專利名稱：用于改善動脈粥樣硬化和其它病變的g型多肽和其它劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動脈粥樣硬化領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及鑒定一類肽，其可口服施用，并改善動脈粥樣硬化或其它以炎癥反應(yīng)為特征的病變的一種或多種癥狀。
背景技術(shù)：
他汀類藥物(statins)(例如Mevacor@，立普妥(Lipito@))的引入使心臟病發(fā)作和中風(fēng)的死亡率降低到了大約三分之一。然而，心臟病發(fā)作和中風(fēng)仍然是致死或致殘的主要原因，特別是在美國和西歐國家。心臟病發(fā)作和中風(fēng)是由一種稱作動脈粥樣硬化的慢性炎癥導(dǎo)致的。
在心血管疾病的發(fā)生過程中涉及多種致病因素，包括疾病的遺傳傾向性、性別、生活方式因素如吸煙和飲食、年齡、高血壓和高血脂，包括高膽固醇血癥。這些因素中的一些，特別是高血脂和高膽固醇血癥(血膽固醇濃度高)，是與動脈粥樣硬化相關(guān)的重要危險性因素。
膽固醇以下述物質(zhì)中的游離或酯化膽固醇的形式存在于血液中脂蛋白顆粒，一般稱作乳糜微粒(chylomicron)；極低密度脂蛋白(VLDL)；低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。血液中總膽固醇的濃度受到如下因素的影響(1)從消化道吸收膽固醇，(2)由膳食成分，如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和乙醇，合成膽固醇，和(3)通過組織，特別是肝，從血液中移出膽固醇，之后膽固醇被轉(zhuǎn)化成膽汁酸、類固醇激素和膽汁膽固醇。
血膽固醇濃度的維持受遺傳和環(huán)境因素二者的影響。遺傳因素包括膽固醇生物合成限速酶的濃度，肝中低密度脂蛋白受體的濃度，轉(zhuǎn)換膽固醇膽汁酸的限速酶的濃度，脂蛋白合成和分泌速度和人的性別。影響人體內(nèi)血膽固醇濃度穩(wěn)態(tài)(hemostasis)的環(huán)境因素包括飲食結(jié)構(gòu)、吸煙頻率、體育鍛煉和多種藥劑的使用。飲食變量包括脂肪(飽和和多聚不飽和脂肪酸)的量和類型、膽固醇的量、纖維的量和類型、可能還有維生素，如維生素C和D，以及礦物質(zhì)如鈣的量。
低密度脂蛋白(LDL)氧化與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有著密切的關(guān)系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，高密度脂蛋白(HDL)能夠起保護作用，對抗LDL氧化，但是在一些情況下，發(fā)現(xiàn)它會加速LDL氧化。動脈粥樣硬化的重要起始因素包括由LDL衍生的氧化磷脂的產(chǎn)生。
正常的HDL能夠阻止這些氧化磷脂的形成，并且一旦形成了這些氧化磷脂，HDL還能夠使它們失活。然而，在一些環(huán)境下，HDL會從抗炎分子轉(zhuǎn)變成促炎分子，其實際上促進這些氧化磷脂的形成。
已有人提出HDL和LDL是先天免疫系統(tǒng)的一部分(Navab et al.(2001)Arterioscler Thromb Vasc Biol.21481-488)。利用模擬HDL主要蛋白——載脂蛋白A-I(apo A-I)——的A類兩親性螺旋肽已經(jīng)成功生成了抗炎HDL(見例如WO 02/15923)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的組合物和方法來改善下述病癥的癥狀動脈粥樣硬化和其它炎癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多動脈炎、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默氏病，和病毒性疾病，如流行性感冒A。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了“分離的”多肽，其改善動脈粥樣硬化或其他與炎癥反應(yīng)有關(guān)的病變的癥狀，和/或包含這類多肽的組合物。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了改善一種或多種炎癥癥狀的肽，該肽包括氨基酸序列LAEYHAK(SEQ ID NO2)或KAHYEAL(SEQID NO638)；并且該肽包括至少一個D氨基酸和/或至少一個保護基團。在一些實施例中，該肽包括D氨基酸和/或一個或多個保護基團(例如，在每個末端的保護基團)。在多種實施例中，該保護基團包括一個或多個選自下組的基團酰胺、3-20碳烷基、Fmoc，t-boc，9-芴乙?；?、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲苯-2-磺?；?Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、乙?；?Ac)、丙基、丁基、戊基、己基、N-甲基鄰氨基苯甲?；?N-methyl anthranilyl)、聚乙二醇(PEG)和三氟乙?；?TFA)。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供改善一種或多種炎癥癥狀的肽，其中該肽長度為約3到約10個氨基酸；包括這樣的氨基酸序列，該序列含有與一個或兩個芳香、疏水或不帶電極性氨基酸交替出現(xiàn)的酸性或堿性氨基酸；具有疏水末端氨基酸，或者帶疏水保護基團的末端氨基酸；并且不是全由L氨基酸組成的序列LAEYHAK(SEQ ID NO2)；其中該肽將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或者使抗炎HDL更加抗炎。該肽可任選地包括一個或多個D氨基酸和/或一個或多個保護基團，例如如上所述的基團。
在多種實施方案中，本發(fā)明提供的肽可改善一種或多種炎癥癥狀，其中該肽包括例如表3或14中的肽的氨基酸序列或者其多聯(lián)體(concatamer)。在一些實施方案中，該肽包括至少一個D氨基酸，在一些實施方案中，該肽全部由D氨基酸組成。在多種實施例中，該肽額外地或者作為選擇地包括至少一個保護基團(例如在每個末端的保護基團)。一些合適的保護基團包括，但不僅限于，酰胺、3-20碳烷基、Fmoc，t-boc，9-芴乙?；?、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、乙?；?Ac)、丙基、丁基、戊基、己基、N-甲基鄰氨基苯甲酰基、聚乙二醇(PEG)和三氟乙?；?TFA)等。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供可改善一種或多種炎癥癥狀的肽，其中該肽包括選自下組的氨基酸序列DMT-Arg-Phe-Lys(SEQ ID NO1)，DMT-Arg-Glu-Leu(SEQ ID NO2)，Lys-Phe-Arg-DMT(SEQ ID NO3)和Leu-Glu-Arg-DMT(SEQ ID NO4)，其中DMT是二甲基酪氨酸。同樣，該肽可以包括至少一個D氨基酸和/或至少一個保護基團，例如上文說明的基團。在一些實施例中，該肽是Boc二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys(OtBu)(SEQ IDNO5)，或Boc二甲基酪氨酸-Arg-Glu-Leu(OtBu)(SEQ ID NO6)。
本發(fā)明還考慮了藥物制劑，其包括本文所述的任何活性劑(例如肽、有機分子等)和藥學(xué)可接受的賦形劑。在一些實施方案中，該活性劑是肽，并且該肽被配制成經(jīng)時釋放(time release)劑型。在一些實施方案中，該制劑被配制成單位劑量劑型。在一些實施方案中，配制該制劑以通過選自下組的途徑施用口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用和肌肉內(nèi)注射。
本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防例如動脈粥樣硬化、再狹窄、與哺乳動物炎癥急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥、或糖尿病等病癥的方法，其中該方法包括向有需要的哺乳動物施用一種或多種本文描述的活性劑(例如肽)。在一些實施方案中，活性劑處于藥學(xué)可接受的賦形劑中(例如，適于口服的賦形劑)，和/或可配制成單位劑量劑型。在多種實施方案中，施用包括通過選自下組的途徑施用活性劑口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用、吸入施用和肌肉內(nèi)注射。在多種實施方案中，該哺乳動物是被診斷為具有一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的，和/或被診斷為有中風(fēng)或動脈粥樣硬化危險性的，和/或患有與炎癥急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥或有其危險性的，和/或患有再狹窄或具有其危險性的，和/或患有糖尿病或有其危險性的哺乳動物(例如人類)。
另外，還提供了如本文所述的活性劑(例如，肽)，用于治療選自下組的病癥動脈粥樣硬化、再狹窄、與哺乳動物炎癥急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥和糖尿病。在一些實施方案中，本發(fā)明提供如本文所述的活性劑(例如肽)在制造用于治療或預(yù)防選自下組的病癥的藥物中的用途動脈粥樣硬化、再狹窄、與哺乳動物炎癥急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥、和糖尿病。
在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了用于將藥物送遞到體內(nèi)血管中的支架(stent)，其包括其中形成多個儲庫的支架框，和位于儲庫內(nèi)的一種或多種如本文所述(例如表1-15中)的活性劑和/或如本文所述的有機小分子。在多種實施方案中，該活性劑是包含4F的氨基酸序列(SEQ ID NO13)的肽。在多種實施方案中，該活性劑包含在聚合物內(nèi)。在一些實施方案中，該支架框包括金屬基材或聚合物基材中的一種(例如，不銹鋼、鎳鈦金屬互化物(nitinol)、鉭、MP35N合金、鉑、鈦、合適的生物相容性合金、合適的生物相容性聚合物、和其組合)。儲庫可任選地包含微孔，并且在一些實施方案中，當(dāng)存在微孔時，微孔的直徑為大約20微米或者更小。在多種實施方案中，當(dāng)存在微孔時，微孔的直徑為大約20-約50微米。在多種實施方案中，當(dāng)存在微孔時，微孔的深度為大約10-約50微米。在多種實施方案中，微孔延伸穿過支架框，開口于支架的內(nèi)表面上，并開口于支架的外表面上。在一些實施方案中，支架進一步包括布置在支架框內(nèi)表面上的蓋層(cap layer)，該蓋層覆蓋通孔的至少一部分，并提供屏障特性，以控制藥物聚合物中的藥物從支架框內(nèi)表面洗脫的速度。在一些實施方案中，儲庫包括沿著支架框外表面的通道。在一些實施方案中，其中該聚合物包括第一藥物聚合物的第一層，其中該藥物聚合物包括根據(jù)本發(fā)明的第一活性劑，且該聚合物層包括具有活性劑或其它藥物的第二藥物聚合物。在多種實施方案中，屏障層可定位在包含活性劑的聚合物層之間，或者位于聚合物層的表面上。在多種實施方案中，導(dǎo)管與支架框偶聯(lián)。該導(dǎo)管可任選地包含用于擴張支架的裝置，例如用于擴張支架的球囊(balloon)，可收縮從而使支架得以擴張的外殼(sheath)等。
本發(fā)明還提供了制造藥物-聚合物支架的方法，包括提供支架框；在支架框中切出多個儲庫；對至少一個儲庫施加包含一種或多種本文所述活性劑的組合物；和干燥該組合物。該方法可任選地進一步包括向干燥的組合物施加聚合物層；和干燥該聚合物層。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療血管病癥的方法，包括將支架(如本文所述)定位在身體血管內(nèi)；擴張支架；并從支架的至少一個表面洗脫至少一種活性劑。
還提供了合成本文所述多種肽的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了合成肽的方法，其中該方法包括提供所述肽的至少三條不同的肽片段亞序列；和在溶液相中偶聯(lián)該肽片段亞序列，從而形成該肽。在一些實施方案中，該肽的長度為6-37個氨基酸。在一些實施方案中，該肽的長度為18個殘基。在一些實施方案中，該肽包括A類兩親性螺旋。在多種實施方案中，該肽包括氨基酸序列D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO13)。在多種實施方案中，所有三條肽片段亞序列的每一條的長度為6個氨基酸。在一些實施方案中，三條肽片段亞序列具有如下序列D-W-F-K-A-F(SEQ ID NO641)、Y-D-K-V-A-E(SEQ ID NO642)和K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO643)。在一些實施方案中，該肽均由D氨基酸構(gòu)成。
定義在指示某種分離的多肽時，術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物純的”是指，基本上沒有通常在自然條件下與其伴隨的成分的材料。對核酸和/或多肽而言，該術(shù)語可指不再與其自然條件下側(cè)翼連接的序列側(cè)翼連接的核酸或多肽?；瘜W(xué)合成的多肽是“分離的”，因為它們不是在自然狀態(tài)下(例如，在血液、血清等等中)出現(xiàn)的。在一些實施方案中，術(shù)語“分離的”說明多肽不存在于自然中。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于這樣的氨基酸聚合物，其中有一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的自然存在的氨基酸的人造化學(xué)類似物；也適用于自然存在的氨基酸聚合物。
術(shù)語“兩親性螺旋肽”(amphipathic helical peptide)是指包括至少一個兩親性螺旋(兩親性螺旋域)的肽。本發(fā)明的一些兩親性螺旋肽可包括兩個或多個(例如3、4、5個等)兩親性螺旋。
術(shù)語“A類兩親性螺旋”是指這樣的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)其形成α-螺旋，使極性和非極性面產(chǎn)生隔離，帶正電荷的殘基位于極性-非極性界面上，帶負(fù)電荷的殘基位于極性面的中心(見例如，”Segrest et al.(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and genetics 8103-117”)
“載脂蛋白J”(apo J)已知有多種名稱，包括簇蛋白(clusterin)、TRPM2、GP80和SP40，40(Fritz(1995)Pp 112 InClusterin；Role in VertebrateDevelopment，F(xiàn)unction，and Adaptation(Harmony JAK Ed.)，R.G.Landes，Georgetown，TX)。它首先被描述為異源二聚體糖蛋白和培養(yǎng)的大鼠支持細胞分泌蛋白的成分(Kissinger et al.(1982)Biol Reprod；27233-240)。翻譯產(chǎn)物是單鏈前體蛋白，其經(jīng)過細胞內(nèi)切割成為二硫鍵連接的34kDa α亞單位和47kDa β亞單位(Collard and Griswold(187)Biochem.，263297-3303)。它與細胞損傷、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和凋亡相關(guān)，并且與清除由細胞損傷或死亡導(dǎo)致的細胞碎片有關(guān)。簇蛋白已經(jīng)顯示能夠以高親和力與多種分子結(jié)合，包括脂類、肽和蛋白質(zhì)、以及疏水探針1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalenesulfonnate)(Bailey et al.(2001)Biochem.，4011828-11840)。
G型兩親性螺旋存在于球蛋白中，因此稱為G型。這類兩親性螺旋的特征是，它在極性面上具有隨機分布的帶正電和帶負(fù)電的殘基，并具有窄的非極性面。由于該窄非極性面，這類螺旋不容易和磷脂連接(見Segrest etal.(1990)ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and Genetics.8103-117；另見Erratum(1991)ProteinStructure，F(xiàn)unction，and Genetics.979)。數(shù)種可以互換的載脂蛋白的G型兩親性螺旋具有相似但不完全相同的特征。與G型兩親性螺旋相似，該另一種類型的螺旋在極性面上也有隨機分布的帶正電和帶負(fù)電殘基。然而，與具有窄非極性面的G型兩親性螺旋相反，這種類型具有寬非極性面，從而使這種類型容易結(jié)合磷脂，因此這種類型被稱作G*，以與G型兩親性螺旋相區(qū)別(見Segrest et al.(1992)J.Lipid Res.，33141-166；另見Anantharamaiah et al.(1993)Pp.109-142，其在《The Amphipathic Helix》(Epand，R.M.Ed CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida)中)。Jones等((1992)J.LipidRes.33287-296)說明了用于識別和分類兩親性螺旋域的計算機程序，其包括但不僅限于螺旋輪程序(helical wheel program)(WHEEL或WHEEL/SNORKEL)、螺旋網(wǎng)程序(helical net program)(HELNET，HELNET/SNORKEL，HELNET/Angle)、用于添加螺旋輪的程序(program foraddition of helical wheels)(COMBO或COMBO/SNORKEL)、用于添加螺旋網(wǎng)的程序(program for addition of helical nets)(COMNET，COMNET/SNORKEL，COMBO/SELECT，COMBO/NET)、共有輪程序(consensus wheelprogram)(CONSENSUS，CONSENSUS/SNORKEL)等。
當(dāng)用于“改善一種或多種動脈粥樣硬化癥狀”時，術(shù)語“改善”是指減少、防止或消除動脈粥樣硬化和/或相關(guān)病變的一種或多種癥狀特征。這種減少包括，但不僅限于，減少或消除氧化磷脂，減少動脈粥樣硬化斑塊(plaque)的形成和破裂(rupture)，減少臨床事件，例如心臟病發(fā)作、心絞痛(angina)或中風(fēng)，降低高血壓，降低炎性蛋白質(zhì)合成，減少血漿膽固醇等。
術(shù)語“對映體氨基酸”是指以至少兩種彼此呈不可重疊的鏡像的形式存在的氨基酸。大多數(shù)氨基酸(甘氨酸除外)是對映異構(gòu)體，以所謂的L型(L氨基酸)或D型(D氨基酸)存在。大多數(shù)自然存在的氨基酸是“L”氨基酸。術(shù)語“D氨基酸”和“L氨基酸”用于指示氨基酸的絕對構(gòu)型，而不是平面偏振光的具體旋轉(zhuǎn)方向。本文的使用與本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)使用一致。本文用標(biāo)準(zhǔn)1字母或3字母編碼表示氨基酸，例如在《工業(yè)產(chǎn)品信息和文獻手冊》(Handbook on Industrial Property Information andDocumentation)中的標(biāo)準(zhǔn)ST.25中指定的。
術(shù)語“保護基團”是指當(dāng)連接于在氨基酸的功能基團(例如側(cè)鏈、α氨基、α羧基等)上時能夠阻擋(block)或掩蓋(mask)該功能基團性質(zhì)的化學(xué)基團。優(yōu)選的氨基端保護基團包括，但不僅限于，乙?；虬被Ｆ渌陌被吮Ｗo基團包括，但不僅限于烷基鏈，如脂肪酸中的烷基鏈、丙酰基(propeonyl)、甲?；?。優(yōu)選的羧基端保護基團包括，但不僅限于，形成酰胺或酯的基團。
短語“保護磷脂免受氧化劑氧化”是指化合物具有這樣的能力當(dāng)磷脂與氧化劑(例如過氧化氫、13-(S)-HPODE、15-(S)-HPETE、HPODE、HPETE、HODE、HETE等)接觸時，降低磷脂氧化速度(或氧化磷脂產(chǎn)生量)。
術(shù)語“低密度脂蛋白”或“LDL”是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常用法定義的。一般地，LDL是指當(dāng)通過超速離心分離時，在d＝1.019到d＝1.063的密度范圍發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物。
術(shù)語“高密度脂蛋白”或“HDL”是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常用法定義的。一般地，HDL是指當(dāng)通過超速離心分離時，密度范圍為d＝1.063到d＝1.21的脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物。
術(shù)語“I族HDL”是指可減少氧化脂質(zhì)(例如在低密度脂蛋白中)或保護氧化脂質(zhì)免受氧化劑氧化的高密度脂蛋白或其成分(例如apo A-I、對氧磷酶、血小板活化因子乙酰水解酶等)。
術(shù)語“II族HDL”是指保護脂類免受氧化或者在修復(fù)(例如減少)氧化脂類的活性降低或者沒有該活性的HDL。
術(shù)語“HDL成分”是指構(gòu)成高密度脂蛋白(HDL)的組分(例如分子)。測定可保護脂類免受氧化或可修復(fù)(例如減少)氧化脂類的HDL，也包括測定顯示有這種活性的HDL組分(例如apo A-I、對氧磷酶、血小板活化因子乙酰水解酶等)。
術(shù)語“人類apo A-I肽”是指全長的人類apo A-I肽，或其包含A類兩親性螺旋的片段或區(qū)域。
本文使用的“單核細胞反應(yīng)”是指與動脈粥樣硬化斑形成相關(guān)聯(lián)的“炎癥反應(yīng)”的特征性單核細胞活性。單核細胞反應(yīng)的特征是單核細胞粘附于血管壁細胞(例如，血管內(nèi)皮細胞)，和/或化學(xué)趨向進入內(nèi)皮下間隙，和/或單核細胞分化成巨噬細胞。
當(dāng)指氧化磷脂的量時，術(shù)語“無改變”是指缺少可以檢測到的改變，更優(yōu)選地，缺少統(tǒng)計學(xué)顯著的改變(例如，至少為85％的置信度，優(yōu)選地至少為90％，更優(yōu)選地至少為95％，最優(yōu)選地至少為98％或99％的置信度)。無可檢測到的改變還可以指，測定中氧化磷脂的水平發(fā)生改變，但沒有在不存在本文所述蛋白質(zhì)時那樣多，或者沒有其它陽性或陰性對照那樣多。
本文使用如下的簡寫PAPCL-α-1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；POVPC1-棕櫚酰-2-(5-氧戊酰)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；PGPC1-棕櫚酰-2-戊二酸單酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；PEIPC1-棕櫚酰-2-(5，6，-環(huán)氧異前列腺烷E2)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(1-palmitoyl-2-(5，6-epoxyisoprostaneE2)-sn-glycero-3-phosphocholine)；ChC18:2膽固醇亞油酸酯；ChC18:2-OOH膽固醇亞油酸酯氫過氧化物(cholesteryl linoleatehydroperoxide)；DMPC1，2-雙十四酰(ditetradecanoyl)-消旋-甘油-3-磷酸膽堿；PON對氧磷酶；HPF標(biāo)準(zhǔn)化高倍視野；PAPCL-α-1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿；BL/6C57BL/6J；C3HC3H/HeJ。
用于蛋白質(zhì)或肽的術(shù)語“保守取代”是指，不會顯著改變分子的活性((例如對脂蛋白的)特異性或(例如對脂類或脂蛋白的)結(jié)合親和力)的氨基酸取代。典型的保守氨基酸取代涉及用具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的氨基酸取代另一種氨基酸。下面的六組分別包含通?？梢曰ハ啾Ｊ厝〈陌被?)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
在兩個或多個核酸或多肽序列中，術(shù)語“同一”或百分比“同一性”是指，將兩個或多個序列或亞序列按最大的對應(yīng)度進行比較或比對，且使用一種如下的序列比較算法或通過目測觀察進行測量時，該兩個或多個序列或亞序列相同，或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸。關(guān)于本發(fā)明的肽，序列同一性在肽的全長上確定。
對于序列比較，通常用一個序列作為參考序列，將測試序列與之比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入到計算機，如果需要的話，指定亞序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性。
用于比較的最優(yōu)化序列比對可以通過如下手段進行利用Smith &Waterman的局部同源性算法；Adv.Appl.Math.2484(1981)，Needleman &Wunsch的同源性比對算法，J.Mol.Biol.48443(1970)，Pearson & Lipman的搜索相似性方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.852444(1988)，通過這些算法的計算機化實現(xiàn)(Wisconsin的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Software Package，Genetic Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者目測檢查(一般地參見Ausubel et al.，同上)。
有用算法的一個實例是PILEUP。PILEUP利用漸進(progressive)、成對(pairwise)的比對從一組相關(guān)序列中生成一個多序列比對結(jié)果，顯示關(guān)系(relationship)和百分比序列同一性。它還描繪顯示用于生成該比對結(jié)果的聚類關(guān)系的樹或樹形圖(dendogram)。PILEUP使用Feng & Doolittle漸進比對方法(J.Mol.Evol.35351-360(1987))的簡化方法。所用的方法與Higgins& Sharp說明的方法(CABIOS 5151-153(1989))相似。該程序可比對多達300條序列，每條序列的最大長度為5,000核苷酸或氨基酸。多序列比對程序首先成對比對兩個最相似的序列，產(chǎn)生兩條比對序列的類群(cluster)。然后將該類群與下一條最相關(guān)的序列或已比對序列的類群進行比對。這兩個序列類群通過兩條單獨序列成對比對的簡單擴展進行比對。最終的比對結(jié)果是通過一系列的漸進、成對比對獲得的。該程序是通過指定序列比較區(qū)的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐標(biāo)，并指定程序參數(shù)來運行的。例如，一條參考序列可以用如下的參數(shù)與其他測試序列進行比對，從而確定百分比序列同一性關(guān)系默認(rèn)缺口權(quán)重(3.00)、默認(rèn)缺口長度權(quán)重(0.10)和末段缺口權(quán)重。
另一個適用于確定百分比序列同一性和序列相似度的算法實例是BLAST算法，其說明見Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215403-410。公眾可以通過國家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得用于執(zhí)行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中確定長度為W的短字而確定高得分序列對(HSP)，其中該短字在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，或者匹配或者滿足某個正值閾值分?jǐn)?shù)T。T是指相鄰字分?jǐn)?shù)閾值(Altschul et al，supra)。這些最初的命中相鄰字起初始搜索種子的作用，以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSP。然后這些命中字沿著每條序列向兩個方向一直延伸，只要累積比對分?jǐn)?shù)增加即可一直延伸。對于核苷酸序列，累積分?jǐn)?shù)的計算是使用參數(shù)M(一對匹配殘基的賞分；總是＞0)和N(不匹配殘基的罰分；總是＜0)。對于氨基酸序列，使用得分矩陣計算累積分?jǐn)?shù)。命中字沿每個方向的延伸在如下情況下停止累積比對分?jǐn)?shù)與其達到過的最大值相比減少了數(shù)量X；由于一個或多個負(fù)分殘基比對結(jié)果的積累，使累積分?jǐn)?shù)變?yōu)榱慊蛘咝∮诹?；或達到序列的任一末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定算法的靈敏度和速度。BLAST程序(用于核苷酸序列)使用的默認(rèn)值為字長度(W)為11，期望(E)為10，M＝5，N＝-4，雙鏈比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)值為字長度(W)為3，期望(E)為10，和BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 8910915)。
除了計算百分比序列同一性，BLAST算法還進行兩個序列之間相似度的統(tǒng)計分析(見例如Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Aci.USA905873-5877)。通過BLAST算法提供的一種相似度量度是最小加和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果比較測試核酸與參考核酸的最小加和概率小于大約0.1，更優(yōu)選地小于大約0.01，最優(yōu)選地小于大約0.001，則認(rèn)為該核酸與參考序列相似。
附圖簡述

圖1顯示D4F(Navab，等，(2002)，Circulation，105290-292)和由D氨基酸制成的apoJ肽336(D-J336*)在共培養(yǎng)實驗中對防止體外LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的效果的比較結(jié)果。該數(shù)據(jù)是在一式四份培養(yǎng)物(quadruple culture)中的9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)目的平均值±SD。(D-J336＝Ac-LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE-NH2，SEQ ID NO7)。
圖2顯示與用D-4F相比，用D-J336預(yù)處理動脈壁細胞來防止LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的效果。該數(shù)據(jù)是在四份培養(yǎng)物中的9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)目的平均值±SD。
圖3顯示在LDL受體缺失小鼠中，apoJ肽模擬物對HDL保護能力的影響。該數(shù)據(jù)是在每一式四個測定孔中的9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)目的平均值±SD。
圖4顯示來自口服肽的apoE缺失小鼠(apoE null)的HDL針對LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的保護效果。該數(shù)據(jù)是在一式四個測定孔中的每一個的9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)目的平均值±SD。星號表示與無肽HDL相比有顯著差異(p＜0.05)。
圖5顯示口服apoA-I肽模擬物和apoJ肽對LDL的氧化易感性的影響。數(shù)值是在一式四個測定孔中的每一個的9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)目的平均值±SD。星號表示與無肽mLDL相比有顯著差異(p＜0.05)。
圖6顯示口服apoA-I肽模擬物和apoJ肽對HDL保護能力的影響。數(shù)值是在一式四個測定孔中的每一個的9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)目的平均值±SD。星號表示與無肽mHDL相比有顯著差異(p＜0.05)。
圖7顯示口服apoA-I肽模擬物和apoJ肽對血漿對氧磷酶活性的影響。數(shù)值是一式四個血漿等份(aliquot)讀數(shù)的平均值±SD。星號表示與無肽對照血漿相比有顯著差異(p＜0.05)。
圖8顯示在apoE-/-小鼠中，口服G*肽對HDL保護能力的影響。該數(shù)值是一式四個血漿等份讀數(shù)的平均值±SD。星號表示與無肽對照血漿相比有顯著差異(p＜0.05)。
圖9顯示在ApoE-/-小鼠中，口服G*肽，146-156，對HDL保護能力的影響。
圖10A-10C顯示本發(fā)明某些肽的螺旋輪圖。圖10AV2W3A5F10，17-D-4F；
圖10BW3-D-4F；圖10CV2W3F10-D-4F。
圖11，向人動脈壁共培養(yǎng)物添加標(biāo)準(zhǔn)人LDL(“LDL”)，其中共培養(yǎng)物沒有(“無添加”)或者具有人HDL(+對照HDL)，或者具有來自apoE缺失小鼠的鼠HDL，其中該小鼠或者給予食物過夜(“+食物HDL”)，或者給予含D-4F的食物過夜(“+D4F HDL”)，或者給予含G5-D-4F的食物過夜(“+G5 HDL”)，或者給予含G5，10-D-4F的食物過夜(“+5-10HDL”)，或者給予G5，11-D-4F的食物過夜(“+5-11 HDL”)，并且所產(chǎn)生的單核細胞趨化活性如先前所述地確定(Navab M，Anantharamaiah，GM，Hama S，Garber DW，Chaddha M，Hough G，Lallone R，F(xiàn)ogelman AM.Oraladministration of an apo A-I mimetic peptide synthesized from D-amino acidsdramatically reduces atherosclerosis in mice independent of plasma cholesterol.Circulation 2002；105290-292)。
圖12顯示，本發(fā)明的肽可有效減輕糖尿病癥狀(例如血糖)。從26周齡的肥胖Zucker大鼠取血，然后以每天腹膜內(nèi)注射D-4F(5.0mg/kg/日)處理。10天后，再次從大鼠取血，確定血漿葡萄糖和脂質(zhì)過氧化物(LOOH)。*p＝0.027；**p＝0.0017。
圖13顯示D4F對頸動脈球囊損傷的效果。16周齡肥胖Zucker大鼠用D-4F(5mg/kg日)注射1周，此時它們已經(jīng)經(jīng)歷了頸總動脈球囊損傷。兩周后處死大鼠，并確定內(nèi)-中膜比(intimal media ratio)。
圖14A-14K提供展示溶液相化學(xué)中產(chǎn)生的多種化合物的純度的數(shù)據(jù)。
圖15顯示，溶液相合成方案的產(chǎn)物具有非常高的生成HDL和前βHDL的生物活性，其中HDL和前βHDL抑制apoE缺失小鼠體內(nèi)LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化性。apo E缺失小鼠飼予5微克如上所述合成的D-4F(“片段”)，或者給予小鼠相同量的不含D-4F的鼠糧(“食物”)。給食開始后12小時，對小鼠取血，并在FPLC上分級血漿。向人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中添加LDL(100微克LDL-膽固醇)，其中或者單獨添加(“LDL”)，或者與對照人類HDL(“對照HDL”)，或者與來自小鼠的HDL(50微克HDL-膽固醇)或后-HDL(pHDL；前βHDL)一起添加，其中小鼠接受(“片段”)或者沒有接受(“食物”)D-4F，并確定所產(chǎn)生的單核細胞趨化活性。
圖16顯示本發(fā)明的多種肽對HDL對氧磷酶活性的影響。
圖17顯示LAEYHAK(SEQ ID NO8)對單核細胞趨化活性的影響。
*p＜0.001+hHDL對hLDL；**p＜0.001+給肽后6小時猴HDL對+0時猴HDL；***p＜0.001+給肽后6小時猴L(fēng)DL對+0時猴L(fēng)DL；‖p＜0.0010時+猴L(fēng)DL對hLDL。
圖18A和18B顯示根據(jù)本發(fā)明的支架的一個實施方案。圖18A示意地圖解藥物-聚合物支架1800，其包括支架框1820和在其中形成的多個儲庫1830；和藥物聚合物1840，其包含一種或多種本文所述的活性劑(例如4F、D4F等)和任選的位于藥物聚合物上的聚合物層。圖18B示意地圖解血管病癥治療系統(tǒng)1850，其包括支架框1870、在支架框內(nèi)形成的多個儲庫1890、具有聚合物層的藥物聚合物1880、和與支架框1880偶聯(lián)的導(dǎo)管1040。導(dǎo)管1860可以包括用于擴張支架的球囊，或者可收縮從而容許支架擴張的外殼。藥物聚合物1880包含一種或多種本文所描述的活性劑。藥物聚合物層可任選地包括屏障層、蓋層或另一藥物聚合物。聚合物層典型地為每種活性劑提供特征性的可控藥物洗脫。藥物洗脫是指活性劑從藥物聚合物1880轉(zhuǎn)移出去。確定藥物聚合物排出的生物活性劑的總量作為洗出量，典型地以單位重量例如微克計，或者以每支架外周面積的重量計。
發(fā)明詳述在一些實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定多種可以有效改善動脈粥樣硬化或者其它以炎癥反應(yīng)為特征的病變的癥狀的活性劑(例如，肽和/或某些有機小分子)?？梢韵嘈?，施用一種活性劑或者組合施用兩種或多種活性劑可以有效地將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或者使抗炎HDL更加抗炎。在一些實施方案中，這種“轉(zhuǎn)變”的特征是對氧磷酶活性升高。
一個驚人的發(fā)現(xiàn)是，某些兩親性螺旋肽，例如本文所述的A類和G*類肽，以及本文所述的其它劑，具有抗炎性質(zhì)，并且能夠調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化或其它以炎癥反應(yīng)為特征的病變(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多動脈炎(polyarteritis nodosa)和骨質(zhì)疏松癥)的癥狀。
在一些實施方案中，該肽是兩親性螺旋肽類似物，該肽在極性面上分布有帶電殘基(帶正和/或負(fù)電的殘基)，并具有寬非極性面(稱為類球蛋白(globular protein like)，G*)兩親性螺旋域。這種兩親性螺旋G*域是apo J和某些其它載脂蛋白(apoprotein)(例如apo M，apo AI，apo AIV，apo E，apoCII，apo CIII等，但通常不包括apo A-II或apo C-I)的特征。
在一些實施方案中，本發(fā)明的肽包括或者由A類兩親性螺旋構(gòu)成，且本文說明的某些經(jīng)過修飾的A類兩親性螺旋肽在分子的疏水面內(nèi)有改變，其提高了活性和/或血清半衰期。
在一些實施方案中，本發(fā)明的肽是含有至少一個二甲基酪氨酸的小肽。另外還提供了含有或者包含氨基酸序列LAEYHAK(SEQ ID NO8)的小肽，該氨基酸序列含有一個或多個保護基團和/或一個或多個D殘基。一些小肽包括與芳香或疏水氨基酸交替出現(xiàn)的酸性或堿性氨基酸。某些前述的肽不包括全部由L殘基構(gòu)成的LAEYHAK(SEQ ID NO8)。
在多種實施方案中，本發(fā)明的肽優(yōu)選的長度為大約6或10個氨基酸到約100個氨基酸，更優(yōu)選的長度為大約10到大約60或80個氨基酸，最優(yōu)選的長度為大約10、15或20個到大約40或50個氨基酸。在一些實施方案中，肽的長度為大約6或10-大約30或40個氨基酸。本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的肽與apo J或其片段(長度為大約10-大約40個氨基酸，例如在與所述的肽相同長度的范圍上)的序列同一性大于大約40％，優(yōu)選地大于大約50％或60％，更優(yōu)選地大于大約70％或80％，最優(yōu)選地大于大約90％或95％。
本發(fā)明的一個驚人發(fā)現(xiàn)是，這些肽，特別在包括一個或多個D型氨基酸時，保留了相應(yīng)L型肽的生物學(xué)活性。而且，這些肽顯示體內(nèi)活性，即使在口服施用時也是如此。這些肽顯示有更長的血清半衰期和更高的改善或預(yù)防/抑制一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的能力。
我們發(fā)現(xiàn)，正常的HDL可抑制形成輕微氧化LDL的三個步驟。在這些研究中(見例如WO 02/15923)，我們證實，用apo A-I或apo A-I模擬肽(37pA)在體外處理人類LDL，可以從含HPODE和HPETE的LDL中除去種子分子。這些種子分子是人類動脈壁細胞共培養(yǎng)物能夠氧化LDL和LDL誘導(dǎo)動脈壁細胞產(chǎn)生單核細胞趨化活性所必需的。我們還證實，在將apo A-I注射到小鼠體內(nèi)或者輸注到人體內(nèi)之后，從小鼠或者人類志愿者分離的LDL可抵抗人類動脈壁細胞的氧化，并且不會在動脈壁細胞共培養(yǎng)物中誘導(dǎo)單核趨化性。
不受具體理論限制，我們相信，本發(fā)明的活性劑發(fā)揮功能的方式與PCT公開WO 2002/15923中說明的apo A-I模擬物的活性相似。特別地，可以相信，本發(fā)明部分地通過提高HDL的抗炎性起作用。特別地，我們相信，本發(fā)明的肽結(jié)合LDL內(nèi)LDL氧化所必需的種子分子，隨后將種子分子帶離它最終排出的位置。
我們證實，口服由D氨基酸合成的apo AI模擬肽可顯著減輕小鼠體內(nèi)的動脈粥樣硬化，與血漿或HDL膽固醇濃度的變化無關(guān)。與apo A-I模擬物的作用相似，我們相信，由D氨基酸合成的模擬apo J兩親性螺旋域的合成肽和其它本文所述的肽能夠口服施用，或者通過其它方法施用，包括注射，并且可改善動脈粥樣硬化和其它慢性炎癥。
在一些實施方案中，本發(fā)明的肽可以全部由L型氨基酸構(gòu)成。然而，包括一個或多個D型氨基酸的或者優(yōu)選地全部由D型氨基酸構(gòu)成的肽(全部對映體氨基酸都是D型)可通過口服提供更有效的遞送，并且在循環(huán)中更加穩(wěn)定。特別優(yōu)選的肽的一個或兩個末端都被封閉(例如，用N端乙?；駽端酰胺化)。
實例1例證了本發(fā)明肽的保護功能。新型肽阻止LDL誘導(dǎo)的人動脈壁細胞的單核細胞趨化活性所需的體內(nèi)濃度比apoA-I模擬物(D4F)需要的濃度低10-25倍(圖1中DJ336與D4F比較)。相似地，在預(yù)培養(yǎng)中，本發(fā)明的肽阻止動脈壁細胞LDL氧化的效力高10-25倍(圖2中DJ336與D4F比較)。如圖3所示，當(dāng)向LDL受體缺失小鼠口服施用DJ335時，其基本上與D4F同樣有效地提高HDL防止LDL誘發(fā)的單核細胞趨化活性的保護性。
圖4顯示，當(dāng)添加到飲用水中時，本發(fā)明的肽(DJ336)提高apo E缺失小鼠體內(nèi)HDL保護能力的效力與D4F相同。圖5顯示，通過誘導(dǎo)單核細胞趨化活性確定，添加到飲用水中時，本發(fā)明的肽DJ336使來自apo E缺失小鼠的LDL對人動脈壁細胞氧化產(chǎn)生抗性的效力略高于D4F。圖6顯示，通過測量單核細胞趨化活性的產(chǎn)生，確定了DJ336添加到飲用水中時，抑制人動脈壁共培養(yǎng)物中的磷脂PAPC被氧化劑HPODE氧化的效力與D4F相同(試驗系統(tǒng)的解釋見Navab et al(2001)J.Lipid.Res.421308-1317)。圖7證實，當(dāng)添加到飲用水中時，DJ336提高apo E缺失小鼠對氧磷酶活性的效力至少與D4F相同。
根據(jù)前文，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于改善和/或防止動脈粥樣硬化和/或與炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的(以其為特征的)病變的一種或多種癥狀的方法。該方法典型地包括向生物體，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類，施用一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽或其它活性劑(或這些肽的模擬物)。這些劑的施用方式，如本文所述的，可根據(jù)多種標(biāo)準(zhǔn)方法的任何方法，包括但不僅限于，注射、栓劑、鼻噴霧、經(jīng)時釋放植入物(time-release implant)、透皮貼(transdermal patch)等。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述肽通過口服施用(例如，作為糖漿、膠囊或藥片)。
盡管本發(fā)明是就人類用途進行說明的，但是它也適用于動物，例如獸醫(yī)用途。因此優(yōu)選的生物體包括，但不僅限于，人類、非人類靈長動物、犬科動物、馬科動物、貓科動物、豬、有蹄動物、兔(largomorph)等。
本發(fā)明的方法不僅限于顯示有一種或多種動脈粥樣硬化癥狀(例如，高血壓、斑塊形成和破裂、臨床事件的減少如心臟病發(fā)作、心絞痛或中風(fēng)、高水平的血漿膽固醇、高水平的低密度脂蛋白、高水平的極低密度脂蛋白、或炎性蛋白質(zhì)等)的人類或非人類動物，還可用于預(yù)防。因此，本發(fā)明的肽(或其模擬物)可以向生物體施用，防止一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的發(fā)作/發(fā)生。這方面特別優(yōu)選的對象是顯示有一種或多種動脈粥樣硬化危險性因素(例如，家族史、高血壓、肥胖、飲酒過多、吸煙、高血膽固醇、高血甘油三酯、血中LDL、VLDL、IDL高、或HDL低、糖尿病或糖尿病家族史、高血脂、心臟病發(fā)作、心絞痛或中風(fēng)等)的受試者。
除了使用本發(fā)明的動脈粥樣硬化抑制肽的方法之外，本發(fā)明還提供了這些肽自身，被配制為制劑，特別是口服制劑的肽，和用于治療和/或預(yù)防一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的試劑盒。
I.處理方法本文描述的活性劑(例如肽、有機小分子、氨基酸對等)可有效減輕本文所述的適應(yīng)癥的一種或多種癥狀，和/或降低其發(fā)作速度(rate of onset)和/或嚴(yán)重程度。特別地，本文所述的活性劑(例如肽、有機小分子、氨基酸對等)可有效減輕一種或多種動脈粥樣硬化癥狀。不受具體理論所限，可以相信，這些肽與形成促炎氧化磷脂必需的“種子分子”結(jié)合，例如Ox-PAPC、POVPC、PGPC和PEIPC。
此外，因為許多炎癥和/或其他病變至少部分地受到氧化脂類的介導(dǎo)，我們相信，本發(fā)明的肽可有效改善以生物活性氧化脂類的形成為特征的病癥。此外，本文所述的活性劑對于多種其他病癥似乎也有效。
現(xiàn)在對本文所述活性劑似乎可以減輕和/或預(yù)防的多種病變進行說明。
A)動脈粥樣硬化及相關(guān)病變我們發(fā)現(xiàn)，正常的HDL在抑制輕微氧化LDL的形成中的三個步驟。特別地，我們證實，通過用apo A-I或apo A-I模擬肽(37pA)體外處理人LDL，從包含HPODE和HPETE的LDL中除去了種子分子。這些種子分子是人類動脈壁細胞共培養(yǎng)物能夠氧化LDL，以及LDL誘導(dǎo)動脈壁細胞產(chǎn)生單核細胞趨化活性所必需的。我們還證實，在向小鼠注射或向人體輸注apo A-I之后，從注射/輸注了apo A-I的小鼠或人志愿者分離的LDL可抵抗人動脈壁細胞的氧化，不會在動脈壁細胞共培養(yǎng)物中誘導(dǎo)單核細胞趨化活性。
本發(fā)明多種活性劑的保護功能在多種相關(guān)應(yīng)用中得到了證明(見例如，PCT公開WO2002/15923和WO2004/034977等)。WO2002/15923的圖1中，圖面A、B、C和D顯示了ApoE缺失小鼠體內(nèi)14C-D-5F與血液組分的結(jié)合。還證實，來自給食可導(dǎo)致動脈粥樣化(atherogenic)的飲食并注射PBS的小鼠的HDL不能抑制人LDL的氧化，也不能抑制人動脈壁共培養(yǎng)物中LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性。對比地，來自給食可導(dǎo)致動脈粥樣化的飲食并每天注射根據(jù)本發(fā)明的肽的小鼠的HDL，與正常的人HDL一樣有效地抑制人LDL氧化并防止共培養(yǎng)物中LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性(WO02/15923中的圖2A和2B)。此外，取自給食可導(dǎo)致動脈粥樣化的飲食并注射PBS的小鼠的LDL與取自給食相同飲食并每天注射20μg肽5F的小鼠的LDL相比，更加容易氧化，也更加容易誘導(dǎo)單核細胞趨化活性。D肽未顯示免疫原性(WO 02/15923中的圖4)。
人動脈壁細胞對來自飼予可導(dǎo)致動脈粥樣化的飲食并注射根據(jù)本發(fā)明肽的小鼠的HLD和LDL的體外響應(yīng)與這些肽的體內(nèi)保護作用一致。盡管總膽固醇、LDL-膽固醇和IDL+VLDL-膽固醇水平相似，且HDL-膽固醇占總膽固醇的百分比較低，但是飼予可導(dǎo)致動脈粥樣化的飲食并注射肽的動物具有明顯較低的損害評分(lesion scores)(WO 02/15923中的圖5)。因此，本發(fā)明的肽可以防止被飼予可導(dǎo)致動脈粥樣化的飲食的小鼠體內(nèi)動脈粥樣硬化損害的發(fā)展。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過施用一種或多種本文所述的活性劑改善和/或防止一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的方法。
B)減輕與冠狀動脈鈣化(coronary calcification)和骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的癥狀或病癥血管鈣化和骨質(zhì)疏松癥常常共存于同一個受試者中，Ouchi等((1993)Ann NY Acad Sci.，676297-307)；Boukhris和Becker((1972)JAMA，2191307-1311)；Banks等((1994)Eur J Clin Invest.，24813-817)；Laroche等((1994)Clin Rheumatol.，13611-614)；Broulik和Kapitola((1993)EndocrRegul.，2757-60)；Frye等((1992)Bone Mine.，19185-194)；Barengolts等((1998)Calcif Tissue Int.，62209-213)；Brnett和vasikaran((2002)Ann ClinBiochem.，39203-210.)。Parhami等((1997)Arterioscl Thromb Vasc Biol.，17680-687)證實，輕微氧化的LDL(MM-LDL)和MM-LDL中的生物活性脂類[也就是氧化的1-棕櫚酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)(Ox-PAPC)]，以及異前列腺烷(isoprostane)，8-異前列腺素E2，但不是未氧化的磷脂(PAPC)或異前列腺烷8-異前列腺素F2α，在體外誘導(dǎo)鈣化血管細胞(CVC)的堿性磷酸酶活性和成骨細胞分化，但抑制MC3T3-E1骨細胞的分化。
骨單位與動脈壁的相似之處在于，骨單位集中在內(nèi)皮細胞覆蓋(lined)的內(nèi)腔上，該內(nèi)腔被含有基質(zhì)(matrix)和類成纖維細胞(fibroblast-like cell)的內(nèi)皮下空間包圍，該空間進一步被占據(jù)類似于動脈壁中平滑肌細胞位置的前成骨細胞和成骨細胞包圍(同前所引)。骨小梁成骨細胞還與骨髓內(nèi)皮下空間(同前所引)接界。Parhami等假定，脂蛋白能夠穿過骨動脈的內(nèi)皮，并沉積在內(nèi)皮下空間中，在那里它們被氧化，就如在冠狀動脈的情況一樣(同前所引)。根據(jù)他們的體外數(shù)據(jù)，他們預(yù)測，骨動脈內(nèi)皮下空間和骨髓內(nèi)的LDL氧化會導(dǎo)致成骨細胞分化和礦物化減少，這有助于骨質(zhì)疏松癥(同前所引)。他們的假說進一步預(yù)測，LDL水平與骨質(zhì)疏松癥正相關(guān)，正如與冠狀動脈鈣化正相關(guān)一樣(Pohle et al.(2001)Circulation，1041927-1932)，但HDL水平與骨質(zhì)疏松癥負(fù)相關(guān)(Parhami et al.(1997)Arteroscl Thromb Vasc Biol.，17680-687)。
在體外，骨髓基質(zhì)細胞系M2-10B4的成骨細胞分化被MM-LDL但非天然LDL抑制(Parhami et al.(1999)J Bone Miner Res.，142067-2078)。當(dāng)培養(yǎng)來自被飼予低脂肪飲食的動脈粥樣硬化易感C57BL/6(BL6)小鼠的骨髓基質(zhì)細胞時，存在強的成骨分化(同上)。對比地，當(dāng)培養(yǎng)來自被飼予高脂肪、可導(dǎo)致動脈粥樣化的飲食的小鼠的骨髓基質(zhì)細胞時，它們沒有經(jīng)歷成骨分化(同上)。這個觀察結(jié)果非常重要，因為它為在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中骨髓基質(zhì)細胞的成骨潛力降低提供了可能的解釋(Nuttall andGimble(2000)Bone，27177-184)。在體內(nèi)，成骨潛力的降低伴隨著骨質(zhì)疏松骨骼中脂肪生成增加(同上)。
發(fā)現(xiàn)向apoE缺失小鼠的飲水中添加D-4F6周，可以顯著增加骨小梁骨密度，并且可以相信，本發(fā)明的其它活性劑將具有相似的作用。
我們的數(shù)據(jù)表明，骨質(zhì)疏松癥能夠看作是“骨的動脈硬化癥”。其似乎是氧化脂類作用的結(jié)果。HDL可破壞這些氧化的脂類，并促進成骨細胞分化。我們的數(shù)據(jù)表明，向哺乳動物施用(例如，在apoE缺失小鼠的飲水中)本發(fā)明的活性劑僅大約幾周時間可顯著增加骨小梁。
這表明，本文所述的活性劑可用于減輕一種或多種骨質(zhì)疏松癥狀(例如抑制脫鈣)或者用于誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松骨的重新鈣化?；钚詣┻€可用作預(yù)防藥，防止哺乳動物(例如具有骨質(zhì)疏松癥危險性的患者)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。
我們相信，類似的機制也是導(dǎo)致冠狀動脈鈣化，例如鈣化性主動脈狹窄的原因。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明考慮使用本文所述的活性劑抑制或防止如下疾病癥狀，例如冠狀動脈鈣化、鈣化性主動脈狹窄、骨質(zhì)疏松癥等。
C)炎癥和自身免疫適應(yīng)癥慢性炎癥和/或自身免疫病癥也以許多活性氧類別的形成為特征，并且可以使用本文所述的一種或多種活性劑加以治療。因此，不為具體理論所限，我們相信，本文所述的活性劑可用于預(yù)防或治療性地減輕和/或抑制多種其他病癥的發(fā)作和/或其一種或多種癥狀，這些病癥包括但不僅限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性多動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等。
在一些實施方案中，活性劑可用于減輕一種或多種由這些病癥中的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的或與之相關(guān)聯(lián)的癥狀。
另外，在一些實施方案中，活性劑可用于減輕一種或多種由與AIDS有關(guān)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的或與之有關(guān)的病癥。
D)感染/創(chuàng)傷/移植我們觀察到，流感感染和其他感染的結(jié)果之一是HDL中對氧磷酶和血小板激活乙酰水解酶活性的降低。不為具體理論所限，我們相信，在急性期反應(yīng)中，作為這些HDL酶活性損失的結(jié)果以及作為促氧化性(pro-oxidant)蛋白與HDL關(guān)聯(lián)的結(jié)果，HDL不再能夠防止LDL氧化，也不再能夠防止內(nèi)皮細胞的LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的產(chǎn)生。
我們觀察到，在感染流感病毒A之后每天注射極低劑量本發(fā)明的某些制劑(例如，對于小鼠為20微克)的受試者體內(nèi)，對氧磷酶活性沒有降低，產(chǎn)生的具有生物活性的氧化磷脂的產(chǎn)生也沒有超過背景水平。這表明，4F、D4F(和/或本發(fā)明的其他劑)可以向(包括例如，在流感感染期間已患有冠狀動脈疾病，或者會由于病毒感染、細菌感染、創(chuàng)傷、移植、多種自身免疫癥狀等產(chǎn)生急性期炎癥反應(yīng)的)患者施用(例如口服或注射)，因此我們能夠通過這種短期治療防止與產(chǎn)生這些炎癥狀態(tài)的病變相關(guān)聯(lián)的心臟病發(fā)作和中風(fēng)發(fā)病率的增加。
此外，通過恢復(fù)和/或保持對氧磷酶的水平和/或單核細胞活性，本發(fā)明的制劑可用于治療感染(例如，病毒感染、細菌感染、真菌感染)和/或與感染有關(guān)的炎癥(例如腦膜炎)和/或創(chuàng)傷。
在一些實施方案中，由于聯(lián)合了抗炎活性和抗感染活性，本文描述的劑還可用于處理傷口或其他創(chuàng)傷，減輕與器官或組織移植、和/或器官或組織移植排斥、和/或植入的假體、和/或移植動脈粥樣硬化(transplantatherosclerosis)、和/或生物膜(biofilm)形成相關(guān)聯(lián)的不利作用。此外，我們相信，L-4F、D-4F和/或本文說明的其他制劑還可用于減輕脊髓損傷的影響。
E)糖尿病及關(guān)聯(lián)癥狀還發(fā)現(xiàn)本文所述的多種活性劑具有減輕和/或防止一種或多種糖尿病關(guān)聯(lián)癥狀的效力。因此，在多種實施方案中，本發(fā)明提供了處理(治療和/或預(yù)防性)糖尿病和/或相關(guān)病變(例如I型糖尿病、II糖尿病、幼年型糖尿病、糖尿病性腎病、腎病、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等)的方法。
F)抑制再狹窄本文還證實，本發(fā)明的活性劑可有效抑制再狹窄，例如球囊血管成形術(shù)(balloon angioplasty)之后的再狹窄。因此，例如圖13顯示了A類兩親性螺旋肽D4F對頸動脈球囊損傷的效果。用D-4F(5mg/kg/日)注射16周齡肥胖Zucker大鼠1周，此時對它們進行頸總動脈球囊損傷。兩周后，處死大鼠并確定內(nèi)膜-中膜比。如圖13所示，經(jīng)過處理的動物體內(nèi)再狹窄減少。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明考慮施用一種或多種本文所述的活性劑，以減輕/預(yù)防再狹窄。這些制劑可以全身性施用(例如口服、注射等)或者局部施用，例如通過使用藥物洗脫支架和/或簡單地通過在血管成形期間局部施用。
G)減輕與急性炎癥反應(yīng)有關(guān)的動脈粥樣硬化癥狀本發(fā)明的活性劑還可用于多種用途。例如，我們觀察到，心血管并發(fā)癥(例如動脈粥樣硬化、中風(fēng)等)經(jīng)常伴隨或者跟隨急性期炎癥反應(yīng)的發(fā)作，例如與復(fù)發(fā)性炎癥、病毒感染(例如流行性感冒)、細菌感染、真菌感染、器官移植、創(chuàng)傷或其它創(chuàng)傷等相關(guān)聯(lián)的炎癥反應(yīng)。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明考慮向正在遭受急性炎癥反應(yīng)或有急性炎癥反應(yīng)的危險性的，和/或具有或處于動脈粥樣硬化癥和/或相關(guān)病變(例如中風(fēng))危險性的受試者施用一種或多種本文所述的活性劑。
因此，例如，具有冠狀動脈疾病危險性的人在流感季節(jié)可以預(yù)防性地施用一種或多種本發(fā)明的活性劑?；加蓄愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種自身免疫疾病等復(fù)發(fā)性炎癥的人(或動物)，可以用本文所述的一種或多種劑處理，以減輕或防止動脈粥樣硬化或中風(fēng)的發(fā)生?；加腥缂毙該p傷、組織移植等創(chuàng)傷的人(或動物)，可用本發(fā)明的多肽處理，以減輕動脈粥樣硬化或中風(fēng)的發(fā)生。
在一些情況下，這些方法需要診斷急性炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)或危險性。急性炎癥反應(yīng)典型地涉及肝中代謝和基因調(diào)節(jié)的改變。它是一個動態(tài)內(nèi)平衡過程，除了免疫、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外，還涉及機體所有主要系統(tǒng)。通常，急性期反應(yīng)只持續(xù)幾天；然而，在慢性或復(fù)發(fā)性炎癥情況下，急性期反應(yīng)某些方面的異常持續(xù)會促進與疾病相伴的基本組織損傷，并且還可能導(dǎo)致進一步的并發(fā)癥，例如心血管疾病或蛋白質(zhì)沉積疾病，例如淀粉樣變。
急性期反應(yīng)的一個重要方面是肝臟生物合成概況(biosynthetic profile)的根本性改變。在正常情況下，肝臟以穩(wěn)態(tài)濃度合成一組特征性的血漿蛋白質(zhì)。這些中的許多蛋白質(zhì)具有重要功能，在炎癥刺激之后的急性期反應(yīng)期間，需要更高血漿水平的這些急性期反應(yīng)物(APR)或急性期蛋白(APP)。盡管大多數(shù)ARP是通過肝細胞合成的，但是有一些是通過其它細胞類型合成的，包括單核細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和脂肪細胞。大多數(shù)APR的誘導(dǎo)比正常水平高50％到數(shù)倍。對比地，主要APR可增加至高于正常水平1000倍。這些包括血清淀粉樣蛋白A(SAA)和或者人體內(nèi)的C反應(yīng)蛋白(CRP)或其小鼠中的同源物，血清淀粉樣蛋白P組分(SAP)。在急性期反應(yīng)期間，所謂的負(fù)APR(negative APR)的血漿濃度降低，以便使肝臟合成誘導(dǎo)APR的能力提高。
因此，在一些實施方案中，急性期反應(yīng)或其危險性可以通過測量一種或多種APP加以評估。測量這些標(biāo)志物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，并且有提供這種測量手段的商業(yè)公司(例如，通過Cardiotech Services，Louisville KY測量AGP)。
II.活性劑多種活性劑可用于治療一種或多種本文所討論的適應(yīng)癥。這些劑包括，但不僅限于，A類兩親性螺旋肽，在非極性面具有芳香或脂肪族殘基的A類兩親性螺旋肽的模擬物，小肽包括五肽、四肽、三肽、二肽和氨基酸對，Apo-J(G*肽)、和肽模擬物，例如下文所述的物質(zhì)。
A)A類兩親性螺旋肽在一些實施方案中，用于本發(fā)明方法的活性劑包括A類兩親性螺旋肽，例如美國專利6,664,230和PCT公開WO 02/15923和WO 2004/034977中描述的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含A類兩親性螺旋的肽(“A類肽”)除了能夠減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀之外，還可用于治療一種或多種本文所述的其它適應(yīng)癥。
A類肽的特征是形成有α螺旋，其造成極性和非極性殘基隔離，藉此形成極性和非極性面，帶正電的殘基位于極性-非極性界面上，帶負(fù)電的殘基位于極性面的中心(見例如，Anantharamaiah(1986)Meth.Enzymol，128626-668)。注意，當(dāng)折疊成3.667個殘基/轉(zhuǎn)角時，apo A-I的第四個外顯子(fourth exon)產(chǎn)生A類兩親性螺旋結(jié)構(gòu)。
按照本文所述，對一個指定為18A的A類肽(見例如，Anantharamaiah(1986)Meth.Enzymol，128626-668)進行修飾，產(chǎn)生可口服施用的肽，并可高效抑制或防止動脈粥樣硬化和/或本文所述其它適應(yīng)癥的一種或多種癥狀。不限于具體理論，可以相信，本發(fā)明的肽可以在體內(nèi)通過拾取(picking up)種子分子，減輕LDL的氧化而起效。
我們確定，18A疏水面上Phe殘基數(shù)目的增加理論上可以增加脂類親和力，這可通過Ralgunachari等(1996)Arteriosclerosis，Thrombosis，& VascularBiology 16328-338描述的計算來確定。理論上，用Phe系統(tǒng)取代18A非極性面中的殘基可產(chǎn)生六種肽。具有額外2、3和4個Phe的肽的理論脂類親和力(λ)值分別為13、14和15個單位。然而，如果額外的Phe從4增加到5，則λ值跳躍4個單位(到19個λ單位)。增加到6或7個Phe，將產(chǎn)生較不顯著的增加(分別到20和21個λ單位)。
我們制備了數(shù)種這樣的A類肽，包括指定為4F、D4F、5F和D5F的肽等。多種A類肽可以抑制動脈粥樣硬化易感小鼠中身體損害的發(fā)生。此外，這些肽在減輕本文所述多種病變的一種或多種癥狀中顯示出不同但顯著的有效程度。表1列舉了若干這樣的肽。
表1.本發(fā)明使用的A類兩親性螺旋肽舉例
1接頭用下劃線標(biāo)注NMA是N-甲基鄰氨基苯甲?；?N-Methyl Anthranilyl)在一些優(yōu)選實施方案中，該肽包括4F(表1中的SEQ ID NO13)的變體，也稱作L-4F，其中所有的殘基都是L型氨基酸；或D-4F，其中有一個或多個殘基是D型氨基酸。在本文所述的任何肽中，C末端和/或N末端和/或內(nèi)部殘基可以用一個或多個如本文所述的封閉基團加以封閉。
盡管表1中的多種肽都示例說明性地用乙?；騈甲基鄰氨基苯甲?；Ｗo氨基末端，用酰胺基保護羧基末端，但是這些保護基團的任何一個都可以被除去和/或用另一種本文所述的保護基團替換。在特別優(yōu)選的實施方案中，該肽包括一個或多個如本文所述的D型氨基酸。在一些實施方案中，表1中肽的每一個氨基酸(例如每一個對映體氨基酸)都是D型氨基酸。
還要指出，表1不是封閉性的。使用本文的教導(dǎo)，可以按常規(guī)制造其它合適的A類兩親性螺旋肽(例如，通過保守或半保守取代(例如用E取代D)、延伸、缺失等)。因此，例如，一個實施方案使用了一種或多種本文所述的肽(例如，表1中SEQ ID NO10-28和47-所指示的肽)的截短形式。因此，例如，SEQ ID NO29顯示了這樣一種肽，其包括14個來自18A的C末端的氨基酸，其中包含一個或多個D氨基酸，而SEQ ID NO30-46顯示了其它的截短形式。
更長的肽也是合適的。這種較長的肽可完全形成A類兩親性螺旋，或者該A類兩親性螺旋(或多個螺旋)可形成該肽的一個或多個域。此外，本發(fā)明考慮了肽的多聚體形式(例如多聯(lián)體)。因此，例如，本文所述的肽能夠偶聯(lián)在一起(直接地或者通過具有一個或多個插入氨基酸的接頭(例如碳接頭(carbon linker)，或一個或多個氨基酸))。示例說明性的聚合體肽包括18A-Pro-18A和SEQ ID NOs86-93的肽，在一些實施方案中，包括一個或多個D氨基酸，更優(yōu)選地，每一個氨基酸都是如本文所述的D氨基酸，和/或其一個或兩個末端都被保護。
B)在非極性面具有芳香或脂肪族殘基的apoA-I的其它A類兩親性螺旋肽模擬物在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了經(jīng)過修飾的A類兩親性螺旋肽。一些優(yōu)選的肽在非極性面的中心含有一個或多個芳香族殘基，例如3FCπ(例如存在于4F中)，或在非極性面的中心具有一個或多個脂肪族殘基，例如3FIπ，見例如表2。不受具體理論所限，我們相信，肽3FC非極性面上的中心芳香族殘基，由于非極性面中心π電子的存在，允許水分子滲透到肽-脂類復(fù)合物的疏水脂類烴基鏈附近，這樣使活性氧類別(例如脂氫過氧化物)得以進入，使它們與細胞表面隔離。類似地，我們還相信，在非極性面中心具有脂肪族殘基的肽，例如3FIπ，可具有類似的作用，但效力不如3FCπ。
優(yōu)選的肽將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或者使抗炎HDL更加抗炎，和/或減少LDL誘導(dǎo)的由動脈壁細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性，其效果等于或者大于D4F或者表1所示的其它肽。
表2.一些優(yōu)選肽實例
其他合適的A類肽的特征是，具有改進的疏水表面。這些肽的實例如表3所示。
表3.具有改進疏水相的肽實例
本文所述的肽(V2W3A5F10，17-D-4F；V2W3F10-D-4F；W3-D-4F)可比原本的D-4F效力更強。
C)較小的肽另一個驚人的發(fā)現(xiàn)是，一些小肽，其最少由3個氨基酸構(gòu)成，其中優(yōu)選地(但非必需的)有一個或多個氨基酸為其D型立體異構(gòu)體，并具有疏水域以允許脂肪蛋白相互作用，和親水域以允許一定程度的水溶性，這樣的小肽也有顯著的抗炎性質(zhì)，并可用于治療一種或多種本文所述的病變?！靶‰摹钡湫偷亻L度范圍是2個氨基酸到大約15個氨基酸，更優(yōu)選地為大約3個氨基酸到大約10或11個氨基酸，最優(yōu)選地長度范圍是大約4個到大約8個或10個氨基酸。在多種實施方案中，肽典型的特征是，具有疏水末端氨基酸或具有通過與一個或多個疏水“保護”基團結(jié)合而稱為疏水性的末端氨基酸。多種“小肽”在共同待審的專利申請USSN 10/649,378(2003年8月26日提出申請)和USSN 10/913,800(2004年8月6日提出申請)和PCT專利申請PCR/US2004/026288中有說明。
在有些實施方案中，肽可以用下面的公式I表示X1-X2-X3n-X4I其中n是0或1，X1是疏水氨基酸和/或具有疏水保護基團，X4是疏水氨基酸和/或具有疏水保護基團；并且當(dāng)n為0時，X2是酸性或堿性氨基酸；當(dāng)n為1時，X2和X3是獨立的酸性氨基酸、堿性氨基酸、脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸，其中當(dāng)X2是酸性氨基酸時，X3是堿性氨基酸、脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸；當(dāng)X2是堿性氨基酸時，X3是酸性氨基酸、脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸；當(dāng)X2是脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸時，X3是酸性氨基酸或堿性氨基酸。
更長的肽(例如，長達10、11或15個氨基酸)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。典型地，當(dāng)較短的肽(例如根據(jù)公式I的肽)以酸性、堿性、脂肪族或芳香族氨基酸為特征時，較長肽的特征是包含兩個或多個相應(yīng)類型氨基酸的酸性、堿性、脂肪族或芳香族域。
1)活性小肽的功能性質(zhì)本發(fā)明的一個驚人發(fā)現(xiàn)是，通過許多物理性質(zhì)預(yù)測本發(fā)明小肽(例如小于10個氨基酸，優(yōu)選地小于8個氨基酸，更優(yōu)選地為大約3到大約5或大約6個氨基酸)具有使HDL更加抗炎，減輕動脈粥樣硬化和/或哺乳動物中其他以炎癥反應(yīng)為特征的病變的能力。這些物理性質(zhì)包括乙酸乙酯中的高溶解性(例如，大于大約4mg/ml)，和在pH7.0緩沖水溶液中的溶解性。在含水環(huán)境中，一旦與磷脂例如1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DMPC)接觸，特別有效的小肽可誘導(dǎo)或參與形成直徑為大約7.5nm(±0.1nm)的顆粒，和/或誘導(dǎo)或參與形成堆疊雙層，雙層尺寸大約為3.4-4.1nm，堆疊雙層之間的間隔為大約2nm，和/或誘導(dǎo)或參與形成大約38nm的囊狀結(jié)構(gòu)。在一些優(yōu)選實施方案中，小肽的分子量小于大約900Da。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明考慮了這樣的小肽，其改善本文所述適應(yīng)癥/病變的一種或多種癥狀，例如炎癥，其中所述肽長度范圍是大約3到大約8個氨基酸，優(yōu)選地大約3到大約6或7個氨基酸，更優(yōu)選地大約3到大約5個氨基酸；在乙酸乙酯中以大于大約4mg/ml的濃度溶解；在pH7.0的緩沖水溶液中可溶；當(dāng)在含水環(huán)境下與磷脂接觸時，形成直徑為大約7.5nm(±0.1nm)的顆粒，和/或形成雙層尺寸大約為3.4-4.1nm、堆疊雙層之間的間隔為大約2nm的堆疊雙層；分子量小于大約900道爾頓；可將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或使抗炎HDL更加抗炎；不具有氨基酸序列Lys-Arg-Asp-Ser(SEQ ID NO249)，尤其是其中Lys-Arg-Asp和Ser全為L氨基酸的序列。在一些實施方案中，這些小肽保護磷脂免受氧化劑的氧化。
盡管這些小肽不受限制，但在一些實施方案中，這些小肽能夠包括如下所述的小肽。
2)三肽據(jù)發(fā)現(xiàn)，可合成一些三肽(3氨基酸肽)，其顯示如本文所述的理想性質(zhì)(例如將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL的能力，降低LDL誘導(dǎo)的由動脈壁細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性的能力，能夠增加前βHDL的能力等)。在一些實施方案中，該肽的特征表示為式I中N為0，如下面的式II所示X1-X2-X4II其中末端氨基酸(X1和X4)是疏水的，或者是因為有疏水側(cè)鏈，或者是因為側(cè)鏈或C和/或N末端被一個或多個疏水保護基團封閉(例如，N末端被Boc-，F(xiàn)moc-，煙酰基等封閉，C末端被(tBu)-OtBu等封閉)。在一些實施方案中，X2氨基酸是酸性的(例如，天冬氨酸、谷氨酸等)或堿性的(例如，組氨酸、精氨酸、賴氨酸等)。肽可以全部是L氨基酸，或包含一個或多個D氨基酸，或全部都是D氨基酸。
本發(fā)明的一些優(yōu)選的三肽包括，但不僅限于，表4所示的肽。
表4.具有疏水封閉基團和酸性、堿性或組氨酸中心氨基酸的一些優(yōu)選三肽實例
盡管表4的肽顯示具有特定的保護基團，但是需要注意，這些基團可以用本文所述的其他保護基團替換，并且/或者可以去除一個或多個所示的保護基團。
3)具有中心酸性和堿性氨基酸的小肽在一些實施方案中，本發(fā)明肽的范圍從4個氨基酸到大約10個氨基酸。末端氨基酸通常是疏水的，這或者是由于疏水側(cè)鏈，或者是由于末端氨基酸具有一個或多個疏水保護基團。末端氨基酸(X1和X4)是疏水的，這或者是由于具有疏水側(cè)鏈，或者是由于側(cè)鏈或C和/或N末端被一個或多個疏水保護基團封閉(例如N末端被Boc-，F(xiàn)moc-，煙?；确忾]，C末端被(tBu)-OtBu等封閉)。典型地，肽的中心部分包含堿性氨基酸和酸性氨基酸(例如，在4-mer中)，或者，在更長的分子中，包含堿性域和/或酸性域。
這些4-mer單位可用式I表示，其中X1和X4是疏水的，和/或具有如本文所述的疏水保護基團，X2是酸性的，而X3是堿性的，或者X2是堿性的，而X3是酸性的。肽可以全部是L-氨基酸，或者包含一個或多個D-氨基酸，或全部都是D-氨基酸。
本發(fā)明的一些優(yōu)選肽包括，但不僅限于表5所示的肽。
表5.具有中心酸性和堿性氨基酸的小肽的說明性實例
盡管表5的所示的肽帶有特定的保護基團，但是需要注意，這些基團可以被其他如本文所述的保護基團替換，和/或可以消除一個或多個所示保護基團。
4)具有中心酸性或堿性氨基酸及中心脂肪族氨基酸的小肽在一些實施方案中，本發(fā)明肽的范圍是4個氨基酸到大約10個氨基酸。末端氨基酸典型地是疏水的，這或者是由于具有疏水側(cè)鏈，或者是由于末端氨基酸具有一個或多個疏水保護基團。末端氨基酸(X1和X4)是疏水的，這或者是由于具有疏水側(cè)鏈，或者是由于側(cè)鏈或C和/或N末端被一個或多個疏水保護基團封閉(例如N末端被Boc-，F(xiàn)moc-，煙酰基等封閉，C末端被(tBu)-OtBu等封閉)。典型地，肽的中心部分包含堿性或酸性氨基酸和脂肪族氨基酸(例如，在4-mer中)，或者，在更長的分子中，包含堿性域或酸性域以及脂肪族域。
這些4-mer可用式I表示，其中X1和X4是疏水的，和/或具有如本文所述的疏水保護基團，X2是酸性或堿性的，而X3是脂肪族的，或者X2是脂肪族的，而X3是酸性或堿性的。肽可以全部是L-氨基酸，或者包含一個或多個D-氨基酸，或全部都是D-氨基酸。
本發(fā)明的一些優(yōu)選肽包括，但不僅限于表6所示的肽。
表6.在中心具有酸性或堿性氨基酸及中心脂肪族氨基酸的一些優(yōu)選肽的實例
盡管表6所示的肽帶有特定的保護基團，但是需要注意，這些基團可以被其他如本文所述的保護基團替換，和/或可以消除一個或多個所示保護基團。
5)具有中心酸性或堿性氨基酸及中心芳香族氨基酸的小肽在一些實施方案中，本發(fā)明“小”肽的范圍是4個氨基酸到大約10個氨基酸。末端氨基酸通常是疏水的，這或者是由于具有疏水側(cè)鏈，或者是由于末端氨基酸具有一個或多個疏水保護基團。末端氨基酸(X1和X4)是疏水的，這或者是由于具有疏水側(cè)鏈，或者是由于側(cè)鏈或C和/或N末端被一個或多個疏水保護基團封閉(例如N末端被Boc-，F(xiàn)moc-，煙?；确忾]，C末端被(tBu)-OtBu等封閉)。典型地，肽的中心部分包含堿性或酸性氨基酸和芳香族氨基酸(例如，在4mer中)，或者，在更長的分子中，包含堿性域或酸性域以及芳香族域。
這些4-mer可用式I表示，其中X1和X4是疏水的，和/或具有如本文所述的疏水保護基團，X2是酸性或堿性的，而X3是芳香族的，或者X2是芳香族的，而X3是酸性或堿性的。肽可以全部是L-氨基酸，或者包含一個或多個D-氨基酸，或全部都是D-氨基酸。5-mer可用稍加修改的式I表示，其中插入X5，如表7所示，并且其中X2通常是芳香族氨基酸。
本發(fā)明的一些優(yōu)選肽包括，但不僅限于表7所示的肽。
表7.具有中心酸性或堿性氨基酸及中心芳香族氨基酸的一些優(yōu)選肽的實例
盡管表7所示的肽帶有特定的保護基團，但是需要注意，這些基團可以被其他如本文所述的保護基團替換，和/或可以消除一個或多個所示保護基團。
6)中心具有芳香族氨基酸或者被組氨酸分開的芳香族氨基酸的小肽在一些實施方案中，本發(fā)明的肽以暴露在分子的中心的π電子為特征，其允許粒子發(fā)生水合，從而使得肽粒子可以俘獲促炎氧化脂類，例如脂肪酸氫過氧化物和在sn-2位含有花生四烯酸氧化產(chǎn)物的磷脂。
在一些實施方案中，這些肽由最少4個氨基酸，最多大約10個氨基酸組成，優(yōu)選地(但非必需)，其中一個或多個氨基酸為該氨基酸的D-對映體，末端氨基酸是疏水的，這或者是由于具有疏水側(cè)鏈，或者是由于末端氨基酸具有一個或多個疏水封閉基團(例如N末端被Boc-，F(xiàn)moc-，煙酰基等封閉，C末端被(tBu)-OtBu等封閉)。這些肽在中心并不具有酸性或堿性氨基酸，而是在中心一般具有芳香族氨基酸，或者被組氨酸分開的芳香族氨基酸。
本發(fā)明的一些優(yōu)選肽包括，但不僅限于表8所示的肽。
表8.具有中心芳香族氨基酸或者被一個或多個組氨酸分開的芳香族氨基酸或芳香域的肽的實例
盡管表8所示的肽具有特定的保護基團，但是需要注意，這些基團可以被其他如本文所述的保護基團替換，和/或可以消除一個或多個所示保護基團。
7)三肽和四肽總結(jié)為清晰起見，在下面表9中概括地總結(jié)了本發(fā)明的若干三肽和四肽。
表9.本發(fā)明一些肽的一般結(jié)構(gòu)
當(dāng)較長的肽是理想的時候，X2和X3可代表域(例如兩個或多個指定類型氨基酸的區(qū)域)，而不是單個氨基酸。表9只是示例說明性的，而沒有限制意義。使用本文的教導(dǎo)，可以容易地確定其他合適的肽。
8)成對氨基酸和二肽在一些實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)某些氨基酸對在彼此聯(lián)合施用或連接形成二肽時，具有一種或多種本文所述的性質(zhì)。因此，不受具體理論所限，可以相信，當(dāng)氨基酸對彼此聯(lián)合施用時，如本文所述，它們在體內(nèi)能夠參與或者誘導(dǎo)膠束形成。
類似于本文所述的其它小肽，可以相信，肽對可以在體內(nèi)結(jié)合，并且顯示如下物理性質(zhì)，包括在乙酸乙酯中具有高溶解性(例如大于大約4mg/ml)，在pH7.0的緩沖水溶液中可溶。一旦在含水環(huán)境中與磷脂，例如1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DMPC)接觸，可以相信，氨基酸對誘導(dǎo)或參與直徑為大約7.5nm(±0.1nm)的微粒的形成，和/或誘導(dǎo)或參與雙層尺寸大約為3.4-4.1nm的堆疊雙層的形成，該堆疊的雙層之間間隔大約2nm，和/或誘導(dǎo)或參與大約38nm的囊泡結(jié)構(gòu)的形成。
而且，進一步相信，氨基酸對可顯示一種或多種如下的生理相關(guān)性質(zhì)1.它們將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或者使抗炎HDL更加抗炎；2.它們降低LDL誘導(dǎo)的由動脈壁細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性；3.它們刺激前βHDL的形成和循環(huán)；4.它們提高HDL膽固醇；和/或5.它們提高HDL的對氧磷酶活性。
這些氨基酸對可以作為單獨的氨基酸施用(順次或同時施用，例如以聯(lián)合制劑的形式)，或者它們能夠直接地或通過接頭(例如PEG接頭、碳接頭、分支接頭、直鏈接頭、雜環(huán)接頭、由衍生化脂類形成的接頭等))共價偶聯(lián)。在一些實施方案中，氨基酸對通過肽鍵共價連接，形成二肽。在多種實施方案中，盡管二肽典型地包括兩個氨基酸，其中每一個都附有保護基團，但是本發(fā)明還試圖包括如下二肽，其中只有一個氨基酸具有一個或多個保護基團。
氨基酸對通常包括如下的氨基酸，其中每一個氨基酸與至少一個保護基團(例如，如本文所述的疏水保護基團)連接。氨基酸可以是D或L型。在一些實施方案中，成對的氨基酸并不彼此連接，每一個氨基酸具有兩個保護基團(例如，表10中的分子1和2)。
表10.本發(fā)明氨基酸對舉例
*通常與第二個氨基酸聯(lián)合施用。
**在一些實施方案中，這些肽彼此聯(lián)合施用。
***在一些實施方案中，這些肽或者單獨施用，或者與本文所述的一種其它肽聯(lián)合施用通過提供成對的受保護氨基酸和/或二肽，然后根據(jù)上文所述的一種或多種物理和/或生理性質(zhì)篩選氨基酸對/二肽，能夠容易地鑒定合適的氨基酸對。在一些實施方案中，本發(fā)明排除了包含天冬氨酸和苯丙氨酸的氨基酸對和/或二肽。在一些實施方案中，本發(fā)明排除了如下的氨基酸對和/或二肽，其中一個氨基酸是(-)-N-[(反式-4-異丙基環(huán)己烷)羰基]-D-苯丙氨酸(那格列奈(nateglinide))。
在一些實施方案中，成對的氨基酸獨立地從如下的組中選擇酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸等)，堿性氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸等)，和非極性氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等)。在一些實施方案中，第一個氨基酸是酸性或堿性時，第二個氨基酸是非極性，或者第二個氨基酸是酸性或堿性時，第一個氨基酸是非極性。在一些實施方案中，第一個氨基酸是酸性時，第二氨基酸是堿性，或者相反(見例如表11)。
通過施用二肽對，可以獲得相似的組合。因此，例如在一些實施方案中，表10中的分子3和4可以彼此聯(lián)合施用。
表11.一些概括性的氨基酸對/二肽
注意，這些氨基酸對只是示例性的，而沒有限制意義。使用本文的教導(dǎo)，可以容易地確定其他合適的氨基酸對/二肽。
D)Apo-J(G*肽)在一些實施方案中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，模擬apo J兩親性螺旋域的肽(例如多種apo-M衍生物)在保護LDL對抗動脈壁細胞氧化和降低LDL誘導(dǎo)的由于人動脈壁細胞氧化LDL造成的單核細胞趨化活性方面特別有效，并且能夠減輕動脈粥樣硬化和/或本文所述其它病變的一種或多種癥狀。
載脂蛋白J具有寬的非極性面，稱作類球蛋白或G*兩親性螺旋域。G型兩親性螺旋存在于球蛋白中，因此稱作G型。這類兩親性螺旋的特征是在極性面上隨機分布帶正電和帶負(fù)電的殘基，并具有窄的非極性面。由于該窄非極性面，這類螺旋不容易與磷脂結(jié)合(見Segrest et al.(1990)ProteinsStructure，function，and Genetics.8103-117；另見Erratum(1991)ProteinStructure，function，and Genetics.979)。有數(shù)種可以互換的載脂蛋白具有與G兩親性螺旋相似但不相同的特征。與G型兩親性螺旋相似，這一類螺旋在極性面上隨機分布帶正電和帶負(fù)電的殘基。然而，與具有窄非極性面的G型兩親性螺旋相反，這類螺旋具有寬的極性面，使得這類螺旋容易與磷脂結(jié)合，這類螺旋稱作G*，以便與G型兩親性螺旋區(qū)別(見Segrest et al.(1992)J.Lipid Res.，33141-166；另見Anantharamaiah et al.(1993)Pp.109-142，《InThe Amphipathic Helix》，Epand，R.M.Ed.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida)。
在如下的文獻中說明了多種合適的G*兩親性螺旋共同待審的專利申請USSN 10/120,508，其于2002年4月5日提出申請，USSN10/520,207，其于2003年4月1日提出申請，和PCT專利申請PCT/US03/09988，其于2003年4月1日提出申請。此外，表12中列舉了許多與apo J的G*兩親性螺旋域相關(guān)的本發(fā)明的合適肽。
表12.本發(fā)明使用的與apo J的G*兩親性螺旋域相關(guān)的優(yōu)選肽
然而，本發(fā)明的肽并不僅限于apo J的G*變體。一般而言，基本上來自于任何其他蛋白質(zhì)，優(yōu)選apo蛋白質(zhì)的G*域也是合適的。利用保護活性測定(例如，保護LDL免于氧化等)，如本文實例中的舉例，能夠容易地確定這些蛋白質(zhì)具體的合適度。一些特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)包括如下蛋白質(zhì)的G*兩親性螺旋域或其變體(例如，保守取代等)，這些蛋白質(zhì)包括但不僅限于apo AI、apo AIV、apo E、apo CII、apo CIII等。
表13列舉了本發(fā)明使用的與除apo J之外的載脂蛋白相關(guān)的G*兩親性螺旋域相關(guān)的一些優(yōu)選肽。
表13.本發(fā)明使用的與除apo J之外的載脂蛋白相關(guān)的G*兩親性螺旋域相關(guān)的優(yōu)選肽
E)從apo-M衍生的G*肽其他在本發(fā)明方法中有效的G*肽包括，但不僅限于，從apo-M衍生的G*肽。
表14.G*肽舉例
其他合適的肽包括但不僅限于表15的肽。
表15.具有改進的疏水相的肽舉例
本文所述的肽(V2W3A5F10、17-D-4F；V2W3F10-D-4F；W3-D-4F)可以具有比原始D-4F更強效。
另外的合適肽包括，但不僅限于，P1-二甲基酪氨酸-Arg-Phe-Lys-P2(SEQID NO1)和P1-二甲基酪氨酸-Arg-Glu-Leu-P2(SEQ ID NO2)，其中P1和P2是如本文所述的保護基團。在一些實施方案中，這些肽包括，但不僅限于，Boc二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys(OtBu)(SEQ ID NO5)和Boc二甲基酪氨酸-D-Arg-Glu-Leu(OtBu)(SEQ ID NO6)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的肽包括這樣的肽，所述肽包含氨基酸序列LAEYHAK(SEQ ID NO8)或者由該序列構(gòu)成，該序列包括至少一個D氨基酸和/或至少一個或兩個末端保護基團。在一些實施方案中，本發(fā)明包括A肽，其改善一種或多種炎癥癥狀，其中該肽長度為大約3到大約10個氨基酸；包含這樣的氨基酸序列，該序列包含與芳香或疏水氨基酸交替出現(xiàn)的酸性或堿性氨基酸；包含疏水末端氨基酸或者末端氨基酸具有疏水保護基團；不是全部由L氨基酸構(gòu)成的序列LAEYHAK(SEQ ID NO8)；其中該肽可以將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL和/或使抗炎HDL更加抗炎。
還要指出，本文表中列舉的肽并未包括全部。使用本文的教導(dǎo)，可以按常規(guī)制造其他合適的肽(例如通過保守或半保守取代(例如用E取代D)、延伸、缺失等)。因此，例如，一個實施方案采用SEQ ID Nos459-487所指定的任何一個或多個肽的截短序列。
更長的肽也是合適的。這些更長的肽可以完全形成G或G*類兩親性螺旋，或者G兩親性螺旋能夠形成該肽的一個或多個域。此外，本發(fā)明包含肽的多聚體形式。因此，例如，本文表中列舉的肽可以偶聯(lián)在一起(直接地，或者通過具有一個或多個插入氨基酸的接頭(例如碳接頭，或一個或多個氨基酸))。合適的接頭包括，但不僅限于，脯氨酸(-Pro-)、Gly4-Ser3(SEQID NO622)等。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個示例說明性的多聚體肽是(D-J336)-P-(D-J336)(即，Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-P-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-NH2，SEQ IDNO623)。
本發(fā)明還試圖使用“雜交”肽，其包括一個或多個G或G*兩親性螺旋域和一個或多個A類兩親性螺旋。合適的A類兩親性螺旋肽在PCT公開WO 02/15923中有說明。因此，作為示例，一個這樣的“雜交”肽是(D-J336)-Pro-(4F)(即，Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2，SEQ ID NO624)，或類似物。
使用本文的教導(dǎo)，技術(shù)人員能夠按常規(guī)修飾所示的兩親性螺旋肽，產(chǎn)生本發(fā)明的其他合適的apo J變體和/或兩親性G和/或A螺旋肽。例如，可以對現(xiàn)有的氨基酸進行常規(guī)的保守或半保守取代(例如用E取代D)。多種取代物對所產(chǎn)生的肽的脂質(zhì)親和力的影響可以用Palgunachari等(1996)說明的計算方法進行預(yù)測(Arteriosclerosis，Thrombosis，& Vascular Biology16328-338))。這些肽可以延長或縮短，只要保持類型的螺旋結(jié)構(gòu)即可。此外，可進行取代，使所得的肽與對象物種內(nèi)源產(chǎn)生的肽更加相似。
盡管，在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的肽利用天然存在的氨基酸或天然存在氨基酸的D型，非天然存在的氨基酸(例如甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍、正亮氨酸、ε-氨基己酸、4-氨基丁酸、四氫異喹啉-3-羧酸、8-氨基辛酸、4-氨基丁酸、Lys(N(ε)-三氟乙酰)、α-氨基異丁酸等)的取代產(chǎn)物也在本文考慮之內(nèi)。
使用計算方法可以對新肽進行設(shè)計和/或評估。識別和分類兩親性螺旋域的計算機程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，在Jones et al.(1992)J.Lipid res.33287-296中有描述。這些程序包括，但不僅限于，螺旋輪程序(WHEEL或WHEEL/SNORKER)、螺旋網(wǎng)程序(HELNET，HELNET/SNORKEL，HELNET/Angle)、用于添加螺旋輪的程序(COMBO或COMBO/SNORKEL)、用于添加螺旋網(wǎng)的程序(COMNET，COMNET/SNORKEL，COMBO/SELECT，COMBO/NET)、共有輪程序(consensus wheel program)(CONSENSUS，CONSENSUS/SNORKEL)等。
E)封閉基團和D殘基盡管本文所述的多種肽和/或氨基酸對可能顯示沒有保護基團，但是在一些實施方案中(例如，特別是用于口服施用的)，它們可具有一個、兩個、三個、四個、或更多保護基團。保護基團可以和肽的C和/或N末端連接，和/或與構(gòu)成肽的一個或多個內(nèi)部殘基相連(例如，可封閉組成氨基酸上的一個或多個R基團)。因此，例如，在一些實施方案中，任何本文所述的肽可以具有，例如，保護氨基末端的乙?；?，和/或保護羧基末端的酰胺基。這種“雙”保護肽的一個實例是Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-NH2(具有封閉基團的SEQ ID NO459)，這些保護基團的任一或兩者都可被除去和/或被另一種如本文所述的保護基團取代。
不受限于具體理論，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，封閉，特別是封閉本發(fā)明對象肽的氨基和/或羧基末端，可大大改善口服遞送，并顯著提高血清半衰期。
多種保護基團均適用于本目的。這些基團包括，但不僅限于，乙酰基、酰胺、烷基，其中乙?；屯榛貏e優(yōu)選用于保護N末端，且酰胺特別優(yōu)選用于保護羧基末端。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，保護基團包括，但不僅限于，如脂肪酸中的烷基鏈、丙?；?、甲?；?。特別優(yōu)選的羧基保護基團包括酰胺、酯和成醚保護基團。在一個優(yōu)選實施方案中，使用乙?；Ｗo氨基末端，用酰胺基保護羧基末端。這些封閉基團提高肽的成螺旋趨勢。一些特別優(yōu)選的封閉基團包括多種長度的烷基，例如具有如下表達式的基團CH3-(CH2)n-CO-，其中n的范圍是大約1-大約20，優(yōu)選地大約1到大約16或18，更優(yōu)選大約3到大約13，最優(yōu)選大約3到大約10。
在一些特別優(yōu)選的實施方案中，保護基團包括，但不僅限于，如脂肪酸中的烷基鏈、丙?；⒓柞；?。特別優(yōu)選的羧基保護基團包括酰胺、酯和成醚保護基團。在一個優(yōu)選實施方案中，使用乙?；Ｗo氨基末端，用酰胺基保護羧基末端。這些封閉基團可提高肽的成螺旋趨勢。一些特別優(yōu)選的封閉基團包括多種長度的烷基，例如具有下式的基團CH3-(CH2)n-CO-，其中n的范圍是大約3到大約20，優(yōu)選地大約3到大約16，更優(yōu)選的大約3到大約13，最優(yōu)選的大約3到大約10。
其他的保護基團包括，但不僅限于，F(xiàn)moc、叔-丁氧羰基(t-BOC)、9-芴乙?；?、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲苯-2-磺?；?Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲?；?Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、乙酰基(Ac)和三氟乙?；?TFA)。
保護/封閉基團對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，同樣將這些基團與構(gòu)成本發(fā)明肽的合適殘基偶聯(lián)的方法也是如此(見，例如，Greene et al.，(1991)Protective Groups in Organic Synthesis，2nded.，John Wiley & Sons，Inc，Somerset)。在一個優(yōu)選實施方案中，例如，在合成期間，當(dāng)肽處于樹脂上時，用乙酸酐實現(xiàn)乙?；?。酰胺保護可通過為合成選擇合適的樹脂加以實現(xiàn)。在合成本文實施例所述的肽期間，使用rink amide樹脂。在合成完成之后，同時除去酸性雙功能氨基酸(例如Asp和Glu)和堿性氨基酸(Lys)，及Tyr羥基上的全部非永久性保護基團。用酸處理從該樹脂釋放的肽N末端被保護成乙?；?，羧基被保護成NH2，同時除去了所有其他的保護基團。
在一些特別優(yōu)選的實施方案中，肽包含一個或多個本文所述D型(右旋而非左旋)氨基酸。在一些實施方案中，至少有兩個對映體氨基酸，更優(yōu)選地至少4個對映體氨基酸，最優(yōu)選地至少8或10個對映體氨基酸是“D”型氨基酸。在一些實施方案中，本文所述肽的每隔一個氨基酸，或者甚至每個氨基酸(例如，每個對映體氨基酸)是D型氨基酸。
在一些實施方案中，至少50％的對映體氨基酸是“D”型，更優(yōu)選地至少80％的對映體氨基酸是“D”型，最優(yōu)選地至少90％或者甚至全部對映體氨基酸是“D”型氨基酸。
F)肽模擬物除了本文所述的肽之外，也包括仿肽(peptidomimetics)。在制藥工業(yè)中，通常使用肽類似物作為具有類似于模板肽性質(zhì)的非肽藥物。這些類型的非肽化合物稱作“肽模擬物”或“仿肽”(Fauchere(1986)Adv.Drug Res.1529；Veber and Freidinger(1985)TINS p.392；和Evans et al.(1987)J.Med.Chem.301229)，并且通常是借助計算機分子建模(molecular modeling)開發(fā)的。與治療上有效的肽結(jié)構(gòu)類似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等價的治療或疾病預(yù)防效果。
一般而言，仿肽在結(jié)構(gòu)上類似于示范多肽(paradigm polypeptide)(例如，表1所示的SEQ ID NO5)，但其中有一個或多個肽連接任選地被如下的連接替代-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順和反)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，-CH2SO-等，其方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且在如下文獻中有進一步的說明Spatola(1983)p.267，Chemistry and Biochemistry of AminoAcids，Peptides，and Proteins，B.Weinsterin，eds.，Marcel Dekker，New York，；Spatola(1983)Vega Data 1(3)Peptide Backbone Modifications.(綜述)；Morley(1980)Trends Pharm Sci pp.463-468(綜述)；Hudson et al.(1979)Int JPept Prot Res 14177-185(-CH2NH-和CH2CH2-)；Spatola et al.(1986)Life Sci381243-1249(-CH2S-)；Hann，(1982)J Chem Soc Perkin Trans I 307-314(-CH-CH-(順和反))；Almquist et al.(1980)J Med Chem.231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White et al.(1982)Tetrahedron Lett.232533(-COCH2-)；Szelke et al.，歐洲專利申請EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay et al.(1983)Tetrahedron Lett.244401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby(1982)Life Sci.，31189-199(-CH2S-))。
一種特別優(yōu)選的非肽連接是-CH2NH-。這種肽模擬物與多肽實施方案相比可以具有顯著的優(yōu)勢，包括例如生產(chǎn)更加經(jīng)濟、化學(xué)穩(wěn)定性更高、藥理性質(zhì)(半衰期、吸收、效價、效能等)更高、抗原性更小等。
此外，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(Rizo and Gierasch(1992)Ann.Rev.Biochem.61387)可以產(chǎn)生本文所述肽的環(huán)狀變換，或者包含共有序列或基本上相同的共有序列變化的限制肽(constrained peptides)(包括環(huán)化肽)；例如，通過添加能夠形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基。
G)有機小分子在一些實施方案中，本發(fā)明的活性劑包括有機小分子，例如共同待審的專利申請USSN 60/600,925中描述的，其于2004年8月11日提出申請。在多種實施方案中，有機小分子類似于在分別于2003年8月26日和8月11日提出申請的共同待審專利申請USSN 10/649,378和USSN 60/494,449中描述的四或五肽，并在一些實施方案中模擬這些它們。
本發(fā)明有機小分子的分子量通常小于大約900道爾頓。典型地，小分子在乙酸乙酯中高度可溶(例如，濃度等于或大于4mg/ml)，并且能夠溶于pH7.0的緩沖水溶液。
在水環(huán)境中使磷脂，例如1，2-雙十四酰(ditetradecanoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DMPC)與本發(fā)明的有機小分子接觸，會形成直徑大約7.5nm(±0.1nm)的顆粒。此外，還經(jīng)常形成堆疊雙層，其中雙層尺寸大約為3.4-4.1nm，堆疊中雙層的間隔大約2nm。還經(jīng)常形成大約38nm的囊狀結(jié)構(gòu)。而且，當(dāng)本發(fā)明的分子向哺乳動物施用時，它們可以使HDL更加抗炎，并減輕一種或多種動脈粥樣硬化癥狀和/或其它以炎癥反應(yīng)為特征的病癥。
因此，在一些實施方案中，有機小分子是可以改善哺乳動物體內(nèi)以炎癥反應(yīng)為特征的病變(例如動脈粥樣硬化)的一種或多種癥狀的分子，其中小分子在乙酸乙酯中溶解度大于4mg/ml，并且可溶于pH7.0的緩沖水溶液，并且當(dāng)在含水環(huán)境中與磷脂接觸時，會形成直徑大約7.5nm的顆粒，并形成堆疊雙層，其中雙層尺寸大約為3.4-4.1nm，堆疊中雙層的間隔大約2nm，同時分子量小于900道爾頓。
在一些實施方案中，分子具有如下式 其中P1、P2、P3和P4是獨立選擇的疏水保護基團；R1和R4是獨立選擇的氨基酸R基團；n，i，x，y和z獨立地為0或1，其中當(dāng)n和x都是0時，R1是疏水基團，當(dāng)y和i都是0時，R4是疏水基團；R2和R3在pH7.0時為酸性或堿性基團，其中當(dāng)R2是酸性時，R3是堿性，當(dāng)R2是堿性時，R3是酸性；R5，若存在的話，從如下基團中選擇芳香基、脂肪基、帶正電基團或帶負(fù)電基團。在一些實施方案中，R2或R3是-(CH2)j-COOH，其中j＝1、2、3或4，和/或-(CH2)j-NH2，其中j＝1、2、3、4或5，或-(CH2)j-NH-C(＝NH)-NH2，其中j＝1、2、3或4。在一些實施方案中，R2、R3和R5，如果存在，是氨基酸R基團。因此，例如，在多種實施方案中，R2和R3獨立地是天冬氨酸R基團、谷氨酸R基團、賴氨酸R基團、組氨酸R基團或精氨酸R基團(例如，如表1所示)。
在一些實施方案中，R1選自下組Lys R基團，Trp R基團，Phe R基團，Leu R基團，Orn R基團或norLeu R基團。在一些實施方案中，R4選自下組Ser R基團，Thr R基團，Ile R基團，Leu R基團，norLeu R基團，Phe R基團或Tyr R基團。
在多種實施方案中，x是1，R5是芳香基團(例如，Trp R基團)。
在多種實施方案中，n，x，y和i中至少有一個是1，P1、P2、P3和P4當(dāng)存在時是獨立地選自下組聚乙二醇(PEG)、乙?；?、酰胺、3-20碳烷基、Fmoc，9-芴乙?；?、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲苯-2-磺?；?Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲?；?Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、叔-丁氧羰基(Boc)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、丙基、丁基、戊基、己基、和三氟乙?；?TFA)。在一些實施方案中，P1(存在時)和/或P2(存在時)獨立地選自Boc-，F(xiàn)moc和煙?；?，且P3(存在時)和/或P4(存在時)獨立地選自tBu和OtBu。
盡管上面列舉了多種保護基團(P1、P2、P3、P4)，但是這些列舉只是出于舉例的目的，并不構(gòu)成限制。參考本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以知道多種其它的保護/封閉基團。這些封閉基團的選擇可以使消化最小化(例如，用于口服藥物遞送)，和/或增加攝取/生物利用度(例如，在鼻腔施用、吸入治療、直腸施用中通過黏膜表面)，和/或增加血清/血漿半衰期。在一些實施方案中，保護基團可以作為賦形劑或賦形劑的組分提供。
在一些實施方案中，z為0，分子具有下式 其中P1、P2、P3、P4、R1、R2、R3、R4、n、x、y和i如上所述。
在一些實施方案中，z為0，分子具有下式 其中R1、R2、R3和R4如上所述。
在一個實施方案中，分子具有下式 在一些實施方案中，本發(fā)明包括具有本文所述物理和/或功能性質(zhì)并具有下式的小分子
其中P1、P2、P3和P4是如上所述獨立選擇的疏水保護基團，n，x和y獨立地為0或1；j，k和l獨立地為0、1、2、3、4、或5；R2和R3在pH7.0是酸性或堿性的，其中當(dāng)R2是酸性時，R3是堿性；當(dāng)R2是堿性時，R3是酸性。在一些優(yōu)選實施方案中，小分子可溶于水；且小分子的分子量小于大約900道爾頓。在一些實施方案中，n，x，y，j和l為1；k為4。
在一些實施方案中，P1和/或P2是芳香族保護基團。在一些實施方案中，R2和R3是氨基酸R基，例如上文所述的。在多種實施方案中，n，x和y中至少有一個是1，P1、P2、P3和P4當(dāng)存在時，是如上所述從下組中獨立選擇的保護基團聚乙二醇(PEG)、乙?；Ⅴ０?、3-20碳烷基、Fmoc，9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲苯-2-磺?；?Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺酰基(Pmc)。
III活性劑的功能分析用于本發(fā)明方法的一些活性劑如各式(例如上面的式I)和/或特定序列所述。在一些實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的活性劑以一種或多種如下的功能性質(zhì)為特征1.它們使促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或者使抗炎HDL更加抗炎；2.它們降低LDL誘導(dǎo)的由動脈壁細胞產(chǎn)生的單核細胞趨化活性；3.它們刺激前β-HDL的形成和循環(huán)；4.它們提高HDL膽固醇；和/或5.它們提高HDL對氧磷酶活性本文所述的具體的劑和/或相應(yīng)于本文所述各式的劑，可以按照期望容易地對其一種或多種活性進行檢驗。
用于篩選上述每種功能性質(zhì)的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。特別地，需要指出，單核細胞趨化活性、HDL膽固醇和HDL對氧磷酶活性的測定方法如PCT/US01/26497(WO 2002/15923)所述。
IV.肽制備本發(fā)明使用的肽可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)肽合成技術(shù)化學(xué)地合成，或者特別在肽不包含“D”氨基酸殘基時，可以重組表達。在一些實施方案中，甚至含有“D”氨基酸殘基的肽也被重組表達。當(dāng)重組表達多肽時，在如下環(huán)境中培養(yǎng)宿主生物(例如細菌、植物、真菌細胞等)，其中一種或多種氨基酸完全以D型提供給生物。于是，在這種系統(tǒng)中重組表達的肽便摻入了那些D氨基酸。
在一些優(yōu)選實施方案中，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種液相或固相肽合成技術(shù)中的任何方法，化學(xué)地合成肽。固相合成是化學(xué)合成本發(fā)明多肽的一種優(yōu)選方法，其中序列的C端氨基酸附著在不溶載體上，隨后順次添加序列中剩余的氨基酸。用于固相合成的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，例如在如下的文獻中有描述Barany and Merrifield(1963)Solid-Phase Peptide Synthesis；pp3-284 The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology.Vol 2Special Methods in PeptideSynthesis，Part A.；Merrifield etal.(1963)J.Am.Chem.Soc.，852149-2156；和Stewart et al.(1984)Solid PhasePeptiede Synthesis，2nded.Pierce Chem.Co.，Rockford，III。
在一些實施方案中，肽通過固相肽合成程序，利用二苯甲胺(benzhyderylamine)樹脂(Beckman Bioproducts，0.59mmol NH2/g樹脂)作為固相載體合成。COOH末端氨基酸(例如叔-丁基羰基-Phe)通過4-(羥甲基)苯乙酰基[4-(oxymethyl)phenacetyl]附著在固相載體上。這種連接比傳統(tǒng)的芐基酯連接更加穩(wěn)定，然而最終的肽仍然能夠用加氫反應(yīng)切斷。為此目的使用甲酸作為氫供體進行轉(zhuǎn)移氫化。用于肽合成和合成肽分析的詳細實驗方案在Anantharamaiah等(1985) J.Biol.Chem.，260(16)10248-10255的附錄中有說明。
需要指出，在肽，特別是含有D氨基酸的肽的化學(xué)合成中，除了期望的全長產(chǎn)物之外，該合成通常還會產(chǎn)生若干截短的肽。純化過程(例如HPLC)通常會損失相當(dāng)數(shù)量的全長產(chǎn)物。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在合成D肽(例如D-4)時，為了防止在純化最長形式的過程中造成的損失，可以進行透析并使用混合物，從而省略最后的HPLC純化。這種混合物損失高度純化產(chǎn)物的大約50％的效價(例如，每wt蛋白質(zhì)產(chǎn)物)，但是混合物含有大約6倍的肽，因此總活性更大。
在一些實施方案中，肽合成只利用液相化學(xué)，或者與固相化學(xué)組合運用。在一種方法中，最終肽的制備是通過合成兩個或多個亞序列(例如用固相或液相化學(xué))，然后在溶液相合成中連接這些序列。在實施例中顯示了4F序列(SEQ ID NO13)的溶液。為了制備該18氨基酸肽，首先制備3條6氨基酸肽(亞序列)。然后，在溶液中使這些亞序列偶聯(lián)，形成完整的4F肽。
V.藥物制劑和裝置A)藥物制劑為了執(zhí)行本發(fā)明的方法，可以向例如被診斷患有一種或多種動脈粥樣硬化癥狀，或者有動脈粥樣硬化危險性和/或本文所述多種其它病變的個體，施用一種或多種本發(fā)明的活性劑。活性劑能夠以“天然”形式施用，或者，如果期望，以鹽、酯、酰胺、前藥或衍生物等形式施用，前提是該鹽、酯、酰胺、前藥或衍生物在藥理學(xué)上適合，也就是說，在本方法中有效?；钚詣┑柠}、酯、酰胺、前藥和其它衍生物可用有機合成化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序制備，在例如March(1992)Advanced Organic Chemistry；Reactions，Mechanisms and Structure，4thEd.N.Y.Wiley-Interscience.
例如，用傳統(tǒng)的方法由游離堿制備酸加成鹽，其典型地涉及與合適的酸進行反應(yīng)。一般而言，將藥物的堿形式溶解在極性有機溶劑中，例如甲醇或乙醇，并向其中添加酸。所得的鹽或者沉淀，或者可通過添加極性較小的溶劑從溶液中提出來。用于制備酸加成鹽的合適酸包括有機酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對-甲苯磺酸、水楊酸等，以及無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。通過用合適的堿處理，加酸鹽可以重新轉(zhuǎn)變成游離堿。本文活性劑特別優(yōu)選的酸加成鹽是鹵化物鹽，例如用鹽酸或氫溴酸制備的鹵化物鹽。相反，本發(fā)明活性劑的堿式鹽可以用藥學(xué)可接受的堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等，以相似的方法制備。特別優(yōu)選的堿式鹽包括堿金屬鹽，例如鈉鹽，和銅鹽。
酯的制備通常涉及使可能存在于藥物分子結(jié)構(gòu)中的羥基和/或羧基官能化。酯通常是游離醇基的?；〈苌?，也就是，衍生自式RCOOH的羧酸的部分，其中R是醇，優(yōu)選的是低級烷基。如果需要，通過使用常規(guī)的氫解或水解處理可以將酯再轉(zhuǎn)變成游離酸。
還可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或在相關(guān)文獻中說明的技術(shù)制備酰胺和前藥。例如，酰胺可用合適的胺反應(yīng)劑由酯制備而成，或者可以從酸酐或?；韧ㄟ^與氨水或低級烷胺反應(yīng)而制備。前藥通常是這樣制備的共價連接上某個部分，使得化合物在受到個體代謝系統(tǒng)的修飾之前沒有治療活性。
本文鑒定的活性劑可用于腸胃外、表面、經(jīng)口、經(jīng)鼻(或者用吸入)、直腸、或局部施用，例如氣霧或透皮，來預(yù)防和/或治療如本文所述的一種或多種病變/適應(yīng)癥(例如，動脈粥樣硬化和/或其癥狀)。藥物組合物可以多種單位劑型施用，這取決于施用的方法。合適的單位劑型包括，但不僅限于，粉劑、片劑、丸劑、膠囊、錠劑、栓劑、貼劑、鼻噴霧、注射劑(injectibles)、可植入緩釋制劑、脂質(zhì)復(fù)合物等。
本發(fā)明的活性劑典型地與藥學(xué)可接受的載體(賦形劑)組合，形成藥物組合物。藥學(xué)可接受的載體可含有一種或多種生理可接受的化合物，它們起到，例如，穩(wěn)定該組合物或者提高或降低活性劑吸收的作用。生理可接受的化合物可包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑，如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白質(zhì)；保護和攝取促進劑，如脂質(zhì)；可降低活性劑清除或水解的組合物，或賦形劑或其他穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。
其他生理可接受的化合物包括潤濕劑、乳化劑、分散劑、或特別有利于防止微生物生長或作用的防腐劑。多種防腐劑是眾所周知的，包括例如，苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以意識到，藥學(xué)可接受載體，包括生理可接受化合物的選擇取決于，例如，活性劑的施用途徑和活性劑的特定的理化特性。
賦形劑優(yōu)選地是無菌的，并且通常沒有非期望物質(zhì)。這些化合物可以通過傳統(tǒng)的、眾所周知的滅菌技術(shù)加以滅菌。
在治療應(yīng)用中，向患有一種或多種本文所述病變的一種或多種癥狀的，或者具有本文所述一種或多種病變危險性的患者施用足以防止和/或治愈和/或至少部分防止或抑制所述疾病和/或其并發(fā)癥的劑量的本發(fā)明化合物。足以實現(xiàn)這一目的的劑量定義為“治療有效劑量”。本應(yīng)用的有效劑量取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者健康的綜合狀態(tài)。根據(jù)患者需要和可以耐受的劑量和頻率可進行單次或多次施用。任何情況下，該組合物應(yīng)當(dāng)提供足夠量的本發(fā)明的制劑的活性劑，來有效地對患者進行治療(改善一種或多種癥狀)。
活性劑的濃度可以有很大變化，其主要是根據(jù)流體體積(fluid volume)、粘度、體重等，按照所選的具體施用模式和患者的需要來選擇。然而，通常選擇的濃度提供大約0.1或1mg/kg/日到大約50mg/kg/日范圍的劑量，有時可以更高。典型的劑量范圍是大約3mg/kg/日到大約3.5mg/kg/日，優(yōu)選大約3.5mg/kg/日到大約7.2mg/kg/日，更優(yōu)選大約7.2mg/kg/日到大約11.0mg/kg/日，最優(yōu)選大約11.0mg/kg/日到大約15.0mg/kg/日。在一些優(yōu)選實施方案中，劑量范圍是大約10mg/kg/日到大約50mg/kg/日。在一些實施方案中，劑量范圍是大約20mg到大約50mg，每日口服兩次?？梢岳斫猓@些劑量可以改變，以針對特定受試者或受試者組提供最優(yōu)化的治療方案。
在一些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的活性劑可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行口服(例如通過藥片)或注射。在其他優(yōu)選實施方案中，肽可以用常規(guī)的透皮藥物送遞系統(tǒng)，也就是，透皮“貼劑”，通過皮膚遞送，其中活性劑通常包含在一種疊層(laminated)結(jié)構(gòu)內(nèi)，該結(jié)構(gòu)粘貼在皮膚上充當(dāng)藥物遞送裝置。在這種結(jié)構(gòu)中，藥物組合物通常包含在上襯層(upper backing layer)下面的層，又稱“儲庫”(reservoir)內(nèi)。應(yīng)當(dāng)意識到，本文中術(shù)語“儲庫”是指最終可供遞送到皮膚表面的一定量的“活性組分”。因此，例如，“儲庫”可以包括貼劑襯層上的粘合劑中的活性成分，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何基質(zhì)制劑中的活性組分，這樣的基質(zhì)制劑有多種。貼劑可以包含單個儲庫，或者可以包含多個儲庫。
在一個實施方案中，儲庫包括藥學(xué)可接受接觸粘合材料的聚合物基質(zhì)，用于在藥物遞送中將系統(tǒng)粘貼在皮膚上。合適的皮膚接觸粘合材料的實例包括，但不僅限于，聚乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸脂、聚氨酯等?；蛘?，含有藥物的儲庫和皮膚接觸粘合劑以分離的且明顯不同的層的形式存在，粘合劑位于儲庫的下面，這里，儲庫可以是如上所述的聚合體基質(zhì)，或者可以是液體或水凝膠儲庫，或者可以采取其他形式。這些疊層中的襯層用作裝置的上表面，優(yōu)選地起“貼劑”主結(jié)構(gòu)元件的作用，并提供該裝置大部分的柔性。選擇用于襯層的材料優(yōu)選地活性劑和存在的任何其他材料都是基本上非透過性的。
其他用于局部藥物遞送的優(yōu)選形式包括，但不僅限于，軟膏和乳膏。軟膏是半固體的制品，其典型地是基于礦脂或其他石油衍生物。含有所選活性劑的乳膏典型地是粘性液體或半固體乳劑，通常是水包油或油包水。乳膏基材典型是耐水洗的(water washable)，并且含有油相、乳化劑和液相。油相有時也稱作“內(nèi)部”相，一般由礦脂和脂肪醇，例如十六烷醇或十八烷醇組成；液相的體積通常但不必定超過油相，并且一般含有濕潤劑。乳膏制劑中的乳化劑一般是非離子、陽離子、陰離子或兩性離子表面活性劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識到，要使用的特定軟膏或乳膏可以提供最佳的藥物遞送。和其他載體或介質(zhì)一樣，軟膏基質(zhì)應(yīng)當(dāng)是惰性的、穩(wěn)定的、無刺激性的、且非致敏的。
與典型的肽制劑不同，本發(fā)明含有D型氨基酸的肽可以在沒有針對胃酸等造成的蛋白質(zhì)水解等進行保護的條件下施用，甚至口服。然而，在一些實施方案中，通過使用保護性賦形劑可以提高肽的遞送。這典型地可以通過如下方法實現(xiàn)將多聚肽與組合物復(fù)合，使其耐受酸和酶的水解；或者將肽封裝(package)在合適的抗性載體內(nèi)，例如脂質(zhì)體。保護用于口服遞送的肽的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(見，例如，美國專利5,391,377，其描述了用于口服遞送治療劑的脂質(zhì)成分)。
使用緩釋蛋白“封裝”系統(tǒng)可以保持高的血清半衰期。這種緩釋系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。在一個優(yōu)選實施方案中，用于蛋白質(zhì)和肽的ProLease可生物降解微球遞送系統(tǒng)(Tracy(1998)Biotecchnol.Prog.14108；Johnson et al.(1996)，Nature Med.2795；Herbert et al.(1998)，Pharmaceut.Res.15，357)，是由生物可降解聚合物微球構(gòu)成的干粉，所述微球在聚合物基質(zhì)內(nèi)含有活性劑，其可以配制為具有或者沒有其他藥劑的干燥制劑。
ProLease微球的制造過程經(jīng)過特殊的設(shè)計，以便實現(xiàn)高的封裝效率，同時保持活性劑的完整性。該過程由下列步驟組成(i)通過噴射冷凍干燥含有穩(wěn)定化賦形劑的藥物溶液，由總體制備凍干藥物顆粒；(ii)制備藥物-聚合體懸液，隨后進行超聲或均質(zhì)化以減小藥物顆粒的尺寸；(iii)通過向液氮中噴霧產(chǎn)生凍結(jié)的藥物-聚合體微球；(iv)用乙醇抽提聚合物溶劑；和(v)過濾和真空干燥，生產(chǎn)最終的干燥粉末產(chǎn)品。最終的粉末含有固體形式的活性劑，其是均質(zhì)的，并且剛性地分散在多孔聚合物顆粒內(nèi)。該過程中最經(jīng)常使用的聚合物(丙交酯-乙交酯共聚物(PLG))既生物相容，又可生物降解。
封裝可以在低溫下(例如-40℃)實現(xiàn)。在封裝期間，蛋白質(zhì)在無水條件下水保持固態(tài)，因此使由水誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象活動性(conformationalmobility)最小化，防止以水作為反應(yīng)劑的蛋白質(zhì)降解反應(yīng)，和避免可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的有機-水界面的產(chǎn)生。優(yōu)選過程使用大多數(shù)蛋白質(zhì)在其中不可溶的溶劑，因此造成高封裝效率(例如，大于95％)。
在另一個實施方案中，溶液的一種或多種成分可以作為“濃縮物”提供，例如保存在現(xiàn)成可稀釋的存儲容器內(nèi)(例如具有預(yù)先測量的體積)，或者保存在現(xiàn)成可添加到一定體積水中的可溶膠囊內(nèi)。
前面的制劑和施用方法只是舉例性的，不構(gòu)成限制。應(yīng)當(dāng)意識到，使用本文的教導(dǎo)，可以容易地設(shè)計其他合適的形式和施用模式。
B)脂基制劑(lipid-based formulations)在一些實施方案中，本發(fā)明的活性劑與一種或多種脂質(zhì)結(jié)合施用。脂質(zhì)可以配制成賦形劑，用于保護和/或提高活性劑的轉(zhuǎn)移/攝取，或者它們可以分別施用。
不受具體理論所限，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，施用(例如，口服施用)某些磷脂可以顯著提高HDL/LDL比值。此外，可以相信，某些中等長度的磷脂是通過與一般脂類轉(zhuǎn)運涉及的過程不同的過程轉(zhuǎn)運的。因此，與本發(fā)明的活性劑共同施用某些中等長度的磷脂可以提供若干優(yōu)點它們保護活性劑免于被消化或水解，提高攝取，并且提高HDL/LDL比值。
脂類可以形成包封本發(fā)明活性劑的脂質(zhì)體，和/或它們可以與活性劑復(fù)合/混合，和/或它們能夠與活性劑共價偶聯(lián)。制作脂質(zhì)體和包封劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的(見，例如，Martin andPapahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.，257286-288；Papahadjopoulos etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8811460-11464；Huang et al.(1992)Cancer Res.，526774-6781；Lasic et al.(1992)FEBS Lett.，312255-258等)。
用于這些方法的優(yōu)選磷脂在sn-1和sn-2位置有大約4個碳到大約24個碳的脂肪酸。在一些優(yōu)選實施方案中，脂肪酸是飽和的。在其他優(yōu)選實施方案中，脂肪酸可以是非飽和的。表16列舉了多種優(yōu)選的脂肪酸。
表16.用于施用本文所述活性劑的優(yōu)選磷脂在sn-1和/或sn-2位置的優(yōu)選脂肪酸
這些位置的脂肪酸可以相同或不同。特別優(yōu)選的磷脂在sn-3位置具有磷酸膽堿。
VI.施用典型地，活性劑可以根據(jù)需要向哺乳動物(例如，人)施用。該哺乳動物典型地包括患有一種或多種本文所述病變和其危險性的哺乳動物(例如，人)。
活性劑可以使用如本文所述的多種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何方法施用，包括，但不僅限于，注射、栓劑、鼻噴霧、經(jīng)時釋放植入、透皮貼劑等。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，肽通過口服施用(例如，作為糖漿、膠囊或片劑)。
這些方法涉及施用本發(fā)明的單一活性劑，或者施用兩種或多種不同的活性劑?；钚詣┛梢宰鳛閱误w(例如，單獨或組合的形式)，或二聚體、寡聚體或多聚體形式提供。在一些實施方案中，多聚體形式可以包含結(jié)合的單體(例如，離子或疏水連接的)，而一些其他的多聚體形式包含共價連接的單體(直接連接或通過接頭)。
盡管本發(fā)明是就在人類中的使用說明的，但是它也適用于動物，例如用于獸醫(yī)。因此，一些優(yōu)選的生物包括，但不僅限于，人類、非人靈長類、犬科動物(canines)、馬科動物(equines)、貓科動物(felines)、豬、有蹄類、兔等。
本發(fā)明的方法不僅限于已顯示患有一種或多種本文所述病變的癥狀的人類或非人動物，還可用于預(yù)防。因此，可以向生物體施用本發(fā)明的活性劑，用于防止本文所述病變(例如，動脈粥樣硬化、中風(fēng)等)的一種或多種癥狀的發(fā)作/發(fā)生。這里特別優(yōu)選的對象是顯示有病癥的一種或數(shù)種危險性因素的對象。因此，例如，動脈粥樣硬化的危險性因素包括家族史、高血壓、肥胖、高酒精攝取、吸煙、高血膽固醇、高血甘油三酯、血中LDL、VLDL、IDL過高，或HDL過低、糖尿病或糖尿病家族史、高血脂、心臟病發(fā)作、心絞痛或中風(fēng)等。
VII.藥物洗脫支架再狹窄，即先前狹窄隨后經(jīng)過擴張的外周或冠狀血管的再封閉，具有相當(dāng)高的發(fā)病率(例如，對這些步驟而言為20-50％)，并且取決于多種臨床和形態(tài)學(xué)變量。再狹窄可以在血管成形術(shù)之后很短的時間內(nèi)開始，但通常在大約六(6)個月時結(jié)束。
一種最新開發(fā)的用于解決再狹窄問題的技術(shù)是血管內(nèi)支架。支架典型地是永久植入(擴張)在冠狀和外周血管內(nèi)的裝置。這些支架的目的是為患病(狹窄)的血管提供長期“支撐”(scaffolding)或支持。其理論是，如果血管被從其內(nèi)部支持，則不會關(guān)閉或再狹窄。
已知的支架設(shè)計包括，但不僅限于，單絲線圈(monofilament wire coil)支架(見例如美國專利4,969,458)；焊接金屬籠(welded metal cages)(見例如美國專利4,733,665和4,776,337)；圍繞圓周形成有軸向狹槽的薄壁金屬圓柱(見例如美國專利4,733,665、4,739,762、4,776,337等)?？捎糜谥Ъ艿囊阎Y(jié)構(gòu)材料包括，但不僅限于，聚合物、有機紡織品和生物相容性金屬，例如，不銹鋼、金、銀、鉭、鈦和形狀記憶合金如鎳鈦金屬互化物。
為了進一步防止再狹窄，支架可以用一種或多種藥物覆蓋和/或充滿，例如，該藥物制為可控釋放的制劑，以抑制與再狹窄相關(guān)聯(lián)的細胞增生。最常見地，這種“藥物洗脫”支架被設(shè)計成遞送多種癌癥藥物(細胞毒素)。
然而，由于它們具有減輕炎癥反應(yīng)，減少和/或消除氧化脂類和/或其他被氧化物質(zhì)，抑制巨噬細胞趨化活性等活性，本文所述的活性劑也完全適用于防止再狹窄。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明考慮如下的支架，其表面上涂覆有，和/或在支架表面上的空穴或微穴(microcavities)內(nèi)保持有一種或多種本文所述的活性劑(見例如圖18A和18B)。
在一些實施方案中，活性劑包含在生物相容性基質(zhì)內(nèi)(例如生物相容性聚合物，如聚氨酯、硅樹脂(silicone)等)。合適的生物相容性材料在例如美國專利公開20050084515、200500791991、20050070996等中有描述。在多種實施方案中，聚合物包括，但不僅限于，硅樹脂-氨基甲酸乙酯共聚物，聚氨酯，苯氧基(phenoxy)，乙烯-乙烯乙酸，聚己內(nèi)酯，丙交酯-乙交酯共聚物，聚丙交酯，聚砜，彈性蛋白，纖維蛋白，膠原蛋白，硫酸軟骨素，生物相容性聚合物，生物穩(wěn)定性聚合物，生物可降解聚合物。
因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于遞送藥物到機體血管內(nèi)的支架。該支架典型地包括支架框，其包括在其中形成的多個儲庫。這些儲庫典型地包含活性劑，和/或位于儲庫內(nèi)和/或涂覆在支架表面上的含活性劑聚合物。在多種實施方案中，該支架是金屬基或聚合物基。一些優(yōu)選支架材料包括，但不僅限于，不銹鋼、鎳金屬互化物、鉭、MP35N合金、鉑、鈦、合適的生物相容性合金、合適的生物相容性聚合物、和/或其組合。
在多種實施方案中，支架含有孔(例如，儲庫)，該孔可包含微孔(例如直徑范圍是大約10μm到大約50μm，優(yōu)選地大約20μm或者更小)。在多種實施方案中，微孔的深度范圍是大約10μm到大約50μm。在多種實施方案中，微孔延伸穿過支架框，在支架的內(nèi)表面和支架的外表面上均有開口。在一些實施方案中，支架可以任選地包括位于支架框內(nèi)表面上的蓋層，該蓋層覆蓋通孔的至少一部分，并提供屏障特征，以控制聚合物中的活性劑從支架框內(nèi)表面洗脫的速度。在多種實施方案中，儲庫包含沿著支架框外表面的溝槽。支架可以任選地具有多層聚合物，其中不同層的聚合物攜帶不同的活性劑和/或其他藥物。
在一些實施方案中，支架任選地包括位于支架框和聚合物之間的粘合層。合適的粘合層包括，但不僅限于，聚氨酯、苯氧基、丙交酯-乙交酯共聚物、聚丙交酯、聚砜、聚己內(nèi)酯、粘合促進劑(adhesion promoter)和/或其組合。
除了支架之外，活性劑還可以涂覆在基本上任何可植入的醫(yī)學(xué)裝置上，或者包含在其內(nèi)，該醫(yī)學(xué)裝置可植入在血管外和/或血管內(nèi)位置。
另外還提供了制造藥物-聚合物支架的方法，包括提供支架框；使用例如高功率激光在支架框內(nèi)切出多個儲庫；向至少一個儲庫施加一種或多種活性劑和/或藥物聚合物；干燥藥物聚合物；向干燥的藥物聚合物施加聚合物層；和干燥該聚合物層。所述活性劑和/或聚合物可以通過常規(guī)的方法施加，包括但不僅限于，噴(spraying)、浸(dipping)、涂(painting)、刷(brushing)和分配(dispensing)。
還提供了用于治療血管病癥，和/或以炎癥反應(yīng)為特征的病癥，和/或以氧化活性類別的形成為特征的病癥的方法。該方法典型地涉及如上所述地將支架或其它可植入裝置定位在機體內(nèi)(例如，機體的血管內(nèi))，并從植入物的至少一個表面洗脫至少一部分活性劑。
VIII.提高肽攝取本發(fā)明還驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)全L氨基酸肽(例如，或者具有本發(fā)明肽序列的肽)與D型(也就是，本發(fā)明的肽)聯(lián)合施用時，可提高D型肽的攝取。因此，在有些實施方案中，本發(fā)明考慮在本發(fā)明方法中使用D-型和L-型肽的組合。D-型肽和L-型肽可以具有不同的氨基酸序列，但是，在優(yōu)選的實施方案中，它們都具有本文所描述的氨基酸序列，在更加優(yōu)選的實施方案中，它們具有相同的氨基酸序列。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明兩親性螺旋肽的多聯(lián)體也可有效減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀。含有該多聯(lián)體的單體可以直接偶聯(lián)在一起，或通過接頭連接在一起。在一些實施方案中，接頭是氨基酸接頭(例如脯氨酸)，或肽接頭(例如Gly4Ser3，SEQ ID NO625)。在一些實施方案中，多聯(lián)體是2mer，更優(yōu)選的是3mer，再優(yōu)選的是4mer，最優(yōu)選的是5mer、8mer或10mer。如上所述，多聯(lián)體可以包括如本文所述的G*相關(guān)兩親性螺旋與如PCT公開WO2002/15923中說明的apo A-I變體的組合。
IX.附加藥理活性劑附加藥理活性劑可以與主活性劑例如本發(fā)明的肽一起遞送。在一個實施方案中，這些劑包括，但不僅限于，可降低動脈粥樣硬化事件和/或其并發(fā)癥的危險性的劑。這些劑包括，但不僅限于，β受體阻滯劑、β受體阻滯劑與噻嗪類利尿劑的組合、他汀類藥物(statins)、阿司匹林(aspirin)、ACE抑制劑、ace受體抑制劑(ARB)等。
合適的β受體阻滯劑包括，但不僅限于，心選擇性的(選擇性β1受體阻滯劑)，例如醋丁洛爾(acebutolol)(SectralTM)、阿替洛爾(atenolol)(TenorminTM)、倍它洛爾(betaxolol)(KerloneTM)、比索洛爾(bisoprolol)(ZebetaTM)、美托洛爾(metoprolol)(LopressorTM)等。合適的非選擇性受體阻滯劑(同等阻滯β1和β2)包括，但不僅限于，卡替洛爾(carteolol)(CartrolTM)、納多洛爾(nadolol)(CorgardTM)、噴布洛爾(penbutolol)(LevatolTM)、吲哚洛爾(pindolol)(ViskenTM)、普萘洛爾(propranolol)(InderalTM)、噻馬洛爾(timolol)(BlockadrenTM)、拉貝洛爾(labetalol)(NormodyneTM，TrandateTM)等。
合適的β受體阻滯劑與噻嗪類利尿劑組合包括，但不僅限于，美多洛爾(Lopressor)HCT、ZIAC、Tenoretic、Corzide、Timolide、普萘洛爾(Inderal)LA 40/25、Inderide、Normozide等。
合適的他汀類藥物包括，但不僅限于，普伐他汀(pravastatin)(普拉固(Pravachol)/Bristol-Myers Squibb)、辛伐他汀(simvastatin)(Zocor/Merck)、洛伐它丁(lovastatin)(Mevacor/Merck)等。
合適的ace抑制劑包括，但不僅限于，卡托普利(captopril)(例如Squibb生產(chǎn)的CapotenTM)、貝那普利(benazepril)(例如Novartis生產(chǎn)的LotensinTM)、恩納普利(enalapril)(例如Merck生產(chǎn)的VasotecTM)、福森普利(fosinopril)(例如Bristol-Myers生產(chǎn)的MonoprilTM)、賴諾普利(lisinopril)(例如Merck生產(chǎn)的PrinivilTM或Astra-Zeneca生產(chǎn)的ZestrilTM)、喹那普利(quinapril)(例如Parke-Davis生產(chǎn)的AccuprilTM)、雷米普利(ramipril)(例如Hoechst MarionRoussel，King Pharmaceuticals產(chǎn)的AltaceTM)、咪達普利(imidapril)，培哚普利(perindopril)erbumine(例如Rhone-Polenc Rorer生產(chǎn)的aceonTM)、群多普利(trandolapril)(例如Knoll Pharmaceutical產(chǎn)的MavikTM)等。合適的ARBS(Ace受體阻滯劑)包括，但不僅限于，氯沙坦(losartan)(例如Merck生產(chǎn)的CozaarTM)、厄貝沙坦(irbesartan)(例如Sanofi產(chǎn)的AvaproTM)、坎地沙坦(candesartan)(例如Astra Merck產(chǎn)的AtacandTM)、纈沙坦(valsartan)(例如Novartis產(chǎn)的DiovanTM)等。
X.用于改善一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的試劑盒在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，用于改善一種或多種動脈粥樣硬化癥狀，或者用于預(yù)防性處理具有動脈粥樣硬化危險性的對象(人或動物)，或者用于治療或預(yù)防一種或多種本文所述其他病癥。試劑盒優(yōu)選地包括含有一種或多種本發(fā)明活性劑的容器。活性劑可以以單位劑量制劑提供(例如栓劑、片劑、膠囊、貼劑等)，和/或可以任選地與一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑組合。
該試劑盒可以任選地進一步包括一種或多種用于治療心臟病和/或動脈粥樣硬化的其它制劑。這些制劑包括，但不僅限于，如上文所述的β受體阻滯劑、血管擴張藥、阿司匹林、他汀類藥物、ace抑制劑或ace受體抑制劑(ARB)等。
此外，試劑盒任選地包含標(biāo)簽和/或指導(dǎo)材料，為實現(xiàn)本發(fā)明的“治療”或“預(yù)防”方法或用途提供指導(dǎo)(即規(guī)程)。優(yōu)選的指導(dǎo)材料應(yīng)說明本發(fā)明一種或多種多肽的使用，以減輕一種或多種動脈粥樣硬化癥狀，和/或防止具有動脈粥樣硬化危險性的個體中一種或多種這些癥狀的發(fā)作或增加，和/或減輕一種或多種以炎癥反應(yīng)為特征的病變的癥狀。指導(dǎo)材料還可以任選地教導(dǎo)優(yōu)選的劑量/治療方案、禁忌癥(counter indications)等。
盡管指導(dǎo)材料典型地包含手寫或印刷的材料，但它們并不僅限于此。任何可以存儲這些指令并可以與終端用戶交流這些指令的介質(zhì)均在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。這些介質(zhì)包括，但不僅限于，電子存儲介質(zhì)(例如磁盤、磁帶、錄音帶、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如CD ROM)等。這些介質(zhì)可以包括可提供這些指導(dǎo)材料的互聯(lián)網(wǎng)地址。
實施例下面的實施例是用來舉例說明而提出的，而不是對要求保護的本發(fā)明構(gòu)成限制。
實施例1使用ApoJ相關(guān)肽調(diào)理動脈粥樣硬化癥狀A(yù))防止LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性圖1顯示D-4F(Circulation 2002；105290-292)與從D氨基酸(D-J336，Ac-L-L-E-Q-L-N-E-Q-F-N-W-V-S-R-L-A-N-L-T-Q-G-E-NH2，SEQ ID NO13)制得的apoJ肽在共培養(yǎng)中體外防止LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的效果的比較。將人類主動脈內(nèi)皮細胞與單獨的培養(yǎng)基(無添加物)、對照人LDL(200μg蛋白質(zhì)/ml)、或?qū)φ杖薒DL+對照人HDL(350μg HDL蛋白質(zhì)/ml)一起孵育。向其它孔內(nèi)加入如圖所示的濃度范圍的D-J336或D-4F加上對照人LDL(200μg蛋白質(zhì)/ml)。過夜孵育之后，分析上清液的單核細胞趨化活性。如圖1所示，防止LDL誘導(dǎo)的人動脈壁細胞的單核細胞趨化活性的apoJ變體肽的體外濃度比D-4F肽所需的濃度低10-25倍。
B)通過D-J336預(yù)處理動脈壁細胞防止LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性圖2顯示在預(yù)孵育中D-4F和D-J336防止LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的效果的比較。將人主動脈內(nèi)皮細胞與D-J336或D-4F一起預(yù)孵育6小時，其中D-J336的濃度為4、2和1μg/ml，D-4F的濃度為100、50、25和12.5μg/ml。然后洗滌該培養(yǎng)物，并與單獨的培養(yǎng)基(無添加物)、或與對照人LDL(200μg蛋白質(zhì)/ml)、或與對照人LDL+對照人HDL(350μgHDL蛋白質(zhì)/ml)一起孵育，作為測定對照。用肽預(yù)處理過的孔接受200μg蛋白質(zhì)/ml的對照人LDL。過夜孵育之后，分析上清液的單核細胞趨化活性。
如圖2所示，在體外防止動脈壁細胞氧化LDL中，ApoJ變體肽強9-24倍。
C)apo J肽模擬物對LDL受體缺失小鼠體內(nèi)HDL保護能力的效果向LDL受體缺失小鼠(每組4只)的飲用水中添加D-4F(表示為F)或由D氨基酸制得的apoJ肽(D-J336，表示為J)，劑量為每毫升飲用水0.25或0.5mg。24或48小時后，從小鼠取血，分離HDL，并測試其針對LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的保護能力。測定對照包括不加脂蛋白(無添加物)，或只有對照人LDL(表示為LDL，200μg膽固醇/ml)，或?qū)φ誏DL+對照人HDL(表示為+HDL，350μg HDL膽固醇)的培養(yǎng)孔。為了測試小鼠HDL，將對照LDL與小鼠HDL一起添加到動脈壁細胞培養(yǎng)物中(+F HDL或+J HDL)。分別按100μg膽固醇/ml添加小鼠HDL。在用D-4F或D-J336處理之后，100μg/ml的小鼠HDL防止對照LDL誘導(dǎo)動脈壁細胞產(chǎn)生單核細胞趨化活性的活性，與350μg/ml的對照人HDL一樣。在體外和體內(nèi)，D-J336肽相對D-4F所需的相對劑量的差異的原因可能與肽在水中的溶解度有關(guān)，我們相信，當(dāng)設(shè)法實現(xiàn)相等的溶解度時，D-J肽在體內(nèi)的活性將高得多，和它們在體外一樣。
D)來自口服肽的apo E缺失小鼠的HDL針對LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性的保護圖4圖解了口服apo A-1肽模擬物和apoJ肽對HDL保護能力的影響。在ApoE缺失小鼠(每組4只)的飲用水中給予D-4F(表示為F)50、30、20、10、5μg/ml飲用水，或在飲用水中給予apoJ肽(表示為J)50、30或20μg/ml飲用水。24小時后取血，用FPLC分級血漿，并分別合并含有LDL(表示為mLDL，以代表小鼠mLDL)和含有HDL(表示為mHDL)的級分，通過確定LDL誘導(dǎo)的單核細胞趨化活性來確定HDL針對LDL氧化的保護能力。對于測定對照，培養(yǎng)孔不接受脂蛋白(無添加物)，只接受mLDL(200μg膽固醇/ml)，或mLDL+標(biāo)準(zhǔn)正常人HDL(表示為Cont.h HDL，350μg HDL膽固醇/ml)。
為了測試鼠HDL，將mLDL與鼠HDL(+F mHDL或+J mHDL)一起添加到動脈壁細胞培養(yǎng)物中。來自沒有在飲用水中接受任何肽的小鼠的HDL稱為無肽mHDL。鼠HDL的使用濃度為100μg膽固醇/ml。在接受D-4F或D-J336之后，100μg/ml的鼠HDL的活性與350μg/ml的正常人HDL相同。如圖4所示，當(dāng)添加到飲水中時，在增強apo E缺失小鼠HDL保護能力方面，D-J肽與D-4F一樣強。
E)得自于口服給予肽的apo E缺失小鼠的LDL誘導(dǎo)單核細胞趨化活性的能力圖5顯示了口服apo A-1肽模擬物和apoJ肽對LDL易氧化性的效果。在飲水中向apoE缺失小鼠(每組4只)提供50、30、20、10、5μg/ml飲用水的D-4F(表示為F)，或50、30或20μg/ml飲用水的apoJ肽(從D氨基酸制備的D-J336，表示為J)。24小時后從小鼠收集血液，如圖4所示，用FPLC分級血漿，合并含有LDL(稱為mLDL，代表鼠LDL)的級分，并通過誘導(dǎo)單核細胞趨化活性確定LDL的易氧化性。對于實驗對照，培養(yǎng)孔不接受脂蛋白(無添加物)，只接受mLDL(200μg膽固醇/ml)，或mLDL+標(biāo)準(zhǔn)正常人HDL(表示為Cont.h HDL，350μg HDL膽固醇)。
將來自于接受了D-4F的小鼠的鼠LDL(F mLDL)或來自于接受了apoJ肽的小鼠的鼠LDL(J mLDL)添加到動脈壁細胞培養(yǎng)物中。來自于沒有從飲用水中接受任何肽的小鼠的LDL以“無肽LDL”表示。
如圖5所示，當(dāng)添加到飲水中時，通過誘導(dǎo)單核細胞趨化活性確定，在賦予來自apo E缺失小鼠的LDL以對人動脈壁細胞氧化的抗性方面，D-J336略強于D-4F。
F)從口服肽的apo E缺失小鼠獲得的HDL針對磷脂氧化和單核細胞趨化活性誘導(dǎo)的保護作用圖6表示了口服apoA-1肽模擬物和apoJ肽對HDL保護能力的影響。在飲水中向apoE缺失小鼠(每組4只)提供50、30、20、10、5μg/ml飲水的D-4F(表示為F)，或50、30或20μg/ml飲用水的apoJ肽(由D氨基酸制成的D-J336，以J表示)。24小時后收集血液，用FPLC分級血漿，并合并含有HDL(表示為mHDL)的級分，通過誘導(dǎo)單核細胞趨化活性確定HDL對抗PAPC氧化的保護能力。對于測定對照，培養(yǎng)孔不接受脂蛋白(無添加物)，接受磷脂PAPC 20μg/ml+HPODE 1.0μg/ml，或接受PAPC+HPODE+標(biāo)準(zhǔn)正常人HDL(350μg HDL膽固醇/ml，表示為+Cont.hHDL)。
為了測試鼠HDL，將PAPC+HPODE與鼠HDL(+F mHDL或+J mHDL)一起添加到動脈壁細胞培養(yǎng)物中。來自于沒有在飲用水中接受任何肽的小鼠的HDL以“無肽mHDL”表示。鼠HDL的使用濃度為100μg膽固醇/ml。
圖6所示的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)添加到飲水中時，以單核細胞趨化活性的產(chǎn)生為量度，D-J336在人動脈壁細胞共培養(yǎng)物中就導(dǎo)致HDL抑制氧化劑HPODE對磷脂PAPC的氧化而言與D-4F一樣強。
G)口服apoA-1肽模擬物和apoJ肽對小鼠血漿對氧磷酶活性的效果圖7顯示，口服apoA-1肽模擬物和apoJ肽對小鼠血漿對氧磷酶活性的影響。在飲用水中向apoE缺失小鼠(每組4只)提供50、10、5或0μg每ml飲用水的D-4F(表示為F)，或給予50、10或5μg每ml飲用水的apoJ肽(由D氨基酸制成的D-J336，表示為J)。24小時后收集血液，測定血漿的PON1活性。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)添加到飲水中時，D-J336在提高apo E缺失小鼠對氧磷酶活性方面至少與D-4F一樣強。
實施例2口服G*肽提高Apo E缺陷小鼠體內(nèi)的HDL保護能力用具有如下氨基酸序列的G*肽處理4月齡雌性apoE缺陷小鼠(每組n＝4)。肽113-122＝Ac-LVGRQLEEFL-NH2(SEQ ID NO626)，肽336-357＝Ac-LLEQLNEQFNWVSRLANLTQGE-NH2(SEQ ID NO627)，肽377-390＝Ac-PSGVTEVVVKLFDS-NH2(SEQ ID NO628)。
每只小鼠通過胃管接受200μg肽。4小時后取血，分離血漿，分級脂蛋白，并測定HDL(25μg/ml)針對人動脈壁細胞培養(yǎng)物中LDL(100μg/ml)氧化的保護能力。數(shù)據(jù)如圖8所示。肽在小鼠體內(nèi)提供了顯著的HDL保護能力。
在另一個實驗中，用具有如下序列的11氨基酸G*肽146-156處理4月齡雌性apoE缺陷小鼠(n＝4)Ac-QQTHMLDVMQD-NH2(SEQ ID NO629)。小鼠在飲水中接受了指定濃度的肽(見圖9)。18小時后獲取血液，分離血漿，分級脂蛋白，并測定HDL(50μg膽固醇/ml)針對人動脈壁細胞培養(yǎng)物中PAPC(25μg/ml)+HPODE(1.0μg/ml)氧化的保護能力。測定對照包括不含添加物，含PAPC+HPODE，及PAPC+HPODE+對照HDL(表示為+HDL)。數(shù)據(jù)是一式三份的培養(yǎng)物中9個高倍視野內(nèi)遷移的單核細胞數(shù)的平均值±SD。星號表示相對水對照(0μg/ml)的顯著水平p＜0.05。
實施例3肽合成的溶液相化學(xué)在一些實施方案中，溶液相合成化學(xué)為合成本發(fā)明的肽提供了更加經(jīng)濟的手段。
在本發(fā)明之前，通常用全固相合成化學(xué)進行合成。固相合成小于9個氨基酸的肽比固相合成大于9個氨基酸的肽經(jīng)濟得多。合成大于9氨基酸的肽會由于延長中的氨基酸鏈從樹脂物理解離而造成大量的材料損失。固相合成含有少于9個氨基酸的肽要經(jīng)濟得多，因為延長中的鏈相對地幾乎沒有從樹脂損失。
在一些實施方案中，溶液相合成是這樣進行的將18個氨基酸的apoA-I模擬物肽，即4F(和其他相關(guān)肽)的合成由全固相合成轉(zhuǎn)變成全溶液相合成，或者先固相合成三條鏈，每一條含有例如6個氨基酸，然后在溶液中組裝這三條鏈。這大大提高了整個合成的經(jīng)濟性。當(dāng)肽的長度不是18個氨基酸時，可以很容易地對這一過程進行修改。因此，例如，15mer的合成可以通過固相合成三個5mer，隨后在溶液中組裝這三條鏈。14mer的合成可以通過固相合成兩個5mer和一個4mer，隨后在溶液中組裝這些鏈，等等。
A.合成方案概述表17顯示了合成肽D4F(Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2(SEQ ID NO13))的示例性方案。(表17顯示了該合成方案和合成產(chǎn)率)。
表17.示例性溶液相合成方案
用通過固相方法產(chǎn)生的片段進行溶液相合成片段1Wang樹脂.C端6肽(經(jīng)過氨解).產(chǎn)率定量NH2-K(Boc)-F-K(Boc)-E(But)-A-F-Wang樹脂(SEQ ID NO633)NH2-K(Boc)-F-K(Boc)-E(But)-A-F-CO-NH2(SEQ ID NO634)在DMF中用DIC/HOBT將從上面獲得的片段2與片段1偶聯(lián)Fmoc-Y(But)-D(But)-K(Bpc)-V-A-E(But)-K(Boc)-F-K(Boc)-E(But)-F-CO-NH2(SEQ ID NO635)在除去保護基團之后，12殘基肽作為游離肽被鑒定。產(chǎn)率為50％用DMF中的哌啶(20％)從上面12個殘基除去Fmoc。干燥后，在DMF中用DCl/HOBT將該肽與片段3偶聯(lián)Ac-D(But)-W-F-K(Boc)-A-F-Y(But)-D(But)-K(Boc)-V-A-E(But)-K(Boc)-F-K(Boc)-E(But)-A-FCO-NH2(SEQ ID NO636)被保護肽的產(chǎn)率是定量的。
用TFA(80％)、苯酚(5％)、茴香硫醚(5％)、水(5％)、三異丙基硅烷(TIS，5％)混合物攪拌90min除去保護基團。
用乙醚沉淀，并用C-4HPLC柱純化。產(chǎn)率25％B)合成規(guī)程細節(jié)1)合成D-4F的片段縮合步驟在固相上進行片段縮合的合成片段是片段1Ac-D(OBut)-W-F-K(εBoc)-A-F-COOH(SEQ ID NO637)；片段2Fmoc-Y(OBut)-D(OBut)-K(εBoc)-V-A-E(OBut)-COOH(SEQ IDNO638)；和片段3Fmoc-K(εBoc)F-K(εBoc)-E(OBut)-A-F-Rink Amide樹脂(SEQ IDNO639)。
片段1被留在樹脂上，以便在TFA處理之后獲得最終的肽酰胺。
合成片段1在DMF∶二氯甲烷(1∶1)中在6倍當(dāng)量DIEA的存在下，向氯三苯甲基樹脂(Nova Biochem，1.3mMol/g取代，使用5mMol或6.5g)添加Fmoc-Phe(1.2倍當(dāng)量)，攪拌4h。樹脂上多余的官能團在二氯甲烷和DIEA的存在下用甲醇封端(capped)。除去Fmoc-之后，如上所述，用HOBt/HBTU試劑添加Fmoc氨基酸衍生物(2倍當(dāng)量)。最終的Fmoc-D(OBut)-W-F-K(εBoc)-A-F氯三苯甲基樹脂用Fmoc脫封閉劑處理，并在二異丙基乙胺(diisoprolylethyl amine)存在下，用6當(dāng)量的乙酸酐乙?；?。所得的Ac-D(OBut)-W-F-K(εBoc)-A-F-樹脂在室溫用三氟乙醇-乙酸-二氯甲烷(2∶2∶6，10ml/g樹脂)的混合物處理4h。通過過濾除去樹脂之后，在真空下利用正己烷通過共沸蒸餾(aziotropic distillation)除去溶劑。殘余物(1.8g)經(jīng)質(zhì)譜分析確定為Ac-D(OBut)-W-F-K(εBoc)-A-F-COOH(SEQ IDNO640)。
使用用于片段1的程序獲得片段2，F(xiàn)moc-Y(OBut)-D(OBut)-K(εBoc)-V-A-E(OBut)-COOH(SEQ ID NO641)。最終產(chǎn)量為2.2g。
片段3使用0.9g(0.5mmol)Rink amide樹脂(Nova Biochem)獲得片段，用二氯甲烷中20％的哌啶(pipetidine)處理Rink amide樹脂，5min一次，15min第二次(Fmoc去封閉試劑)。用縮合劑HOBt/HBTU(2當(dāng)量，在數(shù)滴二異丙基乙胺的存在下)縮合1.2當(dāng)量的Fmoc-Phe(氨基酸縮合)。繼續(xù)進行其余氨基酸的去封閉和縮合，從而獲得Fmoc-K(εBoc)F-K(εBoc)-E(OBut)-A-F-rink amide樹脂(SEQ ID NO642)。切除Fmoc，并使用肽樹脂K(εBoc)F-K(εBoc)-E(OBut)-A-F-rink amide樹脂(SEQ ID NO642)進行如下所述的片段縮合。
在DIEA存在下，用HOBt-HBTU程序過夜將DMF中的片段2添加到片段3(1.2倍當(dāng)量)。在用DMF沖洗樹脂并脫封閉之后，用HOBt-HBTU程序過夜將Fmoc-片段1(1.2倍當(dāng)量)添加到十二肽樹脂。
最終的肽樹脂(3.3g)用TFA-苯酚-三異丙基硅烷-茴香硫醚-水混合物(80∶5∶5∶5)處理1.5h(10ml試劑/g樹脂)。將樹脂濾去，溶液用10倍體積乙醚稀釋。通過離心分離沉淀的肽，并用乙醚清洗2次。將1g粗肽進行HPLC純化，獲得100mg肽。
2)肽的鑒定肽通過質(zhì)譜和分析HPLC方法加以鑒定。
圖14A-14L顯示了所得肽的純度。圖15顯示，所得的肽在小鼠體內(nèi)具有生物活性。
實施例4由Apo-M衍生的G*肽提高對氧磷酶活性向4月齡雌性apoE缺失小鼠(每組n＝4)按10μg/只腹腔注射施用亂序的(scrambled)D-4F(一種無活性對照肽)或D-4F，或按50μg/只腹腔注射施用由L氨基酸(L-ApoM)合成的肽Ac-KWIYHLTEGSTDLRTEG-NH2(SEQID NO643)。2或6小時后對小鼠采血，通過FPLC分離它們的HDL，確定HDL中的對氧磷酶活性，并在X軸上作圖。向其他4月齡雌性apoE缺失小鼠(每組n＝4)按100μg/只灌胃施用由L氨基酸(L-ApoM)合成的肽Ac-KWIYHLTEGSTDLRTEG-NH2(SEQ ID NO643)(灌胃L-ApoM)。6小時后對小鼠采血，通過FPLC分離其HDL，測定HDL中的對氧磷酶活性，并在X軸上作圖。
如圖16所示，所述來自apoM，對應(yīng)于殘基99-115，由L-氨基酸合成，并且N端和羧基端都被封閉的序列(SEQ ID NO643)，無論是通過腹腔注射還是通過胃飼施用均可提高apoE缺失小鼠體內(nèi)的對氧磷酶活性。
實施例5LAEYHAK(SEQ ID NO8)肽的活性通過胃管向4只獼猴(cynomologous monkey)的每一只施用5毫克溶于2.0ml水的全部由D氨基酸合成的肽LAEYHAK(SEQ ID NO8)，之后給2.0ml水進行沖洗。6小時后，對猴子進行采血，用快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)分級其血漿，并在人動脈壁細胞培養(yǎng)物中進行試驗。
如圖17的A欄所示，以100μg/ml LDL膽固醇的濃度向細胞添加正常人類LDL(hLDL)產(chǎn)生了單核細胞趨化活性，其繪制在圖的y軸上。同樣如A欄所示，向細胞一起添加50μg/ml HDL-膽固醇濃度的正常人類HDL(hHDL)與100μg/ml LDL-膽固醇濃度的hLDL導(dǎo)致單核細胞趨化活性顯著降低。
如圖17的B欄所示，在0時刻(也就是在施用肽之前)，向細胞一起添加100μg/ml LDL-膽固醇濃度的hLDL和50μg/ml HDL-膽固醇濃度的猴HDL不會降低單核細胞趨化活性。然而，亦如B欄所示，添加同樣濃度的猴HDL，但是在施用肽之后6小時添加，顯著降低了單核細胞趨化活性。如C欄所示，在施用肽之前(0時)向細胞添加100μg/ml LDL-膽固醇濃度的猴L(fēng)DL，相比于A欄中添加相同濃度的hLDL，單核細胞趨化活性顯著增加。另外C欄亦顯示，在施用肽6小時后向細胞添加相同濃度的猴L(fēng)DL可顯著降低單核細胞趨化活性。
可以理解，本文所述的實施例和實施方案只是出于舉例說明的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在它們的基礎(chǔ)上，可以想到多種修改和變化，這些都包含在本申請的精神和范圍內(nèi)以及所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文將本文所引用的全部出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容并入用于所有目的。
權(quán)利要求
1.改善一種或多種炎癥癥狀的肽，其中所述肽包括氨基酸序列LAEYHAK(SEQ ID NO8)或KAHYEAL(SEQ IDNO644)；且所述肽包含至少一個D氨基酸和/或至少一個保護基團。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽包括至少一個D氨基酸。
3.權(quán)利要求2的肽，其中所述肽全部由D氨基酸構(gòu)成。
4.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽包含至少一個保護基團。
5.權(quán)利要求4的肽，其中所述肽在每個末端包含至少一個保護基團。
6.權(quán)利要求4的肽，其中所述保護基團從下面的保護基團中選擇酰胺、3-20碳烷基、Fmoc，t-boc，9-芴乙?；?、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺?；?Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、乙酰基(Ac)、丙基、丁基、戊基、己基、N-甲基鄰氨基苯甲酰基、聚乙二醇(PEG)和三氟乙?；?TFA)。
7.權(quán)利要求3的肽，其中所述肽包含至少一個保護基團。
8.權(quán)利要求3的肽，其中所述多肽在每個末端包含至少一個保護基團。
9.改善一種或多種炎癥癥狀的肽，其中所述肽長度范圍是大約3到大約10個氨基酸；包含如下所述的氨基酸序列，該序列包含與一個或兩個芳香、疏水或不帶電極性氨基酸交替出現(xiàn)的酸性或堿性氨基酸；包含疏水末端氨基酸或帶疏水保護基團的末端氨基酸；不是全部由L氨基酸構(gòu)成的序列LAEYHAK(SEQ ID NO8)；其中所述肽將促炎HDL轉(zhuǎn)變成抗炎HDL，或者使抗炎HDL更加抗炎。
10.改善一種或多種炎癥癥狀的肽，其中所述肽包含如表3或14所示肽的氨基酸序列或其多聯(lián)體。
11.權(quán)利要求10的肽，其中所述肽包含至少一個D氨基酸。
12.權(quán)利要求11的肽，其中所述肽全部由D氨基酸構(gòu)成。
13.權(quán)利要求10的肽，其中所述肽包含至少一個保護基團。
14.權(quán)利要求13的肽，其中所述肽在每個末端包含至少一個保護基團。
15.權(quán)利要求13的肽，其中所述保護基團從下面的保護基團中選擇酰胺、3-20碳烷基、Fmoc，t-boc，9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)、均三甲苯-2-磺?；?Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺?；?Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲?；?Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、乙?；?Ac)、丙基、丁基、戊基、己基、N-甲基鄰氨基苯甲?；⒕垡叶?PEG)和三氟乙?；?TFA)。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的肽，其中所述肽包含至少一個保護基團。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的肽，其中所述肽在每個末端包含至少一個保護基團。
18.改善一種或多種炎癥癥狀的肽，其中所述多肽包括選自下組的氨基酸序列DMT-Arg-Phe-Lys(SEQ ID NO1)，DMT-Arg-Glu-Leu(SEQ ID NO2)，Lys-Phe-Arg-DMT(SEQ ID NO3)和Leu-Glu-Arg-DMT(SEQ ID NO4)，其中DMT是二甲基酪氨酸。
19.權(quán)利要求18的肽，其中所述肽包含至少一個D氨基酸。
20.權(quán)利要求19的肽，其中所述肽全部由D氨基酸構(gòu)成。
21.權(quán)利要求18的肽，其中所述Arg是D氨基酸。
22.權(quán)利要求21的肽，其中所述肽在每個末端包含至少一個保護基團。
23.權(quán)利要求21的肽，其中所述保護基團從下面的保護基團中選擇酰胺、3-20碳烷基、Fmoc，t-boc，9-芴乙?；?-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、芐氧羰基、呫噸基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧三苯甲基(Mmt)、4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色滿-6-磺?；?Pmc)、4-甲基芐基(MeBzl)、4-甲氧芐基(MeOBzl)、芐氧基(BzlO)、芐基(Bzl)、苯甲?；?Bz)、3-硝基-2-吡啶硫基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亞環(huán)己基)乙基(Dde)、2，6-二氯芐基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯芐氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴芐氧羰基(2-Br-Z)、芐氧甲基(Bom)、環(huán)己氧基(cHxO)、叔-丁氧甲基(Bum)、叔-丁氧基(tBuO)、叔-丁基(tBu)、乙?；?Ac)、丙基、丁基、戊基、己基、N-甲基鄰氨基苯甲酰基、聚乙二醇(PEG)和三氟乙酰基(TFA)。
24.權(quán)利要求19的肽，其中所述肽包含至少一個保護基團。
25.權(quán)利要求24的肽，其中所述肽在每個末端包含至少一個保護基團。
26.權(quán)利要求18的肽，其中所述肽從下面選擇Boc二甲基酪氨酸-D-Arg-Phe-Lys(OtBu)(SEQ ID NO5)及Boc二甲基酪氨酸-Arg-Glu-Leu(OtBu)(SEQ ID NO6)。
27.權(quán)利要求9、1、10和18中任一項的肽，其中所述炎癥是動脈粥樣硬化。
28.藥物制劑，包含權(quán)利要求9-26任一項的肽和藥學(xué)可接受的賦形劑。
29.權(quán)利要求28的藥物制劑，其中該肽在經(jīng)時釋放制劑中。
30.權(quán)利要求28的藥物制劑，其中該制劑配制為單位劑量制劑。
31.權(quán)利要求28的藥物制劑，其中該制劑配制為口服施用。
32.權(quán)利要求28的藥物制劑，其中該制劑配制為供通過選自下組的途徑施用口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用、吸入施用和肌肉內(nèi)注射。
33.一種改善哺乳動物體內(nèi)動脈粥樣硬化癥狀的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用一種或多種根據(jù)權(quán)利要求9-26中任一項的肽。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述肽處于藥學(xué)可接受的賦形劑中。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述肽處于適合于口服施用的藥學(xué)可接受賦形劑中。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述肽作為單位劑量制劑施用。
37.權(quán)利要求33的方法，其中所述施用包括通過選自下組的途徑施用所述肽口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用、吸入施用和肌肉內(nèi)注射。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的哺乳動物。
39.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動物是被診斷具有中風(fēng)或動脈粥樣硬化的危險性的哺乳動物。
40.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動物是人。
41.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動物是非人哺乳動物。
42.一種減輕或預(yù)防與哺乳動物中對炎癥的急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥的方法，其中所述冠狀動脈并發(fā)癥是動脈粥樣硬化癥狀，所述方法包括向具有所述急性期反應(yīng)或有所述急性期反應(yīng)的危險性的哺乳動物施用一種或多種根據(jù)權(quán)利要求9-26中任一項的肽。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述肽處于藥學(xué)可接受的賦形劑中。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述肽處于適合于口服施用的藥學(xué)可接受賦形劑中。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述肽作為單位劑量制劑施用。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述施用包括通過選自下組的途徑施用所述多肽口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用和肌肉內(nèi)注射。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的哺乳動物。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有中風(fēng)或動脈粥樣硬化危險性的哺乳動物。
49.權(quán)利要求42的方法，其中所述哺乳動物是人。
50.權(quán)利要求42的方法，其中所述哺乳動物是非人哺乳動物。
51.改善哺乳動物中糖尿病癥狀的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用一種或多種權(quán)利要求9-26中任一項的肽。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述肽處于藥學(xué)可接受的賦形劑中。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述肽處于適合于口服施用的藥學(xué)可接受賦形劑中。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述肽作為單位劑量制劑施用。
55.權(quán)利要求51的方法，其中所述施用包括通過選自下組的途徑施用所述肽口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用和肌肉內(nèi)注射。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的哺乳動物。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有中風(fēng)或動脈粥樣硬化的危險性的哺乳動物。
58.權(quán)利要求51的方法，其中所述哺乳動物是人。
59.權(quán)利要求51的方法，其中所述哺乳動物是非人哺乳動物。
60.抑制哺乳動物中再狹窄的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用表1-15所示的一種或多種肽和/或如本文所述的有機小分子。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述肽包含4F的氨基酸序列(SEQ IDNO13)。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述肽處于藥學(xué)可接受的賦形劑中。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述肽處于適合口服施用的藥學(xué)可接受賦形劑中。
64.權(quán)利要求60的方法，其中所述肽作為單位劑量制劑施用。
65.權(quán)利要求60的方法，其中所述施用包括通過選自下組的途徑施用所述多肽口服施用、鼻內(nèi)施用、直腸施用、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮施用和肌肉內(nèi)注射。
66.權(quán)利要求60的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有一種或多種動脈粥樣硬化癥狀的哺乳動物。
67.權(quán)利要求60的方法，其中所述哺乳動物是被診斷為具有中風(fēng)或動脈粥樣硬化的危險性的哺乳動物。
68.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述哺乳動物是人。
69.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述哺乳動物是非人哺乳動物。
70.權(quán)利要求9-26任一項的肽，用于治療選自下組的病癥動脈粥樣硬化、再狹窄、與哺乳動物中對炎癥的急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥，和糖尿病。
71.權(quán)利要求9-26中任一項的多肽在制造用于治療性或預(yù)防性處理選自下組的病癥的藥物中的用途動脈粥樣硬化、再狹窄、與哺乳動物炎癥急性期反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的冠狀動脈并發(fā)癥，和糖尿病。
72.一種用于遞送藥物到體內(nèi)的血管的支架，包括支架框，包含多個形成于其中的儲庫；和位于儲庫內(nèi)的一種或多種如表1-15所示的活性劑和/或如本文所述的有機小分子。
73.權(quán)利要求72的支架，其中所述活性劑是包含4F氨基酸序列(SEQ IDNO13)的肽。
74.權(quán)利要求72的支架，其中所述活性劑包含在聚合物內(nèi)。
75.權(quán)利要求72的支架，其中該支架框包含金屬基材或聚合物基材之一。
76.權(quán)利要求72的支架，其中該支架框基材包含選自下組的材料不銹鋼、鎳鈦金屬互化物、鉭、MP35N合金、鉑、鈦、合適的生物相容性合金、合適的生物相容性聚合物及其組合。
77.權(quán)利要求72的支架，其中該儲庫包含微孔。
78.權(quán)利要求77的支架，其中該微孔的直徑為大約20微米或更小。
79.權(quán)利要求77的支架，其中該微孔的直徑在大約20微米到大約50微米的范圍內(nèi)。
80.權(quán)利要求77的支架，其中該微孔的深度在大約10到大約50微米的范圍內(nèi)。
81.權(quán)利要求77的支架，其中該微孔的深度為大約50微米。
82.權(quán)利要求77的支架，其中該微孔延伸穿過支架框，在支架的內(nèi)表面上有開口，并在支架的外表面上有開口。
83.權(quán)利要求77的支架，其進一步包括設(shè)置在支架框內(nèi)表面上的蓋層，該蓋層覆蓋所述通孔的至少一部分，并提供屏障特性，以控制藥物聚合物中的藥物從支架框內(nèi)表面洗脫的速度。
84.權(quán)利要求72的支架，其中該儲庫包含沿著支架框外表面的通道。
85.權(quán)利要求74的支架，其中所述聚合物包括具有第一藥學(xué)特性的第一藥物聚合物的第一層，并且所述聚合物層包括具有第二藥學(xué)特性的第二藥物聚合物。
86.權(quán)利要求74的支架，還包括位于包含活性劑的聚合物之間的屏障層。
87.權(quán)利要求72的支架，還包括與支架框偶聯(lián)的導(dǎo)管。
88.權(quán)利要求87的支架，其中該導(dǎo)管包括用于擴張支架的球囊。
89.權(quán)利要求87的支架，其中該導(dǎo)管包括可收縮而使支架得以擴張的外殼。
90.一種制造藥物-聚合物支架的方法，包括提供支架框；在支架框內(nèi)切出多個儲庫；向至少一個儲庫施加包含一種或多種本文所述活性劑的組合物；和干燥該組合物。
91.根據(jù)權(quán)利要求90的方法，進一步包括向干燥的組合物施加聚合物層；和干燥該聚合物層。
92.一種用于治療血管病癥的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求72的支架定位在身體血管內(nèi)；擴張該支架；和從支架的至少一個表面洗脫至少一種活性劑。
93.一種合成肽的方法，所述方法包括提供所述肽的至少3個不同的肽片段亞序列；和在溶液相中偶聯(lián)所述肽片段亞序列，以形成所述肽。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述肽的長度為6-37個氨基酸。
95.權(quán)利要求93的方法，其中所述肽的長度為18個殘基。
96.權(quán)利要求93的方法，其中所述肽包括A類兩親性螺旋。
97.權(quán)利要求93的方法，其中所述肽包括氨基酸序列D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO13)。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所有三條肽片段亞序列中每一個的長度均為6個氨基酸。
99.權(quán)利要求97的方法，其中三條肽片段亞序列具有如下序列D-W-F-K-A-F(SEQ ID NO645)、Y-D-K-V-A-E(SEQ ID NO646)和K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO647)。
100.權(quán)利要求97的方法，其中所述肽全部由D氨基酸構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明提供了新型的多肽和其它劑，其可改善動脈粥樣硬化和/或其它以炎癥反應(yīng)為特征的病變的一種或多種癥狀。在一些實施例中，該多肽類似于載脂蛋白J的G
文檔編號A61K38/00GK101065137SQ200580039224
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月16日
發(fā)明者阿蘭·M·福格爾曼, 穆罕麥德·納瓦布, 加塔達哈利·M·阿南薩拉梅亞 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, 亞拉巴馬大學(xué)研究基金會