專利名稱：一種治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物及其制備方法，具體地，是以中藥材野菊花為原料制備而成的眼用藥物組合物及其制備方法，屬藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
結(jié)膜炎是眼科的多發(fā)病，占結(jié)膜病的首位。其病因不外乎微生物性與非微生物性兩大類。就微生物性而言，細菌、病毒、寄生蟲等均可引起結(jié)膜炎癥，而且來源甚為廣泛，可直接來自外界，也可來自自身，而自身感染又可能通過血流或淋巴液轉(zhuǎn)移至結(jié)膜(結(jié)核等)；或由鄰近組織，如眼球本身(角膜、鞏膜)、眼眶、鼻腔與副鼻竇、淚器、周圍的眼瞼皮膚直接蔓延而來。就非微生物病因而言，機械的、物理的(熱、放射、電)、化學的、以至全身過敏狀態(tài)和一些全身代謝性障礙(如風濕、痛風)皆可成為致病因素?？傊?，結(jié)膜炎的病因極其復雜，因此，一般通行的結(jié)膜炎臨床分類也是多種多樣的，有的從病因上分類(如過敏性結(jié)膜炎)，有的則以臨床表現(xiàn)分類，按起病急緩、病程長短又可有急、慢性之分。不同病因有時可有同樣的臨床表現(xiàn)(如各種病因都可造成慢性卡他性結(jié)膜炎)，或同一病因有時又可引起不同的臨床癥狀(如溶血性金黃色葡萄球菌感染時，可表現(xiàn)為急性卡他性結(jié)膜炎或假膜性結(jié)膜炎)，由于上述諸多原因，這就決定結(jié)膜炎的臨床表現(xiàn)常常是多種多樣、錯綜復雜的。本病屬于中醫(yī)“紅眼”、“火眼”、“天行赤眼”、“目中赤痛”等范疇。
目前治療結(jié)膜炎的藥物主要為抗菌藥，然而抗菌藥的副作用很大，如氯霉素會造成再生障礙性貧血和灰嬰綜合癥；紅霉素有很強烈的胃腸道反應等。并且長期使用易產(chǎn)生耐藥性。
野菊花是菊科植物野菊Chrysnathemum indicum的干燥頭狀花序或全草。味苦、性微寒、歸肺、肝經(jīng)。具有清熱解毒之功效，主治癰疽癤疔、瘰疬、眼痛等癥。藥理研究對金黃色葡萄球菌、結(jié)核菌及卡介菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌均有明顯的抑菌作用，水劑對大鼠靜脈注入，對ADP誘導的血小板聚集有明顯的抑制作用。臨床作用對高脂血癥、急性支氣管炎、頸淋巴結(jié)核、流行性腮腺炎、口腔潰瘍、菌痢、腸炎、前列腺炎、盆腔炎、肛竇炎、肛乳頭炎等均有良好療效。(見劉國應，野菊花的藥理研究及臨床應用進展，山東中醫(yī)雜志，1990，9(6)；劉國立，野菊花的藥理研究及臨床應用概況，時珍國藥研究，1991，2(3))目前，野菊花為原料的制劑有口服制劑，野菊花注射液，具有解表解毒。用于外感熱病、目赤腫痛、器喉疼痛；上呼吸道感染、急性扁桃體炎屬熱毒上攻者。沈麗珍，菊花在眼科的臨床應用，中國中醫(yī)眼科雜志，2001，11(2)，報道了菊花(白菊、黃菊、野菊)，治療外眼熱性疾病，如急、慢性結(jié)膜炎，其中野菊花多針對各種化學傷、熱燒傷等熱毒壅盛之疾病，但由于原料成分復雜，不同的藥材提取方法可能產(chǎn)生不同的藥效。雖然野菊花注射劑亦有報道用于眼科疾病，但注射劑與滴眼液的質(zhì)量要求不同，附加劑的選擇不同，針對眼用環(huán)境的特殊性，不能將注射劑直接用于滴眼液，目前尚無野菊花為原料制備眼用制劑的報道，亦沒有形成相關(guān)的產(chǎn)品的報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的解決方案是提供了一種治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了該藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明提供了一種治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物它是由中藥野菊花Chrysanthemum indicum L.的提取物為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的眼用制劑，其中，每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C27H30O16計不低于0.2mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C28H32O14計，不低于0.05mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9應不低于10μg。
由于通過試驗證明，蘆丁、蒙花苷、綠原酸均可作為本發(fā)明野菊花滴眼液的質(zhì)量控制指標，對三種成分中的一種或任意兩種或三種同時測定，均能確保有效的控制藥物制劑質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效的目的。
進一步地，每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C27H30O16計應為0.2～15.0mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C28H32O14計應為0.05～10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9應為10～400μg。所述的每制劑單位是指液體制劑的每ml；固體制劑的每g。
其中，所述的野菊花提取物是由如下方法提取將野菊花加水，二次蒸餾，收集重蒸餾液；藥渣加水煎煮，50％～90％乙醇精制，回收乙醇，與重蒸餾液混合，即為野菊花提取物。
所述的制劑是液體制劑、半固體制劑。
進一步地，其中，所述的半固體制劑是眼膏劑、眼用膜劑、眼用凝膠劑；所述的液體制劑為滴眼液、緩釋滴眼液、眼用即型凝膠劑。
所述的滴眼液是由下述重量配比的原料及輔料制備而成 野菊花1500～500份、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-10份、抑菌劑0-8份、黏度調(diào)整劑0-50份、增溶劑0.2-20份、穩(wěn)定劑0-30份、助溶劑0-50份。
其中，所述的滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、硼酸、硼砂、甘油中的一種或混合；所述的助增溶劑為聚氧乙烯40硬脂酸酯、司盤20或40吐溫80、吐溫20、聚氧乙烯40硬脂酸酯、司盤20或40中的一種或混合；所述的pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉或鉀溶液、枸櫞酸鈉溶液、磷酸鹽緩沖液、硼酸、硼砂、氯化鉀、醋酸、鹽酸溶液中的一種或混合；所述的抑菌劑為苯扎氯銨、苯扎溴銨、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、硝酸苯汞、氧氬化汞、三氯叔丁醇、苯乙醇、洗必泰中的一種或混合；所述的黏度調(diào)整劑為羥丙甲纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、卡波姆中的一種或混合；所述的穩(wěn)定劑為焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、硫代次亞硫酸鈉、抗壞血酸、維生素C、乙二氨四乙酸二鈉、甘油中的一種或混合。
進一步地，所述的滴眼液每1000ml是由下述配比的原料藥材及輔料制備而成 野菊花500～1500g、吐溫80 2～10ml、硼酸4～12g、苯扎氯銨0.01～0.5g余量為注射用水，適量氫氧化鈉調(diào)pH值。
更進一步地，所述的滴眼液每1000ml是由下述配比的原料藥材及輔料制備而成 野菊花1000g、吐溫80 5ml、硼酸8g、苯扎氯銨0.05g，余量為注射用水。
其中，所述的液體制劑的pH值為6.0～7.5，進一步優(yōu)選地，pH值為7.0～7.4。
本發(fā)明還提供了該眼用藥物組合物的制備方法，它包括如下步驟 a、取藥材野菊花Chrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序或全草，加水浸泡、用水蒸氣蒸餾法經(jīng)蒸餾、重蒸餾，收集重蒸餾液，備用；收集藥渣中的提取液，濾過，備用，剩余藥渣進行下一步操作； b、將a步驟的藥渣加水煎煮，過濾，與a步驟中濾液合并，濃縮，加乙醇使含醇量為50％～90％，靜置，過濾，回收乙醇，再濃縮，加乙醇使含醇量為50％～90％，靜置，如此反復醇沉2-3次，過濾，濾液備用； c、取b步中濾液，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，加注射用水，冷藏，濾過，濾液加入0.3％活性炭吸附，濾過； d、將a步驟的重蒸餾液與c步驟的濾液混合，加入藥學上可接受的眼用制劑的輔料或輔助性成分制備而成的藥學上常用的眼用制劑。
本發(fā)明眼用藥物組合物，藥物來源廣泛，療效確切，且通過多種指標成分控制制劑的質(zhì)量，穩(wěn)定可控，副作用小，有效提取成分不易產(chǎn)生耐藥性，且通過藥效學試驗證明，采用本發(fā)明原料提取方法制備而成的眼用制劑比原普通注射劑在相同的原料用量下，藥效明顯優(yōu)于原注射劑，滿足眼用制劑的質(zhì)量要求，為臨床提供了治療急、慢性結(jié)膜炎的藥物新選擇。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

具體實施例方式 實施例1本發(fā)明藥物滴眼液的制備 一、原料野菊花1000g、吐溫80 5ml、硼酸8g、苯扎氯銨0.05g、20％氫氧化鈉適量配制1000ml 二、制備工藝 1、取野菊花1000g，加10量水浸泡1小時，水蒸汽蒸餾，收集初餾液1000ml，再重蒸餾，收集重蒸餾液500ml，備用； 2、收集藥渣中的煎煮液，濾過，藥渣加8量水，煎煮二次，每次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.20～1.24(40～70℃)的清膏，加乙醇使含醇量達65％，冷藏，靜置16小時； 3、濾過，減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.18～2.22(40～70℃)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量達85％，攪勻，冷藏放置16小時。濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，加注射用水至500ml，冷藏12小時，濾過，濾液加熱至80～90℃，加入0.3％活性炭，攪拌均勻，保持80～90℃30分鐘； 4、濾過，濾液用0.45μm精濾，加入吐溫后加熱至沸，冷至室溫，加入重蒸餾液500ml，混勻，加入其余附加劑，用20％氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7.0～7.4，加注射用水至1000ml，0.22μm濾過，無菌灌裝，即得。
上述制備工藝中，輔料的選擇和pH值的范圍是本發(fā)明制備方法的關(guān)鍵因素。
實驗例2本發(fā)明藥物滴眼液的制備 a、取藥材野菊花Chrysanthemum indicum L.的全草1000g，加水浸泡、用水蒸氣蒸餾法經(jīng)蒸餾、重蒸餾，收集重蒸餾液，備用；收集藥渣中的提取液，濾過，備用，剩余藥渣進行下一步操作； b、將a步驟的藥渣加水煎煮，過濾，與a步中濾液合并，濃縮，加乙醇使含醇量為50％，靜置，過濾，回收乙醇，再濃縮，加乙醇使含醇量為50％，靜置，如此反復醇沉3次，過濾，濾液備用； c、取b步中濾液，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，加注射用水至500ml，冷藏12小時，濾過，濾液加入0.3％活性炭吸附，濾過； 加入吐溫80 10ml、苯扎氯銨0.5g、20％氫氧化鈉適量、硼酸12g，制備成滴眼液。
實驗例3本發(fā)明藥物滴眼液的制備 a、取藥材野菊花1000g，加水浸泡、用水蒸氣蒸餾法經(jīng)蒸餾、重蒸餾，收集重蒸餾液，備用；收集藥渣中的提取液，濾過，備用，剩余藥渣進行下一步操作； b、將a步驟的藥渣加水煎煮，過濾，與a步驟中濾液合并，濃縮，加乙醇使含醇量為90％，靜置，過濾，回收乙醇，再濃縮，加乙醇使含醇量為90％，靜置，如此反復醇沉2次，過濾，濾液備用； c、取b步中濾液，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，加注射用水至500ml，冷藏12小時，濾過，濾液加入0.3％活性炭吸附，濾過；混合蒸餾液及濾液，加入吐溫80 2ml、苯扎氯銨0.01g、20％氫氧化鈉適量、硼酸4g，制備成滴眼液。
實驗例4本發(fā)明藥物滴眼液的制備 制備工藝同實施例1，只是用量有變化野菊花1000g、吐溫80 6ml、20％氫氧化鈉適量、硼酸6g。
實驗例5本發(fā)明藥物滴眼液的制備 制備工藝同實施例1，只是用量有變化野菊花1000～800g、吐溫80 5ml、甘油7ml、20％氫氧化鈉適量、硼酸8g。
實驗例6本發(fā)明藥物滴眼液的制備 制備工藝同實施例1，只是用量和輔料有變化野菊花1000g、吐溫20 7ml、十二烷基硫酸鈉6ml、磷酸適量、硼酸7g。
實驗例7本發(fā)明藥物滴眼液的制備 制備工藝同實施例1，只是用量和輔料有變化野菊花1200～800g、十二烷基硫酸鈉4ml、甘油9ml、20％氫氧化鈉適量、氯化鈉7g、杜滅芬0.8ml。
實驗例8本發(fā)明藥物緩釋滴眼液的制備 制備工藝同實施例1，只是用量和輔料有變化野菊花1000g、卡波姆2.2g、羥丙甲基纖維素15.0g、磷酸氫二鈉2.5g、磷酸二氫鈉5.0g、氯化鈉5.0g、尼泊金乙酯0.3g、1M氫氧化鈉適量。
實驗例9本發(fā)明藥物緩釋滴眼液的制備 制備工藝同實施例1，只是用量和輔料有變化野菊花1000g；卡波姆5g、羥丙甲基纖維素10g、磷酸氫二鈉2.5g、磷酸二氫鈉2.5g、氯化鈉3.0g、尼泊金乙酯0.3g、1M氫氧化鈉適量。
實驗例10本發(fā)明藥物眼用凝膠的制備 制備工藝同實施例1，只是用量和輔料有變化野菊花1000g；玻璃酸鈉5.2g、羥丙甲基纖維素10g、硼酸2.5g、氯化鈉3.0g、尼泊金乙酯0.3g、1M氫氧化鈉適量；苯乙醇1.5ml。
實驗例11本發(fā)明藥物眼用凝膠的制備 制備工藝同實施例1，只是用量和輔料有變化野菊花1000g；玻璃酸鈉5.2g、羥丙甲基纖維素10g、卡波姆3.5g；硼酸2.5g、氯化鈉3.0g、尼泊金乙酯0.6g。
實驗例12本發(fā)明藥物眼用制劑中附加劑選擇的實驗依據(jù) 附加劑的篩選依據(jù) 1、助溶輔料的選擇 本發(fā)明滴眼液含揮發(fā)油，在水中溶解度小。為防止揮發(fā)油析出，參照野菊花注射劑原工藝進行了預試，選用0.5％聚山梨酯80增加揮發(fā)油的溶解度，增加制劑的穩(wěn)定性。試驗結(jié)果表明，其增溶效果較好。
2、pH調(diào)整劑的選擇 pH值對滴眼液有重要的影響。pH值的確定不僅與人體生理特性有關(guān)，還與原料、輔料的理化性質(zhì)，制劑的穩(wěn)定性、安全性均關(guān)系。人體正常淚液的pH值為7.4，當pH值為6～8時無不舒適感受。確定滴眼液的pH值，主要從藥物的溶解度、穩(wěn)定性、刺激性等方面考慮。野菊花重蒸餾液的pH值常為4.0左右，必須添加適量堿性pH調(diào)節(jié)劑。常用的堿性pH調(diào)節(jié)劑有氫氧化鈉(鉀)溶液、枸櫞酸鈉溶液、磷酸鹽緩沖液等?？紤]到本發(fā)明滴眼液中含黃酮類成分，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH可增加其溶解度，并參照野菊花注射劑原工藝，選用20％氫氧化鈉溶液作為本發(fā)明滴眼液的pH調(diào)節(jié)劑，并對pH調(diào)節(jié)范圍進行了選擇。而硼酸水溶液有pH緩沖，增加主藥溶解度，調(diào)節(jié)滲透壓等作用。又有抑制細菌和霉菌作用，增加本發(fā)明藥物的療效和穩(wěn)定性。故選用1％硼酸為本發(fā)明滴眼液和pH調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至規(guī)定值，以增加黃酮類成分的溶解度。
試驗方法，按以上制備工藝制備，加入0.5％聚山梨酯80后加熱至沸，冷至室溫，加入重蒸餾液，混勻，再加入1％硼酸，用20％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至規(guī)定值，室溫放置20天，分別在調(diào)節(jié)前、調(diào)節(jié)后、放置后考察pH值、性狀、綠原酸和總黃酮含量，結(jié)果見表1。
表1、野菊花滴眼液pH值調(diào)節(jié)前后變化結(jié)果表
由上表可知，pH調(diào)節(jié)后，貯藏過程中pH值均有所下降，但不同的pH值對野菊花滴眼液的穩(wěn)定性影響較大，貯藏過程中指標成分和有效成分均有所下降，因調(diào)pH值至7.0～7.5時下降較小，6.0～6.5時藥液澄明度較差，總黃酮含量下降也較多，結(jié)合穩(wěn)定性和刺激性等方面進行考慮，選擇調(diào)pH值至7.0～7.5較適宜。
3、抑菌劑的選擇 滴眼液是多劑量制劑，原則上需要加入抑菌劑。考慮到本發(fā)明滴眼液所含有效成分本身具有良好的抑菌效果，同時對常用的抑菌劑進行初步篩選，尼泊金類抑菌劑與本發(fā)明滴眼液中聚山梨酯80有配伍禁忌，山梨酸不穩(wěn)定易氧化，而硫柳汞等則考慮其毒性較大。故選用0.1％苯扎氯銨為本發(fā)明滴眼液的抑菌劑，并對其抑菌效果進行了考察。
試驗方法按以上工藝制備野菊花滴眼液300ml，0.22μm微孔濾膜濾過；各取100ml，加入不同比例的苯扎氯銨，使溶解，0.22μm微孔濾膜濾過，裝入輸液瓶中，不加蓋，溶液暴露于空氣中兩小時后，封好瓶蓋，振搖0.5小時后，按照《中國藥典》2000版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法檢查細菌數(shù)、霉菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。實驗結(jié)果見表2。
表2抑菌劑考察 結(jié)論本滴眼液加0.005％的苯扎氯銨后的抑菌效果能夠達到要求。為了減小滴眼液的刺激性，故選擇苯扎氯銨的用量為0.005％。
4、黏度調(diào)整劑的選擇 適當增加滴眼液的黏度，可使藥物在眼內(nèi)停留時間延長，有利于增強藥物的療效，同時黏度增加后亦可減少刺激性。照黏度測定法(《中國藥典》2000年版二部附錄VI G)第二法對滴眼液黏度進行測定，結(jié)果為23mPa·s。綜合考慮，本發(fā)明滴眼液具有較為合適的黏度，又因本發(fā)明滴眼液對高溫不穩(wěn)定，故需要濾過除菌，而加入黏度調(diào)整劑后過濾較困難，所以可不加增黏劑。
5、滲透壓調(diào)整劑的選擇 滴眼劑的滲透壓應與人的淚液(正常淚液的滲透壓值為290mOsm·L)等滲。人眼通?？赡褪艿臐B透壓范圍相當于0.8％～1.2％的氯化鈉溶液，低于或高于此濃度均會產(chǎn)生不適感。
試驗方法按制備工藝制成藥液，測定滲透壓。試驗結(jié)果見表3。
表3滲透壓考察 結(jié)論經(jīng)測定0.8％～1.2％氯化鈉溶液的滲透壓為235～393mOsM，可見本發(fā)明滴眼液的滲透壓在人正常的耐受范圍內(nèi)，不需加滲透壓調(diào)節(jié)劑。
實施例本發(fā)明藥物輔料最佳配比篩選試驗 一、野菊花滴眼液(三個不同輔料處方)對家兔多次給藥的眼刺激性試驗 1、目的觀察家兔眼睛多次(2天)接觸野菊花滴眼液(三個不同輔料處方)后的刺激反應，篩選最佳輔料配比。
2、試驗材料 2.1藥物 (1)野菊花滴眼液A，5mL/支，藥物濃度為1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g，處方為實施例1中野菊花1000g、吐溫80 5ml、硼酸8g、苯扎氯銨0.05g、20％氫氧化鈉適量，制備成滴眼液) (2)野菊花滴眼液B，5mL/支，藥物濃度為1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g，處方為實施例2中吐溫80 10ml、苯扎氯銨0.5g、20％氫氧化鈉適量、硼酸12g，制備成滴眼液) (3)野菊花滴眼液C，5mL/支，藥物濃度為1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g，處方為實施例3中吐溫80 2ml、苯扎氯銨0.01g、20％氫氧化鈉適量、硼酸4g，制備成滴眼液)以上野菊花滴眼液A、B、C均由成都三明藥物研究所提供，由實施例1、2、3制備。
(4)氯化鈉注射液四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司，批號04101131。
2.2動物 家兔，一級，體重2.1～2.5kg，雌雄兼用。由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，動物合格證號川實動管質(zhì)2004-14。
2.3實驗動物設施條件 壹級。設施合格證四川省實驗動物管理委員會實驗動物設施條件合格證明書用實動管使第2001-7號。
2.4實驗場地 成都中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局三級中藥藥理實驗室，證書登記編號TCM-03-043。將動物放在實驗動物飼養(yǎng)觀察室內(nèi)給藥和觀察。室內(nèi)溫度控制在18～22℃。
2.5試驗方法 (1)分組 選擇角膜、虹膜和結(jié)膜均正常無病變的家兔18只。采用同體自身對照方法。于家兔右眼滴入野菊花滴眼液，0.1mL/眼/次，7次/天；以家兔左眼滴入氯化鈉注射液0.1mL/眼/次，7次/天作對比觀察。將野菊花滴眼液和氯化鈉注射液分別滴入家兔兩側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，每次滴藥后使家兔眼睛被動閉合10秒鐘，以便使藥物充分接觸眼睛各部位(角膜、虹膜、球結(jié)膜、瞼結(jié)膜)，每2小時一次，連續(xù)給藥2天，觀察野菊花滴眼液A、B、C三組不同輔料配比對家兔的眼刺激。
(2)觀察檢查指標 眼刺激反應程度每天給藥7次，每2小時給藥1次，分別于每次給藥前按眼刺激評分標準綜合評分，即在每天藥前以及每次給藥后1h用放大鏡檢查雙眼并分別記錄眼刺激反應程度。連續(xù)兩日觀察雙眼并記錄眼刺激反應程度。
眼刺激反應程度評分標準及評價標準分別按表4、5進行 表5眼刺激性評價標準 2.6試驗結(jié)果 野菊花滴眼液多次用藥對家兔眼睛的刺激性程度。結(jié)果見表6。
從表6可見，用野菊花滴眼液A、B、C對家兔右眼每天多次(7次/天)滴眼，連續(xù)應用2天，分別與家兔左眼滴入氯化鈉注射液后比較觀察，在用藥的第1天5至11小時，可見野菊花滴眼液對部分家兔眼睛有極其輕微的刺激性反應，其刺激性強度為0.17～0.83分，其中以野菊花滴眼液C刺激性最低，A刺激性居中。B刺激性最高；但是按照藥物對眼刺激性評分標準判定，其刺激性強度均在0～3.9分之內(nèi)，屬于“無刺激性”。通過以上試驗可以看出，野菊花滴眼液A、B、C多次應用對眼睛均無刺激性，但是從輔料的選擇方面看，野菊花滴眼液C的輔料刺激最小，A次之。
二、穩(wěn)定性試驗 將實施例1、2、3的樣品分裝于輸液瓶中，分別于60℃放置10天，放置前后對樣品進行考察，以考察藥物的穩(wěn)定性，試驗結(jié)果見表7、8、9。
表7實施例1放置10天后穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù) 表8實施例2放置10天后穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù) 表9實施例3放置10天后穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù) 通過實驗數(shù)據(jù)表明，以上輔料配比不同的三種野菊花滴眼液其澄明度、PH值、含量均符合規(guī)定。實施例1和2制劑放置10天后澄明度、PH值、含量無明顯變化，實施例3的PH值變化較大，故實施例1和實施例2的輔料配比較好。
將所述兩類試驗綜合分析，野菊花滴眼液A以及B最為穩(wěn)定，綜合刺激以及穩(wěn)定性的考慮，故選擇野菊花滴眼液A的輔料配比為最佳配比。
上述附加劑的選擇可知，本發(fā)明藥物附加劑雖然是常規(guī)用眼用制劑輔料，但并非簡單的組合，附加劑的選擇和使用決定了原料提取物的性質(zhì)，因此，經(jīng)過創(chuàng)造性的篩選、分析、比較，選擇的附加劑及其用量均是不可預知的，并非所有常規(guī)附加劑均適合本發(fā)明滴眼液，附加劑的選擇有效的保證的本發(fā)明藥物的質(zhì)量。
實施例12本發(fā)明藥物的質(zhì)量控制方法 總黃酮照紫外-可見分光光度法(中國藥典2005版一部附錄VA)測定。
對照品溶液的制備精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品20mg，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微熱使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，搖勻，即得(每1ml中含無水蘆丁0.2mg)。
標準曲線的制備精密量取對照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分別置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6分鐘，加10％硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘；以相應的溶液為空白。照紫外可見分光光度法(中國藥典2005版一部附錄VA)，在500nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。
測定法精密吸取本發(fā)明滴眼液(實施例1-11制備)5ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密吸取1ml，置25ml量瓶中，照標準曲線的制備項下的方法，自“加水至6ml”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計算，即得。
本發(fā)明滴眼液每1ml含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計，不得少于2.0mg。
蒙花苷照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇∶水∶冰醋酸(26∶23∶1)為流動相；檢測波長為327nm。理論塔板數(shù)按蒙花苷峰計算應不低于3000。
對照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓(50℃)干燥至恒重的蒙花苷對照品適量，加甲醇使溶解(必要時加熱)，制成每1ml含35μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密量取本發(fā)明滴眼液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
本發(fā)明滴眼液每1ml含野菊花以蒙花苷(C28H32O14)計，應不得少于0.55mg。
綠原酸照高效液相色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)為流動相；檢測波長為327nm。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于2500。
對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色容量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得(10℃以下保存)。
供試品溶液的制備取本發(fā)明滴眼液2g，精密稱定。加甲醇40ml回流提取3次，每次1小時，合并提取液，減壓濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液。
測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl注入液相色譜儀，測定，即得。
本發(fā)明滴眼液含綠原酸(C16H18O9)應不得少于0.02％。
野菊花中成分復雜，主要含有總黃酮和綠原酸、蒙花苷，由于綠原酸不穩(wěn)定，僅以綠原酸為質(zhì)量控制指標不能有效達到質(zhì)量控制的目的。且由于野菊花作為眼部用藥，不能明確其中有效成分，僅僅能通過可控指標進行質(zhì)量控制。通過選擇三類成分進行控制，通過控制其中一種或兩種或三種成分同時控制，既達到質(zhì)量控制的目的，保證制劑穩(wěn)定，其用量的多少又直接反映了藥物的藥效。
以下通過藥效學試驗證明本發(fā)明的有益效果。
試驗例1野菊花滴眼液急性毒性試驗 1、試驗材料 1.1受試藥物 野菊花滴眼液(200％，為制劑中最大等滲濃度)，5mL/支，藥物濃度為2g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材2g，測定結(jié)果顯示每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C27H30O16計為15.0mg，每制劑單位含蒙花苷C28H32O14為10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為400μg)，由成都三明藥物研究所提供，按實施例1的方法制備，批號040704。功能主治清熱解毒，清肝明目，用于外感風熱所致的暴風客熱、赤絲虬脈，癥見白睛紅赤或有少許赤絲、瘙癢不適、異物感、久視易疲勞，急、慢性卡他性結(jié)膜炎見于上述癥候者。用法用量外用。滴眼，每次1～2滴，一日3～5次。
1.2動物 家兔，紅眼，白毛，一級，體重1.7～2.1kg，雌雄兼用。由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，動物合格證號川實動管質(zhì)2004-14。
1.3實驗動物設施條件 壹級。設施合格證四川省實驗動物管理委員會實驗動物設施條件合格證明書川實動管使第2001-7號。
1.4實驗場地 成都中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局三級中藥藥理實驗室，證書登記編號TCM-03-043。將動物放在實驗動物飼養(yǎng)觀察室內(nèi)飼養(yǎng)和給藥。室內(nèi)溫度控制在18～22℃。
2、試驗方法[1，2] 取家兔12只，雌雄各半。按體重均勻分為2組，即正常對照組和野菊花滴眼液組，在1日內(nèi)分8次對家兔滴眼給予野菊花滴眼液(2g生藥/mL，每次0.05ml/眼/只，雙眼給藥，每1小時1次)，總劑量達0.8g生藥/kg體重。給藥后常規(guī)飼養(yǎng)和觀察7天。
3、試驗結(jié)果 (1)外觀癥狀觀察家兔在各次給野菊花滴眼液后無萎靡癥狀，呼吸、飲食、毛發(fā)正常，糞便正常，無腹瀉，眼球粘膜未見病變。7天內(nèi)無明顯中毒癥狀，動物無死亡。
(2)對家兔的體重增長的影響結(jié)果見表10 表10野菊花滴眼液對急性毒性試驗家兔體重的影響(體重x±s，kg) 注與正常對照組比較，*P＜0.05 從表10可見，在1日內(nèi)分8次對家兔給野菊花滴眼液較大濃度(容量)，7天內(nèi)家兔體重增加均勻，和正常對照組相比較無明顯差異(P＞0.05)。表明野菊花滴眼液較大劑量被吸收進入機體血液循環(huán)后，對全身的急性毒性極低，可見在1日內(nèi)分8次對家兔滴眼給予野菊花滴眼液最大等滲濃度(每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9為15.0mg，檢驗測定每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為400μg)，總劑量達0.8g生藥/kg體重。7天內(nèi)家兔未出現(xiàn)明顯中毒癥狀，家兔無死亡，體重增加均勻，和正常對照組相比較無顯著差異(P＞0.05)，表明即使野菊花滴眼液較大劑量被吸收進入機體血液循環(huán)后，對全身的急性毒性反應亦極低，應用安全，故制劑上限定為每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計應為15.0mg，每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計應為10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9應為400μg 。
試驗例2野菊花眼液的體外抗病毒作用 1、實驗材料 1.1藥物 (1)野菊花滴眼液1規(guī)格5mL/支，藥物濃度為1g生藥/mL(每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg)。功能主治清熱，解毒，明目。用于急慢性卡他性結(jié)膜炎。批號040401，按實施例1方法制備。
(2)野菊花注射液棕黃色液體，藥物濃度為1g生藥/ml(每1ml相當于野菊花1g)，批號040301，由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
(3)阿昔洛韋滴眼液本品為無色的澄明液體。適應癥抗病毒藥。國藥準字H42021090，批號200304292，由武漢五景藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
(4)空白組(基質(zhì)組)蒸餾水． 1.2病毒株腺病毒(AdV)3型、AdV 4型、AdV 7型、AdV 8型及單純皰疹病毒(HSV)1型，分別由首都兒研所和四川省人民醫(yī)院病毒室臨床分離提供。
1.3細胞株Hep-2細胞汕頭市永恒輝生物工程有限公司出品。
1.4生化試劑Eagles液及小牛血清，由日本和德國進口。
2、試驗方法[1] (1)藥物對細胞的毒性測定 ①藥物配制方法用Hanks液將野菊花滴眼液、原野菊花注射液、滴眼劑基質(zhì)液及阿昔洛韋滴眼液原液從1∶10～1∶80作倍比稀釋。
野菊花滴眼液、原野菊花注射液稀釋后濃度為原液(1g生藥/mL)1∶10(0.1g生藥/mL)、1∶20(0.05g生藥/mL)、1∶40(0.025g生藥/mL)和1∶80(0.0125g生藥/mL)。
阿昔洛韋滴眼液稀釋后的濃度分別為原液(1mg/mL)1∶10(0.1mg/mL)、1∶20(0.05mg/mL)、1∶40(0.025mg/mL)和1∶80(0.0125mg/mL)。
②藥物對細胞的毒性測定取野菊花滴眼液、原野菊花注射液、滴眼劑基質(zhì)液及阿昔洛韋滴眼液原液及1∶10～1∶80藥液分別接種于已形成單層細胞的Hep-2細胞各2支，同步并列設置細胞對照管、空白對照(以Hanks液代替藥液)管，加足Eagles維持液。置37℃溫箱中孵育，每天觀察細胞的毒性反應，計算半數(shù)有毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)，并重復試驗。
(2)病毒對細胞的毒力測定 用Hanks液將AdV3型、AdV4型、AdV7型、AdV8型及HSV1型分別從10-1～10-9作連續(xù)稀釋。取AdV3型、AdV7型10-3～10-6、AdV4型、AdV8型10-3～10-8、HSV10-3～10-9。各病毒液體分別接種4支Hep-2細胞管，同步并列設置細胞對照管，加足Eagles維持液。置37℃溫箱，每天觀察細胞病變，計算半數(shù)細胞感染量(TCID50)。
(3)野菊花滴眼液抗病毒作用測定 取100TCID50腺病毒AdV3型、AdV7型、AdV4型、AdV8型及HSV1型病毒液分別接種Hep-2細胞管2支，吸附1小時后，分別洗去病毒液。然后分別加入野菊花滴眼液、原野菊花注射液、滴眼劑基質(zhì)液及阿昔洛韋滴眼液原液的1∶10～1∶80藥液吸附45分鐘后，加足Eagles維持液。同步并列設置病毒對照管、細胞對照管，以Hanks液代替藥液做空白對照。置37℃溫箱，逐日觀察細胞病變。當病毒對照出現(xiàn)+++～++++(75-100％病變)可終止該試驗。并重復試驗后，計算抑制病毒作用的最小有效濃度(MIC)及半數(shù)有效濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI)。
3、試驗結(jié)果 (1)4組滴眼液等藥物對細胞的毒性作用結(jié)果見表11。
表11 4組滴眼液等藥物對Hep-2細胞的毒性作用 注“+++”表示2管細胞有毒性?！?”表示2管細胞無毒性。
從表11可見，野菊花滴眼液在原濃度和稀釋10、20倍的濃度對Hep-2細胞有明顯毒性，稀釋40倍以上對Hep-2細胞無任何毒性反應；野菊花注射液原液對Hep 2細胞有毒性，而在野菊花注射液稀釋10倍以上的各種濃度(1∶10～1∶80)對Hep-2細胞均無任何毒性反應；阿昔洛韋滴眼液原液和滴眼劑基質(zhì)液原液對Hep-2細胞均無任何毒性反應。由表11可見野菊花滴眼液對Hep-2細胞有明顯毒性，效果優(yōu)于野菊花注射液，且以原液(每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg)效果最好，稀釋20倍以后效果逐漸降低，故本滴眼液原液為臨床濃度效果最佳，即每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg。
(2)病毒對細胞的毒力作用病毒AdV3型、AdV7型、AdV4型、AdV8型及HSV1型，在Hep-2細胞內(nèi)分別加10倍稀釋的4～7種不同濃度病毒后。根據(jù)細胞病變結(jié)果，用Read-maench法計算病毒半數(shù)感染量(TCID50)，結(jié)果見表12-1。
表12-1各類病毒的半數(shù)感染細胞量(TCID50) (3)4組藥液在體外試驗的抗病毒作用 ①4組藥液在體外試驗的抗病毒作用結(jié)果見表12-2。表12-2 4組藥液等藥物體外抗病毒作用 注“-”表示2管細胞無病變，“++-+++”表示2管細胞病變程度。
從表12-2可見，野菊花滴眼液和野菊花注射液對AdV3型、AdV7型、AdV8型及HSV1型均有不同程度抑制細胞內(nèi)病變作用，但野菊花滴眼液效果優(yōu)于野菊花注射液。其中1∶20(0.05g生藥/mL)藥液對AdV3型、AdV7型及HSV1型均有較好的抑制作用。1∶10(0.1g生藥/mL)藥液對AdV8型有抑制作用。1∶10～1∶80藥液對AdV4型均無抑制作用。
陽性對照藥阿昔洛韋滴眼液原液(1mg/mL)對AdV8型、HSV1型有抑制細胞內(nèi)病變作用，其他濃度藥液對AdV8、HSV1無抑制作用。阿昔洛韋滴眼液原液(1mg/mL)～1∶80藥液對AdV3型、AdV7型和AdV4型均無抑制作用。
滴眼劑基質(zhì)液對AdV3型、AdV7型、AdV4型、AdV8型及HSV1均無抑制作用?？瞻讓φ?Hanks液)對以上病毒亦均無抑制作用。
由表12見野菊花滴眼液效果優(yōu)于野菊花注射液，且以原液(每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg)效果最好，所以本滴眼液以原液(1g生藥/mL)為臨床濃度效果最佳，即每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg最佳。
②野菊花滴眼液抗病毒作用的最小有效濃度(MIC)、半數(shù)有效濃度(IC50)、最大無毒濃度TD0和治療指數(shù)(TI)。
根據(jù)野菊花滴眼液等體外抗病毒結(jié)果，按Read-maench法，計算出野菊花滴眼液抗病毒作用的最小有效濃度(MIC)、半數(shù)有效濃度(IC50)、最大無毒濃度TD0和治療指數(shù)(TI)。結(jié)果見表13。
表13野菊花滴眼液及阿昔洛韋滴眼液的抗病毒作用 從表13可見，野菊花滴眼液的最大無毒濃度TD0為1∶1，最小有效濃度(MIC)為1∶40，其中AdV8的最小有效濃度(MIC)為1∶20，故野菊花滴眼液的含量的下限按AdV8的最小有效濃度定為每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為0.2mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為0.05mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為10μg。
試驗例3對家兔實驗性金黃色葡萄球菌感染性結(jié)膜炎的治療作用 1、試驗材料 1.1試驗藥物 (1)受試藥物 野菊花滴眼液，5mL/支，藥物濃度分別為2g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材2g，)，批號040704；1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g，)，批號040703；0.5g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材0.5g，)，批號040705。以上野菊花滴眼液各個濃度藥液由成都三明藥物研究所提供，按實施例1的方法制備，1g生藥/mL野菊花滴眼液為臨床劑量。
野菊花注射液1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g)，由雅安三九藥業(yè)有限公司提供，批號040301。
(2)陽性對照藥物 氯霉素滴眼液。8mL(20mg)/支。由四川泰華堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號040212。
1.2.細菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923，濃度為1×108個菌/mL。由成都中醫(yī)藥大學微生物學教研室進行細菌培養(yǎng)、制備和提供。
1.3動物 家兔，紅眼，白毛，一級，體重1.95～2.25kg，雌雄兼用。由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，動物合格證號川實動管質(zhì)2004-14。
3、試驗方法 1.結(jié)膜炎模型的復制方法按照文獻介紹的方法[1]，對家兔雙眼的下眼臉與球結(jié)膜交界處注射金黃色葡萄球菌的混懸液(濃度為1×108個菌/mL)0.1mL/眼，造成金黃色葡萄球菌感染性結(jié)膜炎模型。
2.分組與藥物劑量注射金黃色葡萄球菌造成結(jié)膜炎模型24小時后(第2天)根據(jù)病情輕重程度將家兔40只按性別均勻搭配分成8組，每組5只(雌雄兼用)共10只眼用于實驗。分別作為①正常對照組生理鹽水等體積滴眼；②模型對照組生理鹽水等體積滴眼；③氯霉素滴眼液(陽性對照藥物)組0.24mg/kg(濃度為2.5mg/mL，兩眼滴藥，24μL/眼/次，4次/天)；④～⑥野菊花滴眼液高、中、低三種劑量組0.192、0.096、0.048g生藥/kg(兩眼滴藥，24μL/眼/次，4次/天。)；⑦～⑧原劑型野菊花注射液高、低劑量組0.096、0.048g生藥/kg(兩眼滴藥，24μL/眼/次，高劑量4次/天，低劑量2次/天。)。
3.給藥途經(jīng)與方法在注射金黃色葡萄球菌造成結(jié)膜炎模型24小時后(第2天)根據(jù)病情輕重程度均勻分組，然后開始用生理鹽水、野菊花滴眼液、原劑型野菊花注射液和氯霉素滴眼液滴眼，連續(xù)7日。
4.觀察指標每天上午第1次滴眼藥液之前，先按眼刺激綜合評分標準進行觀察和記錄結(jié)膜炎程度后再分別給予滴眼液。
按文獻[2]采用綜合評分，結(jié)膜炎程度分級評分標準 ①充血血管正常0分；血管充血呈鮮紅色1分；血管充血呈深紅色，血管不易分辨2分；彌漫性充血呈紫紅色3分。
②水腫無水腫0分；輕微水腫1分；明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻2分；水腫至眼瞼近半閉合3分；水腫至眼瞼超過半閉合4分。
③分泌物無分泌物0分；少量分泌物1分；分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分；分泌物使整個眼區(qū)和睫毛潮濕或粘著3分。
5、統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)用x±S表示，兩組之間的比較用Dunnett t檢驗。
6、試驗結(jié)果 結(jié)果見表14，通過數(shù)據(jù)可見，對家兔兩只眼睛的下眼臉與球結(jié)膜交界處注射金黃色葡萄球菌的混懸液(濃度為1×108個菌/mL)0.1mL/眼，造成金黃色葡萄球菌感染性結(jié)膜炎模型。致炎24小時后，可見球結(jié)膜和瞼結(jié)膜彌漫性充血呈紫紅色，水腫異常嚴重(模型對照組7天后與正常對照組比較病變?nèi)悦黠@)，眼睛充血，炎癥分泌物多(尤其感染后1～3天)。野菊花滴眼液及陽性對照藥物氯霉素滴眼液具有顯著的治療作用。野菊花滴眼液高劑量組治療3天后即可使結(jié)膜炎充血、水腫、分泌物等癥狀顯著減輕(P＜0.05)；野菊花滴眼液中(臨床劑量)、低劑量組和原劑型野菊花注射液治療5天后可使結(jié)膜炎充血、水腫、分泌物等癥狀顯著減輕(P＜0.05)。說明野菊花滴眼液與原劑型注射液對金黃色葡萄球菌感染所致家兔結(jié)膜炎均具有治療作用，治療7天后可治愈(與正常對照組比較，P＞0.05)。
試驗例4野菊花滴眼液對家兔病毒性結(jié)膜炎的作用 1試驗材料 1.1試驗藥物 (1)受試藥物 野菊花滴眼液，5mL/支，藥物濃度分別為2g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材2g)，批號040704；1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g)，批號040703；0.5g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材0.5g)，批號040705。以上野菊花滴眼液各個濃度藥液由成都三明藥物研究所提供，1g生藥/mL野菊花滴眼液為臨床劑量。
野菊花注射液1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g)，批號040301，由雅安三九藥業(yè)有限公司提供。
(2)陽性對照藥物阿昔洛韋滴眼液，8ml∶8mg，本品為無色的澄明液體。批號20030509，由湖北潛江制藥廠生產(chǎn)。
1.2病毒株 單純皰疹病毒I型(HSV-I)，TCID50為10-9，由北京藥品生物制品檢定所提供。
1.3動物 家兔，紅眼，白毛，一級，體重2.25～2.50kg，雌雄兼用。由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，動物合格證號川實動管質(zhì)2004-14。
2、試驗方法 (1)結(jié)膜炎模型的復制方法按照文獻介紹的方法[3]，對家兔兩只眼的下眼臉與球結(jié)膜交界處注射單純皰疹病毒I型的混懸液(TCID50為10-9)0.1mL/眼，造成感染性單純皰疹病毒I型結(jié)膜炎模型。
(2)分組與藥物劑量在注射單純皰疹病毒I型造成結(jié)膜炎模型24小時后(第2天)根據(jù)病情輕重程度將家兔40只按性別均勻搭配分成8組，每組5只(雌雄兼用)共10只眼用于實驗。分別作為①正常對照組生理鹽水等體積滴眼；②模型對照組生理鹽水等體積滴眼；③阿昔洛韋滴眼液(陽性對照藥物)組0.096mg/kg(濃度為1mg/mL，兩眼滴藥，24μL/眼/次，4次/天)；④～⑥野菊花滴眼液高、中、低三種劑量組0.192、0.096、0.048g生藥/kg(兩眼滴藥，24μL/眼/次，4次/天。)；⑦～⑧原劑型野菊花注射液高、低劑量組0.096、0.048g生藥/kg(兩眼滴藥，24μL/眼/次，高劑量4次/天，低劑量2次/天。)。
(3)給藥途經(jīng)與方法在注射單純皰疹病毒I型造成結(jié)膜炎模型24小時后(第2天)根據(jù)病情輕重程度均勻搭配分組，然后開始用生理鹽水、野菊花滴眼液、原劑型野菊花注射液和阿昔洛韋滴眼液滴眼，連續(xù)7日。
(4)觀察指標每天上午第1次滴眼藥水之前，先按綜合評分方法觀察和記錄結(jié)膜炎癥程度分值后再分別滴眼藥液。
采用綜合評分[2]，結(jié)膜炎程度分級評分標準 ①充血血管正常0分；血管充血呈鮮紅色1分；血管充血呈深紅色，血管不易分辨2分；彌漫性充血呈紫紅色3分。
②水腫無水腫0分；輕微水腫1分；明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻2分；水腫至眼瞼近半閉合3分；水腫至眼瞼超過半閉合4分。
③分泌物無分泌物0分；少量分泌物1分；分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分；分泌物使整個眼區(qū)和睫毛潮濕或粘著3分。
(5)統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)用x±S表示，兩組之間的比較用Dunnett t檢驗。
3、試驗結(jié)果 結(jié)果見表15，從表15及試驗中可見，對家兔兩只眼睛的下眼臉與球結(jié)膜交界處注射單純皰疹病毒I型的混懸液(TCID50為10-9)0.1mL/眼，造成單純皰疹病毒I型感染性結(jié)膜炎模型。致炎24小時后，可見眼結(jié)膜充血，炎性分泌物多(尤其治療3～5天)。野菊花滴眼液及陽性對照藥物阿昔洛韋滴眼液具有顯著的治療作用。野菊花滴眼液高、中劑量(臨床劑量)組治療5天后即可使結(jié)膜炎充血、水腫、分泌物等癥狀顯著減輕(p＜0.05)；而原劑型野菊花注射液對單純皰疹病毒I型感染性家兔結(jié)膜炎模型無治療作用(p＞0.05)。說明在治療單純皰疹病毒I型感染所致家兔結(jié)膜炎上，野菊花滴眼液優(yōu)于原劑型野菊花注射液。
試驗例5野菊花滴眼液對家兔非細菌性結(jié)膜炎的作用 1、試驗材料 1.1試驗藥物 (1)受試藥物 野菊花滴眼液，5mL/支，藥物濃度分別為2g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材2g)，批號040704；1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g)，批號040703；0.5g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材0.5g)，批號040705。以上野菊花滴眼液各個濃度藥液均由成都三明藥物研究所提供，按實施例1方法制備，1g生藥/mL野菊花滴眼液為臨床劑量。
野菊花注射液1g生藥/mL(每mL相當于含野菊花原生藥材1g)，由雅安三九藥業(yè)有限公司提供，批號040301。
(2)陽性對照藥物氯霉素滴眼液。8mL(20mg)/支。由四川泰華堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號040212。
1.2致炎劑 巴豆油，由成都中醫(yī)藥大學炮制教研室提供，巴豆油與菜油按1∶20稀釋，備用。
1.3動物 家兔，一級，體重1.90～2.20kg，雌雄兼用。由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，動物合格證號川實動管質(zhì)2004-14。
2、實驗場地 成都中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局三級中藥藥理實驗室，證書登記編號TCM-03-043。將動物放在實驗動物飼養(yǎng)觀察室內(nèi)飼養(yǎng)和給藥。室內(nèi)溫度控制在18～22℃。
3、試驗方法 (1)結(jié)膜炎模型的復制方法按照文獻介紹的方法[4]，實驗時每只家兔左右眼結(jié)膜囊內(nèi)分別滴入巴豆油0.05ml(巴豆油以菜油按1∶20稀釋)，閉合眼瞼，輕輕按摩10秒鐘，致炎。造成巴豆油性結(jié)膜炎模型。
(2)分組與藥物劑量在巴豆油造成結(jié)膜炎模型后30分鐘，根據(jù)病情輕重程度將家兔40只按性別、炎癥程度均勻搭配分成8組，每組5只(雌雄兼用)共10只眼用于實驗。分別作為①正常對照組生理鹽水等體積滴眼；②模型對照組生理鹽水等體積滴眼；③氯霉素滴眼液(陽性對照藥物)組0.24mg/kg(濃度為2.5mg/mL，兩眼滴藥，24μL/眼/次，4次/天)；④～⑥野菊花滴眼液高、中、低三種劑量組0.192、0.096、0.048g生藥/kg(兩眼滴藥，24μL/眼/次，4次/天。)；⑦～⑧原劑型野菊花注射液高、低劑量組0.096、0.048g生藥/kg(兩眼滴藥，24μL/眼/次，高劑量4次/天，低劑量2次/天。)。
(3)給藥途經(jīng)與方法在巴豆油造成結(jié)膜炎模型后30分鐘，根據(jù)病情輕重程度將家兔均勻分組，分別用生理鹽水、野菊花滴眼液、氯霉素滴眼液和原劑型野菊花注射液滴眼。
(4)觀察指標于第一次給藥后1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時檢查和記錄結(jié)膜炎癥程度并評分。
采用綜合評分[2]，結(jié)膜炎程度分級評分標準 ①充血血管正常0分；血管充血呈鮮紅色1分；血管充血呈深紅色，血管不易分辨2分；彌漫性充血呈紫紅色3分。
②水腫無水腫0分；輕微水腫1分；明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻2分；水腫至眼瞼近半閉合3分；水腫至眼瞼超過半閉合4分。
③分泌物無分泌物0分；少量分泌物1分；分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分；分泌物使整個眼區(qū)和睫毛潮濕或粘著3分。
(5)統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)用x±S表示，兩組之間的比較用Dunnett t檢驗。
4、試驗結(jié)果 評分結(jié)果見表16，表16結(jié)果顯示，在巴豆油造成結(jié)膜炎模型30分鐘后，可見眼睛充血、水腫嚴重，分泌物多，以野菊花滴眼液和原劑型野菊花注射液治療1小時后，與模型組比較，即可見充血、水腫癥狀明顯減輕，分泌物減少。說明野菊花滴眼液及原劑型野菊花注射液對巴豆油所致的家兔非細菌性結(jié)膜炎均有明顯的抑制作用(P＜0.05)。野菊花滴眼液臨床劑量治療后48h，基本治愈，與正常對照組相比較，P＞0.05，而原劑型野菊花注射液組與正常對照組相比較，仍有差異，P＜0.05，說明治療巴豆油所引起的家兔結(jié)膜炎，野菊花滴眼液比原劑型野菊花注射液優(yōu)。
總結(jié) 一、急性毒性試驗 在對家兔急性毒性試驗中，1日內(nèi)分8次對家兔滴眼給予野菊花滴眼液最大等滲濃度(每mL相當于含野菊花原生藥材2g，測定結(jié)果顯示每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為15.0mg，每制劑單位含蒙花苷C16H18O9為10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為400μg)，總劑量達0.8g生藥/kg體重滴眼。7天內(nèi)家兔未出現(xiàn)明顯中毒癥狀，家兔無死亡，體重增加均勻，和正常對照組相比較無顯著差異(P＞0.05)，表明即使野菊花滴眼液較大劑量被吸收進入機體血液循環(huán)后，對全身的急性毒性反應亦極低，故可以確定，該滴眼液有效成分的含量上限為最大等滲濃度的含量上限，即每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為15.0mg，每制劑單位含蒙花苷C16H18O9為10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為400μg。
二、野菊花滴眼液的體外抗病毒作用 在野菊花滴眼液的體外抗病毒實驗中，野菊花滴眼液效果優(yōu)于野菊花注射液，野菊花滴眼液在原濃度和稀釋10、20倍的濃度對Hep-2細胞有明顯毒性，且以原液(每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg)效果最好，稀釋20倍以后效果逐漸降低，故本滴眼液原液為臨床濃度效果最佳，即每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg。
在相應的實驗中可以看出野菊花滴眼液效果以原液(每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg)效果最好，所以本滴眼液以原液(1g生藥/mL)為臨床濃度效果最佳，即每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為10mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為8mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為200μg最佳。且野菊花滴眼液對腺病毒AdV3型、AdV7型、AdV8型及單純皰疹病毒HSV1型均有不同程度的抗病毒作用，其最大無毒濃度TD0為1∶1，最小有效濃度(MIC)為1∶20～1∶40，其中AdV8的最小有效濃度(MIC)為1∶20，半數(shù)有效濃度(IC50)為0.015g生藥/mL～0.035g生藥/mL，治療指數(shù)(TI)為1～2，故野菊花滴眼液的含量的下限按AdV8的最小有效濃度定為每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計為0.2mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計為0.05mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9為10μg。
故由上述兩類試驗說明本發(fā)明滴眼液的含量限度為每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C16H18O9計應為0.2～15.0mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C16H18O9計應為0.05～10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9應為10～400μg。在該限定范圍內(nèi)，藥效明確，可控性強。
三、藥效學試驗 (一)對家兔實驗性金黃色葡萄球菌感染性結(jié)膜炎的治療作用 在對家兔實驗性金黃色葡萄球菌感染性結(jié)膜炎的治療作用試驗中，野菊花滴眼液高劑量組治療3天后即可使結(jié)膜炎充血、水腫、分泌物等癥狀顯著減輕(P＜0.05)；野菊花滴眼液中(臨床劑量)、低劑量組和原劑型野菊花注射液治療5天后可使結(jié)膜炎充血、水腫、分泌物等癥狀顯著減輕(P＜0.05)。且治療7天后可治愈(與正常對照組比較，P＞0.05)。說明野菊花滴眼液與原劑型注射液對金黃色葡萄球菌感染所致家兔結(jié)膜炎均具有治療作用。
(二)野菊花滴眼液對家兔病毒性結(jié)膜炎的作用 在野菊花滴眼液對家兔病毒性結(jié)膜炎的作用試驗中，野菊花滴眼液高、中劑量(臨床劑量)組治療5天后即可使結(jié)膜炎充血、水腫、分泌物等癥狀顯著減輕(p＜0.05)；而原劑型野菊花注射液對單純皰疹病毒I型感染性家兔結(jié)膜炎模型無治療作用(p＞0.05)。說明在治療單純皰疹病毒I型感染所致家兔結(jié)膜炎上，野菊花滴眼液優(yōu)于野菊花注射液。
(三)野菊花滴眼液對家兔非細菌性結(jié)膜炎的作用 在對家兔非細菌性結(jié)膜炎的作用試驗中，以野菊花滴眼液和原劑型野菊花注射液治療1小時后，與模型組比較，即可見充血、水腫癥狀明顯減輕，分泌物減少。說明野菊花滴眼液及原劑型野菊花注射液對巴豆油所致的家兔非細菌性結(jié)膜炎均有明顯的抑制作用(P＜0.05)。另外，在以野菊花滴眼液高計量治療后24h，結(jié)膜炎基本治愈，與正常對照組相比較，P＞0.05；野菊花滴眼液中計量(臨床劑量)治療后48h，基本治愈，與正常對照組相比較，P＞0.05，而原劑型野菊花注射液組與正常對照組相比較，仍有差異，P＜0.05，說明治療巴豆油所引起的家兔結(jié)膜炎，野菊花滴眼液比原劑型野菊花注射液優(yōu)。
主要參考文獻 1、鄭民實.蒲公英滴眼劑治療實驗性家兔單純皰疹病毒性角膜炎.中國藥理學報，1989，10(4)85 2、中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南(藥學藥理學毒理學) 3、譚海波，張湘暉，張明亮，等.目安眼膏治療實驗性家兔單純皰疹病毒性角膜炎的研究.中國中醫(yī)眼科雜志，2003，13(1)12 4、段涇云，于利森.清明眼藥水藥理作用研究．深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999，9(3)20 表4眼刺激反應評分標準表6野菊花滴眼液多次用藥對家兔眼睛的刺激性程度(x±S) 表14野菊花滴眼液對金黃色葡萄球菌感染所致家兔結(jié)膜炎的治療作用(綜合評分x±S N＝10只眼) 注與模型對照組比較，*P＜0.05；與正常對照組比較，ΔP＜0.05 表15野菊花滴眼液對單純皰疹病毒I型感染所致家兔結(jié)膜炎的治療作用(綜合評分x±S N＝10只眼) 注與模型對照組比較，*P＜0.05；與正常對照組比較，ΔP＜0.05表16野菊花滴眼液對巴豆油所致家兔急性結(jié)膜炎的影響(x±S N＝10只眼) 注與模型組比較，*P＜0.05，與正常對照組比較ΔP＜0.0權(quán)利要求
1、一種治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于它是由中藥野菊花Chrysanthemum indicum L.的提取物為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的眼用制劑，其中，每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C27H30O16計不低于0.2mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C28H32O14計，不低于0.05mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9應不低于10μg。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于每制劑單位中含總黃酮以蘆丁C27H30O16計應為0.2～15.0mg；每制劑單位含野菊花以蒙花苷C28H32O14計應為0.05～10.0mg；每制劑單位含綠原酸C16H18O9應為10～400μg。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的野菊花提取物是由如下方法提取將野菊花加水，二次蒸餾，收集重蒸餾液；藥渣加水煎煮、50％～90％乙醇精制，回收乙醇，與重蒸餾液混合，即為野菊花提取物。
4、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的制劑是液體制劑、半固體制劑；其中，所述的半固體制劑是眼膏劑、眼用膜劑、眼用凝膠劑；所述的液體制劑為滴眼液、緩釋滴眼液、眼用即型凝膠劑。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的滴眼液是由下述重量配比的原料及輔料制備而成
野菊花1500～500份、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-10份、抑菌劑0-8份、黏度調(diào)整劑0-50份、增溶劑0.2-20份、穩(wěn)定劑0-30份、助溶劑0-50份。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、硼酸、硼砂、葡萄糖、甘油中的一種或混合；所述的增溶劑為吐溫80、吐溫20、聚氧乙烯40、硬脂酸酯、司盤20或40、十二烷基硫酸鈉中的一種或混合；所述的pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉或鐘溶液、枸櫞酸鈉溶液、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、氯化鉀、醋酸、鹽酸溶液中的一種或混合；所述的抑菌劑為苯扎氯銨、苯扎溴銨、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、硝酸苯汞、氧氬化汞、三氯叔丁醇、苯乙醇、洗必泰中的一種或混合；所述的黏度調(diào)整劑為羥丙甲纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纖維素、羥丙基乙基纖維素、聚乙二醇、羧甲纖維素鈉、聚乙烯醇、玻璃酸鈉中的一種或混合；所述的穩(wěn)定劑為焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、乙二氨四乙酸、乙二氨四乙酸二鈉、甘油中的一種或混合。
7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的滴眼液每1000ml是由下述配比的原料藥材及輔料制備而成
野菊花500～1500g、吐溫80 2～10ml、硼酸4～12g、苯扎氯銨0.01～0.5g、余量為注射用水。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的滴眼液每1000ml是由下述配比的原料藥材及輔料制備而成
野菊花1000g、吐溫805ml、硼酸8g、苯扎氯銨0.05g，余量為注射用水。
9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，其特征在于所述的液體制劑的pH值為6.0～7.5。
10、一種制備權(quán)利要求1所述的治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物的方法，它包括如下步驟
a、取藥材野菊花Chrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序或全草，加水浸泡、用水蒸氣蒸餾法經(jīng)蒸餾、重蒸餾，收集重蒸餾液，備用；收集藥渣中的提取液，濾過，備用，剩余藥渣進行下一步操作；
b、將a步驟的藥渣加水煎煮，過濾，與a步驟中濾液合并，濃縮，加乙醇使含醇量為50％～90％，靜置，過濾，回收乙醇，再濃縮，加乙醇使含醇量為50％～90％，靜置，如此反復醇沉2-3次，過濾，濾液備用；
c、取b步中濾液，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，加注射用水，冷藏，濾過，濾液加入0.3％活性炭吸附，濾過；
d、將a步驟的重蒸餾液與c步驟的濾液混合，加入藥學上可接受的眼用制劑的輔料或輔助性成分制備而成的藥學上常用的眼用制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療急、慢性結(jié)膜炎的眼用藥物組合物，具體地，它是由中藥野菊花Chrysanthemum indicum L.的提取物為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的眼用制劑，本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法。本發(fā)明眼用藥物組合物，藥物來源廣泛，療效確切，質(zhì)量穩(wěn)定可控，副作用小，有效提取成分不易產(chǎn)生耐藥性。
文檔編號A61K31/7042GK1899339SQ20061002144
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月24日
發(fā)明者陽向波, 謝永平, 徐霞, 謝煒, 鄭娟 申請人:成都三明藥物研究所