本發(fā)明提供的新型肝特異性超超微型順磁性MRI造影劑不僅粒子粒度比USPIO小5倍左右，且具更好的生物安全性、更強(qiáng)的馳豫性和磁響性效能以及更有效的肝占位性病變的早期診斷價(jià)值。較之于目前臨床廣泛使用的Gd－DTPA具有更好的安全性、更強(qiáng)的效能和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可作為一種新型肝臟特異性造影劑。
文檔編號(hào)A61K49/06GK1824331SQ200510111780
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者賴立輝, 陳建照, 張鴻明, 戚艷婷 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)