專(zhuān)利名稱(chēng)：六味地黃多糖的提取工藝及其產(chǎn)品和它的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種六味地黃多糖的提取工藝及其得到的產(chǎn)品和這種產(chǎn)品的應(yīng)用，屬于藥品的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
六味地黃為我國(guó)中藥滋陰補(bǔ)腎的古方名藥，是由熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓共六味中藥組成，該方出自宋代錢(qián)乙所著的《小兒藥證直訣》。宋代名醫(yī)錢(qián)乙，根據(jù)張仲景《金匱要略》中的腎氣(桂附地黃)丸去掉桂枝、附子，留取了地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉六味藥而成。原方主治小兒“五遲”之癥，現(xiàn)廣泛用于腎陰虧虛各種癥候。方用熟地黃滋陰補(bǔ)腎，填津益髓為君藥。山茱萸滋養(yǎng)肝、腎而澀精，山藥補(bǔ)益脾陰而固精，共為臣藥。三藥相配滋補(bǔ)肝、腎、脾之力較全。但以補(bǔ)腎陰為主，補(bǔ)其不足而治本。配伍澤瀉泄腎利濕，并防熟地之滋膩。牡丹皮清瀉肝火，并制山茱萸之酸收。茯苓淡滲脾濕，以助山藥之健運(yùn)，以上三藥為三泄，泄?jié)駶崞狡淦珓僖灾螛?biāo)，均為佐藥。全方配合三補(bǔ)三泄，以補(bǔ)為主。肝、脾、腎三陰并補(bǔ)，以補(bǔ)腎陰為主，相輔相成。滋補(bǔ)而不留邪，降泄而不傷正。組方嚴(yán)謹(jǐn)，是通補(bǔ)開(kāi)合的經(jīng)典名方。被譽(yù)為補(bǔ)腎方藥之祖。經(jīng)過(guò)千年的臨床驗(yàn)證，由于其廣泛而扎實(shí)的療效，成為發(fā)展最穩(wěn)健、用量最大、越用越火的中成藥。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，六味地黃制劑具有調(diào)節(jié)腎功能及內(nèi)分泌系統(tǒng)、提高肌體免疫力和抗衰老作用，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床上主要用于治療腎功能虧損、虛火上炎、腰酸腿痛、牙齒不固、糖尿病及早衰、須發(fā)早白、膚燥面皺、不耐勞乏等癥狀。
其制劑發(fā)展至今，更細(xì)分為湯劑、小蜜丸、大蜜丸、口服液、濃縮丸、硬膠囊與軟膠囊等多種劑型，在臨床上的使用頻率非常高。雖然我國(guó)六味地黃方已有多種劑型，大多采用常規(guī)的提取方法，通過(guò)水煮、醇提或一些簡(jiǎn)單的精制處理，在已有中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?3117152.4)中公開(kāi)的“中藥六味地黃制劑的生產(chǎn)工藝”技術(shù)，只是對(duì)六味地黃中的提取物進(jìn)行精制，沒(méi)有對(duì)其有效成分進(jìn)行有效分離，制劑中帶有大量的無(wú)效物質(zhì)。由于現(xiàn)有制劑的制備工藝落后，缺乏可靠、客觀的質(zhì)量控制指標(biāo)，產(chǎn)品粗糙，質(zhì)量不穩(wěn)，服用劑量大，口感差，沒(méi)有國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
縱觀人們對(duì)于中藥材活性成分與療效的認(rèn)識(shí)，就是伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而臻于全面的；20世紀(jì)中期，人們把多糖當(dāng)作雜質(zhì)看待，因而廣泛地采用水提醇沉法精制中成藥。到20世紀(jì)80、90年代后，人們對(duì)多糖的認(rèn)識(shí)不斷提高，確認(rèn)了不同種類(lèi)、不同分子量的多糖有著不同的藥理活性。六味地黃每一味藥材中都含有多糖，其總含量相當(dāng)原藥材總量的10％以上，是六味地黃眾多作用得以發(fā)揮的主要物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)有研究資料表明，六味地黃的滋陰補(bǔ)腎功能，體現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)造血功能、降血糖、降血脂、抗氧化及抗衰老等眾多的作用，大都是通過(guò)多糖類(lèi)活性物質(zhì)發(fā)揮的。同時(shí)，六味地黃中還含有大量中、小分子物質(zhì)，它們有些能針對(duì)性地對(duì)人體各臟器、各靶點(diǎn)、各功能發(fā)揮治療和調(diào)節(jié)作用，補(bǔ)充和加強(qiáng)了六味地黃的滋陰補(bǔ)腎的效果。有研究證實(shí)，六味地黃中含有32種無(wú)機(jī)元素，其中14種微量元素具有生理活性，這些微量元素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等有預(yù)防作用，對(duì)預(yù)防衰老亦有一定作用。但是，通過(guò)發(fā)明人進(jìn)行的檢索，到目前為止，尚未見(jiàn)到相關(guān)六味地黃多糖提取、應(yīng)用等方面的文獻(xiàn)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種六味地黃多糖的提取工藝及其得到的產(chǎn)品和這種產(chǎn)品的應(yīng)用；目前多糖的提取方法多為水煮醇沉法，該方法對(duì)提取其水煎液中含有的酸性多糖(分子量7300～33000)、寡糖及環(huán)烯萜苷等醇不溶物質(zhì)是很好的方法，但是對(duì)于水煎液中含有的中性多糖及大量的中小分子物質(zhì)來(lái)說(shuō)，這些物質(zhì)能夠溶解于乙醇中，且是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，由于六味地黃水煎液中所含的中性多糖、中小分子物質(zhì)等成分易溶于醇，不溶于水，在醇沉過(guò)程中會(huì)完全丟失這部份活性成分；因此，采用常規(guī)的水煮醇沉提取的六味地黃多糖，其臨床運(yùn)用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于六味地黃方劑原來(lái)固有的臨床價(jià)值；沒(méi)有應(yīng)用的價(jià)值；本發(fā)明為了解決現(xiàn)有提取多糖的不足，保證提取的六味地黃多糖的藥理作用與六味地黃方保持一致性，將六味藥材進(jìn)行合煎，然后用超濾裝置進(jìn)行分離，得到所有包含各種有效成分的六味地黃多糖物質(zhì)，且六味地黃總多糖的含量達(dá)到50％以上，保證六味地黃多糖的療效不受影響。本發(fā)明是這樣構(gòu)成的由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓和牡丹皮組成，按照現(xiàn)行國(guó)家藥典規(guī)定的用量，將熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓和牡丹皮分別粉碎成粗粉，加水浸泡，然后煎煮，合并煎煮液，離心過(guò)濾，得六味地黃提取液，備用；取上述六味地黃提取液，用微濾膜過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用超濾膜過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，備用；取上述六味地黃液出液，用納濾膜過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜下液棄去，膜上液備用；將上述膜上液采用噴霧、冷凍、真空或常溫干燥的方法干燥，粉碎，即得產(chǎn)品。具體的說(shuō)按照重量百分比計(jì)算將熟地黃32％、制山茱萸16％、山藥16％、澤瀉12％g、茯苓12％和牡丹皮12％分別粉碎成粗粉，加水浸泡12小時(shí)，煎煮2次，每次2小時(shí)，合并煎煮液，離心過(guò)濾，得六味地黃提取液，備用；取上述六味地黃提取液，用裝有3μm～0.5μm微濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用裝有能切割15萬(wàn)～1000分子量超濾膜的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，流出液備用；取上述六味地黃流出液，用裝有能切割100～300分子量的納濾膜的納濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜下液棄去，膜上液備用；將上述膜上液采用噴霧、冷凍、真空或常溫干燥的方法干燥，粉碎，即得。準(zhǔn)確的說(shuō)將熟地黃32公斤、制山茱萸16公斤、山藥16公斤、澤瀉12公斤、茯苓12公斤和牡丹皮12公斤分別粉碎成粗粉，加水浸泡12小時(shí)，煎煮2次，每次2小時(shí)，合并煎煮液，離心過(guò)濾，得六味地黃提取液，備用；取上述六味地黃提取液，用裝有3μm微濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取通過(guò)3μm微濾膜的六味地黃膜下液，用裝有0.5μm微濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取通過(guò)0.5μm微濾膜的六味地黃膜下液，用裝有能切割8萬(wàn)分子量的超濾膜的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；將上述膜下液用D101型、DA201型、D-型、SIP系列、X-5型、AB-8型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD-40型、DM-130型、R-A型、CHA-111型、WLD型(混合型)、H107型、NKA-9型大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，流出液備用；取上述六味地黃流出液，用裝有能切割150分子量的納濾膜的納濾器分別過(guò)濾，將經(jīng)過(guò)納濾器過(guò)濾的膜上液與膜下液分離，膜下液棄去，將上述六味地黃膜上液，采用噴霧、冷凍、真空或常溫干燥的方法干燥，粉碎，即可。利用上述方法制備得到的六味地黃多糖，可以應(yīng)用在臨床上治療糖尿病、改善糖耐量、降血脂、提高免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)、延緩衰老、抗疲勞、抗腫瘤以及用于治療腎陰虧損，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴。常規(guī)方法是指公開(kāi)的技術(shù)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)載明的、藥學(xué)專(zhuān)業(yè)教科書(shū)中或該領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員可以查閱、實(shí)施的方法。
采用本發(fā)明提取的六味地黃多糖，是在繼承和發(fā)揚(yáng)祖國(guó)中醫(yī)傳統(tǒng)理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的最新研究成果，采用六味藥材合煎，還原了湯劑的原始方法，保證六味地黃多糖的療效，選用高分子材料，通過(guò)物理方法進(jìn)行精制，以保證六味地黃多糖提取的最大化，經(jīng)測(cè)試，六味地黃多糖的含量在50％以上。六味地黃多糖中含有的多糖成份包括六味地黃多糖CA4、地黃寡糖、地黃多糖RPS-a、b、地黃低聚糖(RGOS)、山茱萸多糖、水溶性多糖Co4、β-茯苓聚糖、茯苓次聚糖、甘露聚糖、山藥多糖RDPS-I、巖藻糖、山茱萸多糖山茱萸多糖PFCC I、山茱萸多糖SZYP-2、山茱萸多糖PFCAIII等；六味地黃多糖中尚含有32種無(wú)機(jī)元素，其中14種微量元素具有生理活。 微量元素測(cè)定一覽表 序號(hào)元素原藥粉浸膏粉文獻(xiàn)報(bào)道1Li(鋰)--+2Be(鈹)+++3Na(鈉)+++4Mg(鎂)+++5Al(鋁)+++6P(磷)+++7S(硫)+++8K(鉀)+++9Ca(鈣)+++10Sc(鈧)--+11Ti(鈦)+++12V(釩)+++13Cr(鉻)+++14Mn(錳)+++15Fe(鐵)+++16Co(鈷)+++17Ni(鎳)+++18Cu(銅)+++19Zn(鋅)+++20Ga(鎵)++-21Ge(鍺)---22As(砷)++-23Br(溴)++-24Se(硒)+++25Sr(鍶)++-26Y(釔)--+27Zr(鋯)++-28Mo(鉬)+++29Ag(銀)++-30Cd(鎘)++-31In(銦)---32Cs(銫)++-33Ba(鋇)+++34La(鑭)+++35Ce(鈰)+++36Sm(釤)++-37Eu(銪)++-38Yb(鐿)+++39Lu(镥)++-40W(鎢)++-41Hg(汞)++-42Tl(鉈)++-43Pb(鉛)+++44Bi(鉍)---45Th(釷)+++46U(鈾)++- 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的制備工藝能有效的將六味地黃藥材里的有效成分提取出來(lái)，方法簡(jiǎn)單、合理，成本低廉；能夠?yàn)槠髽I(yè)所接受；得到的產(chǎn)品經(jīng)驗(yàn)證為六味地黃多糖產(chǎn)品；含有治療相關(guān)疾病需要的多種有效成分。
為了證實(shí)六味地黃多糖的藥理作用，發(fā)明人進(jìn)行了有關(guān)的藥理及毒理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下 六味地黃多糖主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 I、摘要 六味地黃多糖是中藥新藥，通過(guò)對(duì)六味地黃多糖的一系列的藥效學(xué)試驗(yàn)研究結(jié)果證明 1、六味地黃多糖1.04、0.52、0.26g/kg ig 4周與8周對(duì)高血糖模型大鼠有明顯降低空腹血糖作用，改善糖耐量，并有抑制肥胖大鼠膽固醇與甘油三酯升高的趨勢(shì)，提示該藥對(duì)于高血脂、高甘油三酯有預(yù)防作用。
2、六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
3、六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周對(duì)體外抗體形成細(xì)胞有促進(jìn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。
4、六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周對(duì)正常小鼠白細(xì)胞介素-2的生成有明顯的促進(jìn)作用趨勢(shì)，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
5、六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 10天，對(duì)冷刺激模型小鼠，各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物大腦皮層中NE、5-HT含量與模型組相比較，有升高趨勢(shì)，其中，六味地黃多糖中劑量組NE、5-HT含量，陽(yáng)性組5-HT含量與模型組相比較有顯著差異(P＜0.05)，各試驗(yàn)組大腦皮層中DA含量與模型組相比較，無(wú)明顯差異；六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物腦干中NE、DA、5-HT含量與模型組相比較，有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖三個(gè)劑量組DA含量與模型組相比較有顯著差異(P＜0.05)。
6、六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig單次給藥六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物游泳時(shí)間對(duì)照組相比較有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖高劑量組與對(duì)照組相比較有顯著性差異(P＜0.05)，其它各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；多次給藥六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物游泳時(shí)間與對(duì)照組相比較有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖中劑量組與對(duì)照組相比較有顯著性差異，其它各組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
II、試驗(yàn)?zāi)康挠^察中藥六味地黃多糖對(duì)大鼠高血糖模型動(dòng)物的降糖作用以及對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響。
一、六味地黃多糖對(duì)化學(xué)性糖尿病大鼠的降血糖作用 (一)試驗(yàn)材料 1、藥品與試劑 六味地黃多糖由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每克浸膏相當(dāng)于生藥2.13克， 六味地黃膠囊貴州康納圣方藥業(yè)有限公司。試驗(yàn)時(shí)將藥物用蒸餾水配成所需濃度。
鏈尿霉素(strepiozotocin，簡(jiǎn)稱(chēng)SZ)為美國(guó)sigma化學(xué)公司產(chǎn)品。用時(shí)溶于0.1M PH4.4枸櫞緩沖液中。
血糖(GLU)、總膽固醇(TC)和甘油三脂(TRIG)試劑盒。
2、動(dòng)物及飼料 wistar大鼠，200g-500g，B2-型大鼠飼料籠具，蘇州吳縣楓橋輻射制品廠產(chǎn)；顆粒鼠飼料。
3、儀器 離心沉淀機(jī)LXJ-II型，上海第二分析儀器廠產(chǎn)； Lab-500型全自動(dòng)生化分析儀，由南京桃園應(yīng)用生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
(二)試驗(yàn)方法及結(jié)果 選體重200g-500g的健康wistar大鼠，雌雄兼用，分為正常(10只)和高血糖模型組。高血糖模型組大鼠禁飼24h后按30mg/kg尾靜脈i.v新鮮配制的SZ。兩周后取血(取血前禁飼12h)，分離血清，酶法測(cè)血糖。后選血糖值在13.95-26.82mmol/l的50只動(dòng)物進(jìn)入試驗(yàn)。高血糖模型動(dòng)物按血糖水平隨機(jī)分為5組六味地黃多糖高、中、低劑量組；陽(yáng)性組和模型組。分別ig給予配制好的藥液，分別相當(dāng)于六味地黃多糖藥粉1.04、0.52、0.26g/kg六味地黃膠囊0.23g/kg，自來(lái)水、給藥容積為1ml/100g，正常組給予自來(lái)水，容積為1ml/100g，同時(shí)，六味地黃多糖高、中低劑量組；陽(yáng)性組和模型組這五組動(dòng)物自給藥起加喂高脂高糖半合成高熱量飼料(蛋白質(zhì)15％、蔗糖52％，脂肪25％及適量混合鹽、維生素及纖維素等，熱量為21.33/g)，給藥時(shí)間為8周。
分別于給藥4周和8周時(shí)，禁飼10h后尾靜脈取血，取血離心后取血清測(cè)定血糖、膽固醇、甘油三脂；取血后按照2g/kg i.p給予各組動(dòng)物葡萄糖溶液，給予葡萄糖溶液后1h與2h，再次尾靜脈取血，離心后取血清測(cè)定血糖。
結(jié)果1、對(duì)高血糖模型大鼠的血糖及耐糖量的影響 六味地黃多糖藥粉1.04、0.52、0.26g/kg及六味地黃膠囊0.23g/kg ig給藥4周，可明顯降低高血糖模型大鼠的空腹血糧值。與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，可明顯降低給予葡萄糖后1h與2h的血糖值，與模型組比較，六味地黃多糖1.25g/kg組與陽(yáng)性組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
六味地黃多糖1.04、0.26g/kg組有降低趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見(jiàn)表1) 表1 給藥后四周對(duì)空腹血糖含量及糖耐量的影響(X±SD)劑量組別 (g/kg)2h 動(dòng)物數(shù) (只) 藥前血糖 (mmol/L) 藥后四周血糖(mmol/L) 空腹 1h 1.0419.75±2.41六味地黃多糖組0.5216.80±1.85* 0.2618.27±3.16陽(yáng)性組 0.2317.24±3.50*模型組 /21.55±4.86**正常組 /21.55±4.86**10 10 10 10 10 10 18.74+3.15 18.45±2.57 18.62±2.91 18.30±3.02 18.62+3.21 7.19±0.67 15.14+2.27* 19.25+2.31 14.49±1.58** 18.87±2.08* 15.68±2.98*20.00±3.70 15.03±3.36*19.04+3.10 18.77±3.34**23.14±5.23** 7.49±0.7423.14±5.23** *vs模型組 *P＜0.05 **P＜0.01 模型組vs正常組 P＜0.01 六味地黃多糖1.04、0.52、0.26g/kg及六味地黃膠囊0.23g/kg ig給藥8周，可明顯降低化學(xué)性糖尿病模型大鼠的空腹血糖值，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；可明顯降低給予血糖后1h與2h的血糖值，與模型組比較六味地黃多糖0.52g/kg組與陽(yáng)性組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，六味地黃多糖1.04、0.26g/kg組有降低趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見(jiàn)表2) 表2 給藥后八周對(duì)空腹血糖含量及糖耐量的影響(X±SD) 組別劑量 (g/kg)動(dòng)物數(shù)藥前血糖 藥后八周血糖(mmol/L)(只) (mmol/L) 空腹 1h 2h藥物組陽(yáng)性組模型組正常組 1.04 0.52 0.26 0.23 / /10 18.74±3.15 16.01±2.62* 20.39±202518.65±2.2210 18.45±2.57 15 58±2.01** 19.28±2.39* 17.64±2.05*10 18.62±2.91 16.71±2.94* 20.27±3.2019.12±3.0610 18 30±3.02 16.03±3.17* 19.78±3.18* 18.27±2.81*10 18.62±3.21 19.46±2.91** 23.05±3.37** 21.24±3.32**10 7.19±0.67 7.45±0.80 9.31±0.71 8.20±0.60 *vs模型組 *P＜0.05 **P＜0.01 模型組vs正常組 P＜0.01 2、對(duì)膽固醇與甘油三脂含量的影響 藥后四周，六味地黃多糖各劑量組與陽(yáng)性組膽固醇與甘油三脂相比于模型組明顯有降低趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見(jiàn)表3)表3 藥后四周對(duì)膽固醇與甘油三脂含量的影響(X±SD)組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù) (只) 膽固醇 (mmol/L) 甘油三脂 (mmol/L) 藥物組 陽(yáng)性組 模型組 正常組 1.04 0.52 0.26 0.23 / / 10 10 10 10 10 104.55±1.524.25±1.294.72±1.814.19±1.425.35±1.91**1.75±0.423.86±2.254.07±1.914.26±1.684.33±1.685.49±2.36**1.26±0.47 **模型組vs正常組 P＜0.01 藥后八周，六味地黃多糖各劑量組與陽(yáng)性組膽固醇與甘油三脂相比于模型組明顯有降低趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見(jiàn)表4)表4 藥后八周對(duì)膽固醇與甘油三脂含量的影響(X±SD)組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù) (只) 膽固醇 (mmol/L) 甘油三脂 (mmol/L)藥物組陽(yáng)性組模型組正常組 1.04 0.52 0.26 0.23 / /10101010101077±1.724.62±1.824.96±1.944.86±1.486.62±2.47**1.84±0.534.19±2.133.94±1.684.52±1.854.29±1.965.74±2.68**1.44±0.52 **模型組vs正常組 **P＜0.01 二、六味地黃多糖對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響 實(shí)驗(yàn)一藥物對(duì)小鼠巨噬功能的影響 (一)試驗(yàn)材料 1、藥品與試劑 六味地黃多糖由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每克浸膏相當(dāng)于生藥2.13克；六味地黃膠囊貴州康納圣方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)時(shí)將藥物用蒸餾水配成所需濃度。
白色念珠菌懸液試驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)，配制成1×107個(gè)/ml細(xì)菌懸液。
6％高溫滅菌淀粉，Hanks液(含5％小牛血清) 0.03％亞甲藍(lán)(4℃存放)、華氏管、吸量管。
2、動(dòng)物 動(dòng)物昆明種小鼠50只，體重18-22g，雌雄兼用，試驗(yàn)開(kāi)始前預(yù)飼養(yǎng)三天。
(二)試驗(yàn)方法及結(jié)果 取健康小鼠50只，體重18-22g，隨機(jī)分為五組六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg給藥組，0.33g/kg六味地黃膠囊陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。各組均連續(xù)ig給藥2周，對(duì)照組給予自來(lái)水，給藥體積0.2ml/10克。于末次藥前三天i.p高溫滅菌淀粉溶液1ml/只，末次藥后依照吞噬細(xì)胞的吞噬試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以吞噬率(吞噬百分率＝200個(gè)M○內(nèi)發(fā)生吞噬的M○數(shù)/200*100％)和吞噬指數(shù)(吞噬指數(shù)＝發(fā)生吞噬的100個(gè)M○內(nèi)所吞入白色念珠菌總數(shù)/100)表示。
結(jié)果六味地黃多糖高、中劑量組吞噬百分率與吞噬指數(shù)、陽(yáng)性組吞噬指數(shù)明顯高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比較有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，六味地黃多糖低劑量組與對(duì)照組相比較無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 六味地黃多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(X±SD) 組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù)(只) 吞噬百分率 (％) 吞噬指數(shù) 藥物組 陽(yáng)性組 對(duì)照組 1.48 0.74 0.37 0.33 /10101010100.53±0.11**0.44±0.17**0.26±0.110.33±0.06**0.15±0.093.05±0.74**2.77±1.09**1.88±0.841.58±0.431.55±0.37 對(duì)照組**P＜0.01 實(shí)驗(yàn)二藥物對(duì)體外抗體開(kāi)成細(xì)胞及脾臟系數(shù)的影響 (一)試驗(yàn)材料 1、藥品與試劑 六味地黃多糖由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每克浸膏相當(dāng)于生藥2.13克；六味地黃膠囊貴州康納圣方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)時(shí)將藥物用蒸餾水配成所需濃度。
20％綿羊紅細(xì)胞懸液。
補(bǔ)體取新鮮豚鼠血清(用之前經(jīng)綿羊紅細(xì)胞吸收，1ml壓積羊紅細(xì)胞加20ml補(bǔ)體，置4℃20min，離心取上清，置冰箱備用)。
瓊脂用hanks液配制，表層基0.7％，底層基1.4％。
胎牛血清經(jīng)56℃30min，滅活。
2、動(dòng)物 動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄兼用，試驗(yàn)開(kāi)始前預(yù)飼養(yǎng)三天。
(二)試驗(yàn)方法及結(jié)果 取健康小鼠50只，體重18-22g，隨機(jī)分為五組六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg給藥組，0.33g/kg六味地黃膠囊陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。各組均連續(xù)ig給藥2周，對(duì)照組給予自來(lái)水，給藥體積0.2ml/10克。于試驗(yàn)前四天i.p10％SRBC0.2ml/只，四天后，末次藥后1h將動(dòng)物脫臼處死，計(jì)算脾臟系數(shù)，后依照溶血空斑試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)試。
結(jié)果六味地黃多糖中、低劑量組OD值有升高趨勢(shì)，與對(duì)照組相比較明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，六味地黃多糖高劑量組、陽(yáng)性組OD與對(duì)照組基本一致。各組動(dòng)物脾臟系數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異結(jié)果見(jiàn)表6。 表6 六味地黃多糖對(duì)體外抗體開(kāi)成細(xì)胞及脾臟系數(shù)的影響(X±SD) 組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù) (只) 脾臟系數(shù)(％) OD值(吸光度/413nm，1∶1稀釋)藥物組陽(yáng)性組對(duì)照組 1.48 0.74 0.37 0.33 /10101010100.56±0.150.76±0.160.65±0.110.68±0.150.64±0.101.45±0.231.57±0.411.57±0.401 48±0.201.48±0.32 vs對(duì)照組**P＜0.01 試驗(yàn)三藥物對(duì)正常小鼠白細(xì)胞介素-2的影響 (一)試驗(yàn)材料 1、藥品與試劑 六味地黃多糖由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每克浸膏相當(dāng)于生藥2.13克；六味地黃膠囊貴州康納圣方藥業(yè)有限公司。試驗(yàn)時(shí)將藥物用蒸餾水配成所需濃度。
ELISA Mouse IL-2. 2、動(dòng)物 動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄兼用，試驗(yàn)開(kāi)始前預(yù)飼養(yǎng)三天。
3、儀器 96孔培養(yǎng)板。酶標(biāo)檢測(cè)儀，型號(hào)MK3，芬蘭產(chǎn)。
(二)試驗(yàn)方法及結(jié)果 取健康小鼠50只，體重18-22g，隨機(jī)分為五組六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg給藥組，0.33g/kg六味地黃膠囊陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。各組均連續(xù)ig給藥4周，對(duì)照組給予自來(lái)水，給藥體積0.2ml/10克。給藥結(jié)束后，摘眼球處死取血處死小鼠。血液置4℃靜置1小時(shí)。4000rpm離心5min，取上層血清，-20℃保存?zhèn)溆?。依照晶美生物工程有限公司ELISA Mouse IL-2試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定藥物對(duì)正常小鼠白細(xì)胞介素-2的影響，結(jié)果以O(shè)D值表示，取兩次OD平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
結(jié)果六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)生組OD值有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖各劑量組OD值有劑量正向關(guān)系，現(xiàn)對(duì)照組相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 六味地黃多糖對(duì)正常小鼠白細(xì)胞介素-2的影響(X±SD) 組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù) (只)兩次OD平均值藥物組陽(yáng)性組對(duì)照組1.480.740.370.33/10101010100.057±0.0020.056±0.0030.055±0.0020.055±0.0040.054±0.003 試驗(yàn)四藥物對(duì)冷刺激小鼠胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)以及腦內(nèi)遞質(zhì)含量的影響 (一)試驗(yàn)材料 1、藥品與試劑 六味地黃多糖由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每克浸膏相當(dāng)于生藥2.13克；六味地黃膠囊貴州康納圣方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)時(shí)將藥物用蒸餾水配成所需濃度。
多巴胺，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品； 去甲腎上腺素、5-羥色胺，sigama公司產(chǎn)品； L-半胱氨酸，上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品； 乙酸鈉，默克爾精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品； 檸檬酸、高氯酸、半胱氨酸、辛烷基磺酸鈉、EDTA、磷酸氫二鉀、爾正丁胺和檸檬酸鉀，均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2、動(dòng)物 動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄兼用，試驗(yàn)開(kāi)始前預(yù)飼養(yǎng)三天。
3、儀器 600-717-2465高效液相色譜儀，美國(guó)waters公司產(chǎn)品，eprendorf低溫離心機(jī)，德國(guó)出產(chǎn)； (二)試驗(yàn)方法及結(jié)果 取健康小鼠50只，體重18-22g，隨機(jī)分為五組六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg給藥組，0.33g/kg六味地黃膠囊陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。各組均連續(xù)ig給藥10d，模型對(duì)照組給予自來(lái)水，給藥體積0.2ml/10g。給藥期間，除去空白對(duì)照組動(dòng)物，其余五組動(dòng)物每天強(qiáng)迫其在溫度為10℃左右的冷水中游泳5min，給藥1h后，稱(chēng)重后脫臼處死動(dòng)物，解剖分離胸腺、脾臟，稱(chēng)重，計(jì)算胸腺系數(shù)；在冰面解剖取出大腦皮層與腦干，稱(chēng)重后迅速存于液氮容器之中，送檢測(cè)定多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)等神經(jīng)遞質(zhì)含量。
結(jié)果六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)與模型組相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)表8 表8 六味地黃多糖對(duì)冷刺激小鼠胸腺系數(shù)與脾臟系數(shù)的影響(X±SD) 組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù) (只)胸腺系數(shù)(g/g*100)脾臟系數(shù)(g/g*100)藥物組陽(yáng)性組模型組對(duì)照組 1.48 0.74 0.37 0.33 / /101010101010 0.29±0.12 0.28±0.08 0.27±0.10 0.29±0.08 0.27±0.11 0.32±0.10 0.67±0.11 0.64±0.11 0.59±0.16 0.70±0.14 0.72±0.26 0.74±0.10 六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物大腦皮層中NE、5-HT含量與模型級(jí)相比較，有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖中劑量組NE、5-HT含量，陽(yáng)性組5-HT含量與模型組相比較有顯著差異(P＜0.05)，各試驗(yàn)組大腦皮層中DA含量與模型組相比較，無(wú)明顯差異，結(jié)果見(jiàn)表9。表9 六味地黃多糖對(duì)冷刺激小鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響(X±SD) 組別 劑量 (g/kg)動(dòng)物數(shù) NEDA 5-HT(只) (ng/g)(ng/g)(ng/g)藥物組陽(yáng)性組模型組對(duì)照組 1.48 0.74 0.37 0.33 / /1096.07±20.69944.19±152.56357.44±77.0410121.56±30.98* 768.27±185.46506.10±195.93*1093.99±21.70714.96±194.51419.57±188.1010100.90±24.08 751.52±201.17447.33±117.65*1088.84±33.41749.84±214.91312.45±133.701096.30±22.97703.10±214.80357.68±143.77 *模型 *p＜0.05 六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物大腦皮層中NE、5-HT含量與模型級(jí)相比較，有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖三個(gè)劑量組DA含量與模型組想比較有顯著差異(p＜0.05)，六味地黃多糖高劑量組動(dòng)物腦干中5-HT含量與與模型組相比較有顯著差異(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表10。 表10 六味地黃多糖對(duì)冷刺激小鼠腦腦干中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響(X±SD) 組別 劑量 (g/kg) 動(dòng)物數(shù) (只)NE (ng/g)DA (ng/g)5-HT (ng/g)藥物組陽(yáng)性組模型組對(duì)照組1.480.740.370.33//101010101010 146.63±42.11 139.06±50.22 148.18±29.00 152.64±55.11 121.92±41.01 117.17±36.57 255.20±67.71* 258.70±80.69* 263.98±80.14* 225.33±36.82 199.97±37.99 191.11±26.61 234.60±74.66* 216.53±102.95* 202.56±71.96 201.94±77.33 172.60±30.18 142.11±44.98 *vs模型組 *p＜0.05 試驗(yàn)五單次給藥和多次給藥對(duì)正常小鼠冷水中游泳時(shí)間的影響 試驗(yàn)材料 1、藥品與試劑 六味地黃多糖由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每克浸膏相當(dāng)于生藥2.13克；六味地黃膠囊貴州康納圣方藥業(yè)有限公司，試驗(yàn)時(shí)將藥物用蒸餾水配成所需濃度。
2、動(dòng)物 動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄兼用，試驗(yàn)開(kāi)始前預(yù)飼養(yǎng)三天。
試驗(yàn)方法及結(jié)果 取健康小鼠100只，18-22g，隨機(jī)分為10組；單次給藥和多次給藥(10d)各5組，劑量為六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg六味地黃膠囊陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。給藥體積均為0.2ml/10g/d，空白對(duì)照組動(dòng)物給予自來(lái)水，單次給藥動(dòng)物于藥后1h后，稱(chēng)重，根據(jù)體重不同在小鼠尾部系重量為其體重10％的墜物，將各組動(dòng)物放入冷水(15度)中測(cè)試游泳時(shí)間，以小鼠全身沒(méi)入水面下10sec計(jì)時(shí)截至?xí)r間； 結(jié)果單次給藥六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物游泳時(shí)間與對(duì)照組相比較有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖高劑量組與對(duì)照組相比較有顯著差異(p＜0.05)，其它各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，多次給藥六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物游泳時(shí)間與對(duì)照組比較有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖中劑量組與對(duì)照組與與對(duì)照組相比較有顯著性差異，其它各組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表11。 表11 六味地黃多糖對(duì)正常小鼠在冷水中游泳時(shí)間的影響(X+SD) 組別 劑量 動(dòng)物數(shù) 游泳時(shí)間 (g/kg) (只)單次給藥 多次給藥1.4810237.71+99.71*244.57+87.26六味地黃多糖0.7410185.69+66.26290.07+100.41*0.3710163.83+44.19255.50+91.66陽(yáng)性組0.3310188.92+63.00223.46+103.80對(duì)照組/10150.17+62.46201.58+81.43 *vs對(duì)照組 *P＜0.06 四、結(jié)論 六味地黃多糖1.04、0.52、0.26g/kg ig 4周與8周對(duì)高血糖模型大鼠有明顯降低空腹血糖作用，改善糖耐量，并有抑制肥胖大鼠膽固醇與甘油三酯升高的趨勢(shì)，提示該藥對(duì)于高血脂、高甘油三脂有預(yù)防作用。
六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周對(duì)體外抗體形成細(xì)胞有促進(jìn)增長(zhǎng)的趨勢(shì) 六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周對(duì)正常小鼠白細(xì)胞介素-2的生成有明顯的促進(jìn)作用趨勢(shì)，與對(duì)照組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig10天，對(duì)冷刺激模型小鼠，各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物大腦皮層中NE、5-HT含量與模型組相比較有顯著差異(p＜0.05)，各試驗(yàn)組大腦皮層中DA含量與模型組相比較，無(wú)明顯差異；六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物腦干中NE、DA、5-HT含量與模型組相比較，有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖三個(gè)劑量組DA含量與模型組相比較有顯著差異(p＜0.05) 六味地黃多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig單次給藥六味地黃多糖劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物游泳時(shí)間與對(duì)照組相比較有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖高劑量組與對(duì)照組相比較有顯著性差異(p＜0.05)，其它各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；多次給藥六味地黃多糖各劑量組以及陽(yáng)性組動(dòng)物游泳時(shí)間與對(duì)照組相比較有升高趨勢(shì)，其中六味地黃多糖中劑量組與對(duì)照組相比較有顯著性差異，其它各組未風(fēng)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
六味地黃多糖大鼠長(zhǎng)期毒性研究 一、摘要 本申請(qǐng)人試驗(yàn)研究了六味地黃多糖26wk ig大鼠的長(zhǎng)期毒性。取健康wistar大鼠160只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為六味地黃多糖對(duì)照組(veh)、低劑量組(8.5g/kg/d)、中劑量組(25.5g/kg/d)和高劑量組(76.5g/kg/d)，連續(xù)ig大鼠26wk，每周給藥6d，每天觀察動(dòng)物的外觀和一般行為變化，并于給藥13wk、26wk及停藥4wk將各組部份動(dòng)物代謝籠收集尿液，檢查尿常規(guī)，然后腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)、血清塵化指標(biāo)和血液指標(biāo)的測(cè)定，最后將動(dòng)物剖檢并取臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果 (1)六味地黃多糖8.5g\kg/d，連續(xù)ig大鼠26wk及停藥4wk，動(dòng)物外觀和一般行為基本正常。體重增長(zhǎng)，尿常規(guī)、血液學(xué)、血清生化檢測(cè)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)異常。
(2)六味地黃多糖2.5g/kg/d連續(xù)ig大鼠26wk及停藥4wk，動(dòng)物外觀和一般行為基本正常。體重增長(zhǎng)，尿常規(guī)、血液學(xué)、血清生化檢測(cè)、凝血指標(biāo)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)異常。
(3)高劑量組(76.5g/kg/d)部分動(dòng)物給藥第2-4wk出現(xiàn)藥前流涎和給藥時(shí)掙扎、吐藥，藥后活動(dòng)減少，行為邋遢，后漸恢復(fù)。動(dòng)物藥后體重增長(zhǎng)，飲食基本正常，與對(duì)照組情況基本一致。給藥13wk后高劑量級(jí)動(dòng)物紅細(xì)包明顯小于對(duì)照組，與對(duì)照組相比較，有極顯著性差異(p＜0.01)，其余各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)現(xiàn)對(duì)照組比較，差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥26wk各組各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組相比，未見(jiàn)明顯異常。體重增長(zhǎng)，尿常規(guī)、血液學(xué)、血清生化檢測(cè)、凝血指標(biāo)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)異常。
本試驗(yàn)證明，本品主要肉眼所能觀察到的中毒癥狀為給藥2-4wk藥后活動(dòng)減少，給藥13wk高劑量對(duì)紅細(xì)胞造成顯著影響。安全用藥劑量為25.5g/kg/d，其確實(shí)中毒劑量為76.5g/kg/d。分別約為臨床用藥劑量的345、1035倍。
二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 觀察連續(xù)26wk重復(fù)ig給予六味地黃多糖對(duì)大鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，確定無(wú)毒反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。
三、實(shí)驗(yàn)材料 1、受驗(yàn)物六味地黃多糖浸膏，由北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，每毫升相當(dāng)于2.556克藥粉。
2、試劑血液生化測(cè)定試劑盒堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Crea)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(T.BILI)、總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供，總膽固醇(TC)出溫州東甌生物工程有限公司提供。全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀試劑由美國(guó)BioChem ImmunoSystem公司提供。尿八聯(lián)試紙，由高爾寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20031008?；罨糠帜畲紩r(shí)間(APTT-LHO11)、凝血酶原時(shí)間(PT-N39)和凝血酶時(shí)間(TT-25006)試劑盒均出上海生物技術(shù)公司，上海太陽(yáng)醫(yī)療器械有限公司提供。
3、儀器全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀，型號(hào)MEK-6318K，日本光電株式會(huì)社生產(chǎn)。Lab-500型全自動(dòng)生化分析儀，由南京桃園應(yīng)用生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。C2000-4型血凝儀。由北京普利生儀器公司生產(chǎn)。B2型大鼠飼料籠具，蘇州楓橋輻身制品廠產(chǎn)。
4、動(dòng)物及飼料雄性Wistar大鼠，顆粒鼠飼料。
四、方法 1、動(dòng)物飼養(yǎng)4-6周齡健康雄性大鼠挑選后，首先預(yù)飼養(yǎng)1wk，用于實(shí)驗(yàn)時(shí)體重為100g左右，每籠5只，供給充足的水和飼料，保持室溫20-25℃，濕度55-65％。
2、試驗(yàn)周期、劑量、分組和給藥方法六味地黃多糖人用劑量為4.4g藥粉/d，以人體重60kg計(jì)，人用劑量為0.074g藥粉/d。小鼠一日口服最大給藥量為230.1g藥粉/kg。按藥品注冊(cè)管理辦法的要求，確定用藥周期26wk，設(shè)六味地黃多糖高劑量組(76.5g藥粉/kg/d)、中劑量組(25.5g藥粉/kg/d)、低劑量組(8.5g藥粉/kg/d)和對(duì)照組(給予空白溶劑)。每天兩次上午兩次上午8:30、下午4:30ig給藥，高劑量動(dòng)物原液給予，其它各組藥物用水等比稀釋?zhuān)看谓o藥溶積為1.5ml/100g，對(duì)照組ig等溶量溶劑。
3、檢查項(xiàng)目及方法 (1)一般癥狀及死亡情況給藥期間每天定時(shí)觀察動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)和飲食情況，記錄癥狀變化，發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重中毒反應(yīng)的動(dòng)物取出單籠飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物及時(shí)尸檢。
(2)體重測(cè)定給藥及停藥期間每周測(cè)定體重，現(xiàn)藥前比較求出體重增減值。
(3)尿常規(guī)檢查于給藥13wk、26wk和恢復(fù)期結(jié)束后，分別代謝籠收集部分大鼠的尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢查。
(4)血液學(xué)和生化驗(yàn)學(xué)檢查于給藥13wk取對(duì)照組和高劑量組各1/4動(dòng)物、給藥26wk每組各取1/2動(dòng)物、恢復(fù)期結(jié)束時(shí)取剩余所有動(dòng)物ip 1％戊巴比妥鈉溶液淺麻，腹主動(dòng)脈取血，部分用于測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)，部分血液離心取血清后測(cè)定十項(xiàng)血清生化指標(biāo)，部分血液離心取血清，測(cè)定血凝指標(biāo)。血液學(xué)指標(biāo)包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)及分類(lèi)，血紅蛋白(HB)和血小板(PLT)。血清生化指標(biāo)包括丙氨酸基轉(zhuǎn)移酶(ALT)堿性磷酸酶(ALP)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血糖(GLU)總膽固醇(TC)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、總膽紅素(T.BILI)、肌酐(Crea)。血凝指標(biāo)包括凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)。
(5)剖檢及病理組織學(xué)檢查給藥13wk時(shí)取高劑量組和對(duì)照組各1/4動(dòng)物、給藥26wk后每組各取1/2動(dòng)物、恢復(fù)期結(jié)束后取剩余所有動(dòng)物進(jìn)行剖檢，并行肉眼觀察，然后測(cè)腦、心、肝、脾、肺、腎、腎腺、胸腺、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺和甲狀腺濕重，求出臟器系數(shù)，并將上述臟器及胃腸等臟器以10％甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，H-E染色鏡檢。
五、結(jié)果 1、一般情況給藥期間高劑量組(76.5g/kg/d)部分動(dòng)物給藥第2-4wk出現(xiàn)藥前流涎和給藥時(shí)掙扎、吐藥，藥后活動(dòng)減少，行為邋遢，后漸恢復(fù)，動(dòng)物藥后體重增長(zhǎng)、飲食基本正常，與對(duì)照情況基本一致。其它各劑量組動(dòng)物給藥期間一般行動(dòng)、精神狀況均正常，與對(duì)照動(dòng)物想比較無(wú)明顯差異。恢復(fù)期所有各組動(dòng)物肉眼觀察均正常。
2、體重藥前及藥后各組大鼠體重變化見(jiàn)表12、13、14、15。
由表12、13、14、15可見(jiàn)，用藥期間六味地黃多糖低、中、高劑量組動(dòng)物體重增長(zhǎng)基本與對(duì)照組一致，與對(duì)照組相比較，無(wú)明顯差異。
表13 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)雄性大鼠體重增長(zhǎng)的影響藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d) 藥前 1wk 2wk 3wk 4wk 對(duì)照組 105.2±7.2 126.0±11.1 159.2±16.9 189.1±15.8 215.1±17.1 76.5105.6±7.6 131.0±13.4 162.3±17.9 191.5±18.5 213.4±22.1 25.5107.3±9.1 132.3±10.7 167.8±13.7 194.1±15.3 217.2±18.9 8.5 104.6±6.5 128.8±10.2 162.8±13.6 191.0±14.1 214.0±14.9藥劑 重(X±SD，g)品量(g/kg/d)5wk 6wk 7wk 8wk 9wk10wk226.8±21.2 237.1±25.8 255.5±30.5 259.4±30.9 266.2±32.2270.5±32.7231.7±22.4 236.2±23.2 249.8±25.2 254.9±26.7 259.9±29.1262.8±30.5231.5±19.6 239.2±22.3 250.7±22.5 255.8±23.3 257.6±24.4261.7±24.6227.5±19.0 234.7±20.6 249.0±23.8 254.0±21.5 260.7±24.8264.0±25.3藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)11wk 12wk 13wk 14wk 15wk277.0±33.4281.6±33.9282.8±33.5292.8±35.4299.2±36.8265.5±30.4268.0±31.5271.3±33.1280.1±30.5283.3±28.8266.2±26.0271.4±26.0272.6±24.6275.5±24.0277.5±25.4269.6±24.3273.7±24.3275.8±23.1282.6±23.1288.4±24.1藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)16wk 17wk 18wk 19wk 20wk304.9±37.2 311.5±39.4 318.8±40.6 325.5±42.4 326.0±42.7288.8±28.0 294.8±28.8 300.9±29.8 306.1±30.4 306.1±30.9283.3±27.5 286.4±30.1 291.5±29.2 299.1±29.2 302.1±29.2295.2±23.6 300.3±23.5 306.2±24.0 310.0±24.5 312.3±23.3藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)21wk 22wk 23wk 24wk 25wk326.5±42.4 328.1±41.4 330.0±39.9330.7±40.2331.6±40.9307.9±30.5 308.0±32.1 309.3±33.9310.5±34.8313.6±35.7305.4±30.2 308.4±29.8 308.2±32.2309.6±32.8312.4±33.3311.7±23.2 318.9±23.5 319.5±23.4314.7±22.7317.3±23.5藥劑用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)26wk 27wk 28wk 29wk 30wk333.7±42.7 348.0±41.6349.6±40.1350.4±40.3351.2±39.5315.7±35.8 300.4±26.7301.2±26.1302.4±21.8305.6±21.0312.1±32.2 326.0±19.0328.6±19.5329.8±18.5330.6±18.4321.4±24.1 330.8±26.9331.6±24.1331.6±20.7332.6±21.1 表14 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)雄性大鼠體重增長(zhǎng)的影響(n＝40)藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)藥前 1wk 2wk 3wk 4wk對(duì)照組 116.9±12.032.5±8969.5±10.398.6±11.7136.4±20.576.5114.2±13.031.0±8166.7±13.699.6±14.9139.0±16.525.5118.3±11.728.5±9765.7±4.1194.5±13.6132.3±20.78.5 118.6±12.537.5±7675.2±10.4103.0±11.4 143.6±15.4藥劑 重(X±SD，g)品量(g/kg/d)5wk6wk 7wk 8wk9wk10wk159.0±26.0170.0±30.0 192.9±34.9 210.1±35.4231.2±37.2237.3±35.7167.3±20.5187.8±25.6 212.1±29.0 224.4±31.2238.8±30.1247.6±29.6160.3±26.2183.3±26.3 206.2±28.0 221.1±28.9235.5±34.1245.4±34.2166.4±15.7186.2±20.6 211.1±23.6 226.2±25.1246.9±27.6255.0±27.8藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)11wk 12wk 13wk 14wk 15wk246.3±36.0254.4±35.4263.8±36.6 277.7±7.63292.7±39.3256.1±30.6262.7±31.8272.2±33.7 277.9±32.3285.7±36.3257.8±36.3266.9±38.7274.8±40.1 283.5±40.2290.8±42.5265.8±29.5274.9±32.8280.6±34.6 294.5±37.3305.0±36.6藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)16wk 17wk18wk 19wk 20wk 305.7±2.0 315.6±42.4 327.3±44.7335.2±47.7338.8±47.0 295.3±37.5 303.2±39.6 311.9±42.0320.3±42.5323.7±42.5 299.9±40.5 311.6±40.3 319.3±39.5328.1±39.9334.3±42.1 314.1±36.3 323.31±37.0331.6±37.4341.4±37.4348.1±37.7藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)21wk 22wk 23wk 24wk 25wk338.9±44.1345.9±44.1353.6±44.7359.9±44.7364.0±44.2326.1±43.9333.6±45.3340.1±45.1344.4±45.3349.2±45.1339.3±42.3344.2±41.8348.5±42.3352.2±41.4356.5±42.0352.2±36.0356.5±36.2361.7±36.3363.9±37.2366.9±34.7約劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)26wk 27wk 28wk 29wk 30wk367.3±43.7 348.8±52.3351.2±55.2352.8±55.5354.0±53.4350.7±44.0 356.8±35.7358.4±35.6359.2±34.9362.8±34.7360.6±35.4 326.0±19.0363.8±36.4367.0±37.4370.0±36.1372.0±17.5 330.8±26.9372.6±15.5374.2±16.9374.4±15.1 表15 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)雄性大鼠體重增長(zhǎng)的影響(n＝40)藥劑用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)藥前 1wk 2wk 3wk 4wk對(duì)照組 105.2±7.2 20.8±5.354.0±10.983.9±10.2109.9±18.076.5105.6±7.6 25.4±9.156.7±13.485.9±13.8107.8±17.325.5107.3±9.1 25.0±4.760.5±8.1 86.8±9.9 109.9±13.98.5 104.6±6.5 24.2±6.058.2±9.3 86.4±10.1109.4±15.5藥劑重(X±SD，g)品量(g/kg/d)5wk6wk7wk8wk 9wk 10wk121.6±21.7131.9±26.8150.3±31.8154.2±32.7 161.0±33.9 165.3±34.6126.1±17.9130.6±19.1144.2±21.5149.3±22.4 154.3±24.9 157.2±26.2124.0±14.12 131.9±17.1143.4±17.8148.5±19.3 150.3±20.8 154.4±21.2122.9±19.6130.1±20.8144.4±23.8149.4±21.9 156.1±25.3 159.4±25.8藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)11wk 12wk 13wk 14wk 15wk171.8±35.2 176.4±35.8177.6±35.2 187.7±39.0194.1±40.3159.9±26.4 162.4±27.6165.7±28.8 173.3±25.6176.5±24.0158.9±22.9 164.1±22.7165.3±22.3 168.3±22.3170.2±24.7165.0±24.9 169.1±24.5171.2±23.0 178.0±22.6183.8±23.3藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)16wk 17wk 18wk 19wk 20wk199.9±40.6206.4±42.8213.7±43.9220.4±45.9 220.0±46.1182.0±24.3188.0±25.4194.1±26.6199.3±27.3 199.3±27.5176.0±26.4179.1±28.8184.2±28.9191.8±28.6 194.8±28.4190.6±23.0195.7±23.0201.6±24.0205.4±24.6 207.7±23.2藥劑 用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)21wk 22wk 23wk 24wk 25wk221.5±45.5223.1±44.7224.9±43.4225.6±43.7226.5±43.8201.1±27.0201.2±28.7202.5±30.1203.7±31.2206.8±32.0198.1±28.9201.1±28.3200.9±30.5202.3±31.0205.1±31.4207.1±22.5214.3±25.2214.9±25.6210.1±23.1212.7±23.9藥劑用藥期間體重(X±SD，g)品量(g/kg/d)26wk 27wk 28wk 29wk 30wk228.7±45.3 242.4±43.6 244.0±40.9 244.8±41.4 245.6±40.3208.9±32.7 198.4±26.2 199.2±25.6 200.4±21.5 203.6±20.9204.8±30.6 218.6±21.6 221.2±21.9 222.4±21.4 223.2±22.1216.8±24.5 221.8±28.6 222.6±25.8 222.6±22.4 223.6±22.6 3、尿常規(guī)檢查結(jié)果見(jiàn)表16 表16 六味地黃多糖po給藥13wk對(duì)大鼠尿常規(guī)的影響組別 劑量蛋白 FH 隱血 尿膽元 膽紅素 酮體 糖 亞硝酸鹽 (g/kg) + + + ± -給藥13wkn＝10veh /1 3 3 36.1±0.6 -- - -- -藥物76.5 1 2 3 46.2±0.7 -- - -- -組別 劑量 蛋白 FH隱血 尿膽元 膽紅素 酮體 糖 亞硝酸鹽 (g/kg) + + + ± -給藥26wkn＝20veh/ 0 5 7 86.3±0.6 - - - - 高 76.5 1 1 13 5 6.4±0.6 - - - 中 25.5 0 1 9 11 6.2±0.6 - - - -- - 低 8.5 0 3 3 14 6.3±0.6 - - - -- -組別 劑量蛋白 FH 隱血 尿膽元 膽紅素 酮體 糖 亞硝酸鹽 (g/kg) + + + ± -恢復(fù)期n＝20 對(duì)照，高劑量n＝10veh /1 2 3 46.3±0.5 -- - -- -高 76.5 2 0 7 11 6.3±0.7 -- - -- -中 25.5 1 5 4 10 6.3±0.6 -- - -- -低 8.50 1 7 36.3±0.6 -- - -- 注X±SD，P＞0.05，vs veh 由此表16可見(jiàn)，六味地黃多糖各劑量組動(dòng)物在各個(gè)測(cè)定時(shí)期，尿常規(guī)檢查結(jié)果與對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯異 4、血液學(xué)及凝血時(shí)間檢查結(jié)果見(jiàn)表17。
表17 口服給藥26wk對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)及凝血時(shí)間的影響 劑量 WBCRBC (Hb) PLT LY MO GR組別(g/kg)(10·/L)(10*L) (g/L)(10*/L) (％) (％)(％)13wkn＝10veh / 8.00±4.01 7.32±0.59 108.90±9.23 1038.40±129.42 60.57±9.93 10.61±3.56 28.82±10.3076.5 8.58±2.50 6.34±0.70 105.50±10.39 1108.50±171.11 61.28±10.04 10.33±2.20 28.39±10.5926wkn＝20veh 5.64±2.39 6.91±1.10 120.25±14.49 1150.55±181.24 64.75±8.49 8.45±2.57 26.08±11.0476.5 6.13±2.04 6.54±0.57 113.20±10.30 1228.00±128.71 61.00±7.92 7.92±2.50 31.08±10.13 5.55±2.15 6.62±0.67 115.45±9.36 1129.75±163.39 64.09±8.62 8.14±2.21 27.77±10.6325.58.5 4.81±1.61 6.46±0.52 119.20±7.92 1066.65±150.27 62.53±7.10 8.24±2.78 29.23±9.81停藥4wkn＝20對(duì)照，高n＝10veh / 6.08±1.97 7.63±0.95 120.60±7.32 970.80±108.46 61.45±7.00 7.26±2.98 31.29±7.8976.5 7.11±2.15 7.65±0.71 124.10±6.66 1014.40±112.84 57.23±13.75 7.05±2.67 35.27±14.3025.5 6.58±2.26 7.65±0.68 125.9±8.42 1010.45±175.15 60.54±6.15 7.46±2.21 32.01±5.828.5 6.39±2.00 7.62±0.97 123.10±11.64 988.75±142.11 60.34±8.44 7.21±2.95 32.46±8.46 注X±SD，P＞0.01，vs veh 由表17可見(jiàn)，用藥組動(dòng)物給藥13wk高劑量組動(dòng)物紅細(xì)胞明顯小于對(duì)照組，對(duì)照組相比較，有極顯著性差異(P＞0.01)，其余各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)現(xiàn)對(duì)照組比較，差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥26wk以及停藥4wk時(shí)，各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表18 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)及凝血時(shí)間的影響組別劑量TT APTT PT (g/kg) (S)(S) (S)26wkn＝20veh / 39.69±7.82 61.83±17.4612.17±1.64 76.5 39.02±7.63 56.01±19.8512.59±1.01多糖 25.5 39.10±6.74 62.88±23.9912.19±1.66 8.5 39.16±10.4753.49±10.6711.71±1.89停藥4wkn＝20對(duì)照，高n＝10veh /多糖 76.5 25.5 8.5 由表18可見(jiàn)，給藥26wk以及停藥4wk時(shí)，各項(xiàng)血凝血指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
5、血清生化學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)表19。表19 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響組別 劑量ATLAST ALP TP ALB (g/kg) (U/L) (U/L) (U/L) (g/L)(g/L)13wkn＝10veh / 32.14±13.54116.70±46.69 77.65±35.67 69.92±23.55 26.23±8.63藥物 76.5 48.44±31.48112.70±31.87 96.37±41.83 73.29±6.34 26.49±2.5326wkn＝20高n＝18veh / 48.71±19.08153.67±40.89 93.93±21.45 88.88±5.66 31.53±3.52 76.5 46.51±24.14163.75±52.20 94.85±34.70 89.25±7.28 32.37±4.40藥物 25.5 47.93±18.99147.62±33.28 98.32±38.64 87.99±7.15 32.45±3.67 8.544.26±19.30152.8±38.69 98.58±33.10 85.65±6.61 31.85±3.23 GLU BUNCHO CR TBil (mmo/L) (mmo/L)(mmo/L) (umo/L) (umo/L) 6.73±0.8911.87±3.100.78±0.1466.43±9.22 6.52±2.43 6.74±1.5212.82±3.830.78±0.0764.39±7.86 5.11±1.30 7.35±1.589.87±2.53 2.53±0.55107.49±8.41 5.82±2.55 7.07±1.409.58±2.08 2.22±0.52108.04±8.87 6.44±2.41 7.23±1.8710.07±1.772.12±0.49101.02±21.175.52±1.97 6.78±1.359.18±2.00 2.17±0.43103.88±11.145.44±1.65 停藥4wkn＝20 對(duì)照n＝10高n＝9 veh /76.5 藥物 25.58.5 X±SD，P＞0.05，vs veh 由表19可見(jiàn)，給藥13wk，給藥26wk后血清生化檢測(cè)，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)與對(duì)照組比較，均未出現(xiàn)明顯差異。
6、病理組織學(xué)檢查 (1)剖檢 給藥13wk、26wk及藥后恢復(fù)期結(jié)束后，剖檢各組動(dòng)物均未有肉眼可見(jiàn)的異常。
(2)臟器重量 主要臟器濕重與體重比值為臟器系數(shù)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表20、表21。 表20 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)雄性大鼠臟器系數(shù)的影響組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 心 肝 脾 肺 腎 腎上腺藥后13wk(n＝10)Veh / 0.32±0.03 3.76±0.63 0.24±0.04 0.70±0.51 0.78±0.10 0.02±0.01藥物 76.5 0.33±0.01 3.49±0.46 0.21±0.02 0.53±0.07 0.77±0.08 0.02±0.00組別 劑量臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg)甲狀腺 胸腺 睪丸附睪前列腺 腦藥后13wk(n＝10)Veh / 0.01±0.00 0.06±0.04 1.02±0.11 0.36±0.04 0.34±0.09 0.50±0.06藥物 76.5 0.01±0.00 0.08±0.02 0.94±0.06 0.38±0.02 0.37±0.06 0.46±0.05組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 心 肝 脾 肺 腎 腎上腺藥后26wk k(n＝20，高n＝18)Veh / 0.29±0.03 2.76±0.38 0.17±0.03 0.42±0.05 0.57±0.03 0.01±0.00藥物 8.50.28±0.03 2.81±0.42 0.17±0.02 0.44±0.09 0.57±0.06 0.02±0.01 25.5 0.28±0.01 2.89±0.51 0.20±0.07 0.40±0.08 0.59±0.06 0.01±0.00 76.5 0.29±0.03 2.98±0.23 0.19±0.03 0.44±0.08 0.57±0.08 0.02±0.01組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 甲狀腺 胸腺睪丸附睪前列腺 腦 0.01±0.00 0.04±0.02 0.72±0.04 0.30±0.03 0.35±0.09 0.39±0.02 0.01±0.00 0.04±0.01 0.74±0.06 0.30±0.04 0.30±0.03 0.42±0.06 0.01±0.00 0.04±0.02 0.73±0.08 0.31±0.03 0.31±0.05 0.41±0.03 0.01±0.00 0.03±0.01 0.75±0.14 0.31±0.05 0.32±0.06 0.41±0.04組別 劑量臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 心 肝 脾 肺 腎 腎上腺停藥4wk(n＝20，對(duì)照n＝10，高n＝9)veh / 0.27±0.03 2.99±0.46 0.16±0.03 0.51±0.05 0.57±0.10 0.01±0.00 8.5 0.27±0.05 2.70±0.24 0.15±0.03 0.42±0.09 0.57±0.06 0.01±0.00藥物 25.5 0.28±0.02 2.59±0.27 0.17±0.05 0.44±0.07 0.60±0.04 0.01±0.00 76.5 0.27±0.01 2.78±0.08 0.16±0.03 0.48±0.08 0.57±0.05 0.01±0.00組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg)甲狀腺 胸腺 睪丸附睪 前列腺 腦 0.01±0.00 0.04±0.01 0.71±0.08 0.28±0.02 0.35±0.08 0.42±0.01 0.01±0.00 0.04±0.01 0.69±0.10 0.29±0.04 0.33±0.06 0.41±0.03 0.01±0.00 0.04±0.02 0.74±0.09 0.30±0.03 0.31±0.08 0.40±0.04 0.01±0.00 0.04±0.01 0.81±0.06 0.30±0.06 0.39±0.05 0.41±0.04表21 六味地黃多糖口服給藥26wk對(duì)雌性大鼠臟器系數(shù)的影響組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 心肝脾肺 腎藥后13wk(n＝10)veh / 0.35±0.043.74±0.740.40±0.060.57±0.12 0.88±0.08多糖 76.50.40±0.073.85±0.450.42±0.100.60±0.06 1.00±0.28組別 劑量臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg)腎上腺 胸腺甲狀腺 子宮卵巢腦 0.03±0.00 0.01±0.00 0.11±0.02 0.26±0.10 0.06±0.01 0.63±0.08 0.03±0.01 0.01±0.00 0.14±0.02 0.27±0.09 0.07±0.02 0.66±0.09組別 劑量臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 心 肝 脾 肺 腎藥后26wk(n＝20)veh / 0.34±0.05 3.04±0.74 0.21±0.04 0.54±0.08 0.73±0.098.5 0.33±0.03 3.09±0.59 0.24±0.04 0.59±0.16 0.70±0.0825.50.36±0.03 3.36±0.54 0.23±0.09 0.59±0.10 0.76±0.1076.50.34±0.05 3.19±0.41 0.23±0.04 0.59±0.13 0.74±0.08組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 腎上腺 胸腺甲狀腺 子宮卵巢腦0.03±0.01 0.01±0.00 0.09±0.03 0.03±0.08 0.05±0.01 0.59±0.060.03±0.01 0.01±0.00 0.07±0.04 0.26±0.06 0.05±0.01 0.59±0.040.03±0.01 0.01±0.00 0.11±0.05 0.26±0.04 0.05±0.01 0.62±0.070.03±0.01 0.01±0.00 0.10±0.05 0.28±0.08 0.05±0.01 0.59±0.05組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重) (g/kg) 心 肝脾 肺 腎停藥4wk(n＝20，對(duì)照高n＝10)veh / 0.30±0.06 2.88±0.600.17±0.04 0.48±0.08 0.64±0.13 8.5 0.31±0.05 2.86±0.310.20±0.03 0.52±0.10 0.68±0.06 25.50.31±0.03 2.88±0.320.22±0.03 0.48±0.10 0.68±0.09 76.50.32±0.03 3.24±0.250.23±0.05 0.48±0.06 0.78±0.05組別 劑量 臟器系數(shù)(X±SD，g/100g體重)(g/kg) 腎上腺 胸腺 甲狀腺 子宮 卵巢 腦 0.02±0.00 0.01±0.00 0.09±0.05 0.20±0.04 0.04±0.02 0.55±0.05 0.02±0.01 0.01±0.00 0.06±0.02 0.23±0.06 0.05±0.01 0.57±0.04 0.02±0.01 0.01±0.00 0.08±0.02 0.24±0.03 0.04±0.01 0.57±0.04 0.03±0.01 0.01±0.00 0.06±0.01 0.24±0.03 0.05±0.01 0.59±0.02 注X±SD，P＞0.05，vs veh 由表20、表21可見(jiàn)，給藥13wk，26wk，與對(duì)照組比較，六味地黃多糖各劑量組動(dòng)物臟器系數(shù)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，觀察期結(jié)束各組臟器系數(shù)未見(jiàn)異常。
(3)組織切片檢查給藥13wk病理檢查可見(jiàn)心組織形態(tài)呈正常分布，未見(jiàn)心肌細(xì)胞變性，也無(wú)心肌細(xì)胞出血、壞死及纖維化等病變；肝結(jié)構(gòu)完整，肝小葉正常，肝細(xì)胞無(wú)變性壞死；脾未見(jiàn)病變；肺動(dòng)物肺泡正常，間質(zhì)內(nèi)無(wú)增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腎未見(jiàn)間質(zhì)內(nèi)輕、中度灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)及血管充血；腎上腺分為皮質(zhì)和髓質(zhì)，皮質(zhì)細(xì)胞無(wú)變性、環(huán)死、增生，髓質(zhì)細(xì)胞和血管未見(jiàn)異常；甲狀腺甲狀腺濾泡大小及分泌功能正常；胰腺胰腺結(jié)構(gòu)正常，腺泡及導(dǎo)管、胰島結(jié)構(gòu)及數(shù)量無(wú)異常；小腸小腸粘膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥及粘膜脫落、壞死；前列腺、睪丸、附睪、精囊腺、淋巴結(jié)、子宮、卵巢、膀胱、腦、脊髓、垂體、視神經(jīng)、胸骨、胃、十二指腸等臟器未見(jiàn)異常。
給藥結(jié)束病理檢驗(yàn)，心未見(jiàn)心肌細(xì)胞明顯變性，也無(wú)心肌出血、壞死及纖維化等病變；肝正常動(dòng)物，結(jié)構(gòu)完整，肝小葉正常，肝細(xì)胞無(wú)變性壞死，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)較明顯；脾未見(jiàn)病變；肺動(dòng)物肺泡正常，間質(zhì)內(nèi)無(wú)增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腎未見(jiàn)間質(zhì)內(nèi)輕、中度灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)及血管充血；腎上腺分為皮質(zhì)和髓質(zhì)，皮質(zhì)細(xì)胞無(wú)變性、環(huán)死、增生，髓質(zhì)細(xì)胞和血管未見(jiàn)異常；甲狀腺甲狀腺濾泡大小及分泌功能正常；胰腺胰腺結(jié)構(gòu)正常，腺泡及導(dǎo)管、胰島結(jié)構(gòu)及數(shù)量無(wú)異常；小腸小腸粘膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥及粘膜脫落、壞死；前列腺、睪丸、附睪、精囊腺、淋巴結(jié)、子宮、卵巢、膀胱、腦、脊髓、垂體、視神經(jīng)、胸骨、胃、十二指腸等臟器未見(jiàn)異常。
觀察結(jié)束，所有動(dòng)物各臟器均未見(jiàn)明顯的病理改變。
六、結(jié)論 本試驗(yàn)研究了六味地黃多糖26wk ig大鼠的長(zhǎng)期毒性。結(jié)果 (1)六味地黃多糖8.5g/kg/d，連續(xù)ig大鼠26wk及停藥4wk，動(dòng)物外觀和一般行為基本正常。體重增長(zhǎng)，尿常規(guī)、血液性、血清生化檢測(cè)、凝血指標(biāo)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)異常。
(2)高劑量組(76.5g/kg/d)部分動(dòng)物給藥第2-4wk出現(xiàn)藥前流涎和給藥時(shí)掙扎、吐藥，藥后活動(dòng)減少，行為邋遢，后漸恢復(fù)。動(dòng)物藥后體重增長(zhǎng)、飲食基本正常，與對(duì)照組情況基本一致。給藥13wk后高劑量級(jí)動(dòng)物紅細(xì)胞明顯小于對(duì)照組，與對(duì)照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)，其余各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥26wk各組各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯異常；停藥4wk時(shí)，各組各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯異常；體重增長(zhǎng)，尿常規(guī)、血液性、血清生化檢測(cè)、凝血指標(biāo)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)異常。
本試驗(yàn)證明，本品主要肉眼所能觀察到的中毒癥狀為給藥2-4wk藥后活動(dòng)減少，給藥13wk高劑量對(duì)紅細(xì)胞造成顯著影響。安全用藥劑量為25.5g/kg/d，其確實(shí)中毒劑量為76.5g/kg/d。分別約為臨床用藥劑量的345、1035倍。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的實(shí)施例1 1.處方 熟地黃32公斤山茱萸[制]16公斤山藥16公斤 澤瀉12公斤茯苓12公斤 牡丹皮12公斤 2.操作 ①熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮，粉碎成10-80目的粗粉，加入溫水浸泡12小時(shí)，然后煎煮兩次，每次2小時(shí)，合并煎液，離心過(guò)濾，收集離心液，備用。
②離心后的六味地黃水煎液，用裝有3μm微濾膜的過(guò)濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，棄去膜上液，膜下液用能切割15萬(wàn)分子量的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，收集通過(guò)濾膜的膜下液，用D101型大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，用能切割150分子量的納濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，棄去膜下液，收集膜上液，干燥(噴霧、冷凍、真空或常溫干燥)，粉碎，即得到六味地黃多糖產(chǎn)品。
本發(fā)明的實(shí)施例2 1.處方 熟地黃32公斤山茱萸[制]16公斤山藥16公斤 澤瀉12公斤茯苓12公斤 牡丹皮12公斤 2.操作 ①熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮，粉碎成10-80目的粗粉，加入溫水浸泡12小時(shí)，然后煎煮兩次，每次2小時(shí)，合并煎液，離心過(guò)濾，收集離心液，備用。
②離心后的六味地黃水煎液，用裝有0.5μm微濾膜的過(guò)濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，棄去膜上液，膜下液用能切割8萬(wàn)分子量的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，收集通過(guò)濾膜的膜下液，用WLD型大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，用能切割150分子量的納濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，棄去膜下液，收集膜上液，干燥(噴霧、冷凍、真空或常溫干燥)，粉碎，即得到六味地黃多糖粉。
本發(fā)明的實(shí)施例3 1.處方熟地黃32克山茱萸[制]16克山藥16克 澤瀉12克 茯苓12克 牡丹皮12克 2.操作 ①熟地黃、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮，粉碎成10-80目的粗粉，加入溫水浸泡12小時(shí)，然后煎煮兩次，每次2小時(shí)，合并煎液，離心過(guò)濾，收集離心液，備用。
②離心后的六味地黃水煎液，用裝有0.5μm微濾膜的過(guò)濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，棄去膜上液，膜下液用能切割1000分子量的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，收集通過(guò)濾膜的膜下液，用AB-8型大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，用能切割150分子量的納濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，棄去膜下液，收集膜上液，干燥(噴霧、冷凍、真空或常溫干燥)，粉碎，即可得到六味地黃多糖粉。
本發(fā)明的實(shí)施例4將得到的得到六味地黃多糖粉 采用常規(guī)的制備方法，壓成片；用于治療、預(yù)防疾?。豢诜刻?次、每次2片。
本發(fā)明的實(shí)施例5將得到的得到六味地黃多糖粉采用常規(guī)的方法制備成膠囊制劑；用于治療、預(yù)防疾病；口服每天次、每次2粒。
本發(fā)明的實(shí)施例6將得到的得到六味地黃多糖粉采用常規(guī)的制備方法，制備成顆粒；用于治療、預(yù)防疾??；口服每天2次、每次1包。
本發(fā)明的實(shí)施例7將得到的得到六味地黃多糖粉采用常規(guī)的制備方法，制備成注射制劑；用于治療、預(yù)防疾??；靜脈注射用。
權(quán)利要求
1.六味地黃多糖的提取工藝，其特征在于由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓和牡丹皮組成，按照現(xiàn)行國(guó)家藥典規(guī)定的用量，將熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓和牡丹皮分別粉碎成粗粉，加水浸泡，然后煎煮，合并煎煮液，離心過(guò)濾，得六味地黃提取液，備用；取上述六味地黃提取液，用微濾膜過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用超濾膜過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，流出液備用；取上述六味地黃流出液，用納濾膜過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜下液棄去，膜上液備用；將上述膜上液采用噴霧、冷凍、真空或常溫干燥的方法干燥，粉碎，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的六味地黃多糖的提取工藝，其特征在于按照重量百分比計(jì)算將熟地黃32％、制山茱萸16％、山藥16％、澤瀉12％g、茯苓12％和牡丹皮12％分別粉碎成粗粉，加水浸泡12小時(shí)，煎煮2次，每次2小時(shí)，合并煎煮液，離心過(guò)濾，得六味地黃提取液，備用；取上述六味地黃提取液，用裝有3μm～0.5μm微濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用裝有能切割15萬(wàn)～1000分子量超濾膜的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取上述六味地黃膜下液，用大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，流出液備用；取上述六味地黃流出液，用裝有能切割100～300分子量的納濾膜的納濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜下液棄去，膜上液備用；將上述膜上液采用噴霧、冷凍、真空或常溫干燥的方法干燥，粉碎，即得。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的六味地黃多糖的提取工藝，其特征在于將熟地黃32公斤、制山茱萸16公斤、山藥16公斤、澤瀉12公斤、茯苓12公斤和牡丹皮12公斤分別粉碎成粗粉，加水浸泡12小時(shí)，煎煮2次，每次2小時(shí)，合并煎煮液， 離心過(guò)濾，得六味地黃提取液，備用；取上述六味地黃提取液，用裝有3μm微濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取通過(guò)3μm微濾膜的六味地黃膜下液，用裝有0.5μm微濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；取通過(guò)0.5μm微濾膜的六味地黃膜下液，用裝有能切割8萬(wàn)分子量的超濾膜的超濾裝置過(guò)濾，將膜上液與膜下液分離，膜上液棄去，膜下液備用；用D101型、AB？型或WLD混合型大孔樹(shù)脂吸咐，收集流出液，流出液備用；取上述六味地黃流出液，用裝有能切割150分子量的納濾膜的納濾器分別過(guò)濾，將經(jīng)過(guò)納濾器過(guò)濾的膜上液與膜下液分離，膜下液棄去，將通過(guò)8萬(wàn)分子量的超濾膜與150分子量的納濾膜之間的提取液，采用噴霧、冷凍、真空或常溫干燥的方法干燥，粉碎，即可。
4.按照權(quán)利要求3所述的六味地黃多糖的提取工藝，其特征在于可以用DA201型、D-型、SIP系列、X-5型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD-40型、DM-130型、R-A型、CHA-111型、WLD混合型、H107型或NKA-9型大孔樹(shù)脂吸咐。
5.如權(quán)利要求1-4所述工藝制備得到的六味地黃多糖。
6.如權(quán)利要求5所述得到的六味地黃多糖的應(yīng)用，其特征在于用于治療糖尿病、改善糖耐量、降血脂、提高免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)、延緩衰老、抗疲勞、抗腫瘤以及用于治療腎陰虧損，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴。
全文摘要
本發(fā)明是一種六味地黃多糖的提取工藝及其得到的產(chǎn)品和這種產(chǎn)品的應(yīng)用，這種多糖是將熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓和牡丹皮中的有效成分提取后再用微濾膜過(guò)濾，把液用大孔樹(shù)脂后得到的；提取的工藝簡(jiǎn)單、合理，成本低廉；得到的產(chǎn)品經(jīng)驗(yàn)證為六味地黃多糖產(chǎn)品；含有治療相關(guān)疾病需要的多種有效成分；用于治療糖尿病、改善糖耐量、降血脂、提高免疫力、抗腫瘤以及用于治療腎陰虧損等疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1679912SQ20051020005
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月24日
發(fā)明者趙漢臣, 閆薈, 陳萍, 康國(guó)忠 申請(qǐng)人:康國(guó)忠