專利名稱：含有fgf2作為有效成分的治療或預防哮喘和慢性阻塞性肺病的藥劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2，或堿性成纖維細胞生長因子，bFGF)作為有效成分的、用于預防和治療哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的藥劑。本發(fā)明還涉及由卵清蛋白(OA)和雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的COPD和Th1哮喘小鼠模型。
背景技術：
過去20年中，哮喘的流行幾乎加倍，而如今哮喘影響8-10％的世界人口。哮喘是一種氣道慢性炎性紊亂，以對非特定刺激的氣道高反應性(AHR)和氣道重塑為特征，而氣道重塑與所涉及的要素如成纖維細胞和肌成纖維細胞結構和功能的變化相關。哮喘大體分為支氣管哮喘和心源性哮喘，但通常哮喘是指單純性支氣管哮喘。
連同哮喘一起，最具代表性的肺病之一是慢性阻塞性肺病(COPD)，但以伴隨有氣道阻塞而與哮喘相區(qū)別。COPD居世界范圍內死亡原因的第四位，在10種最嚴重的疾病中，只有COPD的發(fā)病率在提高。氣道和軟組織持續(xù)發(fā)炎導致細支氣管和軟組織的病理變化而引起COPD，因而以閉塞性細支氣管炎和肺氣腫(軟組織破壞)為特征。慢性阻塞性肺病的例子有慢性阻塞性支氣管炎、慢性細支氣管炎和肺氣腫。
哮喘和這些慢性阻塞性肺部疾病的治療依靠使用抗炎藥劑或支氣道擴張劑。糖皮質激素、白三烯調節(jié)劑和茶堿是代表性的抗炎藥劑。
雖然糖皮質激素具有強的藥效，但對特定的靶標不起作用，而是抑制所有的免疫和抗炎反應，這意味著糖皮質激素也抑制必要的免疫反應，具有嚴重的副作用，要求吸入治療。白三烯調節(jié)劑具有較少的副作用，但受限于藥效，因而不能獨立控制哮喘而只能用作輔助劑。茶堿也存在藥效弱和副作用的問題。
因此需要開發(fā)具有強的藥效但更少副作用的哮喘治療藥劑。而對于開發(fā)這樣的藥劑來說，首先要全面理解哮喘的發(fā)展機理。
普遍接受的理論是輔助T細胞1型(Th1)或輔助T細胞2型(Th2)分泌對哮喘發(fā)展起重要作用的細胞因子，更確切的說，來自于Th1和Th2的細胞因子失衡引起哮喘(Th1/Th2假說)(Mosmann等人，J.Immunol.，1362348-57，1986；Robinson等人，N.Engl.J.Med.，326298-304，1992；Grunig等人，Science，2822261-3，1998；Richter等人，Am.J.Respir.CellMol.Biol.，25385-91，2001)。然而，由細胞因子誘發(fā)哮喘的準確機理尚未得到解釋。
由活化的Th2淋巴細胞產生的白細胞介素-13(IL-13)是哮喘發(fā)病機理的關鍵細胞因子(Grunig等人，Science，2822261-3，1998)。這一結論得到如下研究結果的支持，在患過敏癥的哮喘動物模型中，通過抑制IL-13的表達抑制氣道高反應性，但通過氣道給予重組IL-13時，再次誘發(fā)氣道高反應性(Marsha等人，Science，2822258-2261，1998)。IL-13轉基因小鼠顯示的組織學報告與哮喘患者中觀察到的結果相似，IL-13的過度表達誘發(fā)氣道炎癥、加速粘液分泌以及上皮細胞纖維化(Zhu等人，J.Clin.Invest.，103779-788，1999)。
IL-13可以通過促進炎癥細胞尤其是嗜酸性粒細胞侵入提高AHR的觀點仍很流行(Hargreave等人，J.Allergy clin.Immunol.，78825-32，1986)。然而，近來的證據(jù)卻顯示不存在嗜酸性粒細胞侵入時，仍然可以誘發(fā)AHR(Venkayya等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.26202-8，2002)。
已知轉化生長因子β1(TGF-β1)或血管內皮生長因子(VEGF)參與IL-13誘發(fā)的哮喘的發(fā)病機理(Lee等人，Nat.Med.，101095-1103，2004)。
TGF-β1作為治療組織創(chuàng)傷的關鍵要素，誘導組織纖維化，而組織纖維化是氣道重塑的主要病理變化。更準確的說，TGF-β1使成纖維細胞變?yōu)榧〕衫w維細胞，肌成纖維細胞分泌的膠原多于靜止型成纖維細胞，組織纖維化導致氣道重塑(Vignola等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，156591-599，1997)。這與以前的研究結果是一致的，即IL-13轉基因小鼠中，肺的纖維化主要通過TGF-β1依賴性途徑誘發(fā)(Lee等人，J.Exp.Med.，194809-21，2001)。
在組織纖維化過程中，TGF-β1誘導成纖維細胞生長因子-2(FGF2或堿性成纖維細胞生長因子，bFGF)、其受體-1(FGFR-1)或FGF受體-2(FGFR-2)的分泌。已知FGF2與內皮細胞或平滑肌細胞的增殖有關，且在血管生成中起重要作用(Nugent等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.32115-20，2000)。然而，F(xiàn)GF2在哮喘和AHR發(fā)病機理中的作用仍然存在疑問。
血管內皮生長因子(VEGF)是一種細胞因子，其通過血液毛細管提高血漿蛋白的滲透性，促進細胞分化和遷移，促使重整細胞的蛋白酶分泌。VEGF還通過抑制細胞凋亡參與新生血管的維持，通過抑制神經原抗原參與免疫應答的調節(jié)，以及參與細胞的生長和分裂。本發(fā)明者表明在IL-13和VEGF之間，存在針對抗原和外界物質的免疫應答有關的正反饋環(huán)(Lee等人，Nat.Med.，101095-1103，2004)。然而VEGF介導的哮喘的發(fā)病機理中，F(xiàn)GF2的作用還尚未闡明。
干擾素-γ(IFN-γ)是Th1分泌的、與哮喘發(fā)病機理有關的另一種關鍵細胞因子。更具體的說，IFN-γ是Th1淋巴細胞中分泌的作為病原體抵抗劑的物質(Fong等人，J.Imunol.，1432887-93，1989)，已知用于抑制Th2細胞因子的生成(Mosann等人，J.Immunol.，1362348-57，1986)?；赥h1/Th2假說，認為IFN-γ抑制哮喘仍存在爭議。根據(jù)與上述觀點相矛盾的前述研究，在IFN-γ轉基因小鼠中觀察到與哮喘患者相似的氣道重塑(Wang等人，J.Exp.Med.，1921587-1600，2000)，特別是哮喘的嚴重程度與IFN-γ的增多顯著相關(Corrogan等人，Lancet11129-32，1988；Mognan等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，1611790-6，2000)。
該反駁觀點還得到如下研究結果的支持，即廣泛使用的哮喘治療藥劑如皮質甾類、β2-腎上腺素拮抗劑、甲基黃嘌呤衍生物抑制Th1的免疫應答，而不抑制Th2免疫應答。因此，采用強調促進Th2免疫應答重要性的Th1/Th2假說解釋哮喘的發(fā)病機理受到限制。
同時，COPD參與哮喘的發(fā)病機理也沒有得以闡明。也就是說，COPD的發(fā)展和進展還沒有得到解釋，因此在開發(fā)COPD治療藥劑之前，需要對上述的準確機理給出全面的解釋。
根據(jù)使用轉基因小鼠的最近研究結果，已經被證明參與哮喘發(fā)病機理的IFN-γ(Wang等人，J.Exp.Med.，1921587-600，2000)和IL-13(Zheng等人，J.Clin.Invest.，1061081-93，2000)是誘發(fā)與人類COPD類似病理現(xiàn)象的要素。如前所述，細胞因子大多在免疫細胞中分泌，表明免疫應答在COPD的發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用。IFN-γ和IL-13是減輕氣道和軟組織炎癥的重要因素。為了治療由炎癥引發(fā)的創(chuàng)傷，在氣道和肺上皮細胞恢復過程中，攻擊者和防衛(wèi)者之間的平衡尤其重要(Lee等人，J.Exp.Med.，200377-89，2004)，攻擊者占優(yōu)或者防衛(wèi)者缺乏可能引起COPD。
本發(fā)明者研究了FGF2在IL-13、TGF-β1、VEGF和IFN-γ介導的哮喘和COPD的發(fā)病機理中的作用，證實FGF2抑制由IL-13刺激的VEGF誘發(fā)的或者IFN-γ誘發(fā)的AHR，以及抑制由氣道和軟組織中炎癥引發(fā)的肺氣腫，所以FGF2可以有效用于哮喘和COPD的預防和治療。
此外，本發(fā)明者通過產生由卵清蛋白和雙鏈RNA誘發(fā)的Th1哮喘和COPD動物模型，這些模型能夠通過有效和有效率的實驗來開發(fā)哮喘和COPD治療藥劑，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的一個目的是提供一種含有FGF2作為有效成分的、用于預防和治療哮喘和COPD的藥劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種由過敏原如卵清蛋白(OA)和雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的Th1哮喘或COPD小鼠模型。
技術方案本發(fā)明提供一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的、用于治療和預防哮喘的藥劑。
本發(fā)明提供一種預防和治療以由IL-13(白細胞介素-13)過度表達誘發(fā)為特征的哮喘的藥劑。
本發(fā)明提供一種預防和治療以由IFN-γ(干擾素-γ)過度表達誘發(fā)為特征的哮喘的藥劑。
本發(fā)明提供一種含有FGF2以抑制IL-13活性為目的的、用于治療和預防哮喘的藥劑。
本發(fā)明提供一種含有FGF2以抑制VEGF活性為目的的、用于治療和預防哮喘的藥劑。
本發(fā)明提供一種含有FGF2以抑制TGF-β1(轉化生長因子-β1)活性為目的的、用于治療和預防哮喘的藥劑。
本發(fā)明提供一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的、用于治療和預防COPD的藥劑。
本發(fā)明提供一種預防和治療以由IFN-γ(干擾素-γ)過度表達誘發(fā)為特征的COPD的藥劑。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其特征在于將過敏原如卵清蛋白和雙鏈RNA直接給予氣道中。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中所述動物為小鼠。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，包括如下步驟(1)通過鼻腔內給予5-15μg聚肌胞苷酸、雙鏈RNA以及50-100μg卵清蛋白四次，致敏BALB/c小鼠；以及(2)在第一次致敏10天后，用25-75μg卵清蛋白致敏所述小鼠。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中在上述步驟(1)中使用10μg雙鏈RNA致敏動物。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中在上述步驟(1)中使用75μg卵清蛋白致敏所述動物，10天后，在上述步驟(2)中使用50μg卵清蛋白致敏所述動物。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中所述哮喘是非嗜酸性的。
本發(fā)明提供一種由本發(fā)明的方法制備的Th1哮喘或COPD動物模型。
本發(fā)明提供一種Th1哮喘或COPD動物模型，其中所述動物為小鼠。
本發(fā)明提供一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的IL-13、VEGF或TGF-β1抑制劑。
本發(fā)明提供一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的纖維化、氣道炎癥、AHR或氣道重塑抑制劑。
下面將詳細描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種含有FGF2作為有效成分的、用于預防或治療哮喘的藥物組合物。更準確的說，本發(fā)明提供一種用于預防和治療以由IL-13(白細胞介素-13)或IFN-γ(干擾素-γ)過度表達誘發(fā)為特征的哮喘的藥劑。本發(fā)明提供的藥劑其特征是抑制IL-13(白細胞介素-13)、VEGF或TGF-β1(轉化生長因子-β1)的活性。
哮喘分為支氣管哮喘、心源性哮喘等，但單純性支氣管哮喘被看作是哮喘。哮喘以氣道高反應性和氣道重塑為特征。
氣道重塑由對過敏原、炎癥或刺激的免疫應答提高而引發(fā)。一旦免疫應答提高，T-細胞就分泌細胞因子(一種細胞內信號遞質子)。分泌的細胞因子誘導炎性細胞遷移進組織，引起氣道內的慢性炎癥，導致氣道結構的改變。
AHR也被認為是哮喘發(fā)病機理的重要因素，AHR將哮喘和其他呼吸道疾病相區(qū)別。AHR伴隨有氣道平滑肌增生、收縮以及上皮細胞和肺部軟組織的纖維化，這些都是氣道重塑的特征。因此，氣道炎癥、AHR和氣道重塑彼此緊密相關，也就是說，對其中一種癥狀的治療可能會對其他癥狀產生意想不到的治療，同一藥劑可應用于氣道炎癥、AHR和氣道重塑這些所有的癥狀。
在Th2細胞因子IL-4轉基因小鼠(IL-4 TG(+))中顯示的AHR水平與野生型(WT)對照的AHR水平相似(圖1A)，而在Th2細胞因子IL-9轉基因小鼠(IL-9(+)/IL-13(+/+))中顯示的AHR水平與野生型(WT)對照組的AHR水平相比有所提高。然而，在IL-13敲除小鼠(IL-9(+)/IL-13(-/-))中AHR被抑制，表明由IL-9過度表達誘導的哮喘被IL-13所介導(見圖1B)。
為了證實上述研究結果，制備IL-13轉基因小鼠以研究氣道高反應性與TGF-β1和VEGF之間的關系，而已知TGF-β1和VEGF的過度表達由IL-13引起。結果是，與野生型對照中的AHR相比，IL-13轉基因小鼠中AHR被增強(見圖2)。
IL-13轉基因小鼠的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中，TGF-β1和VEGF的濃度也提高了，意味著IL-13誘導的AHR受到下游分子如TGF-β1和VEGF的調節(jié)。
通過證實IL-13介導的AHR受到SU1498作用的抑制證明了通過下游分子VEGF調節(jié)IL-13介導的AHR(見圖4)，所述SU1498是受體2的信號阻斷劑。
IL-13介導的哮喘的發(fā)病機理中FGF2的作用尚未闡明。因此，本發(fā)明者力圖解釋FGF2的作用，最后證實FGF2對于治療由VEGF和TGF-β1誘發(fā)的哮喘的特有癥狀是十分有效的，其中VEGF和TGF-β1的水平受IL-13的調節(jié)。在動物模型中，阻斷FGF2導致VEGF濃度的提高(見圖5)，并進一步引起AHR的提高(見圖6)。這一結果與其他實驗結果是一致的，即在FGF2缺乏的小鼠中，阻斷VEGF引起AHR的抑制(見圖6)。
下述研究結果支持FGF2對IL-13或VEGF誘導的哮喘的藥效。
FGF2通過鼻腔內給予IL-13介導的Th2哮喘模型，隨后考察FGF2的影響。結果是，F(xiàn)GF2緩解對乙酰甲膽堿的氣道高反應性(見圖20)，降低支氣管肺泡灌洗液(BAL)中炎性細胞的數(shù)目(見圖21)，并抑制IL-13和VEGF的表達(見圖22)，上述兩者都是Th2哮喘的關鍵介導物。組織學試驗的結果證實FGF2幾乎將支氣管壁的過度增生和閉塞減輕至肺組織的正常狀態(tài)(見圖23)。總之，證實了FGF2抑制VEGF和IL-13的表達，導致AHR和炎癥得以抑制。因此，F(xiàn)GF2可以有效用于治療哮喘。
至于影響IL-13介導的哮喘的下游分子TGF-β1，以前的研究報道在TGF-β1轉基因小鼠中觀察到氣道重塑(Lee等人，J.Exp.Med.，200377-389，2004)，并且由IL-13引發(fā)的支氣管纖維化取決于TGF-β1(Lee等人，J.Exp.Med.194809-821，2001)。在TGF-β1轉基因小鼠中，TGF-β1嚴重誘發(fā)氣道阻力和閉塞(見圖7)，并且乙酰甲膽堿抑制AHR(見圖8)。
為了證實在IL-13介導的哮喘中FGF2和TGF-β1之間的關系，測量了FGF2敲除小鼠中的AHR。結果是，在FGF2敲除小鼠中沒有觀察到TGF-β1對AHR的抑制(見圖9)。這一結果表明AHR沒有受到TGF-β1自身的抑制，而是受到與TGF-β1共同表達的FGF2的抑制。也就是說，當FGF2存在時，TGF-β1的增加降低AHR，但不存在FGF2時，TGF-β1不能抑制AHR的升高。
上述結果證實了FGF2和TGF-β1之間如下的聯(lián)合作用；一旦氣道組織受到傷害，免疫系統(tǒng)就開始工作。氣道平滑肌細胞和成纖維細胞轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，導致誘發(fā)纖維化。此時，F(xiàn)GF2誘導氣道平滑肌細胞和成纖維細胞增殖以補充TGF-β1的缺乏，同時誘導肌成纖維細胞轉變?yōu)闅獾榔交〖毎统衫w維細胞。結果是FGF2誘導肌成纖維細胞轉變?yōu)槌衫w維細胞，導致肌成纖維細胞數(shù)目的降低，意味著FGF2抑制氣道重塑，同時抑制AHR。
為了解釋FGF2對氣道重塑的抑制，測量了FGF2敲除小鼠中的膠原濃度和AHR。結果是，F(xiàn)GF2敲除小鼠的肺中，分泌膠原的成纖維細胞數(shù)目少于野生型對照中的成纖維細胞數(shù)目(見圖10)。結果表明，因為細胞的增殖沒有受到FGF2的誘導，成纖維細胞的數(shù)目降低，使得在這些細胞中分泌的膠原的濃度也降低。還考察了乙酰甲膽堿對AHR的影響。結果是，在野生型小鼠中，AHR沒有受到乙酰甲膽堿的過多影響，但在FGF2敲除小鼠中，AHR明顯提高(見圖9)。上述結果表明，在從IL-13至TGF-β1的途徑中，F(xiàn)GF2的缺乏阻止成纖維細胞的增殖和肌成纖維細胞向成纖維細胞的轉變，導致氣道重塑。此外，對乙酰甲膽堿敏感響應的成纖維細胞的數(shù)目持續(xù)降低，使AHR很高。因此，F(xiàn)GF2可以有效地用于IL-13和TGF-β1介導的哮喘的治療。
除了IL-13，IFN-γ(一種Th1細胞因子)在哮喘的發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用。以前的許多研究支持這樣的觀點Th1細胞因子，尤其是IFN-γ與哮喘緊密相關。然而還沒有建立Th1介導的哮喘模型。這是因為大多數(shù)哮喘的研究都集中于Th1/Th2假說，其強調Th2活化作用對哮喘發(fā)病機理的重要性。因此，目前建立了嗜酸性粒細胞或免疫球蛋白E(IgE)過度表達的哮喘模型。
與此相反，根據(jù)最近的報道，不管是否嗜酸性的炎癥都可以誘導AHR(Venkayya R，Am J Respir Cell Mol Biol 2002；26202-8)，并且非嗜酸性哮喘患者的數(shù)目占所有哮喘患者的一半以上(Douwes等人，Thorax，57643-8，2002)。因此，需要建立用于哮喘研究的Th1型哮喘模型。
因此，本發(fā)明者制備了由IFN-γ誘導的Th1哮喘或COPD動物模型，研究了FGF2在其中的作用。結果是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)FGF2可以有效的用于治療IFN-γ介導的哮喘和COPD。
因而除了提供預防和治療哮喘的藥劑，本發(fā)明提供了用于預防和治療COPD的藥劑，所述藥劑含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分。COPD可以通過IFN-γ(干擾素-γ)的過度表達誘發(fā)。
首先，研究了IFN-γ介導的哮喘中IFN-γ與FGF2之間的關系。用RT-PCR測量了IFN-γ轉基因小鼠肺中FGF2的表達。結果是，與野生型對照不同，在轉基因小鼠中，F(xiàn)GF2的表達顯著受到抑制(見圖13)。結果表明FGF2的表達受到IFN-γ信號轉導通路的下調。
其次，研究了IFN-γ誘發(fā)的氣道炎癥和AHR的發(fā)病機理中FGF2的作用。從IFN-γ轉基因小鼠(IFN-γ(+)/FGF2(+/+))中消除FGF2基因，然后測量AHR。另外，還測量了炎性細胞的數(shù)目和與細胞因子相關的炎癥的水平。結果是，在缺乏FGF2基因的IFN-γ轉基因小鼠(IFN-γ(+)/FGF2(+/+))中，AHR和炎癥顯著提高(見圖14A和14B)。在IFN-γ轉基因小鼠中，提高的VEGF水平對FGF2缺乏誘發(fā)的AHR和炎癥提高中發(fā)揮重要作用(見圖14C)。上述結果表明FGF2也可以有效地用于治療IFN-γ誘導的氣道炎癥和AHR。
研究了在1FN-γ介導的Th1哮喘模型中FGF2的活性。結果是，F(xiàn)GF2降低了對乙酰甲膽堿的AHR(見圖27)，表明FGF2可以有效地用于治療IFN-γ介導的哮喘。
將FGF2給予Th1哮喘和COPD小鼠，然后檢測FGF2在其中的療效。
經過FGF2的治療，小鼠BAL中炎性細胞的數(shù)目(見圖26)和對乙酰甲膽堿的AHR(見圖36)降低。
除了AHR，在小鼠中觀察到實質細胞凋亡，實質細胞凋亡是COPD的一種特征癥狀。FGF2的存在與否影響AHR和實質細胞凋亡。給予FGF2后，不僅IFN-γ小鼠中的AHR降低(見圖27)，而且由IFN-γ誘導的實質細胞損傷也降低(見圖28和29)。FGF2的給予還使得由IFN-γ誘發(fā)的組織損傷和肺泡損傷或者肺氣腫緩解(見圖30和31)。
如前所解釋的那樣，哮喘和COPD模型中，F(xiàn)GF2降低了AHR并抑制肺泡損傷，表明FGF2可以有效用作預防和治療哮喘和COPD的藥劑。
本發(fā)明的含有FGF2作為有效成分的、用于預防和治療哮喘和COPD的藥劑可以包括占組合物總重量0.0001-50重量％的有效成分。
除FGF2外，本發(fā)明的治療藥劑還可以包括具有與FGF2相同或相似功能的一種或多種有效成分。
除上述有效成分外，本發(fā)明的治療藥劑還可以包括一種或多種藥學可接受的適于給予的載體?？梢赃x擇藥學可接受的載體，或可以通過混合一種以上的選自如下的成分來制備鹽水、無菌水、林格氏液(Ringer′ssolution)、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽葡萄糖溶液、甘油和乙醇?？梢蕴砑悠渌Ｓ玫奶砑觿?，如抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑等。為了制備可注射的溶液、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑，還可以另外加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑。針對每種疾病或根據(jù)成分，本發(fā)明的組合物可以通過Remington′s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA中描述的方法進一步制備成適宜的形式。
本發(fā)明的治療藥劑可以口服或腸胃外給藥(例如靜脈內注射、皮下注射、腹腔內注射、局部或鼻腔內注射)。優(yōu)選腸胃外給藥，更優(yōu)選鼻腔內給藥。組合物的有效劑量可以根據(jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給予方法、排泄方式以及疾病嚴重程度決定。
本發(fā)明的治療藥劑的有效劑量為每天0.005～10mg/kg，優(yōu)選每天0.05～1mg/kg。給藥頻率為每天一次或優(yōu)選每天數(shù)次。
本發(fā)明的治療藥劑可以單獨給予或者隨外科手術、激素療法、化學療法和生物反應調節(jié)劑一起給予，以預防和治療哮喘和COPD。
將本發(fā)明的FGF2通過鼻腔內給予小鼠以考察其毒性。結果是，在小鼠中FGF2預計的LD50值遠大于1,000mg/kg，因此經評估FGF2是一種安全的物質。
本發(fā)明進一步提供了Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其特征在于將過敏原如卵清蛋白和雙鏈RNA直接給予氣道中。
所述制備方法包括如下步驟(1)通過鼻腔內給予5-15μg聚肌胞苷酸、雙鏈RNA以及50-100μg清蛋白四次，致敏BALB/c小鼠；以及(2)在第一次致敏10天后，用25-75μg卵清蛋白致敏所述小鼠。在上述步驟(1)中，用于致敏的雙鏈RNA的量優(yōu)選為10μg。卵清蛋白的量優(yōu)選為75μg。10天后，在上述步驟(2)中，用于第二次致敏的卵清蛋白量優(yōu)選為50μg。
此處提及的哮喘可以是非嗜酸性的。
本發(fā)明提供由上述方法制備的Th1哮喘或COPD動物模型。
所述動物可以包括所有可用于生物實驗的哺乳動物，優(yōu)選小鼠。
與Th1哮喘或COPD動物模型的制備相關，在病毒復制過程中產生的雙鏈RNA(dsRNA)強烈誘導IFN-α和IFN-γI型干擾素，顯示出體內抗病毒活性(Guidotti等人，Annu.Rev.Immunol.，1965-91，2001)。I型干擾素促進IL-12和IFN-γ的生成，能通過刺激T細胞致敏以及樹突細胞的成熟誘導獲得性免疫應答(Londhe等人，F(xiàn)EBS Lett.，55333-8，2003)。因此，在用dsRNA治療后，本發(fā)明者制備出患有由Th1通路誘發(fā)的哮喘的動物模型。
用于制備動物模型的dsRNA的序列和長度不受限制，只要它們可以誘發(fā)Th1哮喘。其可以商購得到，且優(yōu)選聚肌胞苷酸(polyI:C)。
在患有Th1通路誘發(fā)的哮喘的小鼠中，AHR提高(見圖15)，并且淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞的數(shù)目增加。但嗜酸性粒細胞的數(shù)目沒有增加。作為介導物，只有與Th1活性有關的IP-10顯著提高(見圖16和圖17)。上述結果表明非嗜酸性的氣道炎癥由OA和dsRNA誘發(fā)。在支氣管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ的水平和血液中抗原特異性IgG1和IgG2的水平也提高(見圖18和圖19)。結果是，OA和dsRNA的氣道致敏由IFN-γ和抗原特異性IgG2a所誘導，而抗原特異性IgE沒有參與。上述結果證實了Th1哮喘動物模型的成功建立。
本發(fā)明的動物模型還顯示出COPD的癥狀，即肺大小和容量增大，肺泡受到損壞，并由于膠原含量的增加誘發(fā)嚴重的纖維化(見圖28～圖31)。
上述結果證實了本發(fā)明的Th1哮喘小鼠也可用作COPD模型。
本發(fā)明的動物模型經證實是將過敏原(卵清蛋白，OA)和雙鏈RNA(dsRNA)直接給予氣道中產生的Th1或非嗜酸性的哮喘模型，可有效用于開發(fā)治療哮喘和COPD的藥劑。


圖1A是顯示在IL-4轉基因小鼠中觀察到的AHR組圖。
圖1B是顯示在IL-9(-)/IL-13(+/+)，IL-9(-)/IL-13(-/-)，IL-9(+)/IL-13(+/+)和IL-9(+)/IL-13(-/-)轉基因小鼠中觀察到的AHR圖。
圖2是顯示IL-13轉基因小鼠和野生型對照之間的AHR對比圖。
圖3是顯示在支氣管肺泡灌洗液(BAL)中，IL-13轉基因小鼠和野生型對照之間VEGF和TGF-β1表達水平的對比圖。
圖4是顯示給予VEGF受體-2抑制劑SU1498后，IL-13轉基因小鼠和野生型對照中觀察到的AHR圖。
圖5是顯示在支氣管肺泡灌洗液(BAL)中，F(xiàn)GF2敲除小鼠和野生型對照之間VEGF和TGF-β1表達水平的對比圖。
圖6是顯示FGF2或FGF2和VEGF敲除小鼠中觀察到的AHR圖。
圖7是顯示TGF-β1轉基因小鼠和野生型對照之間AHR的對比圖。
圖8是顯示TGF-β1轉基因小鼠和野生型對照中觀察到AHR隨時間的變化圖。
圖9是顯示給予TGF-β1后，野生型對照或FGF2敲除小鼠中AHR隨時間的變化圖。
圖10是顯示FGF2敲除小鼠和野生型對照的肺組織中膠原含量的對比圖。
圖11是顯示IFN-γ轉基因小鼠和野生型對照之間AHR的對比圖。
圖12是顯示IFN-γ轉基因小鼠和野生型對照中，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中VEGF、TGF-β1和IP-10表達水平的圖。
圖13是顯示在IFN-γ轉基因小鼠和野生型對照的肺組織中FGF2表達水平的瓊脂糖凝膠照片。
圖14A是顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞總數(shù)(T)、巨噬細胞數(shù)(M)、淋巴細胞數(shù)(L)、嗜中性粒細胞數(shù)(N)以及嗜酸性粒細胞數(shù)(E)的圖。
圖14B是顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中觀察到的與乙酰甲膽堿相關的AHR的圖。
圖14C顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中VEGF、TGF-β1和IP-10表達水平的圖。
圖15是顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，對乙酰甲膽堿的AHR的變化圖。
圖16是顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)以及嗜酸性粒細胞數(shù)的圖。
圖17是顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中細胞因子(VEGF、IL-5、IL-13和IP-10)表達水平的圖。
圖18是顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ表達水平的圖。
圖19是顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，血清中過敏原特異性抗體(IgG1和IgG2a)的生成圖。
圖20是顯示在Th2哮喘模型小鼠和野生型對照中給予重組體FGF2(rFGF2)后觀察到的與乙酰甲膽堿劑量相關的AHR的圖。
圖21是顯示在Th2哮喘小鼠和野生型對照中，給予重組體FGF2(rFGF2)后測量的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)以及嗜酸性粒細胞數(shù)的圖。
圖22是顯示在Th2哮喘小鼠和野生型對照中，給予重組體FGF2(rFGF2)后觀察到的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中細胞因子(VEGF、IL-13、IL-5和IP-10)的濃度的圖。
圖23是在給予重組體FGF2(rFGF2)之前和之后，Th2哮喘小鼠和野生型對照的肺組織的病理照片。
圖24是顯示嚴重哮喘患者的誘導痰中嗜酸性細胞與非嗜酸性細胞的比例的圖。
圖25是顯示根據(jù)疾病的嚴重程度，哮喘患者的誘導痰中IL-4和IFN-γ的表達模式圖。
圖26是顯示當過度表達誘發(fā)劑強力霉素存在或不存在時，在有條件的IFN-γ轉基因小鼠和野生型對照中，支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)以及嗜酸性粒細胞數(shù)的圖。
圖27是顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)，IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中，與乙酰甲膽堿相關的AHR的圖。
圖28是顯示受FGF2存在或不存在影響的IFN-γ轉基因小鼠肺大小的照片。
圖29是顯示IFN-γ轉基因小鼠的肺容量隨FGF2存在或不存在的變化圖。
圖30是顯示IFN-γ轉基因小鼠的肺在FGF2存在或不存在時的纖維化程度。
圖31是顯示在FGF2存在或不存在時，IFN-γ轉基因小鼠軟組織破壞的肺組織的組織學檢查組圖。
具體實施例方式
本發(fā)明實施以及目前優(yōu)選的實施方案在如下實施例中進行描述。
然而，本領域所屬技術人員可以理解的是，可以根據(jù)本申請所公開的內容在本發(fā)明的范圍和精神內做出修改和改進。
實施例1由IL-13過度表達誘發(fā)的哮喘以及TGF-β1和VEGF的相關性為了研究由IL-13誘發(fā)的哮喘的發(fā)病過程，制備了IL-13轉基因小鼠，并測量了每只小鼠的AHR。還研究了IL-13過度表達對TGF-β1和VEGF表達的影響。
1-1 IL-13轉基因小鼠的制備通過常規(guī)方法(Zhou Zhu等人，J.Clin.Invest.，103779-788，1999；Tang等人，J.Clin.Invest.，982845-2853，1996；Ray等人，J.Clin.Invest.，1002501-2511，1997)產生IL-13轉基因小鼠。為了使IL-13候選基因在氣道中的選擇性表達成為可能，含有IL-13候選基因的結構與啟動子相連(B.Stripp and J.Whitsett，University of Cincinnati)，使用誘導10kDaClara細胞蛋白(CC10)表達的啟動子。為了產生可誘導的轉基因小鼠，在這樣的小鼠中，外界嵌入的基因表達能從外界調節(jié)，通過將CC10啟動子與反四環(huán)素控制的反式活化因子(rtTA)和人生長激素(hGH)基因連接制備pKS-CC10-rtTA-hGH(Ray等人，J.Clin.Invest.，982501-2511，1997)。用Elutip-D柱(Schleicher and Schuell Inc，USA)純化質體DNA，并使用顯微注射用緩沖液(0.5mM Trsi-HCl，25mM EDTA，pH 7.5)進行透析。根據(jù)此處引用的文獻，通過前核內(intrapronuclei)顯微注射進行CBA和C57BL/6小鼠的雜交，將上述的質體DNA嵌入得到的F2卵子，得到轉基因小鼠。為了評價轉化作用，將0.5mg/ml的強力霉素(dox)水溶液隨機給予轉基因小鼠和野生型對照，然后從每只小鼠得到支氣管肺泡灌洗液(BAL)以研究IL-13的水平。
1-2 IL-13轉基因小鼠中的AHR為了證實IL-13轉基因小鼠中哮喘的發(fā)病過程，觀察了哮喘的最具代表性的癥狀AHR。根據(jù)本領域公知的常規(guī)方法，AHR可以通過劑量反應曲線斜率(DRS，Pediatric Allergy and Immunology，14；193，2003)和增強的中止(Penh，Mckinley等人，Clinical&ExperimentalImmunology，136224-231，2004)進行研究。Penh可以按如下計算用呼氣峰壓(PEP)除以吸氣峰壓(PIP)，然后用中止乘以計算出的數(shù)。具體地說，上述實施例1-1制備的轉基因小鼠中，在從第二次致敏起24小時和48小時后，用乙酰甲膽堿噴霧3分鐘，誘發(fā)AHR。通過全身體積描記儀每10秒測量呼氣峰壓和吸氣峰壓，共記錄3分鐘，然后用平均值作為數(shù)據(jù)(圖2)。圖2顯示IL-13轉基因小鼠和野生型對照中AHR的研究結果。
如圖2所示，與野生型對照相比，IL-13轉基因小鼠中的AHR提高。
1-3 IL-13過度表達對VEGF和TGF-β1表達的影響進行了如下實驗研究由IL-13過度表達誘發(fā)的AHR與IL-13信號轉導通路的下游調節(jié)劑VEGF和TGF-β1的相關性。將帶有SP45管的管子放入上述實施例1-1制備的轉基因小鼠的氣道中以得到支氣管肺泡灌洗液(BAL)，用含有0.1％BSA和0.05mm EDTA的滅菌鹽水沖洗，然后離心處理。在得到的BAL上清液中，使用ELISA試劑盒(CalBiotech，USA)測量VEGF和TGF-β1的水平(圖3)。圖3是顯示在支氣管肺泡灌洗液(BAL)中，從IL-13轉基因小鼠和野生型對照中得到的VEGF和TGF-β1的表達水平的圖。
如圖3所示，在BAL中，從具有由IL-13過度表達誘發(fā)的AHR的轉基因小鼠得到的TGF-β1和VEGF的濃度增大。結果表明由IL-13誘發(fā)的AHR受下游調節(jié)劑TGF-β1和VEGF的調節(jié)，該結論得到以下實施例1-4結果的支持。
1-4 VEGF阻斷劑對AHR的抑制為了證實上述實施例1-3的結果，將10mg/kg的VEGF受體-2阻斷劑SU1498(EMD Bioscience，USA)給予實施例1-1制備的小鼠腹腔中，一天給予一次(圖4)。圖4是顯示給予VEGF受體-2阻斷劑SU1498后，IL-13轉基因小鼠和野生型對照中觀察到的AHR的圖。
如圖4所示，由IL-13誘發(fā)的AHR受到VEGF受體-2阻斷劑的抑制，表明由IL-13誘發(fā)的AHR通過信號轉導經由VEGF而發(fā)生。
實施例2FGF2在IL-13誘發(fā)的哮喘的發(fā)病機理中的作用為了研究FGF2在IL-13引發(fā)的哮喘的發(fā)病機理中的作用以及下游調節(jié)劑TGF-β1和VEGF的作用，觀察了FGF2敲除(-/-)小鼠中的AHR和氣道重塑。
2-1 FGF2缺乏誘發(fā)的AHR進行了如下實驗以考察FGF2和AHR的聯(lián)系。FGF2敲除小鼠購自Jackson Lab(CA，USA)。采用與實施例1-2和實施例1-3中描述的相似的步驟研究了BAL中對乙酰甲膽堿的AHR(DRS)以及VEGF和TGF-β1的濃度，證明AHR以及VEGF和TGF-β1的濃度提高(圖5和圖6)。圖5是顯示在BAL中，從FGF2敲除小鼠和野生型對照中得到的VEGF和TGF-β1的表達水平的圖。圖6是顯示如實施例1-4描述的用VEGF阻斷劑治療的FGF2敲除小鼠和FGF2敲除小鼠中觀察到的AHR的圖。
如圖5所示，相對于野生型對照，F(xiàn)GF2敲除小鼠的VEGF濃度提高了，表明AHR提高，這與圖6顯示的結果是一致的。
如圖6所示，F(xiàn)GF2敲除小鼠中，AHR提高了，而VEGF阻斷劑能抑制AHR。這一結果表明由FGF2缺乏誘發(fā)的AHR受VEGF的調節(jié)，更準確的說，給予FGF2抑制VEGF的表達，使得FGF2成為用于預防和治療由VEGF通路介導的哮喘的藥劑的有前景侯選物。
2-2 由FGF2缺乏引發(fā)的氣道重塑為了研究FGF2和氣道重塑的聯(lián)系，進行了如下實驗，包括測量與氣道重塑相伴隨的細胞增殖和轉化。
FGF2敲除小鼠購白Jackson Lab(CA，USA)。采用常規(guī)方法取出肺組織，根據(jù)生產者的說明，使用Sircol膠原測定試劑盒(Biocolor assay，Northern Ireland)測定組織中的膠原濃度，該濃度可用作細胞增殖和轉化測量的指數(shù)(圖10)。圖10是顯示從FGF2敲除小鼠和野生型對照中取出的肺組織中膠原的濃度。
如圖10所示，在FGF2敲除小鼠的膠原濃度遠低于野生型對照中的膠原濃度。
因此，F(xiàn)GF2敲除小鼠的肺中分泌膠原的成纖維細胞的數(shù)目降低，這是因為成纖維細胞轉變?yōu)榧〕衫w維細胞并遷移，導致成纖維細胞的數(shù)目降低。結果誘發(fā)氣道重塑。
上述實驗結果證實FGF2抑制氣道重塑和AHR，因此FGF2可以有效用于治療哮喘。
實施例3TGF-β1引發(fā)的哮喘的發(fā)展為了研究由IL-13誘發(fā)的TGF-β1表達所介導的哮喘的發(fā)病機理，使用與實施例1-1中描述的相似步驟制備TGF-β1轉基因小鼠，并進行如下實驗。
3-1 TGF-β1引發(fā)的氣道重塑采用與上述實施例1-2所描述的相似的步驟研究了由氣道重塑產生的AHR(圖7)。圖7是顯示TGF-β1轉基因小鼠和野生型對照之間隨時間的AHR的對比圖。圖8是顯示TGF-β1轉基因小鼠和野生型對照之間隨時間的AHR對乙酰甲膽堿的對比圖。
如圖7所示，TGF-β1誘發(fā)嚴重的氣道阻力，Penh的結果支持這一結論。然而，如圖8所示，AHR對乙酰甲膽堿卻受到抑制。這一結果表明TGF-β1的過度表達僅參與哮喘特征癥狀中的氣道重塑。
3-2 TGF-β1對AHR抑制中FGF2的作用如上述實施例3-1所闡明的，測量了FGF2敲除小鼠中AHR以研究TGF-β1對AHR抑制中FGF2的作用(圖9)。圖9是顯示給予TGF-β1(R&D system，USA)后，觀察到隨時間變化，野生型對照和FGF2敲除小鼠中的AHR的圖。
如圖9所示，在FGF2敲除小鼠中，TGF-β1對AHR抑制更弱，表明TGF-β1對AHR抑制不是因為TGF-β1自身，而是因為與TGF-β1共表達的FGF2。也就是說，TGF-β1的上調對AHR的抑制與FGF2相關。
實施例4由IFN-γ引發(fā)的哮喘的發(fā)生以及FGF2在其中的作用制備由IFN-γ誘發(fā)的哮喘模型，而IFN-γ是COPD和嚴重哮喘的重要介導物。為了證實FGF2的作用，采用與實施例1中描述的類似的步驟在IFN-γ轉基因小鼠中進行了如下實驗。
4-1 IFN-γ過度表達引起AHR提高使用上述實施例1-2中描述的步驟測量了轉基因小鼠中的AHR(圖11)。然后采用與上述實施例1-3所使用的相同方法測量了AHR、VEGF、TGF-β1和IP-10蛋白的水平(圖12)，其中IP-10蛋白的表達由BAL中的IFN-γ所誘發(fā)。圖11是顯示IFN-γ轉基因小鼠和野生型對照之間AHR的對比圖。
如圖11所示，在IFN-γ轉基因小鼠中，AHR被均勻提高。
如圖12所示，由Th2表達的IL-13所誘發(fā)的VEGF和TGF-β1的濃度在轉基因小鼠中并沒有增大，但與Th2不相關的IP-10蛋白(干擾素誘導蛋白10)增多了。這一結果表明在該實施例中，轉基因小鼠中所誘導的AHR是IFN-γ特異性的。
4-2 FGF2在IFN-γ過度表達誘發(fā)的AHR發(fā)生過程中的作用IFN-γ過度表達對FGF2表達的影響為了研究FGF2在IFN-γ過度表達誘發(fā)的AHR發(fā)生過程中的作用，測量了IFN-γ轉基因小鼠中FGF2的表達水平(圖13)。采用常規(guī)的方法從野生型和轉基因小鼠的肺組織中提取RNA，隨后進行RT(反轉錄)-PCR。簡言之，就是根據(jù)生產者的說明使用TRIzol試劑(LifeTechnology，USA)從分別取白野生型和轉基因小鼠的1g肺組織中提取總RNA。使用RT-PCR試劑盒(Promega，USA)以分離的總RNA為模板進行RT-PCR以合成cDNA。使用上游引物(5′-ACT CAC ATT CGA AACCCC AAA C-3′)和下游引物(5′-CGT CAG ATC GCC TGG AGA C-3′)、使用1μg合成的cDNA作模板進行PCR，以擴增FGF2特異性的cDNA。PCR如下進行在95℃預變性8分鐘，在95℃變性1分鐘，在56℃退火1分鐘，在72℃聚合1分鐘，從變性到聚合共進行35個循環(huán)，在72℃最后延伸10分鐘。圖1 3表示瓊脂糖凝膠照片，顯示在IFN-γ轉基因小鼠和野生型對照的肺組織中FGF2特異性cDNA的擴增。
如圖13所示，在IFN-γ轉基因小鼠中，F(xiàn)GF2的表達受到抑制，表明FGF2的表達被IFN-γ所抑制。
FGF2對IFN-γ過度表達誘發(fā)的AHR的作用為了檢查FGF2對氣道炎癥的發(fā)病機理和IFN-γ誘發(fā)的AHR的作用，測量了具有不同基因型小鼠在BAL中的炎性細胞數(shù)目、炎癥所涉及蛋白的水平(圖14)。按照前述的方法產生所述小鼠(Zhou Zhu等人，J.Clin.Invest.，103779-788，1999；Tang等人，J.Clin.Invest.，982845-2853，1996；Ray等人，J.Clin.Invest.，1002501-2511，1997)。圖14中，+表示靶基因過度表達的小鼠，-表示靶基因缺乏的小鼠。圖14A顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)和IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中，取自支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞總數(shù)(T)、巨噬細胞數(shù)(M)、淋巴細胞數(shù)(L)、嗜中性粒細胞數(shù)(N)以及嗜酸性粒細胞數(shù)(E)。圖14B顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中與乙酰甲膽堿相關的AHR。圖14C是顯示在IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)或IFN-γ(+)/FGF2(-/-)轉基因小鼠中，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中VEGF、TGF-β1和IP-10表達水平的圖。
如圖14所示，在IFN-γ轉基因小鼠中FGF2基因缺乏導致由IFN-γ誘發(fā)的AHR提高和炎性細胞密度的提高，使得氣道炎癥加重。這一結果表明FGF2有效用于治療由IFN-γ引發(fā)的哮喘。
實施例5通過給予FGF2抑制IL-13介導的Th2哮喘進行如下實驗研究FGF2蛋白對IL-13介導的Th2哮喘的抑制作用。
重組體FGF蛋白(rFGF2)購白Phamacia-Upjohn Co(意大利)。
為了產生AHR小鼠模型，通過腹腔注射75μg卵清蛋白(OA)和2mg明礬兩次致敏BALB/c小鼠(Jackson Lab，USA)，10天后，通過鼻腔內給予50μg卵清蛋白再次致敏該小鼠以誘發(fā)哮喘。如此得到的小鼠稱為Th2哮喘。
通過鼻腔內給予轉基因小鼠10μg/head rFGF2，每天一次，共給予4天，野生型對照不給予，而只是給予鹽水，然后根據(jù)上述實施例1-2和實施例1-3所述的步驟測量對乙酰甲膽堿AHR的水平(圖20)，炎性細胞的數(shù)目(圖21)，以及介導物如VEGF、IL-13、IL-5和IP-10的濃度(圖22)。
圖20表示在Th2哮喘模型小鼠和野生型對照中給予重組體FGF2后觀察到的與乙酰甲膽堿劑量相關的AHR。圖21顯示在Th2哮喘小鼠和野生型對照中，給予重組體FGF2(rFGF2)后測量的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)以及嗜酸性粒細胞數(shù)。圖22顯示在Th2哮喘小鼠和野生型對照中，給予重組體FGF2(rFGF2)后觀察到的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中細胞因子(VEGF、IL-13、IL-5和IP-10)的濃度。
如圖20所示，與rFGF2未處理的Th2哮喘小鼠相比，rFGF2處理的Th2哮喘小鼠對乙酰甲膽堿的AHR的抑制作用更為明顯。
如圖21所示，與rFGF未處理的Th2哮喘小鼠相比，rFGF2處理的Th2哮喘小鼠的BAL中的炎性細胞的數(shù)目顯著降低。
如圖22所示，與rFGF未處理的Th2哮喘小鼠相比，rFGF2處理的Th2哮喘小鼠中，Th2哮喘的重要介導物IL-13和VEGF的濃度顯著降低。然而，已知與Th2哮喘不相關的IL-5和IP-10的表達沒有改變。
在rFGF2處理后，還對哮喘小鼠的支氣管壁進行了組織學分析(圖23)。圖23為在給予重組體FGF2(rFGF2)之前(A)和之后(B)，Th2哮喘小鼠和野生型對照的肺組織的病理照片。
如圖23所示，由于rFGF2處理的小鼠的支氣管壁組織學分析結果(B)，通過給予rFGF2可使支氣管壁的過度增生和閉塞減輕至正常水平(C)。
上述結果證實了FGF2抑制VEGF和IL-13的表達，導致Th2介導的AHR和氣道炎癥得到抑制。因此，F(xiàn)GF2可有效用于預防和治療哮喘。
實施例6通過給予FGF2抑制由IFN-γ介導的Th1哮喘和COPD進行如下實驗研究在IFN-γ介導的Th1哮喘小鼠中FGF2的抑制活性。
重組體FGF2蛋白購自Phamacia-Upjohn Co.(意大利)。IFN-γ介導的Th1哮喘小鼠按照如下方法產生。
6-1 通過卵清蛋白和雙鏈RNA制備Th1哮喘和COPD動物模型通過鼻腔內單獨或共同給予10μg合成的dsRNA聚肌胞苷酸(PolyIC，Sigma，USA)和75μg卵清蛋白(OA)四次，致敏BALB/c小鼠(Jackson Lab，USA)。10天后，通過鼻腔內給予50μgOA致敏小鼠，以誘發(fā)哮喘。所得到的小鼠稱為Th1哮喘小鼠。陰性對照小鼠僅給予磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
(1)Th1哮喘特征的證實為了證實小鼠是否已誘發(fā)Th1哮喘，根據(jù)實施例1-2和實施例1-3描述的步驟測量了對乙酰甲膽堿的AHR(圖15)，BAL中炎性細胞的數(shù)目(圖16)以及介導物如VEGF、IL-13、IL-5和IP-10的濃度(圖17)。
圖15顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，對乙酰甲膽堿的AHR的變化。圖16顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)以及嗜酸性粒細胞數(shù)。圖17顯示將過敏原(OA)和dsRNA單獨或共同給予后，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中細胞因子(VEGF、IL-5、IL-13和IP-10)的表達水平。
如圖15所示，在OA和dsRNA誘發(fā)的哮喘小鼠中，對乙酰甲膽堿的AHR提高。
如圖16所示，小鼠中淋巴細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞的數(shù)目增加，但嗜酸性粒細胞的數(shù)目沒有改變。
如圖17所示，作為介導物，小鼠中只有IP-10明顯提高。
上述結果表明非嗜酸性的氣道炎癥由OA和dsRNA誘發(fā)。
此外，為了證實上述Th1哮喘是否由IFN-γ誘發(fā)，測量了支氣管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ、IgG1和IgG2a的水平(圖18和圖19)。圖18表示將OA和dsRNA單獨或共同給予后，支氣管肺泡灌洗液(BAL)中IFN-γ的表達水平。圖19表示將OA和dsRNA單獨或共同給予后，血清中過敏原特異性抗體(IgG1和IgG2a)的生成圖。
如圖18和圖19所示，BAL中IFN-γ的水平至少提高3倍，血清中IgG1和IgG2的水平也提高了。上述結果表明由OA和dsRNA誘發(fā)的哮喘與IFN-γ和抗原特異性IgG2a相關，而與參與Th2哮喘的IgE無關。
(2)COPD特征的證實為了證實上述小鼠中是否已誘發(fā)COPD，測量了肺大小和肺容量以及膠原的濃度(圖28、圖29和圖30)，圖28D代表小鼠肺大小的圖。圖29D代表小鼠肺容量的圖。圖30D代表轉基因小鼠肺中的纖維化水平。
如圖28D、圖29D和圖30D所示，Th1哮喘小鼠中，肺大小和肺容量以及膠原的濃度明顯增大，表明小鼠具有COPD的特征。隨肺大小和容量以及膠原濃度提高，肺組織損傷、肺泡破壞以及肺氣腫是COPD的典型癥狀，如圖31所示，這些癥狀也伴隨著小鼠。
圖31A表示Th1哮喘小鼠中軟組織破壞的肺組織的組織學照片。如圖31所示，IFN-γ轉基因小鼠的肺中觀察到由軟組織破壞引起肺泡區(qū)域變大，這是COPD的典型癥狀之一。
肺大小和容量的增大和肺泡中細胞凋亡與膠原含量的提高證實了嚴重的纖維化。
上述結果證實了Th1哮喘小鼠可有效用作顯示COPD發(fā)病機理的COPD模型。
6-2 給予FGF2對Th1哮喘的抑制進行如下實驗研究FGF2蛋白是否能抑制IFN-γ介導的Th1哮喘小鼠中的哮喘。上述實施例6-1產生的小鼠稱為Th1哮喘實驗小鼠組。根據(jù)實施例5使用的相同的步驟，將重組體FGF2給予實施例6-1制備的Th1哮喘小鼠和野生型對照。然后使用實施例1-2中描述的步驟，測量兩組中對乙酰甲膽堿的AHR。
圖27表示給予rFGF2后，Th1哮喘小鼠和野生型對照中觀察到的與乙酰甲膽堿劑量相關的AHR。
如圖27所示，與未經rFGF2處理的小鼠相比，rFGF2處理小鼠中，對乙酰甲膽堿的AHR大為降低。
圖28表示rFGF2處理的Th1哮喘小鼠和rFGF2未處理的小鼠之間肺大小比較的照片。
如圖28所示，rFGF2處理小鼠的肺大小比rFGF2未處理的Th1哮喘小鼠的小。
上述結果表明FGF2減輕IFN-γ轉基因小鼠的特性哮喘癥狀，因此可以有效用于治療IFN-γ誘導的哮喘。
6-3 給予FGF2對COPD的抑制進行如下實驗研究FGF2對COPD的抑制作用。根據(jù)實施例5所描述的步驟，將重組體FGF2給予上述實施例6-1制備的轉基因小鼠和野生型對照。然后，測量了這些小鼠中的肺大小和容量以及膠原濃度，這些都是COPD的主要指標(圖28、圖29和圖30)。圖28A、B、C和D顯示正常小鼠和COPD小鼠的肺大小，圖29顯示了這些小鼠的肺容量。圖30A、B、C和D顯示給予rFGF后或未給予時，野生型對照和COPD小鼠的肺中的纖維化水平。圖31表示在FGF2存在或不存在時，IFN-γ轉基因小鼠軟組織破壞的肺組織的病理照片。
如圖28C和D以及圖29C和D所示，在給予rFGF2之后，肺容量顯著減小。如圖30C和D所示，給予COPD小鼠rFGF2使得膠原濃度也顯著降低。肺大小和容量的減小以及膠原含量的降低表明rFGF2可有效用于COPD的治療，如圖31所示。
圖31表示COPD小鼠中軟組織破壞的肺組織的病理照片。如圖31A所示，與rFGF2處理組(A)的肺不同，rFGF2未處理小鼠(B)的肺中由軟組織的細胞凋亡引起的肺泡區(qū)域變大，這是COPD患者的典型癥狀之一，表明給予rFGF2可有效治療COPD。
上述結果證實肺大小和容量、肺泡中細胞凋亡和膠原含量均參與COPD小鼠的纖維化，給予FGF2可有效治療那些病理癥狀。
實施例7人哮喘模型中IFN-γ的過度表達進行如下實驗研究人哮喘是否由IFN-γ過度表達和非嗜酸性的細胞誘發(fā)。從取自215位成年哮喘患者的痰液顯示可逆性氣道阻塞，根據(jù)常規(guī)的方法，使用sprimetry法測量了他們的肺活量。還進行了乙酰甲膽堿支氣管試驗以測試肺功能(圖24)。圖24表示在嚴重哮喘患者的誘導痰中嗜酸性與非嗜酸性細胞的比例。如圖24所示，證實超過一半的患者患有非嗜酸性哮喘，而不是嗜酸性哮喘。
為了證實哮喘介導因素，測量了IL-4和IFN-γ的水平(圖25)。圖25顯示根據(jù)疾病的嚴重程度，在哮喘患者的誘導痰中，IL-4和IFN-γ的表達模式。
如圖25所示，嚴重哮喘患者中，與Th1哮喘有關的IFN-γ的表達提高，但與Th2哮喘有關的IL-4的表達卻沒有改變。結果表明人類哮喘患者，尤其是嚴重哮喘患者，患有IFN-γ介導的非嗜酸性Th1哮喘。
工業(yè)實用性如前所述，本發(fā)明的含有FGF2作為有效成分的治療藥劑可以有效用于預防和治療纖維化、氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑、哮喘和COPD。此外，使用卵清蛋白和雙鏈RNA開發(fā)的哮喘和COPD動物模型還可以有效用于開發(fā)哮喘和COPD的治療藥劑。
本領域所屬技術人員可以理解，可以容易地將上述說明書中公開的構思和具體實施方案用作修改或設計其他實施方案的基礎，以實現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。本領域所屬技術人員還可以理解，這些等同的實施方案不會背離如所附權利要求中所提出的本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的治療或預防哮喘的藥劑。
2.如權利要求1所述的治療或預防哮喘的藥劑，其中所述哮喘由IL-13(白細胞介素-13)過度表達誘發(fā)。
3.如權利要求1所述的治療或預防哮喘的藥劑，其中所述哮喘由IFN-γ(干擾素-γ)過度表達誘發(fā)。
4.如權利要求1所述的治療或預防哮喘的藥劑，其中FGF2抑制IL-13的活性。
5.如權利要求1所述的治療或預防哮喘的藥劑，其中FGF2抑制VEGF的活性。
6.如權利要求1所述的治療或預防哮喘的藥劑，其中FGF2抑制TGF-β1(轉化生長因子-β1)的活性。
7.一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的治療或預防慢性阻塞性肺病(COPD)的藥劑。
8.如權利要求7所述的治療或預防COPD的藥劑，其中所述COPD由IFN-γ(干擾素-γ)過度表達誘發(fā)。
9.一種Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其特征在于將過敏原如卵清蛋白和雙鏈RNA直接給予氣道中。
10.如權利要求9所述的Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中所述動物為小鼠。
11.如權利要求9或10所述的Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，包括如下步驟(1)通過鼻腔內給予5-15μg聚肌胞苷酸、雙鏈RNA以及50-100μg卵清蛋白四次，致敏BALB/c小鼠；以及(2)在第一次致敏10天后，用25-75μg卵清蛋白致敏所述小鼠。
12.如權利要求11所述的Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中在步驟(1)中使用10μg雙鏈RNA致敏所述動物。
13.如權利要求11所述的Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中在步驟(1)中使用75μg卵清蛋白致敏所述動物，10天后，在步驟(2)中使用50μg卵清蛋白致敏所述動物。
14.如權利要求9-13中任一項所述的Th1哮喘或COPD動物模型的制備方法，其中所述哮喘是非嗜酸性的。
15.一種Th1哮喘或COPD動物模型，其通過權利要求9-13中任一項來制備。
16.如權利要求15所述的Th1哮喘或COPD動物模型，其中所述動物為小鼠。
17.一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的IL-13活性抑制劑。
18.一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的VEGF活性抑制劑。
19.一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的TGF-β1活性抑制劑。
20.一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子-2)作為有效成分的纖維化、氣道炎癥、氣道高反應性或氣道重塑抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有FGF2(成纖維細胞生長因子－2或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF))作為有效成分的、用于治療或預防哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的藥劑。本發(fā)明還涉及由卵清蛋白和雙鏈RNA誘發(fā)的Th1哮喘和COPD小鼠動物模型。本發(fā)明的含有FGF2的治療藥劑可用于治療或預防氣道纖維化、氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑、哮喘和COPD。此外，由卵清蛋白和雙鏈RNA誘發(fā)的Th1哮喘和COPD小鼠動物模型還可用于開發(fā)哮喘和COPD的治療藥劑。
文檔編號A61K38/18GK1953765SQ200580015391
公開日2007年4月25日 申請日期2005年5月12日 優(yōu)先權日2004年5月12日
發(fā)明者金潤根, 姜壽亨, 金炳文, 孫美苑 申請人:東亞制藥株式會社, 金潤根