專利名稱：二酮二硫代哌嗪抗生素用于制備抗血管生成藥物組合物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二酮二硫代哌嗪抗生素、特別是毛殼素與膠霉毒素用于制備具有抗血管生成活性的藥物的用途。
現(xiàn)有技術(shù)毛殼素(I) 和毛殼菌素(II) 是表多硫二氧代哌嗪抗生素的代表性實(shí)例，是由毛殼菌屬的真菌產(chǎn)生的有抗菌及細(xì)胞毒活性的霉菌的次級代謝產(chǎn)物(C.Leigh，A.Taylor，“真菌毒素與真菌代謝物相關(guān)的食品問題”，ed.J.V.Rodricks，p.228，Am.Chem.Soc.，Washington，D.C.，1976；G.W.Kirby，D.J.Robins，真菌毒素的生物合成，ed.P.S.Stenyl，p.301，Academic Press，New York，1980。為了從屬于C.thielavioideum的毛殼菌屬培養(yǎng)物及從Farrowia sp.Strain中分離毛殼素，見S.Udagawa等人，“通過毛殼菌屬與相關(guān)真菌產(chǎn)生的球毛殼甲素、柄曲菌素、O-甲基柄曲菌素與毛殼素”，Can.J.Microbiol.1979，25(2)170-7，和S.Sekita等人，“毛殼菌屬與相關(guān)真菌產(chǎn)生的真菌毒素”，Can.J.Microbiol.1981，27(8)766-72)。此類化合物的特征是有二硫鍵。
除了毛殼素與毛殼菌素以外，表多硫二氧代哌嗪抗生素的另外的實(shí)例是膠霉毒素(III) (P.Waring，J.Baever，“膠霉毒素與相關(guān)的表多硫二氧代哌嗪抗生素”，Gen Pharmacol.27，1311-1316，1996)，葚孢菌素(Chem.Ber.105(11)3658-61，1972)，阿拉諾丁(N.Neuss等人，“阿拉諾丁與相關(guān)代謝物。II.兩種新代謝物的分離、鑒別和結(jié)構(gòu)”，Tetrahedron Letters，42，4467-4471，1968)，輪枝孢菌素(Chem.Ber.105(11)3658-61，1972)，榅桲殺菌素(F.Reusser，“一種煙酸生物合成抑制劑——榅桲殺菌素的作用模式”；J.Bacteriol.96(4)1285-1290，1968)與稻氯曲菌素(亦稱為抗生素A-30641或aspirochlorineK.Sakata等人，aspirochlorine(＝抗生素A30641)，“一種由曲霉菌屬產(chǎn)生新的表二硫哌嗪-2，5-二酮的結(jié)構(gòu)修飾”，TetrahedronLetters，28(46)，5607-5610，1987)。K.Michel等人在J.Antibiot.27，57(1974)公開的同樣是Penicilium turbatum的代謝物，有著表多硫二氧代哌嗪的結(jié)構(gòu)。
毛殼素的結(jié)構(gòu)與絕對構(gòu)型已由H.P.Weber公開(Helv.Chim.Acta，53(5)1061-73，1970；Acta Crystallogr.B28，2945(1972))。毛殼素與其二羥基衍生物，11α，11α’-二羥基毛殼素(榅桲殺菌素，IV)的細(xì)胞毒活性亦有報道，對白血病HeLa細(xì)胞的IC50約為0.03μg/mL(T.Saito等人，Chetracin A，“一種來自毛殼屬Chaetomium abuense和C.retardatum的四硫橋接的新表多硫二氧代哌嗪化合物”，Tetrahedron Letters，26，(39)，4731-4734，1985)。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)對生理性與生理病理性的血管發(fā)生過程起主要作用。有不同機(jī)制涉及到VEGF基因的調(diào)控，調(diào)控過程與組織氧壓是高度相關(guān)的，這一點(diǎn)可通過體內(nèi)與體外缺氧條件下VEGF mRNA水平可逆性升高得到證明。VEGF mRNA表達(dá)的增加主要由與VEGF基因啟動子結(jié)構(gòu)域識別位點(diǎn)結(jié)合的低氧誘導(dǎo)因子-1(Hif-1)的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)。
大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Hif-1是氧穩(wěn)態(tài)的整體調(diào)節(jié)基因，且受損的Hif-1活性促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、發(fā)病和轉(zhuǎn)移(G.L.Semenza，NatureReview Cancer，3，2003，721-732)。因此可猜測針對抑制Hif-1活性的治療策略可提高癌癥患者的存活率(Semenza GL.HIF-1與腫瘤的演化病理生理學(xué)與治療學(xué)，Trends Mol.Med.2002 8S62)。
HIF-1是由Hif-1α與Hif-1β亞單位組成、二聚并通過bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的雜二聚體(Semenza GL等人，“缺氧誘導(dǎo)因子1的二聚化、DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)活性質(zhì)”，J.Biol.Chem.1996 27117771)。Hif-1α亞單位的表達(dá)是通過由VHL蛋白與Hif-1α結(jié)合介導(dǎo)的遍在蛋白化作用與蛋白體降解作用過程，嚴(yán)格受組織氧調(diào)控的(Semenza GL等人，“缺氧誘導(dǎo)因子1水平在氧壓的生理學(xué)相關(guān)范圍內(nèi)呈指數(shù)改變”，Am.J.Physiol.1996 271C1172)。這一相互作用僅當(dāng)Hif-1α在402與564脯氨酸殘基處水解時發(fā)生。氧對修飾Hif-1α的脯氨酰羥化酶是限制性底物(Epstein AC等人，“C.elegans EGL-9與哺乳動物類似物限定通過脯氨酰羥化調(diào)控HIF的二氧化酶家族”，Cell 2001 10743)。Hif-1α的表達(dá)隨著O2濃度的降低呈指數(shù)增加，并決定了Hif-1活性的全面水平。
Hif-1α的反式激活結(jié)構(gòu)域功能亦受氧分壓的負(fù)調(diào)控。N-末端反式激活結(jié)構(gòu)域通過VHL以及與VHL及Hif-1α結(jié)合的抑制Hif-1α的因子(FIH-1)hystone deacilase的募集負(fù)調(diào)控(Semenza GL等人，“FIH-1與Hif-1α及VHL相互作用調(diào)控HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的新型蛋白質(zhì)”，Genes Dev.2001 152675)。
Hif-1的活化是通過與Hif-1結(jié)構(gòu)域的活化生理性地相互作用而促進(jìn)基因樣VEGF的轉(zhuǎn)錄的共激活劑p300/CBP發(fā)生的(Arany Z.等人，“p300/cbp在缺氧細(xì)胞響應(yīng)的基本作用”，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 199693；12969)。p300與CBP也是其他轉(zhuǎn)錄因子的共激活劑，例如Stat-3，NF-κB，p53。
p300/CBP與Hif-1的相互作用對轉(zhuǎn)錄是必需的，最新出版物已證實(shí)Hif-1/p300相互作用對腫瘤生長的重要性(Damert A.等人，“激活劑-蛋白質(zhì)-1結(jié)合使缺氧誘導(dǎo)因子-1-介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)在c6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活成為可能”，Biochem J.1997 327419)。Hif-1αC-末端反式激活結(jié)構(gòu)域(C-TAD)與p300及已知為CH1的CBP結(jié)構(gòu)域結(jié)合。CBP及p300與Hif-1α的結(jié)合通過803天門冬酰胺在C-末端FIH-1活化結(jié)構(gòu)域的氧依賴羥基化作用負(fù)調(diào)控。因此，缺氧誘導(dǎo)了蛋白體降解的穩(wěn)定化以及Hif-1的轉(zhuǎn)錄活性。
Hif-1α TAD-C與p300或CBP的CH1結(jié)構(gòu)域相互作用的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)已經(jīng)闡明(Eck MJ.等人，“缺血誘導(dǎo)因子-1α對CBP/p300募集的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002 995367，Wright PE等人，“Hif-1α/CBP在細(xì)胞缺氧響應(yīng)識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)”，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，2002995271)。p300/CBP與被認(rèn)為是HIF-1α活性的負(fù)調(diào)節(jié)劑的CITED2蛋白質(zhì)(亦稱作p35srj)間相互作用細(xì)節(jié)亦已出版(Freedman，S.J.等人，NatureStructural Biology，2003，10(7)，504-12)。
Hif-1活化作用誘導(dǎo)涉及血管生成因子、葡萄糖載體、糖酵解酶及對腫瘤發(fā)展特別重要的存活、轉(zhuǎn)移與侵入因子的大量基因的轉(zhuǎn)錄。
已在超過70％的人體腫瘤及其轉(zhuǎn)移中已觀察到Hif-1α蛋白質(zhì)的異常表達(dá)，蛋白質(zhì)的異常表達(dá)與血管化作用的增加及腫瘤演化相關(guān)聯(lián)(Zhong，H.等人，“常見人體癌癥與其轉(zhuǎn)移中缺氧誘導(dǎo)因子1α的過度表達(dá)”，CancerResearch，1999，59，5830-5；Bos，R.等人，“在乳腺癌發(fā)生期間缺氧誘導(dǎo)因子1α的水平”，J.Nat.Cancer Inst.2001，93，309-14；Talks，K.I.等人，“缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α與HIF-2在正常人體組織中的表達(dá)與分布”)。在臨床實(shí)踐中，Hif-1α的異常表達(dá)已與許多腫瘤病理學(xué)上的治療失敗及死亡率增加相聯(lián)系，例如非小細(xì)胞肺癌(Giatromanolaki，A.等人，“在可行手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌中缺氧誘導(dǎo)因子1α及2α與腫瘤的血管生成/分子特性及存活率的關(guān)系”，Br.J.Cancer 85，881-890(2001))、口咽鱗狀上皮細(xì)胞癌(Aebersold，D.M.等人，“缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)一種在口咽癌放射治療中新的預(yù)測性與預(yù)后性參數(shù)”，Cancer Res.61，2911-2916(2001))、子宮頸癌早期階段(Birner，P.等人，“缺氧誘導(dǎo)因子1α的過度表達(dá)在早期發(fā)病的子宮頸癌中是不良預(yù)后的標(biāo)記物”，Cancer Res.60，4693-4696(2000))、頭頸癌(Koukourakis，M.I.等人，“鱗狀上皮細(xì)胞頭頸癌的缺氧誘導(dǎo)因子(HiflA和Hif2A)、血管發(fā)生與化放療結(jié)果”，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.53，1192-1202(2002))、突變型-p53卵巢癌(Birner，P.等人，“缺氧誘導(dǎo)因子1α在上皮卵巢腫瘤中的表達(dá)”對預(yù)后與化療反應(yīng)的影響，Clin.Cancer Res.7，1661-1668(2001))，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Birner，P.等人，“缺氧誘導(dǎo)因子1α在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的表達(dá)其對預(yù)后及新血管生成的影響”，Cancer 92，165-171(2001))和BCL-2陽性食管癌(Koukourakis，M.I.等人，“缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α和HIF-2α)在早期食管癌中的表達(dá)以及對光動力學(xué)療法及放療的響應(yīng)”，Cancer Res.61，1830-1832(2001))。
文獻(xiàn)中對抑制Hif-1活性的不同方法已有描述。其中有些提示使用Hif-1α反義寡核苷酸或HIF-1α的負(fù)顯性型。
在藥理學(xué)方法中，通過間接機(jī)制起作用的Hif-1α活性抑制劑已有介紹，例如按照控制Hif-1α活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用的PI3K-mTOR抑制劑(Zundel，W.等人，“PTEN的丟失促進(jìn)HIF-1介導(dǎo)的基因表達(dá)”，GenesDev.14，391-396(2000)；Hudson，C.C.等人，“借助雷帕霉素哺乳靶對缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)與功能的調(diào)控”，Mol.Cell.Biol.22，7004-7014(2002))與MEKK抑制劑((Sodhi，A.等人，“卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒G蛋白偶聯(lián)受體通過細(xì)胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶與p38途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在缺氧誘導(dǎo)因子1α上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)與分泌”，Cancer Res.60，4873-4880(2000))；HSP90侶伴蛋白質(zhì)抑制劑(Mabjeesh，N.J.等人，“格爾德霉素通過前列腺癌細(xì)胞的蛋白體途徑誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α蛋白質(zhì)的降解”，Cancer Res.62，2478-2482(2002))；修飾細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的硫氧還蛋白還原酶抑制劑(Welsh，S.J.等人，“硫氧還蛋白氧化-還原抑制劑1-甲基丙基2-咪唑基二硫化物與灰側(cè)耳菌素抑制誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α與血管內(nèi)皮生長因子形成”，Mol.Cancer Ther.2，235-243(2003))；使微管不穩(wěn)定的分子，例如甲氧雌二醇(Mabjeesh，N.J.等人，“2ME2通過破裂微管及使Hif失調(diào)抑制腫瘤生長與血管發(fā)生”，Cancer Cell 3，363-375(2003))及環(huán)氧聚微管素(Escuin，D.等人，“環(huán)氧聚微管素B抑制其微管穩(wěn)定效應(yīng)的Hif-1α下游”，美國癌癥研究協(xié)會第95屆年會的會議論文集，Abs.5427)。
最近，在人腫瘤移植裸鼠中對組成與被PX-478(美法倉N-氧化物)缺氧誘導(dǎo)的Hif-1α水平兩者的抑制已有報道?；衔镲@示顯著的抗腫瘤活性。但是，該化合物的作用機(jī)制尚未完全闡明(S Welsh等人，“PX-478，一種缺氧誘導(dǎo)因子1α抑制劑的抗腫瘤活性與藥效學(xué)性質(zhì)”，Mol.Cancer，3233-244，(2004))。
最后，最近報道的毛殼菌素，一種干擾Hif-1α與p300結(jié)合的有二酮二硫代哌嗪結(jié)構(gòu)的毛殼菌屬真菌代謝物。該化合物的作用改變了p300的CH1結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，因此防止了其與Hif-1α的相互作用。毛殼菌素給予荷瘤小鼠抑制在腫瘤與腫瘤生長中的缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄(A.L.Kung等人，CancerCell，6，33-43，2004)。
膠霉毒素與毛殼素是從Sigma Aldrich購買的，且根據(jù)以上出版物描述的方法獲得。膠霉毒素的全合成是由T.Fukuyama，S.Nakatsuka e Y.Kishi在膠霉毒素、去氫膠霉毒素與透明菌素的全合成，Tetrahedron，37(11)，2045-2078，1981中報道。
發(fā)明的公開現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)二酮二硫代哌嗪結(jié)構(gòu)的抗生素，特別是毛殼素與膠霉毒素能夠抑制Hif-1α與p300結(jié)合，并在缺氧條件下防止VEGF在維持細(xì)胞中的產(chǎn)生。
因此，在第一個實(shí)施方案中本發(fā)明涉及選自毛殼素及膠霉毒素的二酮二硫代哌嗪抗生素用于制備治療要求抑制Hif-1α與p300結(jié)合的疾病的藥物的用途，特別是制備抗血管生成藥物。
發(fā)明的目的因此是作為抗血管生成、抗增殖與抗轉(zhuǎn)移劑的毛殼素與膠霉毒素。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有選自毛殼素及膠霉毒素活性成分的二酮二硫代哌嗪抗生素及適當(dāng)?shù)妮d體與賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制VEGF在細(xì)胞中生成的方法，該方法包括將細(xì)胞與有效量的毛殼素或膠霉毒素相接觸。
發(fā)明詳述二酮二硫代哌嗪抗生素，特別是毛殼素與膠霉毒素能夠抑制Hif-1α與p300之間的相互作用，用改自Freedman SJ等人Nature StructuralBiology 2003，10(7)，504-512的熒光分析方法可證實(shí)。
毛殼素與膠霉毒素因此可用于控制血管生成及腫瘤生長。
這些化合物的藥物組合物可方便地用于治療許多其中血管生成作為致病因素的疾病，例如不同形式的實(shí)體瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、血管瘤、硬皮病、新生血管性青光眼。
對能夠抑制Hif-1α與p300 CH1結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物特別敏感的實(shí)體瘤包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、口咽鱗狀細(xì)胞癌、子宮頸、卵巢、食管、腎、結(jié)腸、頭頸腫瘤與少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
為治療用途，所說的酮二硫代哌嗪抗生素將通過口服、腸道外、透皮、直腸、局部或等效的施用途徑施用，劑量將由本領(lǐng)域?qū)＜腋鶕?jù)所選化合物的藥理學(xué)-毒理學(xué)與藥動學(xué)性質(zhì)并根據(jù)病理學(xué)、患者的嚴(yán)重程度與進(jìn)展?fàn)顟B(tài)及體重、性別與年齡確定。
但是，劑量一般地根據(jù)患者體重包含從0.1至100mg/Kg/天。
毛殼素與/或膠霉毒素任選用于與其他化療藥例如在化療方案中與有不同作用機(jī)制及潛在協(xié)同作用的藥物組合施用。
本發(fā)明的組合物實(shí)例包括膠囊、片劑、注射或口服溶液或混懸液、栓劑、控釋劑型等等。所說的組合物可通過常規(guī)的技術(shù)與賦形劑制備，例如Remington’S Pharmaceutical Sciences Handbook，XVII ed.Mack Pub.，N.Y.，U.S.A.中公開的那些。
在下列實(shí)施例中詳細(xì)地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1-Biot-Hif-1α786-826/GST-p300323/423的抑制毛殼素阻止Hif-1α和p300之間相互作用的能力通過Freedman SJ等(Nature Structural Biology 2003，10(7)，504-512)提供的熒光分析方法(DELFIATM)經(jīng)適當(dāng)修改后來評估。
人Hif-1α C末端786-826氨基酸殘基生物素化片斷(生物素化Hif-1α786-826)來自AnaSpec公司(San Josè，California，USA)，不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。
表達(dá)GST-p300323-423片斷的組建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞株。用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法獲得編碼p300中323-423氨基酸序列的DNA序列，將其克隆至pGEX-4T-1表達(dá)載體(Amersham n.27-45-80-01)從而獲得表達(dá)GST-p300323-423片斷的組建質(zhì)粒。用1mM的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。將細(xì)菌在一種合適的緩沖液(50mM Tris.HCl pH 8.00、100mM NaCl、0.1mM ZnSO4、1mM DTT、0.1mg/ml溶菌酶，1片羅氏蛋白酶抑制劑)然后超聲裂解，通過谷胱甘肽-瓊脂糖4B樹脂(Amersham Biosciences；no.27-4574-01)純化溶液中的GST融合蛋白質(zhì)。用Bradford公司Bioard測定確定蛋白質(zhì)終濃度(Bradford M.，Anal.Biochem.，72，248，(1976))。通過SDS-PAGE來評估樣品純度。樣品于50％甘油條件下存儲于-80℃。
用NUNC Maxisorp96孔板按以下步驟來進(jìn)行分析。C96 NUNCMaxisorp孔板(Nunc，產(chǎn)品號446612)中加入溶于PBS(磷酸鹽緩沖鹽水10mM磷酸鈉，150mM氯化鈉pH7.4)中終濃度為1μg/ml的抗生物素鏈菌素(Sigma；產(chǎn)品號S 4762)，孵育過夜。每孔用300μl的TBST緩沖液(50mMTris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、0.05％(v/v)吐溫20)洗滌三次。然后每孔加入100μl溶于TBSB(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、5％(w/v)BSA(Sigma，產(chǎn)品號A 2153))的濃度為10nM生物素化Hif-1α786-826溶液，25℃孵育1小時?？装宓淖詈笠慌胖患覶BSB緩沖液。每孔用300μl的TBST緩沖液洗滌三次。準(zhǔn)備好的孔板用于分析。
同時準(zhǔn)備每孔含有10μl溶解于DMSO的濃度為10μM的受試化合物溶液的孔板(子孔板)。然后加入100μl稀釋于孵育緩沖液(加入0.1％(v/v)吐溫20、0.5mM DTT、10μM ZnCl2的TBSB)中濃度為111pM的GST-p300323-423溶液，混勻溶液。將子孔板中100μl混合物立即轉(zhuǎn)移到分析孔板。
每個子孔板準(zhǔn)備濃度為10μM的毛殼素，最后2排加入10μlDMSO，作為陽性對照(第11排，加Hif-1)和陰性對照(第12排，不加Hif-1)。
25℃孵育1小時后，每孔用300μlTBST緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、0.05％(v/v)吐溫20)洗滌三次。然后每孔加入60.8ng銪標(biāo)記的抗GST抗體(DELFIA Eu-N1標(biāo)記；Perkin Elmer；產(chǎn)品號AD0251)，抗體溶解于100μl含10μM ZnCl2的TBSB緩沖液。室溫孵育1小時后，每孔用300μlTBST緩沖液洗滌三次，然后加入100μl信號放大溶液(Enhancement Solution，Perkin Elmer，產(chǎn)品號1244-105)。
用FUSION alpha-FP-HT(Perkin Elmer)以時間分辨率熒光模式讀孔板。
毛殼素活性按以下方法計(jì)算。每孔的熒光值減去檢測孔板第12排陰性對照的平均熒光值，得到的每孔的熒光值除以第11排陽性對照的平均熒光值(該值定義為最大信號值，100％)，結(jié)果用百分率表示。抑制值為100和每孔信號百分值的差。
用由10個濃度梯度的化合物構(gòu)成的子孔板，其濃度梯度為每排90μM到0.178μM之間，從IC50值(化合物濃度能夠抑制50％信號)可以計(jì)算出濃度反應(yīng)曲線。11和12排只含有溶劑作為對照。
檢測中，毛殼素能夠抑制Biot-Hif-1α786-826和GST-p300323/423間的相互作用，IC50值為12.5μM。
實(shí)施例2-VEGF產(chǎn)物的抑制本發(fā)明的化合物使用一種基于遺傳修飾的人肝癌Hep3B細(xì)胞系(Hep3B-VEGF螢光素酶細(xì)胞)的細(xì)胞測試(該細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)一個載體，該載體中螢光素酶基因開放閱讀框被置于大鼠VEGF基因啟動子下)來評估。
用去鐵胺(能誘導(dǎo)低氧)誘導(dǎo)的HIF-1能通過激活VEGF啟動子誘導(dǎo)螢光素酶的轉(zhuǎn)錄，螢光素酶活性的增加能通過一種商業(yè)化的試劑盒檢測。和HIF-1α/p300復(fù)合物作用的化合物可抑制HIF依賴的螢光素酶活化，導(dǎo)致螢光素酶活性的降低。因此，該分析方法能夠評估針對VEGF啟動子的化合物的活性，啟動子活性對于VEGF的產(chǎn)生和后續(xù)的腫瘤血管生成是必不可少的。
Hep-3B-VEGF螢光素酶細(xì)胞系通過以下方法獲得。
人肝癌Hep3B細(xì)胞(ATCC參考號HB-8064)按照2.5×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)基為2ml DMEM/10％胎牛血清，第二天用Fugene 6(Roche Biochemicals)轉(zhuǎn)染。每孔的轉(zhuǎn)染混合物包含6μl轉(zhuǎn)染試劑Fugene6，1μg報告質(zhì)粒pxp2-VEGF-螢光素酶(大鼠VEGF啟動子，NCBIGenBank登記號U22373，Levy等人，J.Biol.Chem.270(22)，13333-13340，1995)，和10ng使細(xì)胞對新霉素抗性的pcDNA 3.1(+)質(zhì)粒(INVITROGEN)。轉(zhuǎn)染按照廠家說明書方法進(jìn)行。
用“極限稀釋”法(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch E.F.和Maniatis T.(1989)Molecular Cloning，A.Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratori)挑選適宜的細(xì)胞群體(表型上能抗新霉素)。用篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測螢光素酶表達(dá)/活性“螢光素酶分析”和上清液中分泌的VEGF量(分泌的VEGF的ELISA檢測)。
采用下列實(shí)驗(yàn)方案。
第一天，Hep-3B-VEGF螢光素酶細(xì)胞按1×104細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，每孔添加125μl培養(yǎng)基，然后在37℃/5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜以使細(xì)胞貼壁。
第二天，將75μl3.2×工作液化合物(已準(zhǔn)備于培養(yǎng)基中，DMSO濃度為1.6％v/v)添加到細(xì)胞中(體積/孔＝ 200μl，化合物濃度＝1.2×，DMSO濃度＝0.6％)。恒溫培養(yǎng)箱中孵育1小時后，通過向每孔添加40μl6×(600μM)去鐵胺儲存液進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)低氧(每孔終體積＝240μl，化合物終濃度＝1×，DMSO終濃度＝0.5％，去鐵胺終濃度＝1×≈100μM)。將孔板放置于恒溫培養(yǎng)箱中18-20小時。
第三天，按照以下方法進(jìn)行螢光素酶分析和分泌的VEGF的ELISA檢測。
分泌VEGF的ELISA檢測用“DuoSet Elisa Development System human VEGF”試劑盒(R&DSystems)對分泌的VEGF進(jìn)行定量。
將接種有Hep3B/VEGF螢光素酶克隆細(xì)胞的空白96孔板的上清液(100μl/孔)轉(zhuǎn)移至半透明96孔板(Maxisorp)，按照試劑盒說明書進(jìn)行分析。
在ELISA檢測分泌的VEGF的抑制中，毛殼素和膠霉毒素的IC50分別為0.1μM和0.2μM。
螢光素酶分析螢光素酶報告基因表達(dá)量用Bright Glo Reagent(Promega)進(jìn)行分析。在棄去上清液后，用PBS洗滌一次，按照40μl/孔的量向空白96孔板(即沒有人肝癌Hep3B/VEGF螢光素酶細(xì)胞的孔板)中加入Bright Glo Reagent。根據(jù)從發(fā)光測量計(jì)讀出孔板的值確定報告基因表達(dá)水平。
在抑制VEGF啟動子的螢光素酶分析中，毛殼素和膠霉毒素的IC50(能夠抑制50％螢光素酶信號時的化合物濃度)分別為0.04μM和0.05μM。
權(quán)利要求
1.除了毛殼菌素外的二酮二硫代哌嗪抗生素用于制備治療其中要求抑制Hif-1α和p300的結(jié)合的疾病的藥物組合物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1用于制備抗血管生成藥物的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2用于預(yù)防或治療實(shí)體瘤的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中的腫瘤選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、口咽鱗狀細(xì)胞癌、子宮頸、卵巢、食管、腎、結(jié)腸、頭頸癌與少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任意一項(xiàng)的用途，其中的抗生素是毛殼素或膠霉毒素。
6.作為血管生成抑制劑的毛殼素和膠霉毒素。
7.作為抗增殖和抗轉(zhuǎn)移劑的毛殼素和膠霉毒素。
8.包含作為活性成分的毛殼素和/或膠霉毒素并與適宜的載體和賦形劑混合的藥物組合物。
9.抑制VEGF在細(xì)胞中生成的方法，該方法包括用有效量的毛殼素或膠霉毒素接觸所述的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及二酮二硫代哌嗪抗生素特別是毛殼素與膠霉毒素用于制備抗腫瘤療法中的藥物組合物的用途。
文檔編號A61K31/496GK101083991SQ200580044003
公開日2007年12月5日 申請日期2005年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者S·德穆納里, M·格魯尼, E·門塔, M·卡辛, G·科萊拉 申請人:歐洲細(xì)胞治療責(zé)任有限公司