專利名稱：胞嘧啶衍生物用于制備治療腫瘤的藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，并尤其涉及(-)-(2s，4s)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶(也稱(-)-OddC)或其衍生物，及其治療動物包括人類癌癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是細胞生長的無序紊亂增殖。腫瘤如果具有侵襲力和遷移性，那么它是惡性的或癌性的。侵襲力是把腫瘤進入周圍組織的趨勢，它突破劃分組織界線的基底膜，從而進入體循環(huán)系統(tǒng)。遷移是指腫瘤遷移到身體的其它部位并離開最初出現(xiàn)的部位，建立增殖區(qū)域的趨勢。
癌癥是美國目前導(dǎo)致死亡的第二病因。已診斷美國有8,000,000以上的人患有癌癥，預(yù)計在1994年將有1,208,000名新患者。在這個國家，每年有500,000名以上的人死于癌癥。
癌癥還沒有在分子水平上完全弄清楚，已知細胞暴露到致癌物如某些病毒，某些化學(xué)物質(zhì)或射線中，就會導(dǎo)致DNA改變，由此滅治“抑制”基因或激活“致癌基因”。抑制基因是生長有規(guī)律的基因，當它發(fā)生突變時，不再控制細胞生長。致癌基因最初是正?；?稱作前致癌基因)，由于突變或改變表達順序變成轉(zhuǎn)化基因。轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)生引起不適宜的細胞生長。由于基因突變，使20多種不同的正常的細胞基因變成致癌基因。轉(zhuǎn)化細胞在很多方面不同于正常細胞，它包括細胞形態(tài)學(xué)，細胞-細胞間的相互作用，膜的組分，細胞骨架結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分泌，基因表達和死亡率(轉(zhuǎn)化細胞可以無限期地生長)。
身體中的各種細胞都可以轉(zhuǎn)化成良性的或惡性的腫瘤細胞。最常見的腫瘤部位是肺，其次為結(jié)腸直腸，乳腺，前列腺，膀胱，胰腺和卵巢。其它常見的癌包括白血病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌，包括腦癌，黑素瘤，淋巴瘤，紅白血病，子宮癌，和頭部、頸部癌。
目前，主要用外科手術(shù)，放射治療和化療三種方法中的一種或三種方法聯(lián)合起來治療癌癥。外科手術(shù)涉及要除掉大量生病的組織。盡管有時外科手術(shù)可有效地除掉某些部位如乳腺，結(jié)腸和皮膚的腫瘤，但它不能用于治療其它部位如脊柱的腫瘤，也不能治療播散性腫瘤疾病如白血病。
化療涉及破壞細胞復(fù)制或細胞代謝。通常用于治療白血病及乳腺癌，肺癌和睪丸癌。
通常有五大類用于治療癌癥的化療劑天然產(chǎn)物及其衍生物蒽環(huán)類化合物(anthracycline)；烷在化劑；抗增殖劑(也稱抗代謝物)；和激素?；焺┩ǔ７Q作抗腫瘤藥。
烷基化劑是通過將鳥嘌呤烷基化及交聯(lián)和與DNA中的其它堿交聯(lián)，抑制細胞分裂發(fā)揮作用的。典型的烷基化劑包括氮芥，吖丙啶化合物，烷基硫酸鹽，順鉑和各種亞硝基脲。這些化合物的缺點是它們不僅攻擊惡性腫瘤細胞，而且也攻擊天然存在的分裂細胞，如骨髓，皮膚，胃腸粘膜和胎兒組織細胞。
抗代謝物是典型的可逆或不可逆性酶抑制劑，或其它干擾核酸復(fù)制，翻譯或轉(zhuǎn)錄的化合物。
已證明幾種合成的核苷具有抗癌活性。公知的具有強抗癌活性的核苷衍生物是5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶已用于在臨床上治療惡性腫瘤，例如包括癌，肉瘤，皮膚癌，肖化器官癌和乳腺癌。然而，5-氟尿嘧啶引起各種不良反應(yīng)如惡心，脫發(fā)，腹瀉，口炎，白血病性血小板減少癥，厭食，色素沉著和水腫。在美國專利號4,336,381和在日本專利公開號50-50383，50-50384，50-64281，51-146482和53-84981中描述了具有抗癌活性的5-氟尿嘧啶的衍生物。
美國專利號4,000,137中披露了肌苷，腺苷或胞苷與甲醇或乙醇的過氧化產(chǎn)物具有抗淋巴細胞白血病的活性。
胞嘧啶阿拉伯糖苷(也稱阿糖胞苷，araC)是脫氧胞苷的核苷類似物，它在1950年首次合成并在1963年應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中。它是通常治療急性脊髓性白血病的重要藥物。它也具有抗急性淋巴細胞性白血病的活性，并且很少用于慢性髓細胞性白血病和非何杰金淋巴瘤。araC的主要作用是抑制核DNA合成，見5Handschumacher，R.和Cheng.Y.，“嘌呤和嘧啶抗代謝物”，Cancer Medicine，XV-1章，第3版，由J.Holland等編輯，Lea和Febigol出版。
5-氮雜胞苷是胞苷類似物，它主要用于治療急性脊細胞性白血病和脊髓發(fā)育不良綜合癥。
2-氟腺苷-5’-磷酸(Fludara，也稱FaraA)是治療慢性淋巴細胞性白血病最有效的藥物之一。該化合物通過抑DNA合成發(fā)揮作用。用F-araA治療細胞與細胞在GI/S期分界期和在S期的蓄積有關(guān)；因此，它是細胞循環(huán)S期特異性藥物，混入活性代謝物F-ara ATP可延緩DNA鏈的延長。F-araA也是有效的核糖核苷酸還原酶抑制劑，所述核糖核苷酸還原酶是形成dATP的關(guān)鍵酶。
2-氯脫氧腺苷用于治療低級B細胞腫瘤如慢性淋巴細胞性白血病，非何杰金淋巴瘤，和毛狀細胞性白血病。其活性范圍與Fludara類似。該化合物抑制DNA在生長期細胞中合成并抑制DNA在靜止期細胞中修復(fù)。
盡管已確定了大量化療藥物并且通常它們已用于治療癌癥，但仍需要尋找新的、有效的并且對健康細胞顯示較低毒性的藥物。
因此，本發(fā)明的目的是提供具有抗腫瘤并尤其具有抗癌活性的化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供治療癌癥的藥用組合物。
本發(fā)明再一目的是提供治療癌癥的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明披露了用于治療人和其它宿主動物腫瘤，尤其是癌癥的方法和組合物，它包括給予有效量的(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶(也稱(-)-OddC，L-OddC或(-)-L-OddC)及其可藥用衍生物包括5’或N4烷基化或?；苌?，或其可藥用鹽，可有可無的藥用載體。
在另一實例中，本文所公開的化合物可用于治療涉及細胞異常或不需要增殖的疾病，特別是腫瘤或癌癥外的其它疾病。其實例包括皮膚病如表皮角化病(包括魚鱗癬)，皮膚角化病，扁平苔蘚和牛皮癬，疣包括生殖器疣，和水皰，以及任何能夠用氨甲喋呤治療的、異常的或不需要細胞增殖。本文所公開的活性化合物也可以用于誘導(dǎo)或促進流產(chǎn)。
在優(yōu)選實例中，提供(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶作為指定對映體(L-對映體)并且基本上不含其相應(yīng)的對映體(即，以富含對映體包括對映體純品的形式存在)已確信，(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶是表現(xiàn)抗腫瘤活性的“L”-核苷的第一個實例。(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶具有式I結(jié)構(gòu)。
已發(fā)現(xiàn)，(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶表現(xiàn)出明顯的抗癌細胞活性并表現(xiàn)出對宿主健康細胞較低的毒性。能夠用該化合物治療的、非限定性癌癥的實例包括肺癌，結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，鼻咽癌，胰腺癌，卵巢癌，白血病，淋巴瘤，頭部和頸部癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌(包括腦癌)，宮頸癌，黑素瘤和肝細胞癌。
在另一實例中，公開了用于治療人和其它宿主動物腫瘤，尤其是癌或其它異常的或不需要的細胞增殖的方法和組合物，它包括給予有效量的下式L-OddC衍生物或其可藥用衍生物，可有可無的藥用載體，優(yōu)選富含對映體形式
其中R為F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-Br，-NO2，-C＝CH，或-C＝N并且R1為氫，烷基，酰基，單磷酸酯基，二磷酸酯基，或三磷酸酯基。
更具體講，本發(fā)明涉及下式的β-L-對映體在制備用于治療宿主動物腫瘤的藥物中用途， 其中R1和R2選自氫，?；虲1-C18烷基，該對映體含至少95％的β-L-對映體。在上述通式中，R1和R2優(yōu)選為氫，所述烷基選自甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，異丙基，異丁基，仲丁基，叔丁基和異戌基；所述?；鶠?C(O)R，其中R為C1-C5烷基，苯基或芐基。
盡管本發(fā)明優(yōu)選實例中所使用的是非天然存在構(gòu)型(L-構(gòu)型)的活性化合物或其衍生物或其鹽，但本文所公開的化合物或其衍生物或其鹽可以天然存在的構(gòu)型(D-構(gòu)型)或外消旋混合物形式給予。
為增加治療功效，可以將本文所公開的，治療腫瘤的任何化合物與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合或交替給予。其實例包括天然產(chǎn)物及其衍生物；蒽環(huán)類化合物；烷基化劑；抗增殖劑(也稱抗代謝物)；和激素。特別地，所述藥物包括但不限于氮芥，吖丙啶化合物，烷基硫酸酯，順鉑，亞硝酸脲，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氮雜胞苷，2-氟腺苷-5’-磷酸，2-氯脫氧腺苷，它莫西芬，放線菌素，安吖啶，爭光霉素，卡鉑，卡氮芥，環(huán)磷酰胺，環(huán)孢菌素，柔紅霉素，阿霉素，白細胞介素，羅氮芥，巰基嘌呤，氨甲喋呤，絲裂霉素，硫鳥嘌呤，長春堿，生長因子包括GCSF，GMCSF，和血小板生長因子；阿霉素，WP-16，羥基脲，依托泊甙；α，β和S干擾素和長春新堿。給予有效量這些藥物的方法是容易確定的，或者例如，見The Physician’s Desk Reference，由MedicalEconomics Date Productior Company最新編輯，出版，和Martindale，The Extra Pharmucopoeia，由The Pharmuceutical Press最新編輯，出版。這些方法可進行常規(guī)性改變，以便使聯(lián)合治療和交替治療的功效最佳。
繪圖簡要說明

圖1顯示(-)-OddC和(-)-OddC+THU(四氫尿苷，胞苷脫酰胺酶抑制劑)對結(jié)腸癌細胞的ID50。圖中繪制的是相對于對照生長的抑制百分數(shù)-濃度(μm)曲線。在圖中，用(●)表示單獨應(yīng)用(-)-OddC時的數(shù)據(jù)并且用(--▲--)表示應(yīng)用(-)-OddC+THU時的數(shù)據(jù)。
圖2是用(-)-OddC，以25mg/kg的劑量，每天兩次處理的鼠癌(結(jié)腸38)中，其腫瘤生長重量圖。該圖繪制的是相對于最初腫瘤重量的腫瘤生長百分數(shù)-天數(shù)曲線。在第1，2，3，4，和5天處理鼠。在圖中，用(●)表示對照(未給予(-)-OddC)的數(shù)據(jù)，用(--▲--)表示給予(-)-OddC的數(shù)據(jù)。
圖3顯示用(-)-OddC處理的P388白血病鼠的存活率。該圖繪制的是存活百分數(shù)-處理天數(shù)曲線。在第1，2，3，4和5天處理鼠。在圖中，用(●)表示對照(未給予(-)-OddC)的存活率，用(--▲--)表示以25mg/kg，每天兩次給予(-)-OddC鼠的存活率，用(○)表示以50mg/kg，每天一次給予(-)-OddC鼠的存活率。
圖4是某些癌細胞系對(-)-OddC的相對敏感性圖，由GI50表示。向右延伸的條形圖表示該細胞系對(-)-OddC的敏感性超過全部試驗細胞系的平均敏感性。由于條形圖刻度是對數(shù)值，所以條形圖右側(cè)的2個單位是指該細胞系獲得GI50時所需化合物的濃度為全部細胞系所需平均濃度的百分之一，因此，通常該細胞系是對(-)-OddC敏感的。相應(yīng)地，向左伸展的條形圖表示該敏感性小于平均敏感性。
圖5是用(●)-OddC抑制人腫瘤生長的圖。將3-6周大NCr裸鼠的每個肋腹皮下注射2×106HepG2或DU-145細胞。當腫瘤處于生長旺盛期時開始治療。在0-4天，每天兩次給予藥物并在指定時間測定腫瘤大小。曲線A和B分別顯示藥物對HepG2腫瘤和DU-145腫瘤的作用(-○-對照；-●-AraC 25mg/kg，i.p.；-□-(-)-OddC，25mg/kg，P.O.；-■-(-)-OddC，25mg/kg，i.p.)。圖A中的每個數(shù)據(jù)點代表10個腫瘤的平均值±SD，圖B中的每個數(shù)據(jù)點代表6個腫瘤的平均值±SD。
詳細說明本發(fā)明本文所公開的發(fā)明是治療人或其它宿主動物腫瘤，尤其是癌癥的方法和組合物，它包括給予有效量的(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶，本文進一步定義的該化合物的衍生物，它包括5-取代的或5’或4烷基化的或酰化的衍生物，或其生理上適宜的鹽，及可有可無的藥用載體。
(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶稱作“L”-核苷。由于二氧戊環(huán)上的2和5位碳是手征性的，所以它們的非氫取代基(分別為CH2OH和胞嘧啶堿)可以是順式的(在同一側(cè))或反式的(在相反的兩側(cè))。因此，通過下列構(gòu)型來表示四個光學(xué)異構(gòu)體(當在水平面上的二氧戊環(huán)部分面向東時，3-位上的氧在前面)順式(兩個取代基都“向上”，它符合天然存在的核苷，稱作“D”-核苷)，順式(兩個取代基都“向下”，它是非天然存在的構(gòu)型，稱作“L”-核苷)，反式(C2取代基“向上”并且C5取代基“向下”)，反式(C2取代基“向下”并且C5取代基“向上”)。已確信，(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶或其衍生物是表現(xiàn)抗腫瘤活性的“L”-核苷的第一個實例。根據(jù)天然不存在“L”核苷構(gòu)型的事實，這是令人意外的。
本文所使用的術(shù)語“高含對映體”指至少包含大約95％并優(yōu)選大約97％，98％，99％或100％核苷單一對映體的核苷組合物。在優(yōu)選實例中，提供(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶或其衍生物或鹽的核苷組合物，它基本上包含一種對映體，即指定對映體(L-對映體)并且基本上不含其相應(yīng)的D-對映體(即，以富含對映體包括對映體純品形式存在)。
活性化合物可以以任何衍生物的形式給予，其中，當將所述衍生物給予接受體時，該衍生物直接或間接提供母體(-)-L-OddC化合物或本文所定義的其它5-取代衍生物，或者其本身具有活性的化合物。非限定性實例為(-)-OddC的可藥用鹽(或者稱作“生理上適宜的鹽”)，上述5-衍生物，和活性化合物的5’和N4?；蛲榛苌?或者稱作“具有生理活性的衍生物”)。在一個實例中，?；囚人狨?-C(O)R)，其中，酯基的非羰基部分選自直鏈，支鏈烷基或環(huán)烷基(典型地為C1-C18，并且更典型地為C1-C5)烷芳基，芳烷基，烷氧基烷基包括甲氧基甲基，芳烷基包括芐基，烷基或C1-C4烷氧基；磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺?；?，單，二或三磷酸酯，三苯甲游基或單甲氧基三苯甲游基，取代的芐基，三烴基甲硅烷基(例如，二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。最優(yōu)選酯基中的芳基包含苯基。
L-O-ddc的可藥用衍生物的特例包括但不限制于 其中R為F，Cl，-CH3，-C(H)＝CH2，-C＝CH哉-C≡N，-Br，-NO2，并且R1和R2獨立地選自氫，烷基和?；?，特別包括但不限制于甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，異丙基，異丁基，仲丁基，叔丁基，異戊基，戊基，叔戊基，3-甲基丁?；?，琥珀酸，3-氯苯甲酸鹽，環(huán)戊基，環(huán)己基，苯甲?；?，乙酰基，新戊酰基，甲磺酸鹽，丙?；?，丁?；?，戊?；?，己酸基，辛酸基，癸酸基，月桂酸基，肉豆蔻酸基，棕櫚酸基，硬脂酸基，油酸基和氨基酸包括但不限制于丙氨?；?，纈氨?；?，亮氨?；?，異亮氨酰基，脯氨酰基，苯丙氨?；滨；?，半胱氨酰基，酪氨酰基，天冬酰胺酰基，谷氨酰胺?；?，天冬氨?；?，谷氨?；嚢滨；滨；?，細氨?；Ｔ趦?yōu)選實例中，提供的衍生物為L-對映體并且基本上不含其相應(yīng)的對映體(即，以富含對映體包括對映體純品的形式存在)。
所提供的L-OddC或其衍生物可以為其可藥用鹽的形式。本文所使用的術(shù)語可藥用鹽或配合物指L-OddC或其衍生物的鹽或配合物，它保留所需要的母體化合物的生物活性，并且如果有的話，也表現(xiàn)極小的不需要的毒理作用。這些鹽的非限定性實例為(a)與無機酸(例如，鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等等)形成的酸加成鹽，和與有機酸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，蘋果酸，抗壞血酸，苯甲酸，鞣酸，棕櫚酸(Pamoicacid)，藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，萘二磺酸，和聚半乳糖醛酸形成的鹽；(b)與多價金屬陽離子如鋅，鈣，鉍，鋇，鎂，鋁，銅，鈷，鎳，鎘，鈉，鉀等等形成的堿加成鹽，或與由N，N-二芐基乙二胺，銨，或乙二胺形成的有機陽離子形成的堿加成鹽；或(c)、(a)和(b)的混合物；例如鞣酸鋅鹽等等。
對活性化合物的修飾，特別是在N4和5’-O位的修飾可影響活性物的溶解性，生物利用度和代謝速度，因此可控制活性物的釋放。進一步，該修飾可影響化合物的抗癌活性，在某些情況下可增加母體化合物的活性。通過制備衍生物并按照本文所描述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法測定其抗癌活性，可以很容易地進行這方面評價。
簡要講，本發(fā)明包含下列部分(a)(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其衍生物和鹽；(b)(+)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其衍生物和鹽；(c)(-/+)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其衍生物和鹽；(d)(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，和用于臨床治療，例如治療或預(yù)防腫瘤包括癌性腫瘤的可藥用衍生物和其鹽；(e)利用(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其可藥用衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，及其可藥用衍生物和鹽來生產(chǎn)用于治療腫瘤包括癌性腫瘤的藥物；(f)藥物制劑，它包含(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其可藥用衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，或其可藥用衍生物或鹽，和可藥用載體；(g)制備(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3，-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶的方法，它包括(i)將保護或未保護的胞嘧啶與式A 1，3-二氧戊環(huán)反應(yīng)
其中R1a為氫或羥基保護基，包括?；?，并且L為離去基團；并除掉或不除掉任何羥基保護基，(ii)將式B化合物 (其中R1a如上定義)與將尿嘧啶環(huán)4-位上的氧基轉(zhuǎn)化為氨基的試劑反應(yīng)；除掉任何存在的保護基，得到需要的產(chǎn)物。
(h)制備(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶的(-)或(+)對映體的方法，它包括，讓化合物或其(-)和(+)對映體混合物形式的衍生物(例如5’-酯)處于反應(yīng)條件中或與具有分離對映體作用的試劑(例如適宜的酶)反應(yīng)并且如果需要，將得到的衍生物轉(zhuǎn)化為母體化合物，或者，可以讓混合物通過手征性液體層析柱，該柱將這種類型的對映體分離。
(i)制備(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶的方法，它包括利用不使產(chǎn)物外消旋的Lewis酸，如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸鹽(triflat)，將保護的下式1，3-二氧戊環(huán)
與保護的在5-位上取代或未取代的胞嘧啶堿反應(yīng)。
就方法g)中的(i)而言，羥基保護基包括下列保護基酰基(例如乙?；?，芳基?；?例如苯甲?；蛉〈谋郊柞；?，三苯甲游基或單甲氧基三苯甲游基，芐基或取代的芐基，三取代的甲硅烷基包括三烴基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。胞嘧啶化合物可以用三取代的甲硅烷基保護或不保護。保護基可以用常規(guī)方法除掉。離去基團是核苷領(lǐng)域中那些已知的、有代表性的離去基團，例如鹵素如氯，氟，甲苯磺?；?，甲磺?；?，三氟甲磺酸鹽，或溴，烷氧基如甲氧基或乙氧基，或?；缫阴；虮郊柞；?。
在方法g)的(i)中，可在Lewis酸如SnCl4，氯化鈦，或三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸鹽存在下，在有機溶劑(例如，1，2-二氯乙烷或乙腈)中進行反應(yīng)。
通過將式C化合物 (其中R1a如上定義)與還原劑，例如氫化鋰鋁反應(yīng)，然后用適宜的常規(guī)試劑對獲得所需中間體處理例如用于?；聂人狒缫宜狒?，用于鹵代的氯化劑或溴化劑，或烷基化試劑，可以得到式A化合物(其中L代表?；?，例如乙?；?。
通過在升高的溫度下，將式D化合物 與HOCH2CO2H反應(yīng)，可以制備式C化合物。
通過具有式CH2＝CH-CH2-OR結(jié)構(gòu)的烯丙醚或酯的臭氧分解或具有式ROCH2-CH＝CH-CH2OR結(jié)構(gòu)的2-丁-1，3-二醇的二醚或二酯的臭氧分解，可以制備式E化合物，其中R為保護基，如烷基，甲硅烷基，或?；?br> 就方法g)中的ii)而言，可以用1，2，4-三唑和4-氯苯基二氯磷酸鹽一起處理式C化合物，形成相應(yīng)的4-(1，2，4-三唑基)化合物，然后，例如通過與甲醇反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為需要的4-氨基(胞苷)化合物。
例如，通過用與方法g)i)中所描述方法的類似的方法將適宜的(保護或未保護的)堿與式A化合物反應(yīng)，可以制備式B和C的初始物。尿嘧啶和胞嘧啶可購于Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI 53233，USA。
通過與適宜的酯化劑，例如?；u或酸酐反應(yīng)，可以將L-OddC或其衍生物轉(zhuǎn)化為可藥用酯。用常規(guī)方法，例如通過用適宜的堿處理，可以將L-OddC或其可藥用衍生物轉(zhuǎn)化為可藥用鹽。例如通過水解，可以將酯或鹽轉(zhuǎn)化為母體。
在另一實例中，本文所公開的化合物可用于治療疾病，特別是那些涉及異常的或不需要的細胞增殖的，不同于腫瘤或癌癥的疾病。其實例包括皮膚病，如表皮角化病(包括魚鱗病，皮膚角化病，扁平苔癬和牛皮癬)，疣包括生殖器疣，和水皰，以及任何能夠用氨甲喋呤治療的、異常的細胞增殖。本文所公開的活性化合物也可以用于誘導(dǎo)或促進流產(chǎn)。
因此，本發(fā)明也包括用于臨床治療，例如治療或預(yù)防異常的或不需要的細胞增殖的(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其衍生物的鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，及其可藥用衍生物和鹽；以及利用(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其可藥用衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，及其可藥用衍生物和鹽來生產(chǎn)用于治療異常的或不需要的細胞增殖的藥物。
II.制備活性化合物如上所述，按照1992年10月29日出版的PCT國際公開號WO92/18517中所公開的方法，用反應(yīng)路線I中所公開的方法和下文所提供的工作實例1-7，或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法可以制備(-)-L-OddC及其衍生物。可利用這些方法或其它已知的方法來制備作為實例的L-OddC的衍生物。
反應(yīng)路線1(-)-OddC的合成實施例1 制備6-脫水-L-葡萄糖在第一步中，通過用酸，例如0.5N HCl處理葡萄糖，從葡萄糖開始制備6-脫水-L-葡萄糖，產(chǎn)率60％(Evans，M.E.，等，Carbohydr.Res(1973)，28，359)。與前面的方法(Jeong，L.S.等人，Tetrahedron Lett.(1992)，33，595和Beach，J.W.等，J.Org.Chem，(1992年出版))不同，該方法無需選擇性保護，通過用NaIO4氧化，再用NaBH4還原，將(2)直接轉(zhuǎn)化為二氧戊環(huán)三醇(3)，在不分離下，將其轉(zhuǎn)化為異亞丙基衍生物(4)。苯甲?；玫?5)，脫保護得到(6)，將二醇(6)氧化得到酸(7)。在無水THF中，用Pb(OAC)4將(7)氧化脫羧酸得到乙酸鹽(8)，即產(chǎn)率較高的主要中間體。在TMSOTf存在下，將乙酸鹽與所需要的嘧啶(例如甲硅烷基化的胸腺嘧啶和N-乙酰化的胞嘧啶)縮合，得到α，β-混合物，將其在硅膠柱上分離，得到單一的異構(gòu)體(9和10)。用甲醇化的氨脫苯甲酰基，得到需要的(-)-OddC(11)。
實施例2 制備(-)-1，6-脫水-α-L-古洛吡喃糖(2)將L-葡萄糖(1)(33g，0.127mol)和0.5N HCl(330ml，0.165mol)的混合物回流20小時。將混合物冷卻并用樹脂(Dowex-2，HCO3-形式)中和至pH6，此過程伴隨氣泡產(chǎn)生。通過用10％HCl水，甲醇，水和飽和NaHCO3溶液洗滌將樹脂再循環(huán)。將反應(yīng)混合物過濾并用水(500ml)洗滌樹脂。將合并的濾液濃縮至干并真空干燥過夜。將殘渣在柱上(5cm高，硅膠，目，CHCl3-CH3OH，10∶1)純化，得到淡黃色固體，在無水乙醇中重結(jié)晶得到無色固體(2)[Rf＝0.43(CHCl3-CH3OH，5∶1)，7.3g，35.52％]。將得到的L-葡萄糖(Rf＝0.07，11g)再循環(huán)，得到(2)(5g，總產(chǎn)率60％)mp 142.5-145℃；1H NMR(DMSO-d6)δ3.22-3.68(m，4H，H-2，-3，-4and-6a)，3.83(d，J6b，6a＝7.25Hz，1H，Hb-6)，4.22(pseudo t，J5，6a＝4.61and 4.18Hz，H，H-5)，4.46(d，J2-OH，2＝6.59Hz，1H，2-OH，可與D2O交換)，4.62(d，J3-OH，3＝5.28Hz，1H，3-OH，可與D2O交換)，5.07(d，J4-OH，4＝4.84Hz，1H，4-OH，可與D2O交換)，5.20(d，J1，2＝2.19Hz，1H，H-1).[α]D25-50.011(c，1.61，CH3OH).
實施例3 制備(-)-(1’S，2S，4S)-4-(1，2，-二羥乙基-1，2-O-異亞丙基)-2-羥甲基)-二氧戊環(huán)(4)將NaIO4(22.36g，0.1mol)的水(300ml)溶液，經(jīng)10分鐘滴加到冷卻至0℃的(2)(11.3g，0.07mol)的甲醇(350ml)溶液中。將混合物機械攪拌15分鐘。將NaBH4(7.91g，0.21mol)加到該混合物中并在0℃下將該反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。將白色固體濾出并用甲醇(300ml)洗滌。將合并的濾液用0.5N HCl(～200ml)中和并濃縮至干。將殘渣真空干燥。利用機械攪拌器，將糖漿狀殘渣與甲醇-丙酮(1∶5，1200ml)一起研制(5小時)并濾出白色固體(第一個)。將濾液濃縮至干并將殘渣溶解在丙酮(500ml)中，然后加入對甲苯磺酸(6.63g，0.035mol)。攪拌6小時后，將混合物用三乙胺中和，濾出固體(第二個)并將濾液濃縮至干。將殘渣溶解在乙酸乙酯(350ml)中并用水(50ml×2)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，并蒸發(fā)得到粗品(4)(3.6g)的淡黃色糖漿。將水層濃縮至于并真空干燥。將得到的固體(第1個和第2個)與干燥的水層物合并并通過在10％甲醇-丙酮(900ml)和對甲苯磺酸(16g，0.084mol)中攪拌1小時再循環(huán)，得到粗品(4)(5.6g)。通過在無水硅膠柱(CH3OH-CHCl3，1％-5％)上純化，得到(4)[Rf＝0.82(CHCl3-CH3OH，10∶1)8.8g，61.84％]的無色油狀物。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.26and 1.32(2×s，2×3H，異亞丙基)，3.41(dd，JCH2OH，OH＝6.04Hz，JCH2OH，2＝3.96Hz，2H，CH2OH)，3.56-4.16(m，6H，H-4，-5，-1′and-2′)，4.82(t，JOH，CH2＝6.0Hz，1H，CH2OH，可與D2O交換)，4.85(t，J2OH，CH2OH＝3.96Hz，1H，H-2).[α]D25-12.48(c，1.11，CHCl3)，C9H16O5元素分析，計算值C，52.93；H，7.90。
實測值C，52.95；H，7.86。
實施例4 制備(+)-(1’S，2S，4S)-4-(1，2-二羥甲基-1，2-O-異亞丙基)-2-(O-苯甲酰氧基甲基)-二氧戊環(huán)(5)在0℃下，將苯甲酰氯(6.5ml，0.056mol)滴加到(4)(8.5g，0.042mol)在吡啶-CH2Cl2(1∶2，120ml)的溶液中并將溫度升至室溫。攪拌2小時后，用甲醇(10ml)將反應(yīng)驟冷并將混合物真空濃縮至干。將殘渣溶解在CH2Cl2(300ml)中并用水(100ml×2)，鹽水洗滌，干燥(MgSO4)過濾，蒸發(fā)，得到淡黃色糖漿，將其通過硅膠柱層析(EtOAc-己烷，4％-30％)來純化，得到(5)[Rf＝0.45(己烷-EtOAc，3∶17，10.7g，83.4％]的無色油狀物。
1H NMR(CDCl3)δ1.35and 1.44(2×s，2×3H，異亞丙基)3.3-4.35(m 6H，H-4，-5，-1′and-2，)，4.44(d，J＝3.96Hz，2H，CH2-OBz)，5.29(t，J＝3.74Hz，1H，H-2)，7.3-7.64，8.02-8.18(m，3H，2H，-OBz).[α]D25+10.73(c，1.75，CH3OH).
C16H20O6元素分析，計算值C，62.33；H，6.54。
實測值C，62.39；H，6.54。
實施例5制備(+)-(1’S，2S，4S)-4-(1，2-二羥乙基)-2-(O-苯甲酰氧基甲基)-二氧戊環(huán)(6)在室溫下，將(5)(5.7g，0.018mol)和對甲苯磺酸(1.05g，0.0055ml)在甲醇(70ml)中的混合物攪拌2小時。因為反應(yīng)尚未結(jié)束，所以將溶劑蒸發(fā)至原體積的-半并再加入甲醇(50ml)和對甲苯磺酸(0.7g，3.68mmol)。再攪拌1小時后，將反應(yīng)混合物用三乙胺中和并將溶劑蒸發(fā)至干。
將殘渣通過硅膠柱層析(己烷-EtOAc，10％-33％)純化，得到(6)[Rf＝0.15(己烷-EtOAc，1∶1)，4.92g，99.2％]的無色糖漿。
1H NMR(DMSO-d6))δ3.43(m，2H，H-2′)，3.67-4.1(m，4H，H-4，-5and-1′)，4.32(d，J＝3.73Hz，2H，CH2-OBz)，4.60(t，J＝5.72Hz，2′-OH，可與D2O交換)，5.23(t，J＝3.96Hz，1H，H-2)，7.45-7.7，7.93-8.04(m，3H，2H，-OBz)，[α]D25+9.16(c，1.01，CHCl3).
C13H16O6的元素分析，計算值C，58.20；H，6.01。
實測值C，58.02；H，6.04。
實施例6制備(-)-(2S，4S)和(2S，4R)-4-乙酰氧基-2-(O-苯甲酰氧基甲基)-二氧戊環(huán)(8)將NaIO4(10.18g，0.048mol)在水(120ml)中的溶液加到(6)(3.04g，0.011mol)在CCl4∶CH3CN(1∶1，160ml)的溶液中，然而加入RuO2水合物(0.02g)。將反應(yīng)混合物攪拌5小時后，通過在硅藻土上過濾除掉固體并將濾液蒸發(fā)至1/3體積。將殘渣溶解在CH2Cl2(100ml)中并用CH2Cl2(100ml×2)提取水層。用鹽水(50ml)洗滌合并的有機層，干燥(MgSO4)，過濾，蒸發(fā)至干并真空干燥16小時，得到粗品(1)(2.6g，91％)。
在N2環(huán)境下，向粗品(7)(2.6g，0.01mol)在無水THF(60ml)的溶液中加入Pb(OAC)4(5.48g，0.0124mol)和吡啶(0.83ml，0.0103mol)。在N2下，將混合物攪拌45分鐘并通過過濾除掉固體。用乙酸乙酯(60ml)洗滌固體并將合并的有機層蒸發(fā)至于。將殘渣通過硅膠柱層析(己烷-EtOAc，2∶1)純化，得到(8)[Rf＝0.73和0.79(己烷-EtOAc，2∶1)，1.9g，69.34％]的無色油狀物。
1H NMR(CDCl3)δ1.998，2.11(2× s，3H，-OAc)，3.93-4.33(m，2H，H-5)，4.43，4.48(2× d，J＝3.73，3.74Hz，2H，CH2OBz)，5.46，5.55(2× t，J＝4.18，3.63Hz，1H，H-2)，6.42(m，1H，H-4)，7.33-759，8.00-8.15(m，3H，2H，-OBz).[α]D25-12.53(c，1.11，CHCl3).
C13H14O6的元素分析，計算值C，58.64；H，5.30。
實測值，C，58.78；H，5.34、實施例7制備(-)-(2S，4S)-1-[2-(苯甲?；?-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]胞嘧啶(9)和(+)-(2S，4R)-1-[2-(苯甲酰氧基)-1，3-二氧戊環(huán)-4基]胞嘧啶(10)在氮環(huán)境下，將N4-乙?；奏?1.24g，7.52mmol)在無水二氯甲烷(20ml)，六甲基二硅氮烷(15ml)和硫酸銨(cat.量)中的混物合回流4小時。將得到的澄清溶液冷卻至室溫。向該甲硅烷基化的乙酰胞嘧啶中加入(8)(1.0g，3.76mmol)在無水二氯乙烷(10ml)和TMSOTf(1.46ml，7.55mmol)中的溶液。加入飽和NaHCO3(10ml)并將混合物再攪拌15分鐘，然而通過硅藻土板過濾。將濾液蒸發(fā)并將固體溶解在EtoAc中，并用水和鹽水洗滌，干燥，過濾并蒸發(fā)，得到粗品產(chǎn)物。將該粗品在二氧化硅柱(5％CH3OH/CHCl3)上純化，得到(9)純α，β混合物(0.40g，30％)及(13)和(14)的α，β混合物(0.48g，40％)。為了分離，將(14)的混合物再乙?；ㄟ^長的二氧化硅柱(3％CH3OH/CHCl3)分離合并的α，β混合物，得到(9)(0.414g，30.7％)和(10)(0.481g，35.6％)的泡沫狀物。將這些泡沫狀物與CH3OH一起研制，得到白色固體。9UV(CH3OH)λmax298nm；元素分析(C17H17N3O8)C，H，N。10UV(CH3OH)λmax298nm。
實施例8制備(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶(11)在室溫下，將(9)(0.29g，0.82％)在CH3OH/NH3(50ml，在0℃下飽和)中的溶液攪拌10小時。將溶劑蒸發(fā)并將粗品在制備型二氧化硅板上(20％CH3OH/CHCl3)純化，得到油狀物。將該油狀物在CH2Cl2/己烷中結(jié)晶，得到(11)(0.136g，77.7％)的白色固體。UVλmax278.0nm(ε11967)(PH2)，270.0nm(ε774)(PH7)，269.0nm(ε8379)(PH11)；元素分析(C8H11N3O4)C，H，N。
II.藥用組合物通過單獨或與其它已知抗癌劑或藥物一起給予有效量的(-)-OddC或其衍生物或可藥用鹽，及可有可無的藥用載體或稀釋劑，可以治療患腫瘤，尤其是人，馬，犬，牛和其它動物，尤其是哺乳動物的癌癥。該治療方法也可以與其它常規(guī)癌癥治療方法如放射性治療或外科手術(shù)聯(lián)合使用。
這些化合物可通過任何適宜的途徑給予，例如，通過口服，非腸道，靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下或表皮，以液體，霜，凝膠，或固體形式或氣霧劑形式給藥。
以足夠釋放出對病人所患疾病治療效有效量而不給治療病人帶來嚴重毒副作用的量的活性化合物包含在可藥用載體或稀釋劑中。就本文所提到的所有疾病而言，優(yōu)選的化合物劑量為每天每公斤體重受試者大約10ng-300mg，優(yōu)選01-100mg，通常更優(yōu)選0.5-25mg。典型的局部給藥劑量為0.01-3％wt/wt(在適宜的載體中)。
通常，以適宜的單位劑量形式給予化合物，所述劑量形式包括但不限制于每單位劑量形式含1-3000mg，優(yōu)選5-500mg活性組分?？诜┝恳话銥?5-250mg。
優(yōu)選地，給予活性組分來獲得活性化合物的峰血漿濃度，其值大約為0.00001-30mM，優(yōu)選大約為0.1-30μm。例如，這可以通過靜脈注射活性組分的溶液或制劑，可有可無的鹽水或水性溶媒，或者可以通過給予活性組分的藥團來獲得。
藥物組合物中的活性化合物的濃度將依賴于藥物的吸收，分布，滅活和排泄速率以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。已發(fā)現(xiàn)，劑量值也隨著疾病嚴重程度的減輕而改變。進一步應(yīng)該知道，就任何特定的治療對象而言，特定的劑量方案應(yīng)該根據(jù)個體需要和具體的療程或監(jiān)督給予組合物的人的職業(yè)判斷，隨時間變化進行調(diào)節(jié)，并且本文所提出的濃度范圍僅作為實例說明并不限定所公開組合物的范圍或應(yīng)用?；钚越M分可以一次給予，或者可以分成許多較小的劑量，在不同間隔的時間給予。
口服組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以包封在明膠膠囊中或壓成片劑。為了口服給藥治療，可以將活性化合物或其前體藥物衍生物與賦形劑混合并以片劑，錠劑或膠囊劑的形式使用。也可以包含在藥學(xué)上可配伍的粘合劑和/或佐劑物質(zhì)，作為組合物中的一部分。
片劑，丸劑，膠囊劑，錠劑等等可以包含任何下列組分或性質(zhì)類似的化合物粘合劑如微晶纖維素，西黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；分散劑如藻酸，Primogel，或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；潤滑劑(glidant)如膠態(tài)二氧化硅；增甜劑如蔗糖或糖精；或矯味劑如薄荷，水楊酸甲酯或橙子矯味劑。當劑量單位形式為膠囊劑時，除上述種類的物質(zhì)外，它可以包含液體載體如脂油。另外，劑量單位形式可以包含各種其它能夠改變劑量單位物理形態(tài)的物質(zhì)，例如糖，紫膠，或腸包衣劑。
活性化合物或其可藥用鹽可以以酏劑，懸浮劑，糖漿劑，糯米紙囊劑，口香糖等組分的形式給予。除上述活性化合物外，糖漿劑可包含增甜劑蔗糖和某些防腐劑，染料和著色劑以及矯味劑。
也可以將活性化合物或其可藥用鹽與其它不削弱所需作用的活性物質(zhì)，或與補充所需作用的物質(zhì)，如其它抗癌藥，抗生素，抗真菌藥，消炎藥，或抗病毒化合物混合。
用于非腸道，真皮內(nèi)，皮下或局部給藥的溶液或懸浮液可包含下列組分滅菌的稀釋劑如注射用水，鹽水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽，枸椽酸鹽或磷酸鹽和調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。非腸道給藥的制劑可包封在由玻璃或塑料制成的安瓿，可處理注射器或多劑量小瓶中。
如果通過靜脈注射給藥，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。
在一個實例中，將活性化合物與保護化合物以防快速從體內(nèi)消除的載體一起配制成制劑，如控釋制劑，包括植入物和微膠囊包封的釋放系統(tǒng)。可以使用可生物降解的，生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸(Polyglyeolic acid)，膠原蛋白，聚原酸酯，和聚乳酸。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，制備這些制劑的方法是明顯的。
脂質(zhì)體懸浮液也可以是藥用載體。這些可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如，在美國專利4,522,811中所描述的方法(本文全文引入供參考)制備。例如，可以通過將適宜的脂類(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰膽堿，花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰膽堿，和膽固醇)溶解在無機溶劑中，然后將溶劑蒸發(fā)，在容器表面上留下所需脂類的薄膜來制備脂質(zhì)體制劑。將活性化合物的水溶液加入到該容器中。用于將容器旋轉(zhuǎn)起來，由此將脂類物質(zhì)從容器壁上游離下來并將脂類聚集體分散，形成脂質(zhì)體懸浮液。
III.生物活性大量的生物測定法已被應(yīng)用，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員利用這些生物測定法來測定化合物的抗癌活性。這些方法中的任一方法都可用于評估本文所公開的化合物的活性。
一種常用的測定活性的方法是利用國家癌癥協(xié)會(“NCI”)試驗小組的癌細胞系。這些試驗可在體外評估特定化合物的抗癌活性并提供體內(nèi)應(yīng)用試驗化合物時的預(yù)測數(shù)據(jù)。其它測定包括體內(nèi)評估化合物對植入或移植到裸鼠上的人或鼠腫瘤細胞的作用。測定(-)-OddC在體內(nèi)抗P388白血病細胞系和C38結(jié)腸癌細胞系的抗癌活性。實施例9和10提供試驗詳細內(nèi)容和這些試驗的結(jié)果。
實施例9利用(-)-O-ddc體內(nèi)處理白血病P388細胞將106個白血病P388細胞植入由Southern Research Institute，Alabama獲得的BDF1鼠的腹膜內(nèi)(iP)。腫瘤細胞植入后第一天開始，每天兩次腹膜內(nèi)給予(-)-OddC，共5天。通過使用該方法，發(fā)現(xiàn)75mg/kg的劑量對受試鼠來說是有毒性的。
圖3和表1顯示這些研究的結(jié)果。在圖3中，(●)代表對照組(未治療的動物)的數(shù)據(jù)，(--△--)代表以25mg/kg劑量，每天兩次給藥鼠的存活率，并且(○)代表以50mg/kg劑量，每天一次給予(-)-OddC鼠的存活率。在用(-)-OddC，以25mg/kg劑量治療的六只鼠中，有一只長期生存者，并且其余五只鼠的壽命增加103％。
表1
接種物在0天時，將106個P388細胞接種到每只鼠的腹膜內(nèi)。
a在第1-5天時，每天兩次治療b在對照組以上增加的壽命百分數(shù)c存活者的壽命等于或大于45天實施例10 用(-)-OddC體內(nèi)處理結(jié)腸38腫瘤細胞將結(jié)腸38腫瘤細胞植入BDF1鼠的皮下。將(-)-OddC以25mg/kg的劑量，每天兩次給予受試鼠，共5天。如圖2所示，結(jié)腸腫瘤細胞的生長受到抑制。在圖2中，(●)代表對照組動物的數(shù)據(jù)，并且(▲)代表用(-)-OddC治療鼠的數(shù)據(jù)。
實施例11 (-)-OddC的體外試驗在NCI’S癌癥檢查方案中評估(-)-OddC。該試驗測定在各種(-)-OddC濃度下，(-)-OddC對各種癌細胞系的抑制作用。在表2中闡述了試驗用細胞系。
表2也提供濃度值，在該濃度下，觀察試驗用細胞系中GI50和TGI。GI50，TGI和LC50是代表濃度的數(shù)值，在該濃度下，下文所定義的PG(生長抑制百分數(shù))分別為+50，0和-50。這些數(shù)值可通過內(nèi)插法，由每個細胞系的劑量反應(yīng)曲線確定，所述曲線是由PG對(-)-OddC濃度的對數(shù)(log10)來繪制的。
PG是測得的(-)-OddC對細胞系的作用并且可按照下列兩式中的一個計算如果(平均OD試驗-平均ODto)≥0，那么PG＝100×(平均OD試驗-平均ODto)/(平均OD對照-平均ODto)如果(平均OD試驗-平均ODto)＜0，那么PG＝100×(平均OD試驗-平均ODto)/(平均ODto)其中平均ODto＝在將細胞暴露到試驗化合物前測得的SRB產(chǎn)生顏色的光學(xué)密度平均值。
平均OD試驗＝在將細胞暴露到試驗化合物后48小時測得的SRB產(chǎn)生顏色的光學(xué)密度平均值。
平均OD對照＝在未將細胞暴露到試驗化合物后48小時測得的SRB產(chǎn)生顏色的光學(xué)密度平均值。
在表2中，前兩列描述的是類型(例如白血病)和用(-)-OddC處理的細胞系(例如CCRF-CEM)。第3列指示log10GI50并且第4列指示log10TGT。如果不能通過插入法得到這些反應(yīng)參數(shù)，那么每個反應(yīng)參數(shù)值都是最高的試驗濃度并且位于“＞”符號前。例如，如果在給予某特定細胞系的(-)-OddC所有濃度下，所有的PG都超過+50，那么該參數(shù)不能通過插入法獲得。
表2
圖4是顯示(-)-OddC對特定細胞系相對選擇性的圖。向右伸展以條形圖代表該細胞系對(-)-OddC的敏感性超過所有試驗細胞系的平均敏感性。因為條形圖的刻度是對數(shù)值，所以條形圖右側(cè)2個單位是指該細胞系顯示GI50時所需化合物的濃度為全部細胞系所需平均濃度的百分之一，因此，通常該細胞系是對(-)-OddC敏感的。相應(yīng)地，向左伸展的條形圖表示其敏感性低于平均值。從表2中，可以很容易地確定這些細胞系，其濃度對數(shù)值(log10)在“＞”的前面。
由圖4中可見，每種類型的試驗癌細胞中至少有一個細胞系是對(-)-OddC敏感的。某些前列腺癌細胞系，白血病細胞系和結(jié)腸癌細胞系表現(xiàn)出對(-)-OddC特別敏感。
實施例12 比較(-)-OddC和AraC如本發(fā)明先有技術(shù)中所討論的，胞嘧啶阿拉伯糖苷(也稱阿糖胞苷，arac)是用于治療急性脊髓細胞性白血病的脫氧胞苷的核苷類似物。它也具有抗急性淋巴細胞性白血病的活性，并且很少用于治療慢性髓細胞樣白血病和非何杰金淋巴瘤。araC的主要作用是抑制核DNA合成。比較(-)-OddC和Arac對腫瘤細胞的毒性是重要的。
將對數(shù)生長期的細胞以5000個細胞/ml/孔的密度放在24-孔板中。將藥物以不同劑量加到細胞中并將培養(yǎng)基保持培養(yǎng)三代的時間。然后進行亞甲藍測定和/或直接計數(shù)細胞數(shù)目。亞甲藍是染料，它以化學(xué)計量方式與存活細胞的蛋白質(zhì)結(jié)合并且可用于間接估測細胞數(shù)(Finlay，1984)。通過插入法測定IC50值。所顯示的每個值都是5個試驗的平均值±標準差，其中每個數(shù)據(jù)點都重復(fù)兩次。
在全部試驗的腫瘤細胞系中，(-)-OddC的細胞毒性較Arac大。在KB鼻咽癌細胞系中和在兩種前列腺癌系DU-145和PC-3中，(-)-OddC明顯比AraC更有效。HepG2細胞來源于肝細胞癌并且2.2.15系來源于HepG2細胞，其中HepG2細胞是由復(fù)制的肝炎B病毒基因組轉(zhuǎn)染的。CEM細胞來源于急性成淋巴細胞性白血病。由(-)-OddC脫氨基形成的化合物(-)-OddU在任何試驗細胞系中都是無毒的。酶研究表明，與AraC不同，AraC因其對脫氨基的敏感性，臨床功效大大減小，而(-)-OddC不是脫氨酶的底物。
已確定，(-)-OddC可以在體內(nèi)磷酸化成單-，二-和三-磷酸核苷酸。這表明，(-)-OddC在磷酸化形式下表現(xiàn)細胞毒性，因為不能使化合物磷酸化的細胞對該化合物是不敏感的。第一個磷酸化酶是人脫氧胞苷激酶。體外酶研究表明，(-)-OddC可以通過該酶磷酸化。
與AraC不同，(-)-OddC不能通過胞苷脫氨酶脫氨基。在固體腫瘤組織中含胞苷脫氨酶可能是在固體腫瘤中缺乏AraC活性的關(guān)鍵因素。這可能部分地說明為什么(-)-OddC在抗裸鼠中HepG2細胞時是活性的，而AraC是無活性的。也解釋了為什么(-)-OddC具有與arac不同的抗腫瘤活性譜。因此，在胃腸道中存在胞苷脫氨酶在arac不能口服攝入中發(fā)揮重要作用。
(-)-OddC的生化研究AraC，(-)-OddC and(-)-OddU的體外細胞毒性
實施例12 體內(nèi)研究3-6周大NCr裸鼠(Taconic免疫缺陷鼠)的每個肋腹皮下植入2×106個HepG2或DU-145細胞并讓腫瘤生長。當腫瘤為100-250mg時開始治療，其中腫瘤的大小通過兩腳規(guī)測定并按照下式計算腫瘤重量(mg)＝長(mm)×寬(mm2)÷2在0-4天，按指定劑量給予藥物，每隔幾天測定一次腫瘤大小。如Bell等人在Cancer(phila)362437-2440(1975)中所述繪制腫瘤生長曲線，并在圖5(a)和5(b)中說明。
通過體重的改變來評估毒性。
盡管Arac的體外毒性與(L)-OddC類似，但在該動物模型中，Arac是無效的。腫瘤提取物的酶分析表明，這并非由于增加dCD活性或減小dCK活性，而可能是肝臟中大量Arac代謝，導(dǎo)致dCD水平增高的結(jié)果。與Arac不同，(L)-OddC在HepG2和DU-145異種移植物中是有效的。腹膜內(nèi)或口服給藥治療HepG2腫瘤后，通過計算得知其凈細胞殺傷數(shù)(log10)分別為0.67和0.87。DU-145腫瘤的大小變小，到第15天時，腫瘤消退一半。在最后一次治療后大約25天，腫瘤再次出現(xiàn)，而在第47天后，其生長再次停止。在第60天，將動物處死，并取出腫瘤。腫瘤顯示壞死的形態(tài)，幾乎沒有細胞能夠?qū)㈠F蟲藍排除在外。另外，在該組織中不能檢測到酶的活性。由動物的重量減小可見所給予的Arac和(L)-OddC劑量的毒性是相同的，并且最初的毒性試驗表明，25mg/kg，每天兩次可能是連續(xù)5天治療的最大耐受劑量。以間歇的方式給藥可能是優(yōu)選的給藥方式。
本文所顯示的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，(L)-OddC具有明顯的抗癌活性并且在很多方面可能優(yōu)越于目前常用的脫氧胞苷類似物。它不僅是第一個已顯示具有抗癌活性的L-核苷類似物，而且也是第一個能夠抑制腫瘤生長的，理想的鏈終止劑。盡管其非天然立體化學(xué)不能抑制(L)-OddC被代謝酶激活或被并入DNA中，但它可能是保護該化合物不被dCD降解的因素。(L)-OddC也是在通常對核苷類似物治療無反應(yīng)的固體腫瘤中唯一具有活性的化合物。通常用于臨床評估固體腫瘤治療的藥物2’，2’-二氟脫氧胞苷(gemcitibine)仍然容易受到dCD(16)的滅活。由于dCD水平升高的機理是細胞對dcyd類似物如AraC(17)具有抵抗力，因此，(L)-OddC可用于治療已對這些藥物無反應(yīng)的病人。
IV.在低聚核苷酸和反意義技術(shù)中應(yīng)用(-)-OddC通常，反意義技術(shù)是指通過某種方法來調(diào)節(jié)基因表達，其中，將合成的低聚核苷酸雜交到互補核酸序列來抑制轉(zhuǎn)錄或復(fù)制(如果靶序列為DNA)，抑制翻譯(如果靶序列為RNA)或抑制加工(如果靶序列為前-RNA)。利用該技術(shù)可調(diào)節(jié)各種細胞活性。簡單的實例為通過反意義低聚核苷酸與mRNA的結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)的生物合成。在另一實例中，將合成的低聚核苷酸雜交到在雙股DNA中的特定基因序列上，形成抑制該基因序列表達的三股配合物(三股螺旋)。反意義低聚核苷酸也可用于通過抑制天然阻遏物的生物合成來間接激活基因表達或通過還原轉(zhuǎn)錄末端來直接激活基因表達。反意義低聚核苷酸治療(AOT)可用于抑制致病基因的表達，其中所述致病基因包括那些與良性或惡性腫瘤細胞無限制生長有關(guān)的基因或那些與病毒，包括HIV和HPV復(fù)制有關(guān)的基團。
低聚核苷酸抗核酸酶的穩(wěn)定性是體內(nèi)應(yīng)用的重要因素。已知3’-核酸外切酶的活性可導(dǎo)致血清中大多數(shù)未修飾反意義低聚核苷酸的降解。Vlassov，V.V.，Yakubov，L.A.，“反意義核酸治療癌癥和AIDS的前景”，1991，243-266，Wiley-Liss，Inc.，New York；Nucleic Acid Res.1993，21，145。
在低聚核苷酸的3’-末端，用(-)-OddC或其衍生物取代該核苷酸可以使低聚核苷酸穩(wěn)定，以抵抗由3’-核酸外切酶引起的降解?；蛘呋蛄硗?，可以用(-)-OddC或其衍生物來取代體內(nèi)核苷酸來抑制由核酸內(nèi)切酶引起的低聚核苷酸的降解。
根據(jù)本公開，本領(lǐng)域任一普通技術(shù)人員都可利用(-)-OddC或其衍生物來使大量低聚核苷酸穩(wěn)定，以抵抗由外切酶或內(nèi)切酶引起的降解，其中所述低聚核苷酸包括在反意義低聚核苷酸治療中所使用的核苷酸。所有這些實例都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。實施例13提供的是利用(-)-OddC來抑制3’-核酸外切酶活性的一個非限定性實例。
實施例13 由(-)-OddC來抑制3’-核酸外切酶活性通過序列凝膠測定法來測定來自人H9(淋巴細胞性白血病的T型細胞)的人胞質(zhì)核酸外切酶活性。簡單地說，用具有下列序列20或23個堿的DNA引物來制備3’-終端底物3’-CAATTTTGAATTTCCTTAACTGCC-5’24 1在由HIV-1RT催化的標準初始反應(yīng)(standing start reaction)中，將引物在5’-端用[γ-32p]ATP標記，然后退火到互補RNA模板上并在3’-端用dTTP(20mer)dCTP(23mer)或(-)-OddC CTP(23ml)終止。在這些條件下，用dTMP(A)終止20mer，用dCMP(B)或(-)-OddCCMP(C)終止23mer。這些信號股DNA底物用于測定其對胞質(zhì)中核酸外切酶的敏感性。在10μl含50mM Tris-Hct，pH8.0，1mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白，0.18μci/ml 3’-終端底物和2μl核酸外切酶(0.03單位)的反應(yīng)物中進行測定。將反應(yīng)物在37℃下孵育指定時間并通過加入4μl 98％甲酰胺，10mM EDTA和0.025％溴酚藍終止。讓樣品在100℃下變性5分鐘，然后在冰上迅速冷卻。將未反應(yīng)的物質(zhì)和反應(yīng)產(chǎn)物在15％聚丙烯酰胺/尿素序列凝膠上分離并通過放射性自顯影儀顯影。在3’-端具有(-)-OddC的低聚核苷酸對3’-核酸外切酶的抵抗力至少比其它低聚核苷酸大5倍。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，根據(jù)前面詳細描述的本發(fā)明說明書，在治療癌癥過程中，修飾或改變本發(fā)明是顯而易見的事。這些修飾和改變應(yīng)屬于權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.下式化合物的β-L-對映體在制備用于治療宿主動物腫瘤的藥物中的用途， 其中R1和R2選自氫，酰基和C1-C18烷基，該對映體含至少為95％的β-L-對映體。
2.權(quán)利要求1的用途，其中R1和R2為氫。
3.權(quán)利要求1的用途，其中烷基選自甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，異丙基，異丁基，仲丁基，叔丁基和異戊基。
4.權(quán)利要求1的用途，其中?；鶠?C(O)R，其中R為C1-C5烷基，苯基或芐基。
5.權(quán)利要求1的用途，其中藥物適用于口服給藥。
6.權(quán)利要求1的用途，其中藥物適用于靜脈給藥。
7.權(quán)利要求1的用途，其中藥物適用于局部或透皮給藥。
8.權(quán)利要求1的用途，其中宿主動物為人。
9.權(quán)利要求1的用途，其中腫瘤是癌性的。
10.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為白血病。
11.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為結(jié)腸癌。
12.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為膀胱癌。
13.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為肝細胞癌。
14.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為乳腺癌。
15.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為肺癌。
16.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為鼻咽癌。
17.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為胰腺癌。
18.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為卵巢癌。
19.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為淋巴瘤。
20.權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤為前列腺癌。
21.權(quán)利要求1的用途，其中所述化合物為(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋的混合物，及其可藥用衍生物和鹽。
22.利用(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其可藥用衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，及其可藥用衍生物和鹽來制備用于治療包括癌性腫瘤的腫瘤的藥物。
23.利用(-)-(2S，4S)-1-(2-羥甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)胞嘧啶及其可藥用衍生物和鹽，或其(+)-對映體或外消旋混合物，及其可藥用衍生物和鹽來制備用于治療異?；虿恍枰募毎鲋车乃幬?。
全文摘要
本發(fā)明涉及具下式的化合物及其可藥用鹽在制備用于治療宿主動物癌癥的藥物中的用途，其中R選自H，F(xiàn)，Cl，－CH
文檔編號A61K31/513GK1827108SQ20061005499
公開日2006年9月6日 申請日期1995年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月6日
發(fā)明者C·K·楚, Y-C·陳 申請人:佐治亞州大學(xué)研究基金會, 耶魯大學(xué)