本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種阿糖胞苷兩親性小分子前藥及其制備方法和應用，還涉及阿糖胞苷兩親性小分子前藥口服制劑的制備與評價。

背景技術(shù)：

白血病是一類起源于造血(或淋巴)干細胞的惡性疾病。阿糖胞苷(cytarabine,ara-c)作為急性粒細胞白血病的主要治療藥物，臨床應用已有超過四十年的歷史。作為一種嘧啶類抗代謝藥，阿糖胞苷可在體內(nèi)經(jīng)磷酸激酶活化轉(zhuǎn)變成三磷酸阿糖胞苷(ara-ctp)，插入到腫瘤細胞dna中，同時對dna多聚酶有強大的抑制作用，阻斷dna的合成；并抑制核苷酸還原酶阻止胞嘧啶核苷酸還原為脫氧胞嘧啶核苷酸，影響dna的復制導致細胞死亡，由于對細胞s增殖期有特異性抑制作用，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用對實體瘤也有良好的治療效果。但阿糖胞苷由于分子結(jié)構(gòu)中的五元糖環(huán)，導致其分子極性大，透膜性差，體內(nèi)生物利用度低；同時嘧啶環(huán)上的4位nh2極易被胃腸道及肝中的脫氨酶代謝失活，口服吸收少，故臨床上無口服制劑。阿糖胞苷靜脈注射后迅速轉(zhuǎn)化為無活性的阿糖尿嘧啶，半衰期僅為3-15min，為達到有效治療濃度，臨床上用藥時多采取靜脈滴注、多次靜脈注射或皮下注射等治療手段，但這樣易產(chǎn)生耐藥性，且病人順應性差。

不同研究者利用阿糖胞苷分子結(jié)構(gòu)中的氨基和羥基進行?；?、醚化等化學修飾并合成了一些新的阿糖胞苷衍生物，從而改善其藥物活性及化學穩(wěn)定性，較大地提高了阿糖胞苷的生物利用度。目前阿糖胞苷衍生物的合成研究主要是對阿糖胞苷的胞嘧啶環(huán)上的4位氨基和阿拉伯糖上的5’位伯羥基進行?；揎?，包括n-?；甚０泛蚾-酰化生成酯，從而導入脂肪族或芳香族?；鶊F，獲得的阿糖胞苷衍生物可以改善其藥物活性及化學穩(wěn)定性，較大地提高阿糖胞苷的生物利用度。

近年來兩親性小分子前藥逐漸成為人們研究熱點，根據(jù)藥物分子結(jié)構(gòu)、水溶性、藥物代謝方面所存在的缺陷，將藥物與極性不同的小分子材料共價鍵合形成兩親性的前藥分子，改善藥物的應用，其優(yōu)勢明顯，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)前藥分子具有適宜的脂溶性和膜透過性，有利于在體內(nèi)轉(zhuǎn)運，提高體內(nèi)生物利用度；(2)內(nèi)在的兩親性可使前藥分子在水中自組裝成納米聚集結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)藥物的自遞送；(3)藥物分子本身參與載體形成，極大提高載藥量的同時還可減少惰性材料的使用而產(chǎn)生的毒副作用；(4)化學鍵連接與聚集結(jié)構(gòu)的形成使藥物緩釋作用更加明顯。

發(fā)明人前期也對阿糖胞苷兩親性小分子前藥進行了研究，短鏈前藥(正己酸-阿糖胞苷，ha-ara)可形成納米粒，但是其用于靜脈注射給藥時緩釋效果不明顯；長鏈前藥(油酸-阿糖胞苷，oa-ara；月桂酸-阿糖胞苷，la-ara)可形成納米螺旋或納米纖維結(jié)構(gòu)，適用于口服給藥。但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)目前研究前藥口服給藥劑型制備過程繁瑣，生產(chǎn)成本高。例如oa-ara需要在長時間(60min)探頭超聲作用下才能形成納米螺旋結(jié)構(gòu)，并且需要牛血清白蛋白(bsa)作為穩(wěn)定劑，處方復雜；而la-ara在水中沉淀離心后需要在超聲條件下多次水洗再分散成納米混懸液后才可應用形成口服制劑；此外，oa-ara和la-ara兩種前藥分子形成的納米口服混懸液濃度較低(最高達1mg/ml)，不利于臨床應用的推廣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

結(jié)合發(fā)明人前期研究和上述問題，本發(fā)明選擇針對阿糖胞苷兩親性小分子前藥以及前藥口服制劑進行研究，尤其是兩親性小分子結(jié)構(gòu)特性以及阿糖胞苷兩親性小分子前藥作為整體的口服制劑制備特性進行研究，最終形成了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的之一在于合成一種新型阿糖胞苷兩親性小分子前藥(pa-ara)，在增強緩釋效果、提高生物利用度的同時，克服前期研究(阿糖胞苷兩親性小分子前藥)技術(shù)的不足，獲得便于簡單快速制備出前藥口服制劑的前藥分子。

為實現(xiàn)該目的，具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明公開了一種新型阿糖胞苷兩親性小分子前藥(pa-ara)，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

其次，本發(fā)明公開了上述阿糖胞苷兩親性小分子前藥(pa-ara)的制備方法，其制備方法為：

阿糖胞苷與棕櫚酸催化反應，棕櫚酸與阿糖胞苷以酰胺鍵結(jié)合，實現(xiàn)對阿糖胞苷4位氨基的化學修飾。

所述催化反應可以為酶促催化或化學催化。

優(yōu)選的，所述催化反應為化學催化。

優(yōu)選的，阿糖胞苷與棕櫚酸催化反應過程為：棕櫚酸，在加入三乙胺和氯甲酸乙酯條件下，與阿糖胞苷反應，生成上述阿糖胞苷兩親性小分子前藥(pa-ara)。

具體的反應步驟包括：(1)一定量的棕櫚酸溶于無水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入三乙胺和氯甲酸乙酯，惰性氣體保護、冰浴條件下反應；

(2)將一定量阿糖胞苷溶于無水dmf中，加入步驟(1)所述反應溶液中，制備獲得上述阿糖胞苷兩親性小分子前藥(pa-ara)。

所述棕櫚酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩爾比為8-12:10-12:10-12:10-15；優(yōu)選為棕櫚酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩爾比為10:11:11:12。

優(yōu)選的實施方案中，在步驟(2)之后還包括阿糖胞苷兩親性小分子前藥純化的步驟(3)。

具體的，純化的步驟(3)為：減壓旋蒸除去反應溶劑無水dmf，真空干燥，得到粗產(chǎn)物；將粗產(chǎn)物溶于乙酸乙酯中，硅膠柱色譜提純，二氯甲烷和甲醇梯度洗脫(100:1-30:1)，得到pa-ara純品為白色固體。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種阿糖胞苷兩親性小分子前藥pa-ara口服制劑及其制備方法。該口服制劑可通過簡單快速的方法制備獲得，并且穩(wěn)定性良好，易于保存，同時具備更優(yōu)異的體內(nèi)口服效果。

為實現(xiàn)該目的，具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明公開了一種阿糖胞苷兩親性小分子前藥pa-ara口服制劑的制備方法，包括：將pa-ara前藥溶于甲醇中，攪拌條件下倒入水中，利用前藥分子兩親性自發(fā)形成pa-ara前藥納米聚集體(混懸液)；將形成的混懸液離心，棄去上清，干燥得到白色塊狀納米聚集體口服制劑。

優(yōu)選的實施方案中，甲醇：水的體積比為1:50-200；更優(yōu)選的，甲醇：水的體積比為1:100。

優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明口服制劑可形成口服混懸液濃度可達5-10mg/ml。

優(yōu)選的實施方案中，干燥方式包括但不限于真空干燥。

其次，上述制備方法得到的阿糖胞苷兩親性小分子前藥pa-ara口服制劑也是本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的目的之三在于提供上述阿糖胞苷兩親性小分子前藥pa-ara及其口服制劑的用途。具體的，該目的涉及的技術(shù)方案包括：

上述阿糖胞苷兩親性小分子前藥pa-ara及其口服制劑在制備抗癌抗腫瘤藥物中的用途，阿糖胞苷兩親性小分子前藥pa-ara可以用于治療或緩解某一組織或器官的癌癥，癌癥包括但不限于白血病、固體瘤、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、腎癌等。

所述抗腫瘤應用包括了pa-ara及其口服制劑在抗腫瘤化療的用途以及pa-ara及其口服制劑與其他化療藥物聯(lián)合在抗腫瘤化療中的用途?？梢月?lián)合應用的抗腫瘤藥物包括但不限于烷化劑、植物生物堿類、抗菌抗腫瘤磺酰胺類藥物、鉑類藥物、抗代謝類或其他的抗癌藥物。

本發(fā)明取得了以下有益效果：

(1)本發(fā)明首次合成ara-c兩親性前藥分子pa-ara，前藥分子不僅解決了ara-c極性大，膜透過性差，在體內(nèi)易被代謝失活等缺點，還可在水中自組裝形成結(jié)構(gòu)均一的納米螺旋聚集體。

(2)本發(fā)明可以通過簡便快速的方法將pa-ara制備成納米聚集體口服制劑，不僅經(jīng)濟實用，還可批量生產(chǎn)，口服制劑更易于保存與運輸，為工業(yè)生產(chǎn)提供可能。

(3)pa-ara納米聚集體口服制劑毒性低，安全性好，服用方便，口服生物利用度良好，生物利用度能達到靜脈注射組的57％，為實現(xiàn)阿糖胞苷口服給藥提供可能。

附圖說明

圖1pa-ara前藥的核磁圖譜

圖2pa-ara聚集體形態(tài)tem圖

圖3pa-ara聚集體口服后血藥濃度曲線，ara-civ靜脈注射阿糖胞苷生理鹽水溶液(檢測阿糖胞苷)，pa-arapo(ara-c)灌胃給藥pa-ara納米聚集體(檢測ara-c)，pa-arapo(pa-ara)灌胃給藥pa-ara納米聚集體(檢測pa-ara)

具體實施方式

結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明，以下實例僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。如果實例中未注明的實驗具體條件，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑公司所推薦的條件；下述實施例中所用的試劑、耗材等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1pa-ara前藥分子合成

分析天平精密稱取一定量的棕櫚酸，溶于無水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)并置于雙頸瓶中，攪拌條件下加入三乙胺和氯甲酸乙酯，氮氣保護、冰浴條件下反應20min。稱取一定量阿糖胞苷溶于5ml溫熱的無水dmf中，攪拌條件下緩慢滴入上述反應溶液，其中摩爾量為棕櫚酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷＝10:11:11:12，反應恢復至室溫并在氮氣保護條件下繼續(xù)反應72h，利用薄層板監(jiān)測反應進程。反應結(jié)束后，減壓旋蒸除去無水dmf，真空干燥過夜，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于乙酸乙酯中，少許柱層層析硅膠拌樣，硅膠柱色譜提純，二氯甲烷和甲醇梯度洗脫(100:1-30:1)，得到pa-ara純品為白色固體，產(chǎn)率為64.3％。

實施例2核磁共振氫譜(¹h-nmr)鑒定pa-ara前藥化學結(jié)構(gòu)

稱取pa-ara前藥約5mg，氘代二甲亞砜(dmso-d6)溶解并置于核磁管內(nèi)，采用400mhz核磁共振氫譜測定其核磁共振氫譜圖，以四甲基硅烷為內(nèi)標物，記錄化合物的化學位移值(ppm)。結(jié)果如圖1所示，核磁結(jié)果可以證實，新合成的分子中阿糖胞苷和棕櫚酸的摩爾比值接近1:1，同時酰胺鍵上h的特征峰的出現(xiàn)，證明酰胺鍵的合成。通過¹h-nmr譜圖可以證實pa-ara前藥的成功合成。

實施例3pa-ara前藥口服制劑制備

精密稱取pa-ara前藥分子約20mg，溶于0.1ml甲醇中，攪拌條件下倒入100倍體積的水中，納米聚集體自發(fā)形成，將混懸液離心，棄去上清，真空干燥得到白色塊狀納米聚集體口服制劑。

本發(fā)明的納米聚集體口服制劑經(jīng)測算和實驗，其形成口服混懸液濃度可達10mg/ml，高于發(fā)明人前期研究的oa-ara和la-ara兩種前藥分子形成的納米口服制劑混懸液濃度。

實施例4pa-ara納米聚集體形態(tài)觀察

取少量干燥后的納米聚集體于1.5mlep管中，加200μl蒸餾水混懸。吸取20μl納米聚集體混懸液滴于碳膜銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余液體，紅外燈照射下干燥后置于透射電鏡下觀察pa-ara納米聚集體形態(tài)。電鏡照片如圖2，結(jié)果顯示pa-ara可在水中聚集成長度約為1μm的納米螺旋聚集體結(jié)構(gòu)，形態(tài)均勻，分散性良好，聚集體尺度適用于口服。相較于前期的oa-ara納米螺旋聚集體，pa-ara螺旋聚集體制備過程中不需要探頭超聲及穩(wěn)定劑的輔助，制備過程更為簡單快捷。

實施例5pa-ara納米聚集體口服體內(nèi)藥動學研究

取健康wistar大鼠12只，體重約為(200±5)g，隨機分為3組，每組4只。給藥前禁食12h，自由飲水。其中a組尾靜脈注射阿糖胞苷生理鹽水溶液(10mg/kg)，b組灌胃給藥阿糖胞苷生理鹽水溶液(10mg/kg)，c組灌胃給藥pa-ara納米聚集體(含阿糖胞苷10mg/kg)。三組實驗動物分別于給藥后0.25h，0.5h，1h，1.5h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h，60h，72h于頸靜脈竇取血0.5ml。將血樣置于肝素鈉(10％wt)潤洗后的離心管中，4000r·min^-1離心15min，吸取上層血漿，于-20℃保存待測。

采用液質(zhì)聯(lián)用(hplc-ms/ms,agilent1260lc)測定血樣中阿糖胞苷和pa-ara的濃度。

血漿樣品的處理辦法：向200μl血漿樣品中加入200μl內(nèi)標溶液(阿昔洛韋，800ng/ml)，再加入400μl乙腈進行沉淀蛋白，渦旋1min，11000rpm離心5min，取上清5μl進行l(wèi)c/ms/ms分析。

大鼠血漿中ara-c和pa-ara分析方法的建立：

1.色譜條件

色譜柱：thermoc18(150×4.6mm)，5μm粒徑；預柱：c18保護柱(4×3.0mm)。流動相a(水，0.2％甲酸)；流動相b(甲醇)。

流動相梯度洗脫條件：0-2min(30％b)，2-4min(30％b→90％b)，4-10min(90％b)，10-12min(85％b)。流速：0.6ml/min，進樣量5μl，柱溫：25℃。

2.質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(esi)；噴霧電壓(is)：5500v；溫度(tem)：650℃；掃描方式：多反應監(jiān)測(mrm)，正離子掃描；霧化氣(gas1):60psi；輔助氣：(gas2)：60psi；噴撞氣(cad)：6psi；氣簾氣(cur)：15psi。定量分析離子對：ara-c：m/z244→112，阿昔洛韋(內(nèi)標)：m/z226→152，pa-ara：m/z481→349。

大鼠體內(nèi)藥代動力學實驗結(jié)果如圖3和表1所示，結(jié)果表明，pa-ara聚集體口服制劑進入體內(nèi)后，可有效轉(zhuǎn)化成阿糖胞苷原料藥，且與靜脈注射組相同給藥劑量時，藥物緩釋效果更加明顯，血漿半衰期延長，生物利用度能達到靜脈注射組的57％。

一般情況下，口服制劑毒性小，安全性好，給藥劑量可適當提高；而靜脈注射組由于給藥劑量過大，導致實驗動物在給藥8h后全部死亡，體現(xiàn)其高劑量下藥物毒性大，安全性差等缺點。由此，我們得出結(jié)論，pa-ara聚集體口服制劑可在體內(nèi)緩慢釋放阿糖胞苷原料藥，延長藥物消除半衰期，口服生物利用度良好，且毒性小，安全性更好。

表1pa-ara聚集體口服后藥動參數(shù)

本發(fā)明首次合成ara-c兩親性前藥分子pa-ara，前藥分子不僅解決了ara-c極性大，膜透過性差，在體內(nèi)易被代謝失活等缺點，還可在水中自組裝形成結(jié)構(gòu)均一的納米螺旋聚集體。通過簡便快速的方法將pa-ara制備成納米聚集體固體口服制劑，不僅經(jīng)濟實用，還可批量生產(chǎn)，固體制劑更易于保存與運輸，為工業(yè)生產(chǎn)提供可能。pa-ara聚集體口服制劑毒性低，安全性好，服用方便，口服生物利用度良好，為實現(xiàn)ara-c口服給藥提供可能。