專利名稱：一種包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試驗(yàn)室研究和臨床治療中的給藥領(lǐng)域，發(fā)明提供了一種能夠快速，高效投遞難透膜藥物進(jìn)入細(xì)胞的給藥方法。
背景技術(shù)：
試驗(yàn)室研究中，很多純化獲得的生物活性物質(zhì)如藻藍(lán)蛋白，超氧化物歧化酶，異硫氰酸熒光素(FITC)等不能有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，這阻礙了對(duì)其的生物學(xué)活性的進(jìn)一步研究；臨床上，大多數(shù)腫瘤治療藥物如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，以下簡稱SOD)等必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，天然SOD由于其分子量較大而基本不能穿透細(xì)胞膜，這導(dǎo)致了SOD的給藥量增加，容易造成過敏性反應(yīng)和毒副作用。卵磷脂是一種脂溶性物質(zhì)，它所形成的球狀脂質(zhì)體具有生物膜的特征，可以有效透過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)緩釋的藥庫，有效提高內(nèi)包物質(zhì)的半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有臨床或研究試驗(yàn)中給藥中存在的不足之處，本發(fā)明的目的是提供一種能快速，高效投遞大分子藥物到細(xì)胞內(nèi)部的納米脂質(zhì)體的制備方法。
本發(fā)明提供的包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的制備方法，依次包括以下步驟(1)將卵磷脂、CaCl2和大分子藥物于生理鹽水?dāng)嚢杌靹颍?℃下靜置，卵磷脂、CaCl2和大分子藥物的質(zhì)量比為20∶10∶0.5～1；(2)4℃下，對(duì)上述混合液交替進(jìn)行超聲波振蕩和靜置，直至得到脂質(zhì)體懸液；(3)1000～2000rpm離心脂質(zhì)體懸液，收集上清；30000～50000rpm離心上清液，沉積于底部的即為脂質(zhì)體小囊，PBS緩沖液洗滌脂質(zhì)體小囊并溶于PBS緩沖液中，得到包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體。
上述的大分子藥物是任何透膜能力差的物質(zhì)，如超氧化物歧化酶或者藻藍(lán)蛋白。采用超聲波振蕩的功率一般為400W～800W。
包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的細(xì)胞給藥方法(1)接種細(xì)胞(懸浮或貼壁細(xì)胞均可，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml培養(yǎng)基)于無血清培養(yǎng)基中，加入20％體積的脂質(zhì)體藥物，37℃二氧化碳(5％)培養(yǎng)箱中孵育1h，期間晃動(dòng)細(xì)胞幾次。
(3)PBS洗滌細(xì)胞兩次，除去胞外未結(jié)合脂質(zhì)體。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體，直徑為90～110nm，對(duì)內(nèi)包藥物(如SOD)的包封率為45％。(2)制備獲得脂質(zhì)體能在20min內(nèi)即有效投遞內(nèi)包藥物到細(xì)胞內(nèi)。(3)藥物被投遞到細(xì)胞后從脂質(zhì)球中釋放出來，進(jìn)而發(fā)揮其藥效，(4)脂質(zhì)體原液配方中不含任何不明或細(xì)胞毒性物質(zhì)，制備獲得的納米脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞沒有任何毒害作用。


圖1是400w和800w超聲波功率下制備獲得脂質(zhì)體顆粒的直徑分布曲線；圖2是脂質(zhì)體投遞熒光藥物的時(shí)間依賴性效果，圖a，b，c分別為包裹FITC的脂質(zhì)體孵育細(xì)胞0min，20min，60min后的圖片。脂質(zhì)體內(nèi)包的FITC的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為488nm和520nm；圖3是雙重?zé)晒馓结槝?biāo)記的脂質(zhì)體對(duì)SPC-A-1肺癌細(xì)胞投遞后的單個(gè)細(xì)胞的示意圖，圖A、B、C、D分別為此細(xì)胞在各種不同激發(fā)波長下的顯微圖片。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述實(shí)施例1、FITC熒光脂質(zhì)體的制備(1)混合100mg卵磷脂，46mg CaCl2，10mg FITC(發(fā)綠色熒光的水溶性分子探針，能自發(fā)分布于脂質(zhì)體微球內(nèi)部)于20ml生理鹽水，攪拌混勻，4℃下放置30min；(2)4℃下，800W超聲波振蕩脂質(zhì)體原液，每次超聲波持續(xù)時(shí)間為9sec，間隔時(shí)間為1sec，并重復(fù)60次。
(3)將懸液置于4℃，靜止放置10min。
(4)依次重復(fù)(2)，(3)操作兩次，制備獲得脂質(zhì)體懸液。
(5)1000rpm離心脂質(zhì)體懸液10min，收集上清；37000rpm超速離心上清液30min，沉積于底部的即為熒光脂質(zhì)體小囊，PBS緩沖液洗滌脂質(zhì)體小囊兩次，并溶于20mL PBS中，得到包裹FITC的納米型脂質(zhì)體。
以力度儀測量獲得脂質(zhì)體的直徑分布，直徑分布為90nm-110nm(見圖1)。
脂質(zhì)體FITC的細(xì)胞投遞于RPM1640培養(yǎng)基中，接種200μl SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞(5×105cells/ml)于96孔板，37℃，二氧化碳(5％)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。PBS洗滌兩次細(xì)胞，并溶于160ul無血清培養(yǎng)基，加入40ul脂質(zhì)體FITC，37℃孵育1h，PBS洗細(xì)胞兩次除去胞外未結(jié)合脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體FITC的細(xì)胞投遞效果觀察200ul胰酶消化以上貼壁細(xì)胞，2000rpm離心細(xì)胞5min，收集細(xì)胞，并溶于200ul PBS，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的FITC投遞效果(見圖2c)。由圖可見包內(nèi)綠色FITC熒光，表明FITC已經(jīng)被投遞到細(xì)胞內(nèi)部。
實(shí)施例2、同實(shí)施例1步驟，其中超聲波功率為400w，摸索超聲波功率對(duì)脂質(zhì)體制備的影響。力度儀測量結(jié)果表明800w超聲波功率下制備獲得脂質(zhì)體大小更為均一，主要分布在90～110nm區(qū)間(見圖1)。
實(shí)施例3、同實(shí)施例1步驟，其中脂質(zhì)體FITC的細(xì)胞孵育時(shí)間為20min，摸索孵育時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體給藥效率的影響。脂質(zhì)體孵育后的胞內(nèi)熒光含量分析表明，此納米脂質(zhì)體在約20min后開始投遞FITC到細(xì)胞內(nèi)部，并在60min后大量投遞FITC到細(xì)胞內(nèi)部(見圖2a，b，c)。
實(shí)施例4、同實(shí)施例1步驟，其中脂質(zhì)體配方為100mg卵磷脂，46mg CaCl2，5mg FITC和5mg羅單明B(簡稱Rh B，是一種發(fā)紅色熒光的脂溶性分子探針，能自發(fā)結(jié)合到脂質(zhì)體微球表面)。制備雙重?zé)晒庵|(zhì)體，摸索脂質(zhì)體透膜方式和透膜后內(nèi)包藥物的細(xì)胞分布情況。結(jié)果表明脂質(zhì)體的透膜方式不是融合，而是內(nèi)吞；且脂質(zhì)體內(nèi)包物質(zhì)在進(jìn)入細(xì)胞后能從脂質(zhì)體中逃逸，并釋放到細(xì)胞質(zhì)中(圖3)。圖3A顯示Rh B在細(xì)胞內(nèi)的分布，圖3B顯示FITC在細(xì)胞內(nèi)的分布，圖3C顯示投遞藥物以后的細(xì)胞外形，圖4D顯示Rh B和FITC在細(xì)胞內(nèi)的共同分布。細(xì)胞大小約20uM，切片厚度為2uM。分布于脂質(zhì)球內(nèi)部的綠色熒光FITC的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為488nm和520nm，分布于脂質(zhì)球表面的紅色熒光Rh B的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為543nm和560nm。
在雙重激發(fā)光同時(shí)激發(fā)下，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Rh B表明脂質(zhì)體在投遞藥物同時(shí)，外層的卵磷脂也進(jìn)入細(xì)胞，暗示脂質(zhì)體的藥物投遞過程不是融合，而是內(nèi)吞。細(xì)胞內(nèi)Rh B和FITC并不重合，說明透膜后FITC不再局限于脂質(zhì)球的內(nèi)部，而是釋放到細(xì)胞質(zhì)中，均勻分布。細(xì)胞內(nèi)Rh B分布不均勻，說明脂溶性卵磷脂在胞內(nèi)相互融合；細(xì)胞內(nèi)均勻分布的FITC說明水溶性FTIC逃脫脂質(zhì)球后在細(xì)胞內(nèi)均勻分布。
實(shí)施例5(1)同實(shí)施例1步驟制備脂質(zhì)體SOD并投遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，其中脂質(zhì)體配方為100mg卵磷脂，46mg CaCl2，5mg SOD(8000U/mg)，制備內(nèi)包大分子臨床藥物(SOD)的脂質(zhì)體。
(2)脂質(zhì)體SOD的包埋率計(jì)算以100g/L Triton-100溶解20ml脂質(zhì)體懸液離心獲得的脂質(zhì)體小囊，F(xiàn)olin-酚法測定其中蛋白含量，包埋率＝脂質(zhì)體小囊SOD蛋白含量/總SOD投入量(8mg)×100％。結(jié)果表明此納米型脂質(zhì)體對(duì)SOD的包埋率為45％。
以上列舉的分別是試驗(yàn)室研究和臨床給藥中最具代表性的FITC和SOD的脂質(zhì)體制備和應(yīng)用方法，所選用的細(xì)胞為目前國內(nèi)發(fā)病較多的SPC-A-1肺癌細(xì)胞。顯然，本發(fā)明制備的脂質(zhì)體包裹對(duì)象不限于以上大分子物質(zhì)，它還包括了所有透膜能力差的大分子藥物；投遞對(duì)象也不限于以上細(xì)胞株。在實(shí)驗(yàn)室研究中的細(xì)胞給藥領(lǐng)域和臨床治療的給藥領(lǐng)域，利用此法進(jìn)行任何相關(guān)或相似的給藥，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的制備方法，其特征是依次包括以下步驟(1)將卵磷脂、CaCl2和大分子藥物于生理鹽水?dāng)嚢杌靹颍?℃下靜置，卵磷脂、CaCl2和大分子藥物的質(zhì)量比為20∶10∶1；(2)4℃下，對(duì)上述混合液交替進(jìn)行超聲波振蕩和靜置，直至得到脂質(zhì)體懸液；(3)1000～2000rpm離心脂質(zhì)體懸液，收集上清；30000～50000rpm離心上清液，沉積于底部的即為脂質(zhì)體小囊，PBS緩沖液洗滌脂質(zhì)體小囊并溶于PBS緩沖液中，得到包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的制備方法，其特征是超聲波振蕩的功率為400W～800W。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所說的大分子藥物是超氧化物歧化酶或者藻藍(lán)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了包裹大分子藥物的納米型脂質(zhì)體的制備方法，其步驟為將卵磷脂、CaCl
文檔編號(hào)A61K38/43GK1943557SQ20061005330
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日
發(fā)明者龔興國, 盧敏, 賴宗騰, 曾冬云 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)