專(zhuān)利名稱(chēng)：促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種中藥提取物及其制備方法，具體涉及龜板提取物(Plastrum Testudinis Extract，PTE)及其制備方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)的主要功能是參與構(gòu)成造血干細(xì)胞生存和分化的微環(huán)境，而近代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，它具有向多種細(xì)胞系分化的潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，進(jìn)而得出MSC擴(kuò)增數(shù)量少而慢是導(dǎo)致人類(lèi)很多重大疾病(如神經(jīng)損傷，神經(jīng)退行性疾病，心臟損傷、骨質(zhì)疏松、再障等)的主要原因。但是，人的骨髓中的MSC不僅含量極少，而且擴(kuò)增速度慢，而進(jìn)行在體或體外移植，存活率又較低。因此，提高骨髓中的MSC含量是困擾廣大醫(yī)務(wù)人員的技術(shù)難題。
現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究表明，龜板咸、甘、平，入腎經(jīng)，滋陰補(bǔ)腎之力強(qiáng)，所以在許多治療與骨髓中MSC含量水平有關(guān)的疾病的傳統(tǒng)組方中普遍使用龜板與其它原料藥進(jìn)行配伍。但這些傳統(tǒng)藥方普遍存在治療周期長(zhǎng)，效果不明顯的缺陷，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中醫(yī)藥領(lǐng)域引入了現(xiàn)代提取制備方法。目前，龜板的提取方法主要有氯仿-甲醇超聲提取，乙醇提取和水提取。采用脂溶性化學(xué)成分分析方法對(duì)氯仿-甲醇超聲提取物進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明氯仿-甲醇超聲提取物含有膽甾醇、十二烯酸膽甾醇脂、甾醇-4-烯-3-酮和脂肪酸，且10-十八碳烯酸含量最高(參見(jiàn)孫蘇亞，李發(fā)美，黃喉擬水龜板中三種甾類(lèi)化合物的分離和鑒定，中國(guó)中藥雜志，2000，25(3)165-166和孫蘇亞，李發(fā)美，龜板中脂肪酸的GC-MS分析，藥物分析雜志，1999，19(6)406-409)。將乙醇提取物和水提取物進(jìn)行游離氨基酸和水解后進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)這兩種提取物均含17種氨基酸及Zn、Fe等人體必需微量元素(方達(dá)任，張克蘭，劉焱文，龜板、鱉甲炮制前后化學(xué)成分的變化，中國(guó)藥學(xué)雜志，1989，24(1)26-28)。上述提取方法所得到的龜板提取物對(duì)去勢(shì)造成的大鼠骨質(zhì)疏松有一定的治療，但是，氯仿和甲醇都是有毒性溶劑，易造成提取物殘留有毒溶劑，對(duì)環(huán)境造成污染，龜板乙醇提取和水提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用。因此，尋求一種綠色環(huán)保的提取方法，得到促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物則成為本領(lǐng)域內(nèi)渴望解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種綠色環(huán)保的龜板提取物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種含有龜板提取物的藥物組合物。
本發(fā)明所述的可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物為一種乙酸乙酯分析純提取物，將其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5為流動(dòng)相，波長(zhǎng)為254nm，色譜柱為Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，進(jìn)樣量為10uL，流速為1.000ml/min的條件下進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)，在保留時(shí)間依次為1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min處有吸收峰，吸收峰的相對(duì)峰面積依次為1.45％、6.14％、56.31％和31.45％(參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1)。
上述高效液相HPLC檢測(cè)所用儀器為DIONEX summit P680(四泵，帶自動(dòng)進(jìn)樣)，所用檢測(cè)器為PDA-100 Photodiode Arry Delector。
本發(fā)明所述的龜板提取物，在常溫(25℃)下為深咖啡色膏體，難溶解于水，易溶于有機(jī)溶劑，在乙醇中溶解量為20mg/ml，氯仿溶解量為50mg/ml，二甲亞砜中溶解量為33.3mg/ml。
本發(fā)明所述的龜板提取物是從龜板中提取得到。其中所述龜板是指烏龜?shù)母辜缀捅臣祝^好是腹甲。
本發(fā)明技術(shù)方案中所述的常溫為25℃。
本發(fā)明所述的龜板提取物含有脂肪酸類(lèi)27～35％、脂肪酸酯類(lèi)52～60％、甾體2～10％。其中，所述的脂肪酸類(lèi)含有十四碳羧酸、十六碳羧酸和十八碳羧酸；所述的脂肪酸酯含有十六碳羧酸甲酯、十六碳羧酸乙酯、十八碳羧酸甲酯、十八碳-9-烯羧酸甲酯和十八碳-9-烯羧酸乙酯；所述的甾體含有3-膽甾醇和3，5-二膽甾烯。
本發(fā)明所述的龜板提取物制備方法是(1)將龜板粉碎成10～40目的細(xì)粉；(2)用龜板粉質(zhì)量的6～12倍的石油醚在50～70℃下回流提取8～12小時(shí)，除去石油迷提取物；(3)將殘?jiān)谬敯宸圪|(zhì)量的6～12倍的乙酸乙酯在60～80℃下回流提取8～12小時(shí)，減壓并加熱濃縮去除乙酸乙酯得到龜板提取物。
上技術(shù)方案步驟(1)的一個(gè)較佳具體制備方法是將龜板粉碎成20目的細(xì)粉。
上技術(shù)方案步驟(2)的的一個(gè)較佳具體制備方法是用龜板粉質(zhì)量的6～12倍的石油醚在60℃下回流提取12小時(shí)，除去石油迷提取物。
上技術(shù)方案步驟(3)的的一個(gè)較佳具體制備方法是用龜板粉質(zhì)量的6～12倍的乙酸乙酯在70℃下回流提取12小時(shí)，減壓并加熱濃縮除去乙酸乙酯得到龜板提取物。
本發(fā)明技術(shù)方案中所使用的乙酸乙酯為常用的分析純，所使用的石油迷為常用的石油迷分析純；所述的龜板粉與提取介質(zhì)之間的比例為重量/體積比(本領(lǐng)域的習(xí)慣做法)，即龜板粉為重量單位，石油迷分析純和乙酸乙酯分析純?yōu)轶w積單位。
本發(fā)明所述的含有上述龜板提取物的藥物組合物，含有治療有效量的龜板提取物和常用的輔劑或賦型劑。
本發(fā)明所述的含有上述龜板提取物的藥物組合物，其中龜板提取物的藥用注射劑，是將上述龜板提取物先經(jīng)硅膠柱層析，再用石油醚-乙酸乙酯混合液，按1％遞減梯度洗脫2次，接著蒸發(fā)濃縮成無(wú)色蠟狀固體，最后加20～40倍的1，2-丙二醇溶解得到。所述無(wú)色蠟狀固體與1，2-丙二醇的為重量/體積比。
本發(fā)明所述的含有龜板提取物的藥物組合物除注射劑以外的其它劑型，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法得到所用的輔劑、賦型劑的使用形式和用量。
本發(fā)明所述的含有龜板提取物的藥物組合物除注射劑以外的其它劑型，采用本領(lǐng)域常用的制備方法。例如將上述龜板提取物和藥物輔劑混合均勻即得。
本發(fā)明所述的含有龜板提取物的藥物組合物，其劑型還可以是片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、口服液、混懸液中的任何一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法得到所用的劑型。
本發(fā)明所述的含有龜板提取物的藥物組合物，其劑型最好是膠囊和針劑。
本發(fā)明藥物具有促進(jìn)MSC生長(zhǎng)的積極作用，應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療重大疾病，如治療神經(jīng)損傷，神經(jīng)退行性疾病，心臟損傷、骨質(zhì)疏松、再障等。
以下通過(guò)藥理試驗(yàn)及其結(jié)果來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所述的龜板提取物在治上述疾病中的有益效果。
為了描述方便而不會(huì)產(chǎn)生歧義，以下所述的龜板提取物未特別定義的均為本發(fā)明所述的龜板提取物(龜板的乙酸乙酯提取物)。
(一)活性比較近代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明堿性成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，bFGF)是促細(xì)胞增殖作用強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，因此本發(fā)明選用bFGF為陽(yáng)性對(duì)照，與龜板提取物作用比較，結(jié)果表明龜板提取物比bFGF作用強(qiáng)。以上結(jié)果提示龜板提取物具有進(jìn)一步研發(fā)新型促干細(xì)胞生長(zhǎng)藥物的潛力，并且可能獲得比傳統(tǒng)細(xì)胞因子更好的效果。
1材料與方法1.1試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.2MSC分離、擴(kuò)增與鑒定1.3.1不同龜板提取物和bFGF作為比較標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MSC的增殖活性影響傳3代MSC分為對(duì)照組、bFGF組和不同龜板提取物組。對(duì)照組分別為L(zhǎng)-DMEM培養(yǎng)液和含二甲亞砜的L-DMEM培養(yǎng)液；bFGF組為對(duì)照組(L-DMEM培養(yǎng)液)加bFGF；龜板組為對(duì)照組(L-DMEM培養(yǎng)液)分別加不同龜板提取物，即石油醚提取物A、龜板乙酸乙酯提取物B、乙醇提取物C和水提取物D，4種提取物分別稱(chēng)取33.33mg，A、B、C三種均溶于1ml二甲亞礬中，D溶于1ml蒸餾水中，得到33.33mg/ml的4種不同龜板提取物供試液，將4種不同龜板提取物再配成作用終濃度分別為1、3、6、9、15、20、30、40(ul/200ul)，培養(yǎng)基200ul/孔。各組分別在96孔培養(yǎng)3d后作MTT法檢測(cè)。
1.3.2龜板提取物和bFGF作為比較標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MSC的增殖活性影響傳3代MSC分為對(duì)照組、bFGF組和龜板提取物組。對(duì)照組為L(zhǎng)-DMEM培養(yǎng)液和含二甲亞砜的L-DMEM培養(yǎng)液，bFGF組為對(duì)照組(L-DMEM培養(yǎng)液)+20ng/mlbFGF，龜板提取物組為對(duì)照組(L-DMEM培養(yǎng)液)+龜板提取物。龜板提取物稱(chēng)取33.33mg，溶于1ml二甲亞砜DMSO中，即為龜板提取物33.33mg/ml供試液，配成作用終濃度分別為0.5、0.8、1.5、2.5、5、6.7mg/ml，培養(yǎng)基200ul/孔。各組分別在分別在96孔培養(yǎng)3d后作MTT法檢測(cè)。
1.4MTT法測(cè)MSC增殖2結(jié)果不同龜板提取物對(duì)MSC增殖活性的量效關(guān)系由表1可見(jiàn)，在1至30(ul/200ul)范圍內(nèi)，隨龜板乙酸乙酯部分B濃度的增大，細(xì)胞吸光值逐漸增高，與對(duì)照組和bFGF組E比較，差別有顯著性(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同龜板提取物對(duì)MSC增殖作用各異，龜板乙酸乙酯提取物B促進(jìn)細(xì)胞增殖；石油醚提取物A、乙醇提取物C和水提取物D對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，龜板提取物B不同劑量對(duì)MSC增殖影響也不同，如較大劑量促進(jìn)細(xì)胞增殖，小劑量對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響，以濃度依賴(lài)方式促進(jìn)MSC增殖。研究結(jié)果表明龜板提取物對(duì)MSC增殖起促進(jìn)藥理作用。
用bFGF作為比較標(biāo)準(zhǔn)和龜板提取物對(duì)MSC的增殖活性比較由圖2可見(jiàn)，在0.8mg/ml至2.5mg/ml范圍內(nèi)，隨龜板提取物濃度的增大，細(xì)胞吸光值逐漸增高，與對(duì)照組比較，差別有顯著性(P＜0.05)，以濃度依賴(lài)方式促進(jìn)MSC增殖，龜板提取物在2.5mg/ml與5mg/ml、6.7mg/ml濃度作用比較，差別無(wú)顯著性，表明龜板提取物最大作用濃度為2.5mg/ml；由于bFGF為促細(xì)胞增殖作用強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，因此選bFGF為陽(yáng)性對(duì)照，bFGF組亦促進(jìn)MSC增殖，但龜板提取物與bFGF組比較，差別有非常顯著性(P＜0.01)，表明龜板提取物促進(jìn)MSC增殖作用強(qiáng)于bFGF。
表1不同龜板提取物對(duì)MSC增殖活性的量效關(guān)系(X±S)

*與對(duì)照組比較，P＜0.01龜板提取物促M(fèi)SC增殖作用的特異性。為了探討龜板補(bǔ)腎促M(fèi)SC增殖作用的特異性，選取清熱解毒中藥如青天葵提取物作對(duì)照，結(jié)果表明青天葵提取物抑制MSC增殖，而龜板提取物促M(fèi)SC增殖，結(jié)果表明龜板促M(fèi)SC增殖可能與其補(bǔ)腎作用有關(guān)。依據(jù)“腎主發(fā)育”這條思路來(lái)解決MSC增殖問(wèn)題，既有中醫(yī)理論特色，更是有臨床實(shí)用價(jià)值。
(二)促進(jìn)MSC生長(zhǎng)1龜板提取物促進(jìn)體外培養(yǎng)的MSC生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)將低、中、高劑量龜板提取物加入體外培養(yǎng)的MSC，以形態(tài)學(xué)觀(guān)察，5-溴脫氧尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，Brdu)，增殖細(xì)胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)，細(xì)胞周期為促M(fèi)SC生長(zhǎng)的藥理學(xué)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)表明龜板提取物以濃度依賴(lài)方式促進(jìn)體外培養(yǎng)MSC生長(zhǎng)效果，藥理劑量為0.8mg/ml-6.7mg/ml。
1.1材料與方法1.1.1MSC的分組培養(yǎng) 傳3代MSC種植24孔板玻片細(xì)胞，分為對(duì)照組，龜板提取物低劑量組，龜板提取物中劑量組，龜板提取物高劑量組。對(duì)照組為含L-DMEM培養(yǎng)液，龜板提取物組為對(duì)照組+龜板提取物。龜板提取物稱(chēng)取33.33mg，溶于1ml二甲苯亞砜DMSO中，即為龜板提取物33.33mg/ml供試液，培養(yǎng)基1ml/孔，低、中、高劑量分別為33.33ug/ml，333.3ug/ml，3333ug/ml(下述相同)。各組分別在6孔培養(yǎng)1d后作流式細(xì)胞儀分析MSC的細(xì)胞周期的影響，各組分別在24孔培養(yǎng)3d后作Brdu，PCNA免疫細(xì)胞組化檢測(cè)，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察。
1.1.2HE染色1.1.3單標(biāo)和雙標(biāo)免疫組化檢測(cè) 在24孔MSC細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Brdu(5mg/L)培養(yǎng)5h，去掉培養(yǎng)液，用DMEM沖洗2遍后再用新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)16h，固定的細(xì)胞涂片以0.01MPBS(PH7.4)洗后入3％過(guò)氧化氫-甲醇溶液中室溫15分鐘，以0.01MPBS洗10×3分鐘后入0.1％TritonX-100的10％牛血清白蛋白溶液室溫1小時(shí)，血清封閉后分別加入CD34、CD45、CD44、CD54、PCNA等多克隆兔抗或BrdU單克隆小鼠抗體，4℃冰箱過(guò)夜。次日以0.01MPBS洗，相應(yīng)的二抗37℃孵育20min，0.01M PBS洗，SABC 37℃孵育20min，充分洗滌，DAB顯色，根據(jù)需要復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，透明封片。雙標(biāo)染色先按以上步驟一抗用BrdU單克隆小鼠抗體，二抗用羊抗小鼠，三抗用SABC-AP，BCIP/NBT顯色，0.1M TBS洗，雙標(biāo)阻斷劑30min，血清封閉后一抗用CD44等多克隆兔抗，二抗用羊抗兔，三抗用SABC，最后用AEC顯色。陰性對(duì)照用正常血清代替一抗，其余過(guò)程同上。
1.1.4檢測(cè)細(xì)胞周期分布 使MSC同步于G0期，按以上實(shí)驗(yàn)分組更換培養(yǎng)液，收集約1×106用于檢測(cè)。收集細(xì)胞于Eppendorf管中，依次經(jīng)過(guò)1×PBS沖洗一次，70％乙醇4℃固定過(guò)夜，以CD44、CD71、CD90標(biāo)記MSC；RNA酶于37℃消化30min及室溫碘化丙啶(PI)染色20min，PI標(biāo)記DNA，計(jì)數(shù)CD44/PI雙標(biāo)細(xì)胞比例，最后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，用MODIFIT軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
1.2結(jié)果1.2.1形態(tài)學(xué)觀(guān)察 倒置相差顯微鏡下觀(guān)察到龜板提取物組MSC胞體梭形，周?chē)泄鈺灒Ⅲw感強(qiáng)，突起平滑細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞數(shù)量不斷增加；對(duì)照組MSC胞體立體感下降，突起收縮，細(xì)胞縮成寬大扁平，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)逐漸增多，增殖速度較慢，細(xì)胞數(shù)量減少。
1.2.2HE染色顯示，對(duì)照組MSC細(xì)胞核大，形態(tài)多樣，以橢圓形或圓形為主，以常染色質(zhì)為主可見(jiàn)1-2個(gè)核仁，核仁明顯，核漿比例大，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞處于未分化的干細(xì)胞狀態(tài)；龜板提取物組MSC可見(jiàn)強(qiáng)分裂相細(xì)胞，細(xì)胞核呈雙核，說(shuō)明龜板提取物促進(jìn)MSC分裂增殖功能。
1.2.3龜板提取物以量效依賴(lài)性促進(jìn)Brdu、PCNA的表達(dá)隨機(jī)取5張Brdu、PCNA免疫陽(yáng)性細(xì)胞染色蓋片，在顯微鏡下(20×)隨機(jī)選10個(gè)視野對(duì)每張蓋片陽(yáng)性細(xì)胞行計(jì)數(shù)，取其平均值。Brdu是一種胸腺嘧啶類(lèi)似物，在DNA合成時(shí)可被細(xì)胞攝取利用而參與DNA組成，利用Brdu標(biāo)記技術(shù)可以識(shí)別外源性MSC細(xì)胞和觀(guān)察其分裂增殖情況，它可以作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的一個(gè)指標(biāo)；增殖細(xì)胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，與細(xì)胞增殖有關(guān)。在G0期細(xì)胞含量很少，G1晚期開(kāi)始增加，S期達(dá)到高峰，G2、M期下降。因此，它可以作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的另一個(gè)指標(biāo)[24](Bravo R，F(xiàn)rank R，Blundell PA，etal.Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNApolymcerase-delta.[J].Nature，1987，326(6112)515)。Brdu、PCNA陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核，核圓、大小不等，顏色淺深不均。對(duì)照組Brdu、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少散在分布；龜板提取物組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多密集分布，低、中、高劑量組MSC的Brdu、PCNA陽(yáng)性表達(dá)均明顯增高，且呈濃度依賴(lài)性；而高劑量組的Brdu、PCNA陽(yáng)性表達(dá)水平，與中劑量組表達(dá)水平相當(dāng)，差別無(wú)顯著性，提示中劑量組333.3ug/ml濃度達(dá)到最大激活細(xì)胞增殖內(nèi)信號(hào)通路或受體。表明龜板提取物以量效依賴(lài)性促進(jìn)Brdu、PCNA的表達(dá)表2不同濃度龜板乙酸乙酯部分對(duì)Brdu和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)影響

**與對(duì)照組比較，P＜0.05；**與對(duì)照組比較P＜0.011.2.4龜板提取物以濃度依賴(lài)方式促進(jìn)S期細(xì)胞增高龜板提取物組S期細(xì)胞百分比比對(duì)照組高，且隨著濃度的增高而加大，在200ug/ml達(dá)到最高，S期為13.2％；與對(duì)照組和bFGF組比較，，S期的變化具有顯著性差異(P＜0.05)，龜板提取物組細(xì)胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化受到激活。
表3龜板提取物對(duì)體外培養(yǎng)的MSC細(xì)胞周期的影響(X±S)

△與bFGF組比較P＜0.05；△△與bFGF組比較P＜0.01**與對(duì)照組比較，P＜0.05；**與對(duì)照組比較P＜0.012、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察龜板提取物對(duì)在體骨髓MSC增殖的影響將龜板提取物溶于二甲亞砜DMSO中，制備為龜板提取物注射劑，分別給予低、中、高劑量龜板提取物腹腔注射大鼠，以細(xì)胞周期S期為促M(fèi)SC增殖的藥理學(xué)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)表明龜板提取物以時(shí)效和量效依賴(lài)方式促進(jìn)在體骨髓MSC增殖效果。
2.1材料與方法2.1.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠100只，200g，雌雄不限，雌鼠無(wú)孕，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXIC(粵)2003-001，粵監(jiān)證字2005A031。
2.1.2量效實(shí)驗(yàn)分組分為空白對(duì)照組，DMSO對(duì)照組，龜板提取物低劑量組，龜板提取物中劑量組，龜板提取物高劑量組。龜板提取物稱(chēng)取33.33mg，溶于1ml二甲亞砜DMSO中，即為龜板提取物33.33mg/ml供試液，低、中、高劑量分別為0.5ml，1ml和1.5ml，空白對(duì)照組則給予1.5ml蒸餾水腹腔注射，DMSO對(duì)照組則給予1.5mlDMSO，分組腹腔注射3天。腹腔注射后0時(shí)、1天、3天、5天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取骨髓，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只SD大鼠，每組SD大鼠20只。
2.1.3時(shí)效實(shí)驗(yàn)分組分為空白對(duì)照組，DMSO對(duì)照組，龜板提取物低劑量組，龜板提取物中劑量組，龜板提取物高劑量組。各組劑量同量效實(shí)驗(yàn)分組，再分腹腔注射3天、5天組，腹腔注射后1天取骨髓，每組SD大鼠10只。
2.1.4、流式細(xì)胞儀分析MSC細(xì)胞周期將分組大鼠骨髓用L-DMEM沖出，充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，300g離心10min，去上清，D-Hanks重懸，離心去上清后，加4ml D-Hanks混勻。Percoll貯存液按0.56∶0.44混合，取4ml放入10ml離心管內(nèi)，吸骨髓液在離液面2cm處貼管壁緩緩加入。水平離心機(jī)900g離心5min，收集單核細(xì)胞層，用DMEM洗滌兩次。70％乙醇4℃固定過(guò)夜，以CD44、CD71、CD90標(biāo)記MSC；RNA酶于37℃消化30min及室溫碘化丙啶(PI)染色20min，PI標(biāo)記DNA，計(jì)數(shù)CD44/PI雙標(biāo)細(xì)胞比例，最后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，用MODIFIT軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2.2結(jié)果2.2.1龜板提取物以量效依賴(lài)性促進(jìn)在體骨髓MSCS期細(xì)胞增高龜板提取物強(qiáng)烈促進(jìn)MSC的細(xì)胞周期進(jìn)程。給予3天龜板提取物高劑量組的MSC立即進(jìn)入S期，給藥后1天，S期達(dá)高峰，與同時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照組、溶劑組相比，差別有顯著性，給藥后5天S期降至低點(diǎn)；中劑量組給藥后1天，MSC開(kāi)始進(jìn)入S期，給藥后3天，S期達(dá)高峰；低劑量組和空白對(duì)照組無(wú)明顯S期變化。結(jié)果表明龜板提取物以量效依賴(lài)關(guān)系促進(jìn)在體骨髓MSCG1向S期轉(zhuǎn)換。
2.5胃粘膜組織學(xué)觀(guān)察在腺胃區(qū)粘膜損傷明顯處，取0.5cm×1.0cm大小的組織塊，10％甲醛溶液中固定24～48h，常規(guī)石臘包埋，行4μm切片，HE染色后光鏡下觀(guān)察組織學(xué)變化。
2.6結(jié)果2.6.1胃液ph值和UI的變化與生理鹽水組比較，生理鹽水+應(yīng)激組胃液ph值明顯下降，UI明顯增加。本發(fā)明制劑+應(yīng)激組的胃液p值明顯高于生理鹽水組及生理鹽水+應(yīng)激組，其UI則明顯低于生理鹽水+應(yīng)激組。

2.6.2胃粘膜大體變化生理鹽水組大鼠胃粘膜色澤紅潤(rùn)，未見(jiàn)損傷性改變。生理鹽水+應(yīng)激組大鼠的胃腔內(nèi)見(jiàn)有大量積血，粘膜表面附有多量血痂，拭去血跡后見(jiàn)腺胃部彌漫性點(diǎn)線(xiàn)狀出血、糜爛及潰瘍形成。與生理鹽水+應(yīng)激組相比，使用本發(fā)明藥物后應(yīng)激組大鼠胃粘膜損傷程度減輕，胃腔內(nèi)并無(wú)血性積液，腺胃區(qū)粘膜僅見(jiàn)少量散在的斑點(diǎn)狀糜爛。
2.6.3胃粘膜組織學(xué)變化生理鹽水組大鼠胃粘膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，層次清楚。生理鹽水+應(yīng)激組粘膜可見(jiàn)明顯出血、壞死及大片狀脫落，粘膜中斷，潰瘍呈火山口狀，幾乎深達(dá)粘膜肌層，其周邊細(xì)胞腫脹、變性明顯。給予本發(fā)明藥物后應(yīng)激組鏡下見(jiàn)胃粘膜輕度充血水腫，偶見(jiàn)表層上皮小片狀脫落，無(wú)出血及潰瘍形成。
具體的實(shí)施方式實(shí)施例1奧美拉唑10g、多潘立酮10g稱(chēng)取一定量MCC粉置離心造粒機(jī)中，以水為黏合劑，制備母核，再于60℃烘箱中烘干，分別用標(biāo)準(zhǔn)篩手工篩分50～60目粒徑的丸核；再稱(chēng)取一定配比的藥物MCC和乳糖的混合粉末適量，置離心造粒機(jī)的供粉室中，取50～60目MCC空白丸芯適量于造粒鍋中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％HPMC水溶液為黏合劑，調(diào)節(jié)噴漿泵轉(zhuǎn)速、供粉速率，制備含藥微丸，供粉完畢后使微丸在and promote recovery in injured rat spinal cord.Nature Med，1999；51410-1412.)但由于倫理和道德問(wèn)題，其臨床應(yīng)用受到限制。最近研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞[4]，(Darwin J，Procko P.Marrow stromal cells as stem cells fornonhematopoietic tissues.Science，1997；27671-74.)從而為脊髓損傷修復(fù)提供了新途徑。我們?cè)隗w外應(yīng)用益腎中藥龜板成功誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上[5]，(陳東風(fēng)，杜少輝，李伊為，等.龜板含藥血清體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003；3224-226.)進(jìn)一步探討龜板對(duì)MSCs在脊髓損傷的存活和分化的影響，為益腎中藥聯(lián)合MSCs移植治療脊髓損傷提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
材料與方法1.試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組化試劑低糖DMEM(L-DMEM)、Percoll和胎牛血清(FBS)為GIBCOL公司產(chǎn)品，5-溴脫氧尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，Brdu)及其單克隆小鼠抗體為SIGMA公司產(chǎn)品，CD44單克隆小鼠抗體由深圳晶美公司提供。神經(jīng)絲蛋白(Neurofilamentprotein-160KD，NF)單克隆小鼠抗體為Neomarkers公司產(chǎn)品，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆小鼠抗體為Maxim公司產(chǎn)品。鏈霉親和素復(fù)合物(SABC)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德公司。
龜板提取物，根據(jù)成人日服藥量折算成大鼠灌胃劑量。將大鼠隨機(jī)分為龜板提取物組和脊髓損傷對(duì)照組。龜板提取物組每天給予龜板提取物50mg灌胃一周；脊髓損傷對(duì)照組則給予等體積蒸餾水灌胃。連灌一周。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純種SD大鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，月齡1～4個(gè)月，體重250～300g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠分為脊髓損傷對(duì)照組及龜板提取物組，每組動(dòng)物數(shù)50只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為10只。MSC均經(jīng)Brdu處理。
2.MSC分離、擴(kuò)增與鑒定將大鼠股骨、脛骨骨髓沖出，D-Hanks洗，1.073g/ml Percoll液900g離心30min，收集單個(gè)核細(xì)胞層，計(jì)數(shù)細(xì)胞按1×106/cm2密度接種，37℃、5％飽和濕度的CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10％FBS的L-DMEM。移植前1d，加入Brdu(5mg/L)培養(yǎng)5h，用D-Hank’s沖洗2遍后再培養(yǎng)16h。移植前0.25％胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)。將部分MSC接種至含蓋片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)2h后取出做Brdu、CD44免疫組化及免疫組化雙重染色來(lái)鑒定MSCs。
3.改良Allen脊髓損傷模型及MSC的定位移植改良Allen脊髓損傷模型 大鼠自由飲食、飲水，腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉；作背部后正中切口，咬除T11-13棘突及T12全部椎板和T11、T13上、下各半個(gè)椎板，暴露10mm長(zhǎng)脊髓，保留硬脊膜；用10g質(zhì)量的物體從7.5cm高處自由落下，造成大鼠不完全性截癱，撞擊成功的標(biāo)志為大鼠尾巴痙攣擺動(dòng)，雙下肢身體回縮性撲動(dòng)。術(shù)后縫合傷口。于第1天進(jìn)行移植，移植的大鼠于第1、2、3、4、6周后處死。
MSCs的立體定位移植 將大鼠麻醉固定，用5ul微量注射器吸取MSC細(xì)胞懸液4.5ul(約4萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)注入大鼠脊髓損傷區(qū)內(nèi)，注射速度1ul/min。留針10min。等量D-Hanks液注入對(duì)照的脊髓損傷區(qū)內(nèi)。
4.組織切片制備與MSC增殖與分化檢測(cè)組織切片制備 手術(shù)后第1、2、3、4、6周處死動(dòng)物，取脊髓損傷區(qū)及其上、下端各1cm的脊髓組織，冰凍切片，連續(xù)切片，片厚5μm，然后貼片。分別用于免疫組化與HE染色。
MSCs移植后增殖與分化的單標(biāo)和雙標(biāo)免疫組化檢測(cè) 固定的細(xì)胞涂片或脊髓組織切片以0.01M PBS(PH7.4)洗后入3％過(guò)氧化氫-甲醇溶液中室溫15min，以0.01M PBS洗10×3min后入0.1％Triton×-100的10％牛血清白蛋白溶液室溫1h，血清封閉后分別加入Brdu單克隆小鼠抗體或NF、GFAP、CD44等單克隆小鼠抗體，4℃冰箱過(guò)夜。次日以0.01MPBS洗，加入相應(yīng)的二抗生物素化羊抗兔(博士德公司)37℃孵育20min，0.01M PBS洗，SABC 37℃孵育20min，充分洗滌，DAB顯色，根據(jù)需要復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，透明封片，顯微鏡觀(guān)察，圖像分析儀分析陽(yáng)性結(jié)果。雙標(biāo)染色先按以上步驟一抗用Brdu單克隆小鼠抗體，二抗用羊抗小鼠IgG，三抗用鏈霉親和素堿性磷酸酶復(fù)合物(SABC-AP)，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍(lán)四唑鹽(BCIP/NBT)顯色，0.1M TBS洗，雙標(biāo)阻斷劑30min，血清封閉后一抗用CD44等多克隆兔抗，二抗用羊抗兔IgG，三抗用SABC，最后用3-氨-9-乙基咔唑(AEC)顯色。陰性對(duì)照用正常血清代替一抗，其余過(guò)程同上。
5.病理組織觀(guān)察取免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性切片的相鄰切片HE染色進(jìn)行病理觀(guān)察。
6.統(tǒng)計(jì)分析每只動(dòng)物隨機(jī)取5張陽(yáng)性細(xì)胞染色切片，在顯微鏡下(×200)對(duì)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，組間比較采用單因素方差分析，差別如有顯著性，再用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。
7.結(jié)果7.1.形態(tài)學(xué)觀(guān)察原代貼壁的MSC呈成纖維細(xì)胞外觀(guān)。MSC貼壁伸展開(kāi)始為多角形、三角形，逐漸變成短梭形、長(zhǎng)梭形。細(xì)胞不斷分裂、增殖，接種后1周，貼壁細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，14天達(dá)到融合生長(zhǎng)；剛經(jīng)過(guò)傳代的MSC呈圓形，很快貼壁、伸展成多角形、三角形，最后呈短梭形和長(zhǎng)梭形。許多新生的圓形、折光性強(qiáng)的幼稚細(xì)胞散布于其間。
7.2.MSC的表型特征培養(yǎng)細(xì)胞蓋片可見(jiàn)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，CD44陽(yáng)性細(xì)胞、Brdu和CD44雙重標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。Brdu陽(yáng)性細(xì)胞呈圓形，胞核染色呈棕黃色。CD44陽(yáng)性細(xì)胞亦呈圓形，胞膜呈棕色，陰性對(duì)照均未著色。Brdu和CD44雙重標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈紅色，胞膜為藍(lán)色，Brdu陽(yáng)性反應(yīng)為胞核染紅色，CD44陽(yáng)性反應(yīng)為胞膜染藍(lán)。CD44和CD54是MSC的重要標(biāo)志物，不是表達(dá)造血干細(xì)胞所特有的表面抗原CD34和白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45的細(xì)胞。
7.3.移植后脊髓損傷組織Brdu染色結(jié)果脊髓損傷組織內(nèi)移植MSC后1周，Brdu陽(yáng)性細(xì)胞核主要位于移植區(qū)內(nèi)，核圓、大小不等，顏色淺不均。脊髓損傷對(duì)照組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少散在排列，隨時(shí)間推移數(shù)量逐漸減少，第6周Brdu陰性；龜板提取物組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多，有許多圓形核染色。第6周仍有少量Brdu陽(yáng)性細(xì)胞。因BrdU標(biāo)記DNA，表明龜板提取物組MSC增殖較對(duì)照組多(表5)。
7.4.移植后脊髓損傷組織Brdu/NF雙標(biāo)染色結(jié)果移植后2-4周，脊髓損傷對(duì)照組移植區(qū)內(nèi)可見(jiàn)Brdu和NF雙重標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，胞核呈紅色，胞膜為藍(lán)色，Brdu陽(yáng)性反應(yīng)為胞核染紅色，NF陽(yáng)性反應(yīng)為胞膜染藍(lán)色，細(xì)胞數(shù)量少；龜板提取物組Brdu和NF雙重標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多，胞體呈三角形，有短的突起。二組GFAP免疫組化反應(yīng)均為陰性。NF是神經(jīng)元的標(biāo)記，此結(jié)果表明龜板提取物組MSC分化為神經(jīng)元較對(duì)照組多(表6)。
Table 5 The number of Brdu immunopositive cells after MSCs transplanted表5MSCs移植后Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)，x±s)

*與損傷組比較，P＜0.05，-為陰性
Table 6 The number of Brdu/NF double labeled immuno-positive cells after MSCs transplanted表6MSCs移植后Brdu/NF雙標(biāo)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)，x±s)

*與損傷組比較，P＜0.05，-為陰性綜上所述，本發(fā)明所述的龜板提取物，含有促M(fèi)SC生長(zhǎng)的有效組份，具有促M(fèi)SC生長(zhǎng)作用強(qiáng)的顯著效果，解決了骨髓中MSC含量極少，擴(kuò)增速度慢，無(wú)法滿(mǎn)足臨床上的大量需求以及長(zhǎng)期增殖活性弱等問(wèn)題。其次，本發(fā)明使用石油醚和乙酸乙酯為提取介質(zhì)，所得到的龜板提取物無(wú)殘留有毒溶劑，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。


圖1為本發(fā)明所述的龜板提取物的高效液相HPLC指紋圖譜圖2為本發(fā)明所述的龜板提取物對(duì)骨髓MSC增殖活性比較實(shí)驗(yàn)直方圖；圖3為本發(fā)明所述的龜板提取物對(duì)在體骨髓MSC的S期影響的時(shí)間效應(yīng)直方圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一、龜板提取物制備1、粉碎采用萬(wàn)能磨粉機(jī)將龜板進(jìn)行粉碎，過(guò)20目篩為所需龜板細(xì)粉。
2、除雜取40g龜板細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加250ml石油醚(分析純)溶劑，加熱至50℃，回流提取12小時(shí)，去除石油醚提取部位。
3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?50ml乙酸乙酯(分析純)加熱至60℃繼續(xù)回流提取12小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀龜板提取物0.4g。
二、化學(xué)成份分析將所得到的咖啡色膏狀龜板提取物經(jīng)硅膠柱層析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫2次，得無(wú)色蠟狀固體，然后使用常規(guī)的方法標(biāo)定其中含有十四碳羧酸2.3％、十六碳羧酸14.16％、十八碳羧酸17.33％、十六碳羧酸甲酯18.00％、十六碳羧酸乙酯10.80％、十八碳羧酸乙酯7.50％、十八碳-9-烯羧酸甲酯15.00％、十八碳-9-烯羧酸乙酯8.69％、3-膽甾醇1.84％、3，5二膽甾烯1.01％。
三、龜板提取物注射液(Injectio PTE)的制備本品為中藥龜板經(jīng)提取有效成分制成的無(wú)菌水溶液。2ml相當(dāng)于龜板有效成分10mg。
1、精制將所得到的咖啡色膏狀龜板提取物經(jīng)硅膠柱層析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫2次，得無(wú)色蠟狀固體，即為龜板提取物精制品。
2、處方龜板提取物精制品500mg，1，2丙二醇20ml，吐溫-80 2ml。制成注射液100ml。
3、制法取龜板提取物精制品500mg，加1，2丙二醇20ml溶解，振搖使龜板精制有效成分完全溶解，再加注射用水至100ml。然后，加活性碳0.5％(V/V)，充分?jǐn)嚢瑁^(guò)濾，最后以G3重熔玻璃漏斗過(guò)濾，灌封，100℃流通蒸氣滅菌30min，即得。
四、龜板提取物注射液的使用方法作用與用途 本品有促進(jìn)MSC生長(zhǎng)和促進(jìn)MSC轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元作用，主要用于治療骨病、再障和神經(jīng)疾病。
用法與用量 常用量肌肉注射和穴位注射，首次4ml，以后每次2ml，一日1-2次。
實(shí)施例2一、龜板提取物制備1、粉碎采用萬(wàn)能磨粉機(jī)將龜板進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩為所需龜板細(xì)粉。
2、除雜取60g龜板細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加500ml石油醚(分析純)溶劑，加熱至50℃，回流提取10小時(shí)，去除石油醚提取部位。
3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?00ml乙酸乙酯(分析純)加熱至70℃繼續(xù)回流提取10小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀龜板提取物0.6g。
二、化學(xué)成份分析將所得到的咖啡色膏狀龜板提取物經(jīng)硅膠柱層析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫2次，得無(wú)色蠟狀固體，然后使用常規(guī)的方法標(biāo)定其中含有含有十四碳羧酸5.5％、十六碳羧酸10.36％、十八碳羧酸14.33％，十六碳羧酸甲酯16.80％、十六碳羧酸乙酯10.8％、十八碳羧酸甲酯7.00％、十八碳-9-烯羧酸甲酯14.00％、十八碳-9-烯羧酸乙酯8.11％，3-膽甾醇6.64％，3，5二膽甾烯3.01％。
三、龜板提取物膠囊(Capsulae PTE)的制備處方 咖啡色膏狀龜板提取物250mg，碳酸鈣45mg，淀粉5mg。每個(gè)膠囊重300mg。
制法 將碳酸鈣與淀粉混勻，過(guò)篩，再與適量乙醇稀釋的浸膏混合，過(guò)120目篩，于60-70℃烘干2h，裝膠囊。
四、龜板提取物膠囊的使用方法作用與用途 本品有促進(jìn)MSC生長(zhǎng)和促進(jìn)MSC轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元作用，主要用于治療骨病、再障和神經(jīng)疾病。
用法與用量 常用量每日1次，每次1-2粒，4周為一療程，可再服兩個(gè)療程，藥量可酌減。
實(shí)施例3一、龜板提取物制備1、粉碎采用萬(wàn)能磨粉機(jī)將龜板進(jìn)行粉碎，過(guò)10目篩為所需龜板細(xì)粉。
2、除雜取60g龜板細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加600ml石油醚(分析純)溶劑，加熱至70℃，回流提取8小時(shí)，去除石油醚提取部位。
3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?00ml乙酸乙酯(分析純)加熱至80℃繼續(xù)回流提取8小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀龜板提取物0.6g。
二、化學(xué)成份分析將所得到的咖啡色膏狀龜板提取物經(jīng)硅膠柱層析，1％梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫1次，得無(wú)色蠟狀固體，然后使用常規(guī)的方法標(biāo)定其中含有十四碳羧酸2.5％、十六碳羧酸13.36％、十八碳羧酸7.33％，十六碳羧酸甲酯15.60％、十六碳羧酸乙酯9.36％、十八碳羧酸甲酯6.50％、十八碳-9-烯羧酸甲酯13.00％、十八碳-9-烯羧酸乙酯7.53％，3-膽甾醇3.64％，3，5二膽甾烯2.4％。
三、龜板提取物片劑(Tablet PTE)的制備處方 咖啡色膏狀龜板提取物400mg，碳酸鈣90mg，淀粉10mg。每片重500mg。
制法 將碳酸鈣與淀粉混勻，過(guò)篩，再與適量乙醇稀釋的浸膏混合，過(guò)90目篩，于60-70℃烘干，壓片。
四、龜板提取物片劑的使用方法作用與用途 本品有促進(jìn)MSC生長(zhǎng)和促進(jìn)MSC轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元作用，主要用于治療骨病、再障和神經(jīng)疾病。
用法與用量 常用量每日1次，每次1-2片，4周為一療程，可再服兩個(gè)療程，藥量可酌減。
權(quán)利要求
1.一種可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物，該龜板提取物為乙酸乙酯分析純提取物，將其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5為流動(dòng)相，波長(zhǎng)為254nm，色譜柱為Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，進(jìn)樣量為10uL，流速為1.000ml/min的條件下進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)，在保留時(shí)間依次為1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min處有吸收峰，吸收峰的相對(duì)峰面積依次為1.45％、6.14％、56.31％和31.45％。
2.權(quán)利要求1所述的可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物含有脂肪酸類(lèi)27～35％、脂肪酸酯類(lèi)52～60％、甾體2～10％。
3.權(quán)利要求1或2所述的可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物的制備方法由下列步驟組成(1)將龜板粉碎成10～40目的細(xì)粉；(2)用龜板粉質(zhì)量的6～12倍的石油醚在50～70℃下回流提取8～12小時(shí)，除去石油迷提取物；(3)將殘?jiān)谬敯宸圪|(zhì)量的6～12倍的乙酸乙酯在60～80℃下回流提取8～12小時(shí)，減壓并加熱濃縮除去乙酸乙酯得到龜板提取物。
4.權(quán)利要求3所述的可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物的制備方法，其特征是將龜板粉碎成20目的細(xì)粉。
5.權(quán)利要求3所述的可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物的制備方法，其特征是用龜板粉質(zhì)量的6～12倍的石油醚在60℃下回流提取12小時(shí)，除去石油迷提取物。
6.權(quán)利要求3所述的可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物的制備方法，其特征是用龜板粉質(zhì)量的6～12倍的乙酸乙酯在70℃下回流提取12小時(shí)，減壓并加熱濃縮去除乙酸乙酯得到龜板提取物。
7.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1或2所述的龜板提取物和藥學(xué)上可以接受的輔料。
8.如權(quán)利要求7所述的一種藥物組合物，其中藥用注射劑，由所述的龜板提取物先經(jīng)硅膠柱層析，再用石油醚-乙酸乙酯混合液，按1％遞減梯度洗脫2次，接著蒸發(fā)濃縮成無(wú)色蠟狀固體，最后加20～40倍1，2-丙二醇溶解得到。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的龜板提取物，該龜板提取物為乙酸乙酯分析純提取物，將其用乙酸乙酯按10mg/ml的比例溶解，并經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾后，在以甲醇∶乙腈∶水＝47.5∶47.5∶5為流動(dòng)相，波長(zhǎng)為254nm，色譜柱為Dikma Diamonsil C18 5um 250×4.6mm，進(jìn)樣量為10uL，流速為1.000ml/min的條件下進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)，在保留時(shí)間依次為1.59±0.05min、2.72±0.05min、3.00±0.06min和4.86±0.05min處有吸收峰，吸收峰的相對(duì)峰面積依次為1.45％、6.14％、56.31％和31.45％。本發(fā)明所述的龜板提取物是由龜板經(jīng)粉碎，石油醚分析純回流提取除雜，殘?jiān)儆靡宜嵋阴シ治黾兓亓魈崛〉玫降?。本發(fā)明所述龜板提取物可制成各種常用的劑型，對(duì)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的技術(shù)效果。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1857315SQ200610034579
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日
發(fā)明者陳東風(fēng), 杜少輝, 李伊為, 黎暉, 周健洪 申請(qǐng)人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)