專利名稱：用于抵抗抗葉酸毒性羧肽酶g的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有羧肽酶G活性的酶的用途，特別涉及其在抵抗由抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性中的用途。
天然葉酸被細胞用于葉酸途徑以合成DNA、RNA，并用于蛋白質(zhì)合成，因此其為基本的飲食需求物質(zhì)(Jolivet等，1983；Pinedo等，1976；Goldman1975)。
葉酸途徑中研究得最多的、作為抗葉酸藥物的靶標的三種酶是二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷酸合成酶(TS)、和甘氨酰胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶(GARFT)。DHFR和TS，以及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)，構(gòu)成胸苷酸循環(huán)的三種酶。SHMT通過亞甲基四氫葉酸(MTHF)的形成催化絲氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸。MTHF在TS的影響下，將其亞甲基提供給脫氧尿苷酸形成DNA的基本成分胸苷酸。重要的是，在TS反應(yīng)中，四氫葉酸(THF)為MTHF的亞甲基向胸苷酸(dTMP)的甲基的轉(zhuǎn)化供應(yīng)還原性等價物。因此，對于所形成的每一分子的dTMP來說，對應(yīng)每一分子的THF轉(zhuǎn)化為二氫葉酸(DHF)。DHF必須再轉(zhuǎn)化為THF以使TS循環(huán)能夠連續(xù)生產(chǎn)dTMP。此反應(yīng)由以NADPH為還原劑的DHFR催化。DHFR也催化葉酸向DHF的轉(zhuǎn)化。
GARFT催化嘌呤生物合成從頭開始所需的十個反應(yīng)系列中的第三個，甘氨酰胺核糖核苷酸向甲酰甘氨酰胺核糖核苷酸的轉(zhuǎn)化利用10-甲?；鵗HF作為甲?；w。GARFT作為三功能蛋白在哺乳動物中產(chǎn)生，除了第三步外，其還催化該途徑中的第二和第五步。GARFT活性位于該三功能蛋白的羧基端部分。嘌呤生物合成的從頭開始導(dǎo)致次黃苷單磷酸的形成，次黃苷單磷酸為RNA形成所必需的ATP和GTP的前體，為DNA形成所必需的dATP和dGTP的前體。
DHFR的抑制導(dǎo)致dTMP缺乏，因為DHF不能在TS反應(yīng)中重復(fù)利用。這反過來導(dǎo)致DNA合成不足，DNA分解以及細胞死亡。TS的直接抑制同樣導(dǎo)致dTMP的缺乏以及細胞死亡。GARFT的直接抑制導(dǎo)致嘌呤核苷酸的損耗，這也引起細胞死亡，但細胞殺死的程度通常低于由同等生長抑制濃度的TS抑制劑所生產(chǎn)的(Kisliuk等，2003)。
合成的葉酸類似物氨甲蝶呤(MTX)自1948(Bleyer 1978)年即已用于臨床，它是用于治療腫瘤性疾病患者的多種化療藥物的重要成分。MTX及其活性代謝物的細胞毒效應(yīng)均通過抑制DHFR而導(dǎo)致DNA合成、修復(fù)和細胞復(fù)制的抑制。增殖活躍的組織如惡性細胞通常對這種MTX的干擾更為敏感。另外，MTX具有免疫調(diào)控效應(yīng)，用于許多其他疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)和牛皮癬的治療。高劑量MTX，通常以長時間輸注的方式給藥，目前經(jīng)常用于非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)或軟組織腫瘤如骨肉瘤患者。
雖然增殖活躍的惡性組織對MTX最敏感，但MTX通過兩個基本機理以劑量和時間依賴的方式對健康細胞產(chǎn)生毒性。第一個機理與所有的抗葉酸藥物相同。通過抑制DNA合成和細胞代謝發(fā)生，其是形成MTX的細胞毒性抗癌作用的基本機理。對健康細胞的明顯的細胞毒性風(fēng)險與MTX的劑量和接觸時間的增加相關(guān)。MTX治療與毒性譜有關(guān)，骨髓抑制、粘膜炎、急性肝炎和腎毒性是最常見最嚴重的并發(fā)癥(Bleyer 1978)。使用高劑量治療時所見到的其他毒性是急性蛻皮性皮炎、B-淋巴細胞功能障礙、以及神經(jīng)學(xué)效應(yīng)。類似的共同毒性也由其他的抗葉酸藥物所引發(fā)，盡管它們通常以低于MTX的劑量給藥。
第二個機理是MTX誘導(dǎo)的腎小管阻塞及由此引發(fā)的腎功能障礙(MTX腎毒性)。MTX由肝臟醛氧化酶代謝為7-羥基-MTX。7-羥基-MTX的水溶性在某些條件下低于其母系化合物的3至5倍，已知其在腎小管中沉淀，這被認為是MTX腎毒性發(fā)病學(xué)中的基本機理(Kintzel 2001，Condit 1969)。正常的腎功能會在給定時間內(nèi)適應(yīng)特定負載的去除，此后累積和損傷就會發(fā)生。如果接受MTX的患者發(fā)生了導(dǎo)致MTX消除減弱的腎毒性，則消除減弱的MTX、持續(xù)的高MTX血漿水平和隨之而來的非腎臟毒性和腎小管損傷進程導(dǎo)致惡化的自身永存性循環(huán)啟動，最終導(dǎo)致患者死亡(盡管死亡甚至能夠在不存在完全腎衰竭時發(fā)生)。
已經(jīng)用其他的抗葉酸化合物記錄到了腎臟毒性，但這可能不是起因于化合物的7-羥基化類似物。7-OH-MTX毒性發(fā)生于高MTX劑量，然而，本文所述更多抗葉酸藥物的給藥物量只能認為是MTX的“中等”劑量。
由于MTX毒性的致命性后果，MTX治療方案中通常包括保護措施
1.亞葉酸拯救亞葉酸鈣是5-甲酰四氫葉酸(也稱為亞葉酸/亞乙酸)的鈣鹽，是葉酸的DHFR代謝物和核酸合成的基本輔酶，其不被MTX所抑制(Immunex Corporation 2001)。結(jié)果，亞葉酸鈣能夠拯救MTX抑制的細胞。然而，在高濃度的MTX時，亞葉酸鈣可能不能阻止全身毒性的產(chǎn)生(Goldman，1975；Pinedo，1976)。MTX由亞葉酸鈣逆轉(zhuǎn)是競爭性的，當MTX濃度升高時需要相對更高的濃度。當MTX濃度達到100μM時，甚至高十倍的亞葉酸鈣濃度(1,000μM)也不能保護骨髓細胞不受毒性影響(Pinedo，1976)。
2.增強MTX的水溶性需要水合和堿化并因此阻止能夠?qū)е履I損傷的MTX腎毒性。
用這些措施可以將威脅生命的MTX毒性的影響范圍降低到約1.5％。然而，盡管這些預(yù)防措施，但是仍有可能發(fā)生由藥物相關(guān)的腎不足所引起的MTX清除延長，并導(dǎo)致嚴重的威脅生命的全身毒性，如骨髓抑制、粘膜炎、肝炎以及皮炎。過去，已經(jīng)作出幾種嘗試以改善患者的全身性MTX毒性。首先，血或腹膜透析能夠增強MTX清除，但通常只產(chǎn)生小而短暫的毒性血清MTX水平降低。第二，給予胸苷或強化的亞葉酸拯救能夠降低全身性MTX毒性，但不能增強MTX排泄。
目前，除了有限的例外，MTX在臨床應(yīng)用中是唯一的抗葉酸抗癌劑。因為MTX相對的安全性及可用性，已付出相當大的努力試圖設(shè)計出更多治療學(xué)上的選擇性抗葉酸藥或具有更廣泛腫瘤譜的抗葉酸藥。起初，所述設(shè)計基于葉酸依賴途徑和MTX作用機理決定因素的初步知識。這些決定因素包括轉(zhuǎn)運、其靶標的緊密結(jié)合性抑制、DHFR、以及MTX向聚-γ-谷氨酸(Glun)代謝物的代謝。這些早期研究促進兩種其他類型抗葉酸抑制劑的發(fā)展(1)與MTX使用相同的細胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的“經(jīng)典“類似物(如親脂的)，其同樣代謝為Glun；以及(2)不需要轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的“非經(jīng)典”類似物，其不代謝為Glun。雖然幾種這樣的類似物已在進行臨床試驗，但還沒有證實任何一種優(yōu)于MTX(McGuire，2003)。
對MTX細胞毒性和選擇性的機理的詳細研究表明，抑制DHFR后，dTMP合成和從頭開始的嘌呤合成的同時抑制導(dǎo)致DNA合成的抑制和隨后的細胞死亡；其他葉酸依賴途徑的抑制對細胞死亡不是必需的。進一步的研究表明dTMP或嘌呤合成的抑制對細胞死亡的作用在不同細胞類型中有所不同。這些資料顯示這些途徑之一的個別性抑制在治療學(xué)上可能(至少在一些實例中)優(yōu)于MTX誘導(dǎo)的雙重抑制。因此在合理的和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計研究中，詳細闡述了兩類新的抗葉酸酶抑制劑TS的直接抑制劑和嘌呤從頭開始合成中兩種葉酸依賴性酶之一或兩者兼有的直接抑制劑。每一類的成員同時包括經(jīng)典和非經(jīng)典類型。臨床前期評估后，這些中的幾種已進入臨床試驗。目前只有兩種新的抗葉酸化合物被批準用于常規(guī)用途；拓優(yōu)得(Tomudex)(D1694，雷替曲塞)目前在歐洲批準用于結(jié)腸癌的治療，Pemetrexed(Alimta)已在美國批準用于胸膜間皮瘤。這對于抗葉酸藥物來說也代表前進了一步，因為例如MTX對于結(jié)腸癌是無效的。
抗葉酸藥物的發(fā)展在繼續(xù)?；谀壳坝嘘P(guān)抗葉酸藥物的豐富的知識體系，作用機理的特定方面已經(jīng)成為焦點。已經(jīng)描述了更新的抗葉酸藥物，其抑制葉酸代謝中一種以上的途徑，具有改善的遞送，或者其抑制葉酸代謝中的其他靶標。這些新的類似物處于臨床前期和臨床期發(fā)展的不同階段(McGuire，2003；Kisliuk，2003；Purcell & Ettinger，2003；其中每一文獻均整體加入作為參考)。
與使用MTX類似，這些更新的抗葉酸藥物臨床使用的一個主要缺點是不可接受的毒性水平。體內(nèi)快速降解這些抗葉酸藥物的能力有兩個主要的臨床優(yōu)勢。首先，其將抗葉酸藥物所引發(fā)的毒性最小化。其還允許給藥更高劑量的抗葉酸化合物，可能產(chǎn)生更強的臨床效果。更低的毒性和更高的功效可能足以實現(xiàn)許多在臨床試驗中沒有進展的藥物的臨床前景。另外，由于與抗葉酸藥物相關(guān)的毒性正常情況下與持續(xù)時間相關(guān)而不與劑量相關(guān)，因而在指定時間點快速去除過量的游離藥物的能力在治療學(xué)上可能是非常有用的。
羧肽酶G2(CPG2)是來自多刺假單胞菌(Pseudomonas sp.)RS-16株(現(xiàn)在重新分類為Variovorax paradoxus)的葉酸降解酶，是83,000-84,000道爾頓的鋅依賴性二聚體蛋白(Kalghati & Bertino，1981；Chabner等，1972；McCullough等，1971；Minton等，1983；and Sherwood等，1985)。CPG2具有相對限制性特異性，水解葉酸的C端谷氨酸殘基、葉酸的聚谷氨酰衍生物、葉酸類似物，例如氨甲蝶呤、以及葉酸的亞片段如對氨基苯甲酰谷氨酸(Minton等，1983)。目前只在少量多刺假單胞菌中鑒定了羧肽酶，可以以其對葉酸及其類似物的底物親和性為基礎(chǔ)將其分離(Kalghatgi and Bertino，1981)。
Sherwood等(1985)先前已報道CPG2遵循Michaelis-Menten動力學(xué)，對葉酸的Km值為4μM，對MTX為8μM，對5-甲基THF為34μM，對5-甲酰THF為120μM(亞葉酸)。CPG2將氨甲蝶呤(MTX)分解為沒有活性的代謝物4-脫氧-4-氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)和谷氨酸，這樣可以提供MTX消除的又一途徑，尤其是在由于MTX腎毒性而發(fā)生腎功能障礙的患者中(Adamson等，1991；Mohty等，2000；von Poblozki等，2000；Widemann等，2000)。
對氨基苯甲酰谷氨酸是CPG2的底物，是許多基于對氨基苯甲酰谷氨酸的芥子氣的前藥(Springer等(1995)；Dowell等(1996))。然而，尚沒有報道嘗試評估是否任何新的抗葉酸藥物都是CPG2分解的底物的研究。本發(fā)明之前，不知道是否除葉酸、MTX、5-甲基THF和5-甲?；鵗HF之外的其他任何葉酸類化合物都是CPG2的底物。不知道也不能預(yù)測是否任何的新一代抗葉酸藥物都是CPG2分解的底物。
現(xiàn)在我們證明拓優(yōu)得(雷替曲塞)是CPG2的底物，用分光光度法檢測，其具有7.8μM的Km和24/s的kcat。所有已知的CPG2的底物在式I中包含A6的五元環(huán)等同位置都具有苯環(huán)，如下。另外，Springer等(1995)評估了芥子氣前藥對氨基苯甲酰谷氨酸衍生物，表明此苯環(huán)上的修飾可能對羧肽酶活性是有害的。相比較而言，拓優(yōu)得在這個位置具有噻吩環(huán)，其不是苯環(huán)的電子等排取代。因此，將不會預(yù)期拓優(yōu)得和其他在該位置具有噻吩的抗葉酸藥物如GARFT抑制劑LY309987、AG2034和AG2037(McGuire，2003)為CPG2的底物。類似地，也不會預(yù)期基于呋喃的等價物會是CPG2的底物。
抗葉酸化合物可用于治療一定范圍的醫(yī)學(xué)病癥，特別是癌癥，能夠抵抗與這些化合物相關(guān)的毒性將會顯著增加其治療學(xué)價值。
本發(fā)明的第一個方面提供抵抗由式I的抗葉酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或溶劑化物所引發(fā)的毒性的方法， 其中
R1為NH2，OH或CH3；R2為NH2或C1-4烷基；B基團為式Ia，Ib，Ic，Id或Ie的結(jié)構(gòu)片段， 在所述基團中，虛線代表環(huán)與嘧啶環(huán)稠合的位點，波浪線代表所述結(jié)構(gòu)片段連接于X基團的位點；R5a至R5e獨立地為H或C1-4烷基；A1為C(R6a)或N；A2為CH或N；A3為C(H)R6b，NR6c或S；A4和A5獨立地為CH2，NH，O或S；B1-B2基團為CH-CH或C＝C；R6a至R6c獨立地為H或C1-4烷基，或R6c為C(O)R6d，或R6c與R7b一起為C1-2正-亞烷基；R6d為H或C1-4烷基；X為-CH2C(H)R7a-或-CH2NR7b-(在后面兩個基團中的CH2部分連接于稠合的、基于嘧啶的雜環(huán)基團)；R7a和R7b獨立地為H，C1-6烷基，C3-6鏈烯基或C3-6炔基，或R7b與R6c一起為C1-2正-亞烷基；A6為O或S；R8為H或選自鹵素，C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或多個取代基；
R3為H或C1-4烷基；R4為-CH2C(R9a)(R9b)-D；R9a和R9b獨立地為H或C1-4烷基，或R9a和R9b一起為＝C(H)R10；R10為H或C1-4烷基；D為C(O)OH，四唑-5-基，(CH2)0-1-NHR11，或者，當R9a和R9b一起為＝C(H)R10時，D也可以為H，或者D為式IIIa或IIIb的結(jié)構(gòu)片段， 其中波浪線指所述結(jié)構(gòu)片段的連接位置；R11為H或C(O)R12；R12為H或由C(O)OH所取代以及任選地由選自鹵素，C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個其他取代基取代的苯基；和烷基、鏈烯基和炔基，以及烷氧基的烷基部分可以由一個或多個鹵原子取代；在給藥了所述化合物的個體中，所述方法包括為所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
本文所用術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。
可能提到的式I化合物的藥學(xué)上可接受鹽(也包括含有下述式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物的鹽)同時包括酸加成鹽和金屬(例如，堿金屬，如鈉或鉀)鹽。溶劑化物包括水合物。
式I的化合物可以顯示出互變現(xiàn)象。特別是，其中R1為OH的式I化合物或者也可以如下描述。
所有互變異構(gòu)體形式及其混合物均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可能提到的式I化合物包括下述(1)式I化合物，其中X為-CH2NR7b-且B為式Ia的結(jié)構(gòu)片段，該式Ia中的A1和A2均為N或式Ic的結(jié)構(gòu)片段。
(2)式I化合物，其中X為-CH2NR7b-。
(3)式I化合物，其中X為-CH2C(H)R7a-。
(4)式I化合物，其中D為四唑-5-基，(CH2)0-1-NHR11，或者，當R9a和R9b一起為＝C(H)R10時，D也可以為H，或D為式IIIa或IIIb的結(jié)構(gòu)片段。
(5)式I化合物，其中R6b與R7b一起為C1-2正-亞烷基且B基團為式Ic，Id或Ie的結(jié)構(gòu)片段，或者式Ia的結(jié)構(gòu)片段，該式Ia中的A1和/或A2為CH。
(6)式I化合物，其中B基團為式Id或Ie的結(jié)構(gòu)片段，或者Ia的結(jié)構(gòu)片段，該式Ia中的A1和A2均為CH。
(7)式I化合物，其中R1為OH且R7b為C1-6烷基，C3-6鏈烯基或C3-6炔基，或者R7b與R6c一起為C1-2正-亞烷基。
可能提到的其他式I化合物包括下述化合物，其中R1為NH2或者具體地為OH；R2為NH2或甲基；B基團為式Ia，Ic或Id的結(jié)構(gòu)片段；A1和A2均為N或者具體地都為CH；R5a，R5c和R5d獨立地為H或者，當A1和A2都為CH時，R5a也可以為甲基；A3為S或者具體地為CH2；A4和A5獨立地為NH；基團B1-B2為CH-CH；R7a為H，甲基或乙基；R7b為甲基或-CH2C≡CH；A6為S；R8為甲基或者具體地為H；R3為H；R9a和R9b都為H或者R9a和R9b一起為＝CH2；R11為由C(O)OH鄰位取代的苯基。
還可能提到更多的式I化合物，其中R2為甲基；基團B為式Ia的結(jié)構(gòu)片段；R5a為H；
X為-CH2NR7b-；R7b為甲基；D為C(O)OH；R9a和R9b都為H。
在優(yōu)選實施方案中，式I化合物為其中A6為S的化合物(即所述化合物包含2，5-噻吩基)。合適的化合物包括拓優(yōu)得(式IV)，LY309987(式V)，AG2034(式VI)和AG2037(式VII)。拓優(yōu)得是最優(yōu)選的。
在另一實施方案中，式I化合物為其中X為-CH2NR7b-的化合物，其中R7b為-CH2C≡CH。
“具有羧肽酶G活性的酶”包括水解葉酸、葉酸類似物、和葉酸的亞片段如對氨基苯甲酰谷氨酸的C端L-谷氨酸殘基的酶。
優(yōu)選地，具有羧肽酶G活性的酶是羧肽酶G2(CPG2)，EC編號3.4.22.12。
編碼CPG2的基因的序列和CPG2的氨基酸序列可在GenBank中找到，登錄號為M12599和AAA62842，也可在Minton等(Gene 31(1-3)，31-38(1984))，Minton and Clarke(J.Mol.Appl.Genet.3(1)，26-35(1985))；和Chambers等(Appl.Microbiol.Biotechnol.29，572-578(1998))中找到，氨基酸序列列于

圖1。
在一個實施方案中，具有羧肽酶G活性的酶可以是具有羧肽酶G活性的CPG2的衍生物。CPG2的“衍生物”包括CPG2的片段、變體、修飾物或稠合物或其組合，其具有羧肽酶G活性。
可以用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)如采用部分蛋白水解(外部水解或內(nèi)部水解)、或通過重新開始從頭合成來制備衍生物?；蛘撸梢杂弥亟MDNA技術(shù)制備所述衍生物。適合用于克隆、操作、修飾和表達核酸，純化表達的蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，例如描述于Sambrook等(2001)“MolecularCloning，a Laboratory Manual”，3rdedition，Sambrook er al(eds)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA，本文作為參考。
CPG2的“片段”意指具有羧肽酶G活性的全長酶的任何部分。典型地，所述片段具有CPG2的至少30％的羧肽酶G活性。如果所述片段具有至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％的CPG2的活性則是更優(yōu)選的。最優(yōu)選所述片段具有CPG2的100％或更高的羧肽酶G活性。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員使用Sherwood等(1985)中第448頁所述的酶測試方法可以很容易地測定CPG2衍生物的羧肽酶G活性。Sherwood等(1985)的全部內(nèi)容加入本文作為參考。
CPG2的“變體”(variant)指通過在一個或多個位點保守性或非保守性地插入、刪除和/或取代氨基酸而被改變的CPG2?！氨Ｊ匦匀〈敝咐鏕ly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr的組合。這樣的修飾可以用蛋白質(zhì)工程和定點突變方法完成，如Sambrook等2001，supra中所述。
例如，修飾一種或同時修飾兩種酶的活性位點的一個或多個殘基可能是有利的。這樣的變體可以有利地改變酶的特異性或活性。Rowsell等(1997)發(fā)表了CPG2的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，并鑒定了酶的活性位點。在其他實施方案中，不修飾活性位點的殘基可能是有利的。典型地，位于活性位點之外的序列變體可能能夠保護酶不在體內(nèi)代謝或減小抗原性。此外，添加一個或多個Cys殘基以允許形成二硫鍵可能也是有利的。
優(yōu)選CPG2的變體與SEQ ID No1有至少70％的序列同一性。如果變體CPG2與SEQ ID No1有至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％的序列同一性則是更優(yōu)選的。最優(yōu)選變體CPG2與SEQ ID No1有91或92或93或94或95或96或97或98或99％或更高的序列同一性。
兩個多肽之間的序列同一性百分數(shù)可以用合適的計算機程序測定，例如威斯康辛基因計算小組(Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序，其將可以理解所計算的相對于已作最佳比對的多肽的一致性百分數(shù)。
或者也可以用Clustal W程序(Thompson等，(1994)Nucleic Acids Res 22，4673-80)進行比對。可以使用如下參數(shù)快速成對比對參數(shù)K-tuple(字)大??；1，窗口大?。?，空位罰分；3，上部對角線數(shù)；5.計分方法百分之x。
多重比對參數(shù)空位開放罰分；10，空位擴展罰分；0.05。
計分陣列BLOSUM。
優(yōu)選CPG2的變體或變體的片段保留CPG2的至少30％的羧肽酶G活性。如果變體CPG2具有CPG2的至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少90％的活性則是更優(yōu)選的。最優(yōu)選CPG2的變體具有CPG2的100％或更高的羧肽酶G活性。
已描述了具有羧肽酶G活性的CPG2的變體(US專利申請2004/0014187)。
在一個實施方案中，CPG2的變體在222、264和272位點的一個或多個Asn殘基處有取代，這些位點是N糖基化位點。優(yōu)選獨立地或組合地，Asn222由Gln取代；Asn 264由Thr或Ser，最優(yōu)選Ser取代；Asn 272由Gln取代。最優(yōu)選的取代組合是222和272位點為Gln，264位殘基為Ser。該QSQ基序?qū)е聦TX的高催化活性和低Km(US 2004/0014187)。
CPG2“修飾”指其中一個或多個氨基酸殘基被化學(xué)修飾的CPG2。這樣的修飾包括與酸或堿，尤其是生理學(xué)上可接受的有機或無機酸和堿形成鹽，形成末端羧基的酯或酰胺，連接上氨基酸保護基團如N-t-丁氧羰基和糖基化。這樣的修飾能夠保護酶不在體內(nèi)代謝或減小抗原性。CPG2可以作為單一拷貝或多拷貝例如銜接重復(fù)存在。
本發(fā)明還包括CPG2、或其具有羧肽酶G活性的片段或變體與其他化合物的稠合物。優(yōu)選所述稠合物保留了CPG2的至少30％的活性。如果所述稠合物具有CPG2的至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少90％的活性則是更優(yōu)選的。最優(yōu)選所述稠合物具有CPG2的100％或更高的羧肽酶G活性。
本發(fā)明可用于減輕個體中由式I的抗葉酸化合物引發(fā)的毒性癥狀(即緩解用途)，或者可用于降低個體中毒性的嚴重性，或者可用于治療個體中的毒性，或者可用于預(yù)防性地防止個體中的毒性。因此，“抵抗毒性”包括治療、減緩或防止由抗葉酸化合物引發(fā)的毒性，或者緩解其癥狀。
具有羧肽酶G活性的酶典型地通過快速降低藥物的血漿水平而發(fā)揮作用，以抵抗由式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性，因此縮短了正常組織與所述藥物的接觸時間并防止更長時間的吸收。
預(yù)期一個人是不是能夠從所述治療中獲益的特定患者可以由醫(yī)師確定。
防止毒性包括治療具有毒性風(fēng)險的患者的意思，例如所述毒性起因于例如高水平的和/或消除延遲的式I的抗葉酸化合物。任何給藥了抗葉酸化合物的患者都可認為具有由其引發(fā)的毒性風(fēng)險。
在一個實施方案中，具有毒性風(fēng)險的個體可以是給藥了抗葉酸化合物，且未曾測定由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性標志的存在的個體。
在另一實施方案中，具有毒性風(fēng)險的個體可以是已給藥了抗葉酸化合物且具有一種或多種由其引發(fā)的臨床毒性標志的個體。
因此在一個實施方案中，所述方法可以包括測定個體是否具有由抗葉酸化合物引發(fā)的臨床毒性標志的前期步驟，其中所述個體給藥了式I的抗葉酸化合物。
在一個實施方案中，由式I的抗葉酸化合物引發(fā)的臨床毒性標志可以是在給藥化合物后的指定時刻，高于預(yù)先確定的水平的化合物的水平，例如血漿水平。預(yù)先確定的指示毒性的抗葉酸化合物的血漿水平可以為在給藥抗葉酸化合物后24小時時，每升0.1或0.2或0.3或0.4或0.5或0.6或0.7或0.8或0.9μmole，或者每升1或2或3或4或5μmole或更多，或者是在給藥抗葉酸化合物后48小時、或72或96或120小時時，或更長時間時。
因此，在另一個實施方案中，所述方法包括在為個體給藥化合物后的指定時刻測定個體中抗葉酸化合物水平的前期步驟，例如在給藥抗葉酸化合物后24或48、或72或96或120小時時或更長時間時。
本發(fā)明包括為給藥了上述定義的式I的抗葉酸化合物的個體給藥具有羧肽酶G活性的酶，所述個體或者具有由所述化合物引發(fā)的毒性癥狀，或者沒有。
在一個實施方案中，為給藥了式I的抗葉酸化合物的每一個體給藥所述的酶是優(yōu)選的，所述給藥在例如給藥了式I化合物后的指定時刻進行。
因此本發(fā)明可視為體內(nèi)分解上述定義的式I的抗葉酸化合物的方法。
在另一實施方案中，具有毒性風(fēng)險的個體可以是給藥了抗葉酸化合物且具有由其引發(fā)的一種或多種臨床毒性癥狀的個體。
因此在一個實施方案中，所述方法可以包括測定給藥了抗葉酸化合物的個體是否具有由抗葉酸化合物引發(fā)的臨床毒性癥狀的前期步驟。
以上定義的多種式I的抗葉酸化合物的毒性癥狀是熟知的。例如，雷替曲塞雷替曲塞(拓優(yōu)得)的毒性包括輕微的粘膜炎、骨髓抑制、嗜中性白細胞減少癥、輕微貧血、脫水、腹瀉、惡心、虛弱、肝中毒(Tsavaris等，2002；Massacesi等，2003)；LY309887的毒性包括遲發(fā)性血液、神經(jīng)和粘膜毒性(Kisliuk，2003)；AG2034的毒性包括貧血、血小板減少癥、粘膜炎、腹瀉、肝毒性、疲勞和失眠(McGuire，2003)。
典型地，在給藥了抗葉酸化合物后約24和48小時之間向個體給藥具有羧肽酶G活性的酶?；蛘?，可以在給藥了抗葉酸化合物后約12和24小時之間、或約48和72小時之間、或約72和96小時之間、或約96和120小時之間，向個體給藥所述的酶。
可以在給藥了抗葉酸化合物后約6小時、或約12小時、或約18小時、或約24小時，或約30小時、或約36小時、或約42小時、或約48小時、或約54小時、或約60小時、或約72小時、或約84小時、或約96小時、或約108小時、或約120小時、或更長時間時向個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
如果錯誤地向個體給藥了抗葉酸化合物，那么優(yōu)選一旦發(fā)現(xiàn)該錯誤就盡快給藥具有羧肽酶G活性的酶，以抵抗由抗葉酸化合物引發(fā)的毒性，這是可以理解的。類似地，如果個體具有抗葉酸化合物引發(fā)的臨床毒性標志，或者具有抗葉酸化合物引發(fā)的臨床毒性癥狀，盡早給藥所述的酶也是優(yōu)選的。
在每周3次的方案中，發(fā)現(xiàn)成人的拓優(yōu)得最大耐受劑量是3.5至4.5mg/m2，兒童群體是6mg/m2(Clarke等，2000)。接下來依據(jù)抗葉酸化合物的減少來給藥具有羧肽酶G活性的酶，這可以增加抗葉酸化合物的最大耐受劑量，因此提高了藥物的功效并使所有副作用最小化。
因此本發(fā)明包括為本文所述的需要的個體給藥高劑量的式I的抗葉酸化合物，例如給藥2或3或4或5或6或7或8或9或10或更多次上述的劑量，隨后為所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
因此本發(fā)明包括在每周3次的施藥方案中，向成年個體給藥等同于約5或6或7或8或9或10或15或20或25或30或40或50mg/m2或更高劑量的拓優(yōu)得，或者在每周3次的施藥方案中，為兒童給藥等同于約7或8或9或10或15或20或25或30或40或50mg/m2或更高劑量的拓優(yōu)得，隨后向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
可以通過任何的傳統(tǒng)方法包括腸胃外(例如皮下或肌肉內(nèi))注射給藥具有羧肽酶G活性的酶或其制劑。所述治療可以由一段時期的單一劑量或多劑量組成。
最優(yōu)選靜脈內(nèi)注射具有羧肽酶G活性的酶或其制劑。
在一些情況下，可以鞘內(nèi)(intrathecally)給藥具有羧肽酶G活性的酶或其制劑，典型地當鞘內(nèi)給藥了式I的抗葉酸化合物時。
對獼猴的研究表明靜脈內(nèi)給藥后的CPG2血漿半衰期在52到58分鐘之間。為獼猴鞘內(nèi)給藥后，估計腦脊液中CPG2的半衰期在3.3到3.9小時之間。
雖然單獨給藥具有羧肽酶G活性的酶是可能的，但優(yōu)選作為藥物制劑，與一種或多種可接受的載體一起。所述載體在可與本發(fā)明化合物兼容的意義上必須是“可接受的”，不能有害于其受體。典型地，所述載體可以是無菌無熱原的水或生理鹽水。
在優(yōu)選實施方案中，以容易制成所需注射溶液的凍干粉末形式存儲具有羧肽酶G活性的酶。典型地，在馬上要用之前，用無菌的正常生理鹽水(0.9％W/V)重新溶解凍干酶瓶子中的內(nèi)容物。
在優(yōu)選實施方案中，除了對乳糖高度過敏的患者外，具有羧肽酶G活性的酶制劑也可以包含作為非活性成分的乳糖。
典型地，在5分鐘期間以每kg體重約50個單位的劑量(1個單位對應(yīng)于37℃下每分鐘裂解1微摩爾MTX的酶活性)為個體靜脈內(nèi)給藥具有羧肽酶G活性的酶。
可以理解能夠以每kg/體重約0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40或45個單位的更低劑量給藥所述的酶。也可以理解能夠以每kg/體重約55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，150或200或更高單位的更高劑量給藥所述的酶。
醫(yī)師利用酶特性的知識、患者體內(nèi)抗葉酸酶的水平以及患者任何毒性癥狀的程度，可以確定給藥具有羧肽酶G活性的酶的頻率、時間和劑量。
可以理解，能夠用可注射的緩釋藥物遞送系統(tǒng)遞送蛋白質(zhì)和肽。特別設(shè)計這些用于減少注射的頻率。這種系統(tǒng)的例子是Nutropin Depot，該系統(tǒng)中裝入了可生物降解形式的重組人生長激素(rhGH)，一旦被注射，將在緩釋期間緩慢地釋放rhGH。
蛋白質(zhì)和多肽遞送的可選方法是溫度敏感的ReGel可注射系統(tǒng)。低于體溫時，ReGel是可注射的液體，而處于身體溫度時其立刻形成凝膠儲存庫，緩慢地消蝕并溶解成已知的、安全的、可生物降解的多聚體。隨著生物多聚體的溶解而遞送活性藥物。
還可以理解，可以為個體給藥編碼具有羧肽酶活性的酶的多核苷酸，使酶在體內(nèi)表達。合適的載體和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
所要治療的個體可以是任何能夠從這種治療中獲益的個體。典型且優(yōu)選地，所要治療的個體是人。然而，本發(fā)明的方法可用于治療哺乳動物，如牛、馬、豬、羊、貓和狗。因此，所述方法同時具有人用藥和獸用藥的用途。
在一個實施方案中，所述抵抗毒性的方法進一步包括為個體給藥葉酸途徑拯救劑，其中所述毒性由上述定義的式I的抗葉酸化合物引發(fā)。
“葉酸途徑拯救劑”的意思包括能夠拯救由抗葉酸化合物所阻斷的葉酸途徑的試劑。最常用的葉酸途徑拯救劑是亞葉酸鈣，5-甲酰基四氫葉酸的鈣鹽?？蛇x的拯救劑可以包括5-甲?；臍淙~酸的其他鹽，以及胸苷本身。典型地，如果抗葉酸化合物是DHFR或GARFT的抑制劑，則葉酸途徑拯救劑是亞葉酸鈣，然而，如果抗葉酸化合物是TS的抑制劑，則葉酸途徑拯救劑是胸苷。
例如，已知拓優(yōu)得(雷替曲塞)是TS的抑制劑，已知LY309987，AG2034和AG2037是GARFT抑制劑(McGuire，2003；Kisliuk，2003)。因此，可以很容易確定合適的葉酸途徑拯救劑。
在一個實施方案中，個體在葉酸途徑拯救劑之前給藥具有羧肽酶G活性的酶。或者，個體也可以在給藥具有羧肽酶G活性的酶之前給藥葉酸途徑拯救劑。在又一實施方案中，可以基本上同時給藥葉酸途徑拯救劑和具有羧肽酶G活性的酶。
抗葉酸化合物可用于治療一定范圍的醫(yī)學(xué)病癥，能夠抵抗與這些化合物有關(guān)的毒性將會提高其治療學(xué)價值。
本發(fā)明包括治療選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病的方法，所述方法包括為個體給藥以上定義的式I的抗葉酸化合物，然后為個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
隨后給藥具有羧肽酶G活性的酶會抵抗由上述抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性。
因此，本發(fā)明包括治療選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病的方法，該方法包括為個體給藥上述定義的式I的抗葉酸化合物，并抵抗由上述抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性。
可以用式I的抗葉酸化合物治療的癌癥是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，McGuire(2003)；Kisliuk(2003)；和Purcell & Ettinger(2003)，以及在以下提到的特定參考文獻中討論了其中一些。
本發(fā)明包括治療癌癥的方法，所述方法包括為個體給藥拓優(yōu)得，并通過給藥具有羧肽酶G活性的酶來抵抗由拓優(yōu)得引發(fā)的毒性。
要通過給藥拓優(yōu)得來治療的癌癥可以是乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸/直腸癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌或胃癌，以及非小細胞肺癌(NSCLC)、惡性間皮瘤或不明原發(fā)癌癥(Clarke等(2000)；Tsavaris等(2002)；Franchi等2003)；和Massacesi等(2003))。
本發(fā)明包括治療癌癥的方法，所述方法包括為個體給藥LY309887，并通過給藥具有羧肽酶G活性的酶來抵抗由LY309887所引發(fā)的毒性。要通過給藥LY309887來治療的癌癥可以是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或胰腺癌(McGuire，2003)。
本發(fā)明包括治療癌癥的方法，所述方法包括為個體給藥AG2034，并通過給藥具有羧肽酶G活性的酶來抵抗由AG2034所引發(fā)的毒性。要通過給藥AG2034來治療的癌癥可以是乳腺癌、結(jié)腸癌或肺癌、黑素瘤或淋巴瘤(McGuire，2003)。
本發(fā)明包括治療癌癥的方法，所述方法包括為個體給藥AG2037，并通過給藥具有羧肽酶G活性的酶來抵抗由AG2037所引發(fā)的毒性。要通過給藥AG2037來治療的癌癥可以是實體腫瘤，如進行性的、轉(zhuǎn)移性的或復(fù)發(fā)性的實體腫瘤(McGuire，2003)。
本發(fā)明的第二個方面提供具有羧肽酶G活性的酶在制備用于抵抗毒性的用途，所述毒性由上述本發(fā)明第一個方面中所定義的式I的抗葉酸化合物所引發(fā)。
在本發(fā)明的該方面和隨后的方面中，優(yōu)選的式I的抗葉酸化合物如以上本發(fā)明第一個方面所述。
本發(fā)明包括具有羧肽酶G活性的酶用于抵抗個體中毒性的用途，所述個體具有多種由上述化合物的毒性所引發(fā)的臨床征候、癥狀或標志之一(oneof more clinical signs，symptoms or markers of toxicity caused by saidcompound，as described above)。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗個體中由上述定義的式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性，向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑?？梢栽谒鏊幬镏盀樗鰝€體給藥葉酸途徑拯救劑，或者可以在所述藥物之后為所述個體給藥葉酸途徑拯救劑，或者可以基本上同時為所述個體給藥葉酸途徑拯救劑和所述藥物。
在本發(fā)明的該方面和隨后的方面中，優(yōu)選的葉酸途徑拯救劑如以上本發(fā)明第一個方面所述。
本發(fā)明的第三個方面提供由上述定義的式I的抗葉酸化合物在制備用于在隨后給藥具有羧肽酶G活性的酶的個體中，抵抗病癥的藥物中的用途，所述病癥是能夠由所述的抗葉酸化合物抵抗的。
在一個實施方案中，也為所述個體給藥葉酸途徑拯救劑?？梢栽谌~酸途徑拯救劑之前、之后或與之同時給藥具有羧肽酶G活性的酶。
本發(fā)明的第四個方面提供葉酸途徑拯救劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗在個體中由上述定義的式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性，所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。可以在所述藥物之前向所述個體給藥所述的酶，或者可以在所述藥物之后向所述個體給藥所述的酶，或者可以基本上同時為所述個體給藥所述的酶和所述藥物。
本發(fā)明的第五個方面提供具有羧肽酶G活性的酶和葉酸途徑拯救劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗由上述定義的式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性。
本發(fā)明包括以上定義的本發(fā)明第二、第三、第四和第五個方面用于抵抗個體中毒性的用途，所述毒性由式I的抗葉酸化合物所引發(fā)，所述個體通過如以上所詳述的給藥抗葉酸化合物治療選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕、和移植物抗宿主疾病。
本發(fā)明的第六個方面提供以上定義的式I的抗葉酸化合物在制備用于治療個體病癥的藥物中的用途，所述病癥選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病，隨后向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括拓優(yōu)得(雷替曲塞)在制備用于治療個體癌癥的藥物中的用途，所述個體被給藥具有羧肽酶G活性的酶。本發(fā)明還包括具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗由拓優(yōu)得所引發(fā)的毒性。典型地，已為所述個體給藥了拓優(yōu)得以治療癌癥。
要通過給藥拓優(yōu)得來治療的癌癥可以是乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸/直腸癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌或胃癌，以及NSCLC、惡性間皮瘤或不明原發(fā)癌癥。
同樣，可以通過給藥包含LY309887，AG2034和AG2037的藥物治療的癌癥是本領(lǐng)域已知的，包括以上所列出的。
因此，本發(fā)明包括具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕、和移植物抗宿主疾病的輔助治療，這些疾病正在通過給藥式I的抗葉酸化合物來治療。
本發(fā)明的第七個方面提供從上述定義的式I化合物裂解末端L-谷氨酸部分的體外方法，所述方法包括將所述化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸。
本發(fā)明的第八個方面提供測定具有羧肽酶G活性的酶裂解以上定義的式I化合物的速率和/或程度的方法，所述方法包括提供式I化合物，在所述化合物的裂解能夠發(fā)生的條件下，將式I化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸，和隨著時間的推移，監(jiān)測式I化合物分解的速率和/或程度。
在一個實施方案中，提供步驟包括提供已知量或已知濃度的式I化合物。
在一個實施方案中，所述監(jiān)測步驟包括隨時間推移，監(jiān)測式I化合物的量和/或濃度。此外，或者任選地，所述監(jiān)測步驟包括隨時間推移，監(jiān)測式I化合物的一種或多種裂解產(chǎn)物的量和/或濃度。
可以理解，測定裂解的速率和/或程度可以在體外進行，或者也可以在體內(nèi)進行。
當所述方法在體內(nèi)進行時，其可用于監(jiān)測用具有羧肽酶G活性的酶處理后仍然未被裂解的式I化合物的水平。因此，所述方法可用于監(jiān)測具有羧肽酶G活性的酶在抵抗與式I化合物相關(guān)的毒性中的效力。
所述方法可進一步包括測定為了將式I化合物的量減少到預(yù)定水平，是否需要額外劑量的具有羧肽酶G活性的酶，典型地，所述預(yù)定水平是不會導(dǎo)致毒性的水平。還可以測定要以額外劑量給藥的酶的量。
因此所述方法也可以包括在所述化合物的裂解能夠發(fā)生的條件下，將式I化合物與額外劑量的具有羧肽酶G活性的酶接觸。
本發(fā)明的第九個方面提供治療系統(tǒng)(或者可以稱為“試劑盒組件”)，所述治療系統(tǒng)由如上定義的式I的抗葉酸化合物和具有羧肽酶G活性的酶組成，或者包括如上定義的式I的抗葉酸化合物和具有羧肽酶G活性的酶。任選地，所述治療系統(tǒng)還可以包含葉酸途徑拯救劑。
優(yōu)選地，治療系統(tǒng)包含本發(fā)明第一個方面如上定義的式I的優(yōu)選化合物，最優(yōu)選拓優(yōu)得。更優(yōu)選所述治療系統(tǒng)包含羧肽酶G2，或其具有羧肽酶G活性的衍生物，如本發(fā)明第一個方面所定義的。本發(fā)明第一個方面也定義了優(yōu)選的葉酸途徑拯救劑。所述治療系統(tǒng)或試劑盒組件同時包含式I的化合物和具有羧肽酶G活性的酶也是合適的，任選地還包含葉酸途徑拯救劑，包裝或呈現(xiàn)為適當?shù)闹苿┬问揭源鎯蚴褂谩＿@樣，具有羧肽酶G活性的酶可以是例如易于重新溶解(reconstituted)為注射用溶液的凍干粉末，或者已經(jīng)重新溶解為注射用溶液。典型地，式I的化合物和所述酶用于在具體的治療方案中分開給藥，因此將其分開包裝或配制。所述的酶和葉酸途徑拯救劑可以一起給藥，因此，可將其配制為共給藥的形式。
上述定義的優(yōu)選的治療系統(tǒng)或試劑盒包含拓優(yōu)得、羧肽酶G2以及，任選地，胸苷。
本發(fā)明的第十個方面提供分解包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或其溶劑化物的方法， 其中波浪線表示結(jié)構(gòu)片段的連接位置；A6為O或S；R8為H或選自鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個取代基；R3為H或C1-4烷基；R4為-CH2C(R9a)(R9b)-D；
R9a和R9b獨立地為H或C1-4烷基，或R9a和R9b一起為＝C(H)R10；R10為H或C1-4烷基；D為C(O)OH，四唑-5-基，(CH2)0-1NHR11，或者，當R9a和R9b一起為＝C(H)R10時，則D也可以為H，或者D為式IIIa或IIIb的結(jié)構(gòu)片段， 其中波浪線表示結(jié)構(gòu)片段的連接位置；R11為H或C(O)R12；R12為H或者由C(O)OH取代的以及任選地由選自鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個其他取代基取代的苯基；且烷基、鏈烯基和炔基，以及烷氧基的烷基部分可以由一個或多個鹵原子取代；所述方法包括將包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸。
優(yōu)選A6為S。
優(yōu)選的具有羧肽酶G活性的酶與以上本發(fā)明第一個方面所述相同。
在一個實施方案中，所述方法可以在活體外(ex vivo)如體外(in vivo)進行。
在可選實施方案中，所述方法可以在體內(nèi)進行。
典型地，包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物是抗葉酸化合物。
在一個實施方案中，當在醫(yī)學(xué)治療過程中將包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的抗葉酸化合物給藥于個體時，或者，本發(fā)明提供抵抗由抗葉酸化合物引發(fā)的毒性的方法，所述方法包括為個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
因此，本發(fā)明包括具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗由包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的抗葉酸化合物引發(fā)的毒性。
在本發(fā)明第十個方面的藥物用途的上下文中，當包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物是抗葉酸化合物時，所使用的優(yōu)選的葉酸途徑拯救劑、藥物制劑、給藥的時刻和水平、所要治療的患者和疾病等等與上述本發(fā)明的第一個方面相同。
本文提到的所有文獻，在此整體引入到本文中作為參考。
本說明書列舉或討論了在先出版的文獻，但不應(yīng)因此就必然認為所述文獻是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或者是公知常識。
現(xiàn)在將通過參考以下的附圖和實施例更詳細地闡述本發(fā)明。
圖1為CPG2(SEQ ID No1)的氨基酸序列。
圖2顯示CPG2的五種底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。拓優(yōu)得(式IV)，LY309887(式V)，AG2034(式VI)，AG2037(式VII)和甲氨喋呤(式X，現(xiàn)有技術(shù))實施例1CPG2的新底物的鑒定A拓優(yōu)得(式IV)拓優(yōu)得是胸苷酸(thymidilate)合成酶抑制劑(Astra Zeneca)。將拓優(yōu)得與CPG2在體外接觸，發(fā)現(xiàn)其為CPG2的底物，如下所述。
用分光光度法測量了用CPG2對拓優(yōu)得的去谷氨?；?Deglutamylation)。制備了10mM拓優(yōu)得的100mM Tris-HCl pH7.3母液，用于制備0-100μM的100mM Tris-HCl pH 7.3系列稀釋液。將各990μl的每種稀釋液置于石英試管中預(yù)熱到37℃。加入10μl酶溶液以啟動反應(yīng)，反應(yīng)進程結(jié)束后測量356nm處的吸光度變化速率。在用過量的CPG2完全轉(zhuǎn)化100μM溶液后，測量拓優(yōu)得在356nm處的消光系數(shù)改變，以計算由于100nmol拓優(yōu)得的完全轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的消光系數(shù)改變。然后，可以由此數(shù)據(jù)將測得的速率轉(zhuǎn)化為所測得的μmol/min(Vmax)，以及Km和kcat值。
在1-100μM的底物濃度范圍獲得的反應(yīng)速率測量值允許用合適的計算機軟件如“Enzfitter”(Biosoft，Cambridge，UK)測定酶的Km和kcat。分光光度測試結(jié)果顯示拓優(yōu)得是CPG2的底物，具有7.8μM的Km和24/s的Kcat。
BLY309887(式V)LY309887是GARFT抑制劑(Eli Lilly)。將LY309887與CPG2體外接觸，發(fā)現(xiàn)其為CPG2的底物。
用分光光度法測量用CPG2對LY309887的去谷氨?；?。制備10mMLY309887的100mM Tris-HCl pH7.3母液，用于制備0-100μM的100mMTris-HCl pH 7.3系列稀釋液。將各990μl的每種稀釋液置于石英試管中預(yù)熱到37℃。加入10μl酶溶液以啟動反應(yīng)，反應(yīng)進程結(jié)束后在合適的波長值測量吸光度變化速率。在用過量的CPG2完全轉(zhuǎn)化100μM溶液后，測量LY309887的消光系數(shù)改變，以計算由于100nmol LY309887的完全轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的消光系數(shù)改變。由此數(shù)據(jù)將測得的速率轉(zhuǎn)化為μmol/min值。在1-100μM的底物濃度范圍獲得的反應(yīng)速率測量值允許用Enzfitter計算機軟件測定酶的Km和kcat。
CAG2034(式VI)在體外將GARFT抑制劑AG2034與CPG2接觸，發(fā)現(xiàn)其為CPG2的底物。
用分光光度法測量CPG2對AG2034的去谷氨?；Ｖ苽?0mM AG2034的100mM Tris-HCl pH7.3母液，用于制備0-100μM的100mM Tris-HCl pH7.3系列稀釋液。將各990μl的每種稀釋液置于石英試管中預(yù)熱到37℃。加入10μl酶溶液以啟動反應(yīng)，反應(yīng)進程結(jié)束后在合適的波長值測量吸光度變化速率。在用過量的CPG2完全轉(zhuǎn)化100μM溶液后，測量AG2034的消光系數(shù)改變，以計算由于100nmol AG2034的完全轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的消光系數(shù)改變。由此數(shù)據(jù)將測得的速率轉(zhuǎn)化為μmol/min值。在1-100μM的底物濃度范圍獲得的反應(yīng)速率測量值允許用Enzfitter計算機軟件測定酶的Km和kcat。
DAG2037(式VII)在體外將GARFT抑制劑AG2037與CPG2接觸，發(fā)現(xiàn)其為CPG2的底物。
用分光光度法測量CPG2對AG2037的分解。制備10mM AG2037的100mM Tris-HCl pH7.3母液，用于制備自0-100μM的100mM Tris-HCl pH 7.3系列稀釋液。將各990μl的每種稀釋液置于石英試管中預(yù)熱到37℃。加入10μl酶溶液以啟動反應(yīng)，反應(yīng)進程結(jié)束后在合適的波長值測量吸光度變化速率。在用過量的CPG2完全轉(zhuǎn)化100μM溶液后，測量AG2037的消光系數(shù)改變，以計算由100nmol AG2037的完全轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的消光系數(shù)改變。由此數(shù)據(jù)將測得的速率轉(zhuǎn)化為μmol/min值。在1-100μM的底物濃度范圍獲得的反應(yīng)速率測量值允許用Enzfitter計算機軟件測定酶的Km和kcat。
實施例2通過給藥CPG2拯救拓優(yōu)得毒性在5分鐘期間，以每kg體重50個單位的劑量，向給藥了拓優(yōu)得并具有毒性拓優(yōu)得血漿水平的患者靜脈內(nèi)給藥CPG2?；颊叩耐貎?yōu)得血漿濃度降至無毒水平。
實施例3通過給藥CPG2和胸苷拯救拓優(yōu)得毒性在5分鐘期間，以每kg體重50個單位的劑量，向給藥了拓優(yōu)得并具有毒性拓優(yōu)得血漿水平的患者靜脈內(nèi)給藥CPG2，并向其給藥胸苷。胸苷拯救與拓優(yōu)得有關(guān)的細胞毒性，而CPG2將拓優(yōu)得血漿濃度急劇降至無毒水平。
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權(quán)利要求
1.抵抗由式I的抗葉酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或溶劑化物引發(fā)的毒性的方法， 其中R1為NH2，OH或CH3；R2為NH2或C1-4烷基；基團B為式Ia，Ib，Ic，Id或Ie的結(jié)構(gòu)片段， 在所述基團中，虛線表示環(huán)與嘧啶環(huán)稠合的位置，波浪線表示所述結(jié)構(gòu)片段連接于基團X的位點；R5a至R5e獨立地為H或C1-4烷基；A1為C(R6a)或N；A2為CH或N；A3為C(H)R6b，NR6c或S；A4和A5獨立地為CH2，NH，O或S；基團B1-B2為CH-CH或C＝C；R6a至R6c獨立地為H或C1-4烷基，或者R6c為C(O)R6d，或者R6c與R7b一起為C1-2正-亞烷基；R6d為H或C1-4烷基；X為-CH2C(H)R7a-或-CH2NR7b-(在后面的兩個基團中，CH2部分連接于稠合的、基于嘧啶的雜環(huán)基團)；R7a和R7b獨立地為H，C1-6烷基，C3-6鏈烯基或C3-6炔基，或者R7b與R6c一起為C1-2正-亞烷基；A6為O或S；R8為H或選自鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個取代基；R3為H或C1-4烷基；R4為-CH2C(R9a)(R9b)-D；R9a和R9b獨立地為H或C1-4烷基，或者R9a和R9b一起為＝C(H)R10；R10為H或C1-4烷基；D為C(O)OH，四唑-5-基，(CH2)0-1-NHR11，或者，當R9a和R9b一起為＝C(H)R10時，則D也可以為H，或者D為式IIIa或IIIb的結(jié)構(gòu)片段， 其中波浪線表示所述結(jié)構(gòu)片段的連接位置；R11為H或C(O)R12；R12為H或由C(O)OH取代的以及任選地由選自鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個其他取代基取代的苯基；和烷基、鏈烯基和炔基，以及烷氧基的烷基部分也可以由一個或多個鹵原子取代；所述方法包括在給藥了所述化合物的個體中，向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中式I的抗葉酸化合物是拓優(yōu)得(式IV)、LY309887(式V)、AG2034(式VI)或AG2037(式VII)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在給藥了抗葉酸化合物后約24小時至48小時之間，向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中所述個體具有多種由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性標志之一。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性標志是在給藥所述化合物后的指定時刻，化合物血漿水平大于指示毒性的預(yù)定水平。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述指示毒性的抗葉酸化合物的預(yù)定血漿水平在給藥化合物后24小時時為1μM。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其還包括在給藥所述化合物后的指定時刻測定個體中抗葉酸化合物血漿水平的前期步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中所述個體具有一種或多種由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性癥狀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性癥狀選自貧血、厭食、虛弱、脫水、腹瀉、疲勞、發(fā)燒、肝毒性、高膽紅素血癥、白斑病、粘膜炎、骨髓抑制、惡心、嗜中性白細胞減少癥、皮疹、可逆性轉(zhuǎn)氨酶升高、口腔炎、血小板減少癥和嘔吐。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其還包括測定個體中一種或多種由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性癥狀的存在的前期步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項的方法，還還包括向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中式I的抗葉酸化合物是二氫葉酸還原酶(DHFR)或甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基轉(zhuǎn)移酶(GARFT)的抑制劑，葉酸途徑拯救劑是亞葉酸鈣。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中抗葉酸化合物是LY309887、AG2034、或AG2037。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中式I的抗葉酸化合物是胸苷酸合成酶(TS)的抑制劑，葉酸途徑拯救劑是胸苷。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中抗葉酸化合物是拓優(yōu)得。
16.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項的方法，其中在給藥葉酸途徑拯救劑之前向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項的方法，其中在給藥具有羧肽酶G活性的酶之前向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項的方法，其中基本上同時向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑和具有羧肽酶G活性的酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項的方法，其中以每kg體重約50個單位的劑量向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
20.治療選自癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病的方法，包括向個體給藥式I的抗葉酸化合物，然后向個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中式I的抗葉酸化合物是拓優(yōu)得，所要治療的癌癥是乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸/直腸癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌或胃癌、或非小細胞肺癌(NSCLC)、惡性間皮瘤或不明原發(fā)癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中抗葉酸化合物是LY309887，所要治療的癌癥是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或胰腺癌。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中抗葉酸化合物是AG2034，所要治療的癌癥是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、黑素瘤或淋巴瘤。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中抗葉酸化合物是AG2037，所要治療的癌癥是實體腫瘤，如進行性的、轉(zhuǎn)移性的或復(fù)發(fā)性實體腫瘤。
25.具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗由權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的式I的抗葉酸化合物引發(fā)的毒性。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其用于在具有由抗葉酸化合物引發(fā)的多種臨床毒性標志之一的個體中抵抗毒性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中臨床毒性標志是在給藥所述化合物后的指定時刻，抗葉酸化合物的血漿水平大于指示毒性的預(yù)定水平。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述指示毒性的抗葉酸化合物的預(yù)定血漿水平在給藥所述化合物后24小時時為1μM。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任一項的用途，其用于在具有由抗葉酸化合物引發(fā)的多種臨床毒性癥狀之一的個體中抵抗毒性。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中由抗葉酸化合物所引發(fā)的臨床毒性癥狀選自貧血、厭食、虛弱、脫水、腹瀉、疲勞、發(fā)燒、肝毒性、高膽紅素血癥、白斑病、粘膜炎、骨髓抑制、惡心、嗜中性白細胞減少癥、皮疹、可逆性轉(zhuǎn)氨酶升高、口腔炎、血小板減少癥和嘔吐。
31.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的式I的抗葉酸化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于在隨后給藥具有羧肽酶G活性的酶的個體中抵抗可由所述抗葉酸化合物抵抗的疾病。
32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項的用途，用于在給藥葉酸途徑拯救劑的個體中抵抗毒性。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中在給藥具有羧肽酶G活性的酶之前向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中在給藥具有羧肽酶G活性的酶之后向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中基本上同時向所述個體給藥葉酸途徑拯救劑和具有羧肽酶G活性的酶。
36.葉酸途徑拯救劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于在給藥具有羧肽酶G活性的酶的個體中抵抗由權(quán)利要求1或權(quán)利要求2限定的式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性。
37.具有羧肽酶G活性的酶和葉酸途徑拯救劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗由權(quán)利要求1或權(quán)利要求2限定的式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性。
38.根據(jù)權(quán)利要求32至37中任一項的用途，其中抗葉酸化合物是DHFR或GARFT的抑制劑，葉酸途徑拯救劑是亞葉酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中抗葉酸化合物是LY309887、AG2034、或AG2037。
40.根據(jù)權(quán)利要求32至37中任一項的用途，其中式I的抗葉酸化合物是TS的抑制劑，葉酸途徑拯救劑是胸苷。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的用途，其中式I的抗葉酸化合物是拓優(yōu)得。
42.根據(jù)權(quán)利要求25至41中任一項的用途，其中具有羧肽酶G活性的酶的劑量為每kg體重約50個單位。
43.根據(jù)權(quán)利要求25至42中任一項的用途，用于在正在通過給藥抗葉酸化合物治療疾病的個體中抵抗由式I的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性，所述疾病選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病。
44.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中限定的式I的抗葉酸化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于在隨后給藥具有羧肽酶G活性的酶的個體中治療選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病的病癥。
45.具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于正在通過給藥式I的抗葉酸化合物進行治療的疾病的輔助治療，所述疾病選自癌癥、RA、MS、牛皮癬、宮外孕和移植物抗宿主疾病。
46.根據(jù)權(quán)利要求43至45中任一項的用途，其中式I的抗葉酸化合物和所要治療的癌癥如權(quán)利要求21-24中任一項所限定。
47.治療系統(tǒng)，其包含上述權(quán)利要求1或2所限定的式I的抗葉酸化合物，和具有羧肽酶G活性的酶。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的治療系統(tǒng)，其還包含葉酸途徑拯救劑。
49.從權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的式I化合物體外裂解末端L-谷氨酸部分的方法，所述方法包括將所述化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸。
50.測定具有羧肽酶G活性的酶對權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的式I化合物的裂解速率和/或程度的方法，所述方法包括提供式I化合物，在所述化合物的裂解能夠發(fā)生的條件下，將式I化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸，以及隨時間的推移，監(jiān)測式I化合物裂解的速率和/或程度。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中監(jiān)測步驟包括監(jiān)測式I化合物的量和/或濃度。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51的方法，其中監(jiān)測步驟包括監(jiān)測式I化合物的一種或多種分解產(chǎn)物的量和/或濃度。
53.根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項的方法，其在活體外進行。
54.根據(jù)權(quán)利要求50至52任一項的方法，其在體內(nèi)進行。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其還包括測定為了將式I化合物的量降低至預(yù)定水平，是否需要額外劑量的具有羧肽酶G活性的酶。
56.根據(jù)權(quán)利要求54或55的方法，其還包括在化合物的裂解能夠發(fā)生的條件下，將式I化合物與額外劑量的具有羧肽酶G活性的酶接觸。
57.裂解包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或溶劑化物的方法， 其中波浪線表示所述結(jié)構(gòu)片段的連接位置；A6為O或S；R8為H或選自鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個取代基；R3為H或C1-4烷基；R4為-CH2C(R9a)(R9b)-D；R9a和R9b獨立地為H或C1-4烷基，或者R9a和R9b一起為＝C(H)R10；R10為H或C1-4烷基；D為C(O)OH，四唑-5-基，(CH2)0-1-NHR11，或者，當R9a和R9b一起為＝C(H)R10時，則D也可以為H，或者D為式IIIa或IIIb的結(jié)構(gòu)片段， 其中波浪線表示所述結(jié)構(gòu)片段的連接位置；R11為H或C(O)R12；R12為H或由C(O)OH取代的以及任選地由選自鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的一個或兩個其他取代基取代的苯基；和烷基、鏈烯基和炔基，以及烷氧基的烷基部分可以由一個或多個鹵原子取代；所述方法包括將包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其在體外進行。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其在體內(nèi)進行。
60.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物是抗葉酸化合物。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其用于在個體中抵抗由抗葉酸化合物引發(fā)的毒性，所述個體已在醫(yī)學(xué)治療過程中給藥了所述的抗葉酸化合物，或者，所述方法包括向所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。
62.具有羧肽酶G活性的酶在制備藥物中的用途，所述藥物用于抵抗由權(quán)利要求57限定的式VIII的抗葉酸化合物所引發(fā)的毒性。
63.根據(jù)權(quán)利要求1至24或49至61中任一項的方法，或根據(jù)權(quán)利要求25-46中任一項或權(quán)利要求62的用途，或根據(jù)權(quán)利要求47或48的治療系統(tǒng)，其中具有羧肽酶G活性的酶是羧肽酶G2，或其具有羧肽酶G活性的衍生物。
全文摘要
在給藥了式I的抗葉酸化合物的個體中抵抗由所述化合物引發(fā)的毒性的方法。所述方法包括為所述個體給藥具有羧肽酶G活性的酶。裂解包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物的方法，所述方法包括將包含式VIII的結(jié)構(gòu)片段的化合物與具有羧肽酶G活性的酶接觸。
文檔編號A61K38/43GK1950088SQ200580013842
公開日2007年4月18日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月28日
發(fā)明者羅杰·梅爾頓, 安東尼·阿特金森 申請人:普羅瑟里克斯醫(yī)藥發(fā)展有限公司