專利名稱：運載重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌及其在抗腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種攜帶siRNA-Stat3，siRNA-Survivin及共表達(dá)siRNA-Stat3及GRIM-19質(zhì)粒的減毒沙門氏菌及其制備方法及其在治療腫瘤的中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤基因治療的主要障礙之一是如何把抗腫瘤因子或其他治療藥物傳遞到腫瘤組織內(nèi)，特別是深部腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，而不傷害正常組織。沙門氏菌為兼性厭氧菌，具有嗜腫瘤活性，在低氧或缺氧條件下的腫瘤深部可繁殖良好并產(chǎn)生溶瘤效應(yīng)，許多報告指出沙門氏菌在腫瘤組織中繁殖的特異性與正常組織相比可超過1000倍以上，因此以減毒沙門氏菌用于腫瘤治療具有十分看好的應(yīng)用前景。
癌基因Stat3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Signal Transducer and Activator ofTranscription，STAT)家族的重要成員，Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。研究表明人前列腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞中Stat3以及其下游基因，如Survivin、cyclin D1、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL以及Mcl-1和VEGF等，常顯示異常表達(dá)或活性增強(qiáng)，與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而Stat3的活化是這種調(diào)控異常的關(guān)鍵一環(huán)。阻斷腫瘤細(xì)胞中癌基因Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能起到治療腫瘤的作用。
RNA干涉(RNA interference)是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，小干涉RNA(small orshort inference RNA/siRNA)能觸發(fā)某種轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控程序，識別有同源序列的mRNA，對其產(chǎn)生特異性切割，從而阻斷其翻譯功能。但是在哺乳動物細(xì)胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達(dá)，尤其是異常高表達(dá)的基因。所以仍然需要尋求更好的治療方案以加強(qiáng)療效。
細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子GRIM-19是Grim(gene associated with retinoid-IFN-inducedmortality)家族成員之一，其過度表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。GRIM-19是Stat3的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能與Stat3的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Transactivation Domain/TAD)結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，因為下調(diào)Stat3下游抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄可能會進(jìn)一步損傷線粒體，使位于線粒體復(fù)合物I的GRIM-19大量釋放入胞漿，從而加大凋亡的反應(yīng)進(jìn)程。
我們的前期工作已經(jīng)成功建立了一種用于治療前列腺癌及黑色素瘤的重組質(zhì)粒，并申報了專利，專利申請?zhí)朇N200510017056.9；公開號CN1730658，目前以減毒沙門氏菌攜帶siRNA-Stat3，siRNA-Survivin及共表達(dá)siRNA-Stat3及GRIM-19的pGRIM-19-Si-Stat3重組質(zhì)粒進(jìn)行多種腫瘤治療，在國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供減毒鼠沙門氏菌作為運載體攜帶Stat3及Survivin的特異性siRNA，聯(lián)合對Stat3呈現(xiàn)拮抗作用的GRIM-19基因共表達(dá)系統(tǒng)及其制備方法，以及其在進(jìn)行基因治療中的應(yīng)用，在對多種腫瘤的治療過程取得了顯著效果，如前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、喉癌、乳腺癌及黑色素瘤等，同時探討了以減毒沙門氏菌為共表達(dá)質(zhì)粒運載體進(jìn)行深部腫瘤的綜合靶向治療，同時對轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生表現(xiàn)出顯著的預(yù)防和抑制作用。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一、構(gòu)建共表達(dá)siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3質(zhì)粒。
1.1pSH1Si-Stat3載體的構(gòu)建1.1.1Stat3 siRNA模板寡核苷酸的設(shè)計根據(jù)genebank(NM 31500)人Stat3基因mRNA的已知序列，確定合適的靶位點(2143-2162)，寡核苷酸鏈序列為GCAGCAGCTGAACAACATG，合成編碼siRNA的DNA模板正義鏈5’GATCCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTGGAAA3’反義鏈5’AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGCG3′稀釋寡核苷酸至終濃度1μg/μl；1.1.2Stat3 siRNA模板寡核苷酸退火1.1.3連接連接退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸到線性化的pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。篩選陽性重組克隆。
1.1.4重組質(zhì)粒的鑒定將pSilencerTMneo 3.1-H1-Stat3 siRNA質(zhì)粒(以下簡稱pSH1Si-Stat3)用限制性內(nèi)切酶(BamH I、Hind III)進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件如下質(zhì)粒8μl；BamH I 1μl；HindIII 1μl；10×H Buffer 2μl；ddH2O 8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，釋放出目的片段的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒。
陽性克隆經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司自動測序儀進(jìn)行cDNA序列測定。
1.2pcDNA3.1-GRIM-19表達(dá)載體的構(gòu)建1.2.1引物設(shè)計根據(jù)Genebank AF286697號編碼GRIM19全長序列由軟件設(shè)計引物
P15’-GAGAATTCATGGCGGCGTCAAAGG-3’(EcoR I)P25’-GAAAGCTTCAGGGCCTACGTGTACCACAT-3’(Hind III).
1.2.2擴(kuò)增人GRIM-19全長序列以正常人胎盤組織為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增人GRIM-19全長序列反應(yīng)循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，62℃45Sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。
PCR產(chǎn)物電泳，用QIAquick Gel Extration Kit進(jìn)行回收。
1.2.3pMD18-T-GRIM-19重組質(zhì)粒制備于0.5ml Ep管中，加入下述試劑回收DNA片段4.5μl；pMD18-T vector 0.5μl(片段量∶載體量＝3～8∶1)；solution I 5μl；將其混勻后，于16℃水浴過夜。轉(zhuǎn)化，鑒定并測序。
1.2.4連接反應(yīng)用KpnI和EcoRI分別酶切pMD18-T-GRIM-19重組質(zhì)粒及pcDNA3.1載體，進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-GRIM-19重組質(zhì)粒(以下略稱為pGRIM-19)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有Amp的培養(yǎng)板篩選陽性克隆。
1.2.5重組質(zhì)粒的鑒定從培養(yǎng)板中挑取單一菌落，提取質(zhì)粒。用KpnI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定。
1.3共表達(dá)siRNA-Stat3及GRIM-19基因p GRIM-19-Si-Stat3真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.3.1引物設(shè)計依據(jù)引物設(shè)計原則，參照pcDNA3.1圖譜設(shè)計引物P3和P4，并在其上下游分別引入Bgl II和Nru I酶切位點長度為213bp。
P35′CGAGATCTGAATTCATATTTGCATGTCGCTATG3’P45′TCGCGAAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 3′1.3.2擴(kuò)增H1啟動子及siRNA-Stat3序列以pSH1Si-Stat3載體為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增H1啟動子及siRNA-Stat3序列反應(yīng)循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，55℃45Sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳，特異帶QIAquick Gel Extration Kit回收。與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并測序。
1.3.3連接反應(yīng)用Bgl II和Nru I分別酶切pMD18-T-H1 Si-Stat3重組質(zhì)粒，pcDNA3.1質(zhì)粒及pcDNA3.1-GRIM-19重組質(zhì)粒，并進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-H1Si-Stat3重組質(zhì)粒(以下略稱為pH1Si-Stat3)及pcDNA3.1-H1-Stat3-GRIM-19(以下略稱為pGRIM-19-Si-Stat3)重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有Amp的培養(yǎng)板篩選陽性克隆。
1.3.4鑒定從培養(yǎng)板中挑取單一菌落，提取質(zhì)粒。
①用Bgl II和Nru I進(jìn)行雙酶切鑒定。
②用Kpn I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定。
二.將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌2.1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備用槍頭挑取單克隆減毒沙門氏菌菌落，投入盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。(同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照)37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個小時。第二天，以1∶100的比例將這5ml菌液倒入500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，振搖2-3h，每半小時測一次OD值，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到100ml預(yù)冷的離心管中，4℃，4200rpm離心10min。棄上清，離心管中加入1mmol/L冰預(yù)冷的HEPES(pH7.0)1ml，使沉淀重懸后，再加入1mmol/L冰預(yù)冷的HEPES(pH7.0)49ml，4℃，4200rpm離心10min。重復(fù)2次。棄上清，往離心杯中加入少量10％甘油(滅菌，預(yù)冷)，重懸菌體，再加滿10％甘油，4℃，4200rpm，離心10min。棄上清，每個離心管中加入500μl 10％的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液在冰上以300μl/管分裝于1.5ml的離心管中，投入液氮1min，-80℃保存。
2.2電轉(zhuǎn)化步驟取1μl純化后的重組質(zhì)粒于1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。將100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.5kV，25μF，200Ω。將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部；將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的LB液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。37℃，250rpm復(fù)蘇1h。取20ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160μl LB涂板，7℃過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1∶1的30％的甘油后混勻-80℃保存。
本發(fā)明技術(shù)方案主要創(chuàng)新點1，本研究成功構(gòu)建pH1Si-Stat3，pGRIM-19及可同時表達(dá)GRIM-19和siRNA-Stat3的共表達(dá)的pGRIM-19-Si-Stat3重組質(zhì)粒。
2.體內(nèi)實驗證明GRIM-19和siRNA-Stat3的共表達(dá)可以起到很好的協(xié)同作用抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。
3.減毒沙門氏菌具有噬腫瘤特性，在腫瘤組織中繁殖的特異性與正常組織相比可超過1000倍以上，1以減毒沙門氏菌攜帶可表達(dá)siRNA-Stat3，GRIM19可運載效應(yīng)質(zhì)粒到達(dá)深部腫瘤并可起到顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，并且能夠明顯延長小鼠的生存時間。
本發(fā)明優(yōu)點及有益效果是癌基因Stat3是轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子家族的重要成員，在很多人及鼠的惡性腫瘤中如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、多發(fā)性黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等有Stat3的過度激活及表達(dá)，活化的Stat3對腫瘤細(xì)胞的形成、生長、凋亡抑制等過程起著重要的調(diào)控作用，提示其調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此阻斷腫瘤細(xì)胞中癌基因Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能起到治療腫瘤的作用。
我們的前期工作表明，雖然siRNA-Stat3可以顯著下調(diào)Stat3基因的表達(dá)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)對腫瘤細(xì)胞的抑制效果，但是在哺乳動物細(xì)胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達(dá)，尤其是異常高表達(dá)的基因。為進(jìn)一步尋找最佳腫瘤治療模式，我們選擇聯(lián)合基因治療手段，即在對Stat3進(jìn)行RNA沉默的基礎(chǔ)上，增加了GRIM-19基因的聯(lián)合表達(dá)。
GRIM-19基因(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19)是Grim家族成員之一，它是一種由IFN-β聯(lián)合RA(Retinoic acid/維甲酸)誘導(dǎo)表達(dá)的新的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子。GRIM-19是一種16-kDa的蛋白，分布在細(xì)胞核和胞漿中，廣泛表達(dá)于大多數(shù)組織，Zhang等采用酵母雙雜交文庫篩選法證實了GRIM-19可結(jié)合于原癌基因Stat3并阻抑依賴Stat3的基因表達(dá)，推測Stat3的TAD可能是GRIM-19結(jié)合的直接位點，與Stat3綁定，形成點狀密集結(jié)構(gòu)共定位于核周，從而抑制Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，因此GRIM-19是Stat3的活性抑制物，有人將GRIM-19列入為抗癌基因系列。GRIM-19與Stat3結(jié)合，并下調(diào)這些抗凋亡蛋白與其它前凋亡調(diào)節(jié)子的結(jié)合可能會進(jìn)一步損傷線粒體，導(dǎo)致氧化磷酸化的中斷，從而加大凋亡的反應(yīng)進(jìn)程。研究證實在某些腫瘤組織中GRIM-19表達(dá)抑制或表達(dá)缺失，而在相鄰的正常組織中GRIM-19表達(dá)卻正常。顯示GRIM-19可能為維持正常組織或抑制癌癥發(fā)生所必須。本研究應(yīng)用共表達(dá)si-Stat3及GRIM-19基因真核重組質(zhì)粒，既以RNAi下調(diào)Stat3表達(dá)，同時提供外源性GRIM-19，以期增強(qiáng)抑制前列腺癌的治療目的。
目前，腫瘤基因治療的主要障礙之一是如何把抗腫瘤因子或其他治療藥物傳遞到腫瘤組織內(nèi)，特別是深部腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，而不傷害正常組織。許多報告指出沙門氏菌能在腫瘤組織中繁殖的特異性與正常組織相比可超過1000-10000倍以上，因此以減毒沙門氏菌用于腫瘤治療具有十分看好的應(yīng)用前景。以減毒沙門氏菌直接用于腫瘤治療，以其為運載體運載抗腫瘤藥物或腫瘤拮抗因子的研究不斷增多，但至今沒有以沙門氏菌運載特異性siRNA表達(dá)載體，并以腫瘤為靶向進(jìn)行RNA沉默的研究報導(dǎo)。我們首次以減毒鼠傷寒沙門氏菌為siRNA-Stat3運載體，并聯(lián)合Stat3拮抗基因GRIM-19，以期實現(xiàn)特異性腫瘤的綜合靶向治療。
本發(fā)明通過前列腺癌原位組織塊移植模型等多種腫瘤模型，模擬了從原發(fā)灶產(chǎn)生，到轉(zhuǎn)移灶形成的完整的前列腺癌轉(zhuǎn)移的病理生理過程，并且采用了減毒鼠沙門氏菌作為運載體進(jìn)行基因治療，對前列腺癌的治療取得了顯著效果。經(jīng)組織細(xì)菌克隆形成試驗和熒光顯微鏡觀察，減毒鼠沙門氏菌表現(xiàn)出優(yōu)先在腫瘤組織中聚集和復(fù)制的特性。以下一些因素可能對減毒沙門氏菌優(yōu)先在腫瘤組織中復(fù)制給予解釋(1)低氧環(huán)境不僅允許兼性厭氧菌生長，而且可以侵入并最后殺傷巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，同時進(jìn)入到巨噬細(xì)胞內(nèi)的傷寒菌又更容易隨巨噬細(xì)胞侵入到腫瘤組織內(nèi)繁殖；(2)腫瘤細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)豐富，快速生長的腫瘤組織內(nèi)容易形成低氧區(qū)和腫瘤壞死區(qū)，使腫瘤組織內(nèi)環(huán)境與正常組織不同；(3)最近研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面存在補(bǔ)體抑制因子，此外，不規(guī)則的血管分布和腫瘤內(nèi)的壓力阻止抗體和裂解沙門氏菌的補(bǔ)體滲透，腫瘤組織中很少發(fā)現(xiàn)有中性粒細(xì)胞，這主要是因為腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子β(TNFβ)或其他免疫抑制因子，從而使中性粒細(xì)胞的激活和浸潤受到抑制，因此沙門氏菌在腫瘤組織中找到一個安全的定居所；(4)由于沙門氏菌的兼性厭氧特性使其既能在有一定氧含量的小轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞內(nèi)定居，也能在較大瘤組織內(nèi)深度缺氧的中心進(jìn)行定居，并呈現(xiàn)出溶解與殺傷腫瘤組織的功能；(5)有報告指出，敲除沙門氏菌基因組中的致病島2(SPI2)可使細(xì)菌喪失抗腫瘤的活性，已知SPI2是沙門氏菌在宿主內(nèi)生長、在巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)存活所必需；(6)有報告指出當(dāng)沙門氏菌侵襲巨噬細(xì)胞以后本身亦能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是使所攜帶外源基因釋放的機(jī)制之一。
本發(fā)明首次應(yīng)用減毒沙門氏菌攜帶Stat3或Survivin特異性siRNA，聯(lián)合對Stat3呈現(xiàn)拮抗作用的GRIM-19基因共表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行了抗多種腫瘤的體內(nèi)外研究。以腫瘤局部注射或小鼠尾靜脈注射Stat3序列特異性siRNA與GRIM-19聯(lián)合表達(dá)載體系統(tǒng)有明顯的協(xié)調(diào)治療作用。結(jié)果表明減毒沙門氏菌具有噬腫瘤特性，在腫瘤組織中繁殖的特異性與正常組織相比可超過1000倍以上，15天后在正常組織中表達(dá)量明顯降低，并且該系統(tǒng)對實驗性腫瘤具有顯著的治療效果，可以延長小鼠的生存時間。


圖1共表達(dá)質(zhì)粒pGRIM-19-Si-Stat3構(gòu)建過程；
圖2(A)pSH1Si-Stat3表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；圖2(B)以pCXN2mycAGRIM-19表達(dá)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GRIM-19全長；圖2(C)KpnI和EcoRI雙酶切鑒定pMD18-T-GRIM-19質(zhì)粒；圖2(D)KpnI和EcoRI雙酶切鑒定pGRIM-19重組質(zhì)粒；圖2(E)以pH1Si-Stat3質(zhì)粒為模板擴(kuò)增H1啟動子和Si-Stat3片斷；圖2(F)Bgl II和NruI雙酶切鑒定pMD18-T-H1Si-Stat3質(zhì)粒；圖2(G)pH1Si-Stat3重組質(zhì)粒及pGRIM-19-Si-Stat3重組質(zhì)粒的鑒定圖3(A)細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示pGRIM-19-Si-Stat3組GRIM-19表達(dá)增強(qiáng)；圖3(B)細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示Stat3表達(dá)減弱。
圖4MTT實驗檢測各組質(zhì)粒對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制圖5Annexin V-CY3凋亡試劑盒檢測共表達(dá)pGRIM-19-Si-Stat3質(zhì)?？梢哉T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；圖6細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的分布分析(A)Amp平板計數(shù)，腫瘤組織細(xì)菌分布與其余臟器相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(B)熒光顯微鏡下觀察冰凍切片，腫瘤組織內(nèi)有大量的綠色熒光顆粒；其余臟器僅見極少的綠色熒光圖7.共表達(dá)質(zhì)粒對裸鼠前列腺癌腫瘤具有生長抑制作用圖8共表達(dá)質(zhì)粒對裸鼠喉癌腫瘤具有生長抑制作用圖9共表達(dá)質(zhì)粒對裸鼠乳腺癌腫瘤具有生長抑制作用圖10共表達(dá)質(zhì)粒對裸鼠肺癌腫瘤具有生長抑制作用圖11.裸鼠前列腺癌腫瘤生長曲線圖12減毒沙門氏菌攜帶重組質(zhì)粒對小鼠原位腫瘤具有生長抑制作用圖13減毒沙門氏菌攜帶重組質(zhì)粒對小鼠前列腺癌原位腫瘤具有生長抑制作用圖14前列腺癌原位腫瘤轉(zhuǎn)移部位圖15酶譜分析表明共表達(dá)質(zhì)粒組MMP-2的表達(dá)量降低圖16轉(zhuǎn)染后腫瘤組織Stat3和GRIM-19基因表達(dá)分析圖17轉(zhuǎn)染后腫瘤組織Stat3和GRIM-19蛋白表達(dá)分析圖18轉(zhuǎn)染后腫瘤組織Stat3下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析圖19TUNEL試劑盒檢測腫瘤組織凋亡具體實施方式
一、材料1.主要試劑T4DNA連接酶購自美國Promega公司；BamH I，Hind III，Nru I，Kpn I等內(nèi)切酶購自大連寶生物工程公司；DNA purification system Wizard plus SVMinipreps購自美國Promega公司；胰化蛋白胨及酵母提取物購自O(shè)XOID公司；瓊脂糖及瓊脂粉購自大連寶生物工程公司；DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程公司；DNA Marker DL2000，1Kb Ladder DNA marker均為Takara公司產(chǎn)品。引物合成及測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。溴化乙錠、瓊脂糖、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、MTT、DTT、DMSO、PI、PMSF購自美國Sigma公司；氨芐青霉素、卡那霉素購自北京鼎國公司；DEPC購自德國Merk公司；高保真Taq DNA聚合酶、DAB、Triton X-100、dNTP、MMV逆轉(zhuǎn)錄酶及質(zhì)粒提取和純化試劑盒購自Promega公司；RNA酶及蛋白酶K購于美國Ambion公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室及matrigel為美國BD生物科學(xué)公司產(chǎn)品；Lipofetion2000及Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；胰酶、IMDM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季青公司；Annexin V-CY3凋亡試劑盒購自SIGMA公司；其它常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。
2.主要儀器PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp，美國)；超凈工作臺(YZ-875蘇州凈化設(shè)備廠)；自動高壓蒸氣消毒器(SONY，日本)；低溫冰箱(-80℃SANYO，日本)；恒溫水浴箱(江蘇常州國華儀器廠)；高速低溫離心機(jī)(TOMY GRX-220，日本)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實驗儀器總廠)；電子天平(OHAUS，美國)；電泳儀(Bio-rad，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；全自動顯微鏡數(shù)碼攝像系統(tǒng)(OLYMPUS，日本)；酶標(biāo)儀(TAKARA，日本)；熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)；流式細(xì)胞儀(COμLTER，美國)；去離子水裝置(日本)；PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp，美國)；可見、紫外分光光度計及分析工作站(島津Shimadazi，日本)；加樣器(JECONS，芬蘭)；自動CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-rad，美國)。
3.質(zhì)粒和菌株pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表達(dá)載體購自Ambion公司。帶有U6啟動子及GFP的質(zhì)粒pGCsilencerTMU6/Neo/GFP購自上海吉凱化學(xué)公司。減毒沙門氏菌購自美國Bema生物公司。PMD-18T vector購自寶泰克公司。pcDNA3.1表達(dá)載體及大腸桿菌JM109購自美國Invitrogen公司。
4.細(xì)胞株人激素非依賴性高轉(zhuǎn)移前列腺癌PC-3M細(xì)胞株，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，人喉癌HEP-2細(xì)胞株，人肺癌A549細(xì)胞株，人黑色素瘤A375細(xì)胞株，人肝癌Bel-7402細(xì)胞株，購自美國ATCC公司。小鼠前列腺癌RM-1細(xì)胞株，購自上海細(xì)胞所。各細(xì)胞株用含10％新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液在37℃、5％CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，以0.25％胰酶消化傳代。
5.實驗動物實驗動物均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。BALB/C nu/nu雄性裸鼠，150只，4～6周齡，體重18～20g，飼養(yǎng)于恒定溫度(22-25℃)、恒定濕度(40％-50％)的SPF層流室中，經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動物自由食用。C57BL6雄性近交系小鼠50只，鼠齡8周，體重18～20g，飼養(yǎng)環(huán)境恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體，定期更換墊料，清潔飲用水及飼料供小鼠自由攝入。
二、方法一、構(gòu)建共表達(dá)siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3質(zhì)粒。
1.1pSH1Si-Stat3載體的構(gòu)建1.1.1Stat3 siRNA模板寡核苷酸的設(shè)計根據(jù)genebank(NM 31500)人Stat3基因mRNA的已知序列，根據(jù)本研究室前期工作，確定合適的靶位點(2143-2162)，寡核苷酸鏈序列為GCAGCAGCTGAACAACATG，合成編碼siRNA的DNA模板正義鏈5’GATCCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTGGAAA3’反義鏈5’AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGCG3′稀釋寡核苷酸至終濃度1μg/μl。
1.1.2Stat3 siRNA模板寡核苷酸退火2μl正義siRNA模板寡核苷酸，2μl反義siRNA模板寡核苷酸，46μl 1×DNA退火溶液；加熱混合物至90℃3分鐘，冷卻至37℃，孵化1小時。
1.1.3連接連接退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸到線性化的pSilenceTMneo 3.1-H1siRNA表達(dá)載體。用45μl去核酸酶水稀釋5μl退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸，終濃度為8μg/μl；建立10μl連接反應(yīng)體系設(shè)1個陰性對照，4℃過夜。反應(yīng)體系如下稀釋退火的siRNA模板寡核苷酸1μl；去核酸酶水6μl；10×T4DNA連接酶緩沖液1μl；pSilencerTMneo 3.1-H1siRNA載體1μl；T4DNA連接酶(5U/μl)1μl。
1.1.4連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.1.4.1大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備將宿主菌JM109接種于LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜。次日，從LB平板上挑取單菌落，接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1∶50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600達(dá)0.45-0.55。冰浴菌液10分鐘，4000g離心10min收集50ml菌體。10ml冰預(yù)冷0.1M CaCl2重懸。2ml冰預(yù)冷0.1M CaCl2重懸沉淀，置于4℃，16h后取100μl用于轉(zhuǎn)化試驗，或加入甘油至終濃度10％，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.1.4.2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)細(xì)胞加入連接反應(yīng)物1μl，混勻后冰浴30min。42℃水浴90s，然后迅速移入冰浴中放置2min。向管中加入LB液體培養(yǎng)基800μl，37℃溫和震蕩培養(yǎng)1h。用無菌彎頭玻璃鋪菌器將200μl菌液鋪于含Amp的LB平板(50μg/mL)表面，待表面液體吸收后，倒置平皿37℃培養(yǎng)16-20h。
1.1.5陽性重組克隆的篩選(堿裂解法)挑取生長于選擇培養(yǎng)板的單菌落，加到含氨芐青霉素(100μg/mL)的5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法小量制備質(zhì)粒，過程如下將1.5ml培養(yǎng)物倒入Ep管中，7000g離心數(shù)秒，吸去培養(yǎng)液，重復(fù)前一步驟，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。將細(xì)菌沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液solution I(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris.Cl pH 8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)中，劇烈震蕩，室溫放置5min。加200μl新配制的溶液solution II(0.2mol/L NaOH、1％SDS)，蓋緊管口，快速顛倒離心管數(shù)次，以混合內(nèi)容物，然后將離心管放置于冰上5min。加冰預(yù)冷的溶液solutionIII(5mol/L乙酸鉀，11.5ml冰乙酸，28.5ml ddH2O)，蓋緊管口，顛倒離心管20sec，將管置于冰上5min。12000g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一Ep管中，加等量酚∶氯仿(25∶24)，振蕩混勻，4℃12，000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移至另一Ep管中。加兩倍體積的乙醇，振蕩混合，于室溫放置2min。離心15min，棄上清，再加70％乙醇1ml以洗滌雙鏈DNA，離心10min，棄上清，室溫干燥沉淀，然后加含RNA酶的ddH2O(20μg/ml)30μl重新溶解核酸沉淀。
1.1.6重組質(zhì)粒的鑒定將pSilencerTMneo 3.1-H1-Stat3 siRNA質(zhì)粒(以下簡稱pSH1Si-Stat3)用限制性內(nèi)切酶(BamH I、Hind III)進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件如下質(zhì)粒8μl；BamH I 1μl；HindIII 1μl；10×H Buffer 2μl；ddH2O 8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，釋放出目的片段的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒。
陽性克隆經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司自動測序儀進(jìn)行cDNA序列測定。
1.2pcDNA3.1-GRIM-19表達(dá)載體的構(gòu)建1.2.1引物設(shè)計根據(jù)Genebank AF286697號編碼GRIM19全長序列由軟件設(shè)計引物P15’-GAGAATTCATGGCGGCGTCAAAGG-3’(EcoR I)P25’-GAAAGCTTCAGGGCCTACGTGTACCACAT-3’(Hind III).
1.2.2擴(kuò)增人GRIM-19全長序列以正常人胎盤組織為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增人GRIM-19全長序列反應(yīng)循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，62℃45Sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。
PCR產(chǎn)物電泳，用QIAquick Gel Extration Kit進(jìn)行回收用手術(shù)刀片從瓊脂糖凝膠中切下含DNA片段的凝膠，放入Ep管中，將其搗碎；向管內(nèi)加入相當(dāng)于凝膠體積三倍的溶膠液，50℃水浴10min，其間輕彈Ep管壁數(shù)次，使凝膠完全溶化；將融化了的膠加入回收柱中，13000rpm離心，1min；向柱中再次加入750μl溶膠液，13000rpm離心1min，棄溶膠液；向柱中加入500μl PE溶液，13000rpm離心1min，棄去PE；再次13000rpm離心1min，棄去殘余的PE，室溫干燥10min；向柱中加入30μl無菌水，室溫放置10min，充分溶解DNA；13000rpm離心1min，得到30μl DNA溶液；取一部分回收的DNA在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，以驗證回收效率。
1.2.3pMD18-T-GRIM-19重組質(zhì)粒制備于0.5ml Ep管中，加入下述試劑回收DNA片段4.5μl；pMD18-T vector 0.5μl(片段量∶載體量＝3～8∶1)；solution I 5μl；將其混勻后，于16℃水浴過夜。轉(zhuǎn)化，鑒定并測序。
1.2.4連接反應(yīng)用KpnI和EcoRI分別酶切pMD18-T-GRIM-19重組質(zhì)粒及pcDNA3.1載體，進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-GRIM-19重組質(zhì)粒(以下略稱為pGRIM-19)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有Amp的培養(yǎng)板篩選陽性克隆。
1.2.5重組質(zhì)粒的鑒定從培養(yǎng)板中挑取單一菌落，提取質(zhì)粒。用KpnI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定。1.3共表達(dá)siRNA-Stat3及GRIM-19基因真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.3.1引物設(shè)計依據(jù)引物設(shè)計原則，參照pcDNA3.1圖譜設(shè)計引物P3和P4，并在其上下游分別引入Bgl II和Nru I酶切位點長度為213bp。
P35′CGAGATCTGAATTCATATTTGCATGTCGCTATG3’P45′TCGCGAAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 3′1.3.2擴(kuò)增H1啟動子及siRNA-Stat3序列以pH1Si-Stat3載體為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增H1啟動子及siRNA-Stat3序列反應(yīng)循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，55℃45Sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳，特異帶QIAquick Gel Extration Kit回收。與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并測序。
1.3.3連接反應(yīng)用Bgl II和Nru I分別酶切pMD18-T-H1Si-Stat3重組質(zhì)粒，pcDNA3.1質(zhì)粒及pcDNA3.1-GRIM-19重組質(zhì)粒，并進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-H1Si-Stat3重組質(zhì)粒(以下略稱為pH1Si-Stat3)及pcDNA3.1-H1-Stat3-GRIM-19(以下略稱為pGRIM-19-Si-Stat3)重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有Amp的培養(yǎng)板篩選陽性克隆。
1.3.4鑒定從培養(yǎng)板中挑取單一菌落，提取質(zhì)粒。
①用Bgl II和Nru I進(jìn)行雙酶切鑒定。
②用Kpn I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定。
二.將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌2.1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備用槍頭挑取單克隆減毒沙門氏菌菌落，投入盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。(同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照)37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個小時。第二天，以1∶100的比例將這5ml菌液倒入500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，振搖2-3h，每半小時測一次OD值，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到100ml預(yù)冷的離心管中，4℃，4200rpm離心10min。棄上清，離心管中加入1mmol/L冰預(yù)冷的HEPES(pH7.0)1ml，使沉淀重懸后，再加入1mmol/L冰預(yù)冷的HEPES(pH7.0)49ml，4℃，4200rpm離心10min。重復(fù)2次。棄上清，往離心杯中加入少量10％甘油(滅菌，預(yù)冷)，重懸菌體，再加滿10％甘油，4℃，4200rpm，離心10min。棄上清，每個離心管中加入500μl 10％的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液在冰上以300μl/管分裝于1.5ml的離心管中，投入液氮1min，-80℃保存。
2.2電轉(zhuǎn)化步驟取1μl純化后的重組質(zhì)粒于1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。將100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.5kV，25μF，200Ω。將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部；將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的LB液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。37℃，250rpm復(fù)蘇1h。取20ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160μl LB涂板，7℃過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1∶1的30％的甘油后混勻-80℃保存。
3.體外研究應(yīng)用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染PC-3M，RM-1細(xì)胞株，MCF-7細(xì)胞株，HEP-2細(xì)胞株，A549細(xì)胞株，Bel-7402細(xì)胞株，A375細(xì)胞株；應(yīng)用半定量RT-PCR，免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot檢測重組質(zhì)粒及相關(guān)基因的基因及蛋白水平的表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡峰；應(yīng)用Annexin V-CY3凋亡試劑盒檢測細(xì)胞早期凋亡；建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGC-Si-Stat3質(zhì)粒的細(xì)胞系，應(yīng)用酶譜分析檢測細(xì)胞MMP-2的表達(dá)；應(yīng)用Transwell小室侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力。
4.體內(nèi)實驗復(fù)制裸鼠移植前列腺癌模型，乳腺癌模型，喉癌模型，肝癌模型，肺癌模型及黑色素瘤模型并應(yīng)用顯微外科技術(shù)建立小鼠前列腺癌原位組織塊移植模型，應(yīng)用減毒沙門氏菌局部注射或尾靜脈注射將重組質(zhì)粒帶入瘤體內(nèi)觀察抑瘤作用；應(yīng)用TUNEL試劑盒檢測腫瘤細(xì)胞凋亡；應(yīng)用Northen blot和Western blot檢測相關(guān)基因的基因與蛋白水平的表達(dá)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Stat3、GRIM-19及Ki-67的表達(dá)；應(yīng)用酶譜分析檢測組織MMP-2的表達(dá)。
4.1裸鼠腫瘤移植瘤模型的建立將腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，經(jīng)離心，將細(xì)胞團(tuán)塊用IMDM培養(yǎng)液吹散，經(jīng)臺盼藍(lán)實驗證實細(xì)胞活力≥95％，最終細(xì)胞濃度為2×107個/ml，取瘤細(xì)胞2×106個(0.1ml)接種于裸鼠左側(cè)背部近前肢皮下組織內(nèi)。隔天用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，待移植瘤長至直徑5mm時將裸鼠隨機(jī)分組進(jìn)行實驗。
4.1.1治療過程每組5只裸鼠，分為5組，分組如下mock組，pH1Si-Scramble組，pH1Si-Stat3組，pGRIM-19組，pGRIM-19-Si-Stat3組。每組腫瘤局部注射攜帶相應(yīng)組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌，分2點注射，每點50μl，細(xì)菌濃度為109cfu/100μl。
4.1.2治療效果觀察指標(biāo)4.1.2.1全身情況觀察實驗動物的活動、進(jìn)食和體重。
4.1.2.2腫瘤體積的變化治療后隔天一次用精密卡尺測量腫瘤最大長徑和短徑，計算腫瘤體積。體積＝0.52×長徑×短徑2。
4.1.2.3病理學(xué)檢查接種后當(dāng)對照組腫瘤長至足夠大時統(tǒng)一拉頸處死所有小鼠切除腫塊稱重，分別行病理學(xué)檢查(10％甲醛固定后，HE染色)。Stat3、GRIM-19、Ki67免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判定以在腫瘤細(xì)胞胞漿或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性。
4.1.3腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL檢測)4.1.4腫瘤組織基因及蛋白質(zhì)水平檢測提取腫瘤組織RNA及蛋白，半定量PCR分析Stat3、GRIM-19在基因水平的表達(dá)，Western blotting分析Stat3、GRIM-19在蛋白水平的表達(dá)。
4.2原位移植瘤建立4.2.1小鼠背部皮下移植瘤模型的建立C57BL6近交系小鼠10只，用強(qiáng)力碘消毒小鼠背部，取鼠源性腫瘤細(xì)胞溶液接種于小鼠背部皮下，接種細(xì)胞濃度為2×107個/ml，每只接種100μl。隔日觀察腫瘤生長情況。
4.2.2小鼠前列腺癌原位移植瘤模型及肝癌原位移植瘤模型的建立用于外科原位移植(SOI)的腫瘤組織來源于上述鼠背皮下腫瘤模型。狀態(tài)較好的腫瘤組織靠近外周，色白有光澤，質(zhì)韌有彈性，不易破碎。將取出的瘤塊置于低溫、無菌的0.9％生理鹽水中，在10倍顯微鏡下切割成直徑1.5mm大小的腫瘤塊。C57BL6近交系小鼠用戊巴比妥鈉(60mg/Kg)麻醉，取仰臥位，強(qiáng)力碘常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾。下腹部正中切口長約1.5-2.0cm，顯露腹腔。將膀胱向上提起，并用無菌棉簽抵住膀胱腹側(cè)壁，暴露腹側(cè)前列腺。鏡下剝離前列腺腹側(cè)筋膜，用尖刀分離兩腹側(cè)葉，將腫瘤塊置于兩腹側(cè)葉間形成的縫隙中，用9-0可吸收線縫合兩腹側(cè)葉及其表面筋膜，使腫瘤塊被嚴(yán)密包埋?；謴?fù)臟器原來的解剖位置，用5-0腸線全層連續(xù)縫合關(guān)腹，待鼠蘇醒后回籠。術(shù)中操作要求輕柔、準(zhǔn)確，避免損傷正常組織和腫瘤組織。
4.2.3實驗動物分組每種腫瘤共有40只C57BL6小鼠進(jìn)行原位移植。分組同上。
4.2.4腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的評價C57BL6小鼠瀕死或處死時采用過量麻醉方法處死，手術(shù)顯微鏡下觀察原位移植的腫瘤生長情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，取肝、肺、脾、腎、椎體、淋巴結(jié)和可疑的骨骼進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色后光鏡下觀察有無轉(zhuǎn)移灶。
細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果
1.經(jīng)測序及酶切鑒定，成功構(gòu)建了共表達(dá)siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3質(zhì)粒。
1.1pSH1Si-Stat3載體的構(gòu)建用BamH I和Hind III雙酶切pSH1Si-Stat3表達(dá)質(zhì)粒，1.5％瓊脂糖凝膠電泳顯示分別出現(xiàn)66bp和4.3kb的酶切片斷，結(jié)果見圖1。DNA測序結(jié)果證實Si-Stat3和Si-Scramble片段與pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表達(dá)載體連接反應(yīng)正確，結(jié)果見圖2(A)。
1.2pGRIM-19表達(dá)載體的構(gòu)建如圖2(B)，以pCXN2mycA GRIM-19質(zhì)粒為模板作PCR，得到GRIM-19的全長，為435bp。如2(C)所示，將重組質(zhì)粒用KpnI和EcoRI作雙酶切，可得到兩個片段，大片段為載體片段，大小為2692bp；小片段為GRIM-19片段，大小為435bp。測序結(jié)果與Genebank(NM_015965)序列完全一致，同時兩端已成功地加入了限制性酶切位點。
將重組質(zhì)粒用KpnI和EcoRI作雙酶切，可得到兩個片段，大片段為載體片段，大小為5428bp；小片段為GRIM-19片段，大小為435bp，結(jié)果見圖2(D)。
1.3pH1Si-Stat3表達(dá)載體的構(gòu)建以pH1Si-Stat3質(zhì)粒為模板擴(kuò)增H1啟動子和Si-Stat3片斷，所得產(chǎn)物大小為204bp，結(jié)果見圖2(E)。將重組質(zhì)粒用Bgl II和Nru I雙酶切，大片段為載體片段，大小為2692bp；小片段為H1Si-Stat3片段，大小為204bp，結(jié)果見圖2(F)。DNA測序結(jié)果證實H1Si-Stat3片段與pcDNA3.1表達(dá)載體連接反應(yīng)正確。
1.4pH1Si-Stat3重組質(zhì)粒及pGRIM-19-Si-Stat3重組質(zhì)粒的鑒定如圖2(G)所示，將重組質(zhì)粒用Bgl II和Nru I雙酶切，大片段為載體片段，大小分別為5428bp和5860bp；小片段為H1Si-Stat3片段，大小為204bp。將pGRIM-19-Si-Stat3重組質(zhì)粒用KpnI和EcoRI作雙酶切，可得到兩個片段，大片段為載體片段，大小為5428bp；小片段為GRIM-19片段，大小為435bp。
2.體外實驗證明重組質(zhì)粒對腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制及促進(jìn)凋亡的作用。
2.1PC-3M細(xì)胞免疫化學(xué)染色細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果如圖3顯示，pGRIM-19-Si-Stat3組GRIM-19表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞漿、胞核中均可見顆粒樣分布的深淺不一的棕黃色物質(zhì)；pGRIM-19-Si-Stat3組Stat3 mRNA表達(dá)減弱。
2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對PC-3M細(xì)胞的生長抑制作用2.2.1相差顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞貼壁生長，狀況良好，多為梭形，大小適中，核仁清晰，可見核分裂相，細(xì)胞折光性好，細(xì)胞增殖旺盛；pH1Si-Stat3組和pGRIM-19組隨轉(zhuǎn)染時間的延長細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，顆粒增多，細(xì)胞碎片增加；pGRIM-19-Si-Stat3組可見細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)增加，失去原有形態(tài)，細(xì)胞核固縮，裂解成質(zhì)膜包繞的碎片，細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少，部分細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中。
2.2.2MTT實驗檢測各組質(zhì)粒對PC-3M細(xì)胞增殖的抑制如圖4所示，三組重組質(zhì)粒均能顯著性的抑制PC-3M細(xì)胞增殖，抑制率分別為51.7％，42.3％和20.9％，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)；而脂質(zhì)體對照組和pH1Si-Scramble對照組細(xì)胞體外增殖活性無明顯差異(P＞0.05)；共表達(dá)siRNA-Stat3及GRIM-19基因真核重組質(zhì)粒與單用相比抑制作用明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
2.3重組質(zhì)?？烧T導(dǎo)PC-3M細(xì)胞凋亡2.3.1應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-3M細(xì)胞凋亡峰重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PC-3M細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后72h較對照組出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡，(P＜0.01)(表1)，在G1期前出現(xiàn)的亞二倍峰即為凋亡峰。
表1共表達(dá)pGRIM-19-Si-Stat3質(zhì)粒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞周期的影響(#P＜0.05versus pH1Si-Scramble；*P＜0.05versus pH1Si-Scramble)

2.3.2Annexin V-CY3凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡如圖5所示，通過激光共聚焦顯微鏡可見脂質(zhì)體對照組及pH1Si-Scramble組PC-3M細(xì)胞呈均一綠色，表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的PC-3M細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。pGRIM-19，pH1Si-Stat3，pGRIM-19-Si-Stat3轉(zhuǎn)染組呈不同程度的annexin V陽性表達(dá)，凋亡細(xì)胞被AnnCy3與6-CF紅綠兩種熒光標(biāo)記而呈現(xiàn)黃色。
3.體外實驗證明減毒沙門氏菌能夠攜帶重組質(zhì)粒進(jìn)入深部腫瘤組織，并對腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制及促進(jìn)凋亡的作用。
3.1細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的分布無菌狀態(tài)下取腫瘤、脾臟、肝臟和肺臟各100mg，研磨，以冷的PBS 5倍稀釋后，接種到含Amp的LB平皿，37℃過夜，次日計算形成的單個克隆數(shù)(圖6A)。腫瘤組織形成單個克隆數(shù)1890±98.2個；脾臟組織形成10±3.5個；肝臟組織形成8±4.3個；肺臟組織形成2±0.3個。腫瘤與其余臟器相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
取各臟器制成冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察，腫瘤組織內(nèi)有大量的綠色熒光顆粒，代表細(xì)菌的分布；其余臟器僅見極少的綠色熒光(圖6B)。
3.2重組質(zhì)粒對裸鼠腫瘤及小鼠原位腫瘤生長的抑制用PC-3M細(xì)胞接種裸鼠，第12天全部出瘤，平均體積為97.5±11.36mm3，分組治療后，裸鼠平均體重，平均腫瘤重量和體積見表2，腫瘤生長抑制見圖7，腫瘤生長曲線見圖11。共表達(dá)質(zhì)粒組與對照組及單獨應(yīng)用組明顯縮小，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。平均體重未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。喉癌(圖8)，乳腺癌(圖9)，肺癌(圖10)裸鼠皮下移植瘤模型均證明pGRIM-19-Si-Stat3重組質(zhì)粒具有協(xié)同作用，與對照組相比平均腫瘤重量和體積均降低。
表2各組裸鼠平均體重，平均腫瘤重量和體積比較(#P＜0.05versus pH1Si-Scramble；*P＜0.05versus pH1Si-Scramble)

成功建立小鼠前列腺癌原位組織塊移植瘤模型及肝癌模型，并用尾靜脈注射減毒沙門氏菌攜帶重組質(zhì)粒到達(dá)深部腫瘤進(jìn)行治療(圖12，13，表3)，模型組可以發(fā)生各種臟器的轉(zhuǎn)移，很好的模擬了晚期癌癥的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移(圖14)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，轉(zhuǎn)移部位低于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(表4)。
表3各組小鼠平均體重，平均腫瘤重量和體積比較(*P＜0.01versus pH1Si-Scramble)

表4各組小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移部位比較

3.3轉(zhuǎn)染后腫瘤組織MMP-2的表達(dá)分析由酶譜分析表明(圖15)，脂質(zhì)體對照組和pH1Si-Scramble對照組腫瘤組織MMP-2的活性明顯高于pGRIM-19，pH1Si-Stat3及pGRIM-19-Si-Stat3轉(zhuǎn)染組，P＜0.05。并且脂質(zhì)體對照組和pH1Si-Scramble對照組病理學(xué)檢查可見肌肉浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)染組未見轉(zhuǎn)移。
3.4轉(zhuǎn)染后腫瘤組織Stat3和GRIM-19基因表達(dá)分析RT-PCR結(jié)果顯示，pGRIM-19組和pGRIM-19-Si-Stat3組GRIM-19mRNA表達(dá)增強(qiáng)(圖16)；pH1Si-Stat3組和pGRIM-19-Si-Stat3組Stat3 mRNA表達(dá)減弱(圖17)。
3.5轉(zhuǎn)染后腫瘤組織Stat3和GRIM-19蛋白表達(dá)分析圖26顯示W(wǎng)estern blot分析結(jié)果，pGRIM-19組和pGRIM-19-Si-Stat3組GRIM-19蛋白表達(dá)增強(qiáng)；pH1Si-Stat3組和pGRIM-19-Si-Stat3組Stat3蛋白表達(dá)減弱。
3.6轉(zhuǎn)染后腫瘤組織相關(guān)因子蛋白表達(dá)分析Western blot分析結(jié)果顯示(圖18)，pGRIM-19組，pGRIM-19-Si-Stat3組和pGRIM-19-Si-Stat3組Bcl-2，cyclin D1，c-Myc，VEGF蛋白表達(dá)減弱，其中pGRIM-19-Si-Stat3組減弱更明顯。
3.7轉(zhuǎn)染后腫瘤組織細(xì)胞凋亡的檢測用蘇木素-伊紅(HE)染色普通光鏡下觀察pGRIM-19，pH1Si-Stat3及pGRIM-19-Si-Stat3轉(zhuǎn)染組腫瘤組織細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色(凋亡細(xì)胞)，正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。原位細(xì)胞凋亡檢測可見pGRIM-19，pH1Si-Stat3及pGRIM-19-Si-Stat3轉(zhuǎn)染組腫瘤組織細(xì)胞核中有棕黃色顆粒，提示有凋亡細(xì)胞(圖19)。
實施例將本發(fā)明與PDS配制成3×108/ml的溶液，裝入1ml安瓶中。使用時，每人皮下或肌肉注射1ml。
權(quán)利要求
1.一種運載重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌，它是由下列步驟得到的一、構(gòu)建共表達(dá)siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3質(zhì)粒1.1pSH1Si-Stat3載體的構(gòu)建1.1.1Stat3 siRNA模板寡核苷酸的設(shè)計根據(jù)genebank(NM 31500)人Stat3基因mRNA的已知序列，確定合適的靶位點(2143-2162)，寡核苷酸鏈序列為GCAGCAGCTGAACAACATG，合成編碼siRNA的DNA模板正義鏈5’GATCCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTGGAAA3’反義鏈5’AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGCG3′稀釋寡核苷酸至終濃度1μg/μl；1.1.2Stat3 siRNA模板寡核苷酸退火1.1.3連接連接退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸到線性化的pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表達(dá)載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選陽性重組克??；1.1.4重組質(zhì)粒的鑒定將pSilencerTMneo 3.1-H1-Stat3 siRNA質(zhì)粒，簡稱pSH1Si-Stat3，用限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind III進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件如下質(zhì)粒8μl；BamH I 1μl；Hind III 1μl；10×H Buffer 2μl；ddH2O 8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳，釋放出目的片段的質(zhì)粒為陽性重組質(zhì)粒；陽性克隆經(jīng)自動測序儀進(jìn)行cDNA序列測定；1.2pcDNA3.1-GRIM-19表達(dá)載體的構(gòu)建1.2.1引物設(shè)計根據(jù)Genebank AF286697號編碼GRIM19全長序列由軟件設(shè)計引物P15’-GAGAATTCATGGCGGCGTCAAAGG-3’(EcoR I)P25’-GAAAGCTT CAGGGCCTACGTGTACCACAT-3’(Hind III)1.2.2擴(kuò)增人GRIM-19全長序列以正常人胎盤組織為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增人GRIM-19全長序列反應(yīng)循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，62℃45Sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物電泳，用QIAquick Gel Extration Kit進(jìn)行回收；1.2.3pMD18-T-GRIM-19重組質(zhì)粒制備于0.5ml Ep管中，加入下述試劑回收DNA片段4.5μl；pMD18-T vector 0.5μl(片段量∶載體量＝3～8∶1)；solution I 5μl；將其混勻后，于16℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化，鑒定并測序；1.2.4連接反應(yīng)用KpnI和EcoRI分別酶切pMD18-T-GRIM-19重組質(zhì)粒及pcDNA3.1載體，進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-GRIM-19重組質(zhì)粒(以下略稱為pGRIM-19)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有Amp的培養(yǎng)板篩選陽性克??；1.2.5重組質(zhì)粒的鑒定從培養(yǎng)板中挑取單一菌落，提取質(zhì)粒。用KpnI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定；1.3共表達(dá)siRNA-Stat3及GRIM-19基因p GRIM-19-Si-Stat3真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.3.1引物設(shè)計依據(jù)引物設(shè)計原則，參照pcDNA3.1圖譜設(shè)計引物P3和P4，并在其上下游分別引入Bgl II和Nru I酶切位點長度為213bp；P35′CGAGATCTGAATTCATATTTGCATGTCGCTATG3’P45′TCGCGAAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC3′1.3.2擴(kuò)增H1啟動子及siRNA-Stat3序列以pSH1Si-Stat3載體為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增H1啟動子及siRNA-Stat3序列反應(yīng)循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃30Sec，55℃45Sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳，特異帶QIAquick Gel Extration Kit回收，與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并測序；1.3.3連接反應(yīng)用Bgl II和Nru I分別酶切pMD18-T-H1 Si-Stat3重組質(zhì)粒，pcDNA3.1質(zhì)粒及pcDNA3.1-GRIM-19重組質(zhì)粒，并進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1-H1 Si-Stat3重組質(zhì)粒(以下略稱為pH1Si-Stat3)及pcDNA3.1-H1-Stat3-GRIM-19(以下略稱為pGRIM-19-Si-Stat3)重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有Amp的培養(yǎng)板篩選陽性克隆；1.3.4鑒定從培養(yǎng)板中挑取單一菌落，提取質(zhì)粒；①用BglII和Nru I進(jìn)行雙酶切鑒定；②用Kpn I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定；二.將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌2.1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備用槍頭挑取單克隆減毒沙門氏菌菌落，投入盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中；(同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照)37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個小時；第二天，以1∶100的比例將這5ml菌液倒入500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，振搖2-3h，每半小時測一次OD值，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到100ml預(yù)冷的離心管中，4℃，4200rpm離心10min。棄上清，離心管中加入1mmol/L冰預(yù)冷的HEPES(pH7.0)1ml，使沉淀重懸后，再加入1mmol/L冰預(yù)冷的HEPES(pH7.0)49ml，4℃，4200rpm離心10min；重復(fù)2次；棄上清，往離心杯中加入少量10％甘油(滅菌，預(yù)冷)，重懸菌體，再加滿10％甘油，4℃，4200rpm，離心10min。棄上清，每個離心管中加入500μl 10％的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液在冰上以300μl/管分裝于1.5ml的離心管中，投入液氮1min，-80℃保存；2.2電轉(zhuǎn)化步驟取1μl純化后的重組質(zhì)粒于1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷；將100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min；打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.5kV，25μF，200Ω；將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部；將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的LB液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。37℃，250rpm復(fù)蘇1h；取20ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160μl LB涂板，7℃過夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果；其余菌液加1∶1的30％的甘油后混勻-80℃保存。
2.如權(quán)利要求1所述的運載重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌的制備方法。
3.如權(quán)利要求1所述的運載重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的運載重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌，治療的腫瘤包括人前列腺癌細(xì)胞、肺癌、胃癌、喉癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種運載重組質(zhì)粒的減毒沙門氏菌及其在抗腫瘤中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建pH1Si－Stat3，pGRIM－19及可同時表達(dá)GRIM－19和siRNA－Stat3的共表達(dá)的pGRIM－19－Si－Stat3重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌。體內(nèi)實驗證明GRIM－19和siRNA－Stat3的共表達(dá)可以起到很好的協(xié)同作用抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。減毒沙門氏菌具有噬腫瘤特性，在腫瘤組織中繁殖的特異性與正常組織相比可超過1000倍以上，以減毒沙門氏菌攜帶可表達(dá)siRNA－Stat3，GRIM19可運載效應(yīng)質(zhì)粒到達(dá)深部腫瘤并可起到顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，并且能夠明顯延長小鼠的生存時間。
文檔編號A61P35/00GK1974759SQ20061001704
公開日2007年6月6日 申請日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日
發(fā)明者張靈, 趙雪儉, 徐德啟, 高麗芳 申請人:吉林大學(xué)