專利名稱：：繡球菌mh-3菌株的提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種繡球菌MH-3菌株(SpamssisCrispa)NIBHFERMP-17221的提取物；此外，本發(fā)明還涉及該繡球菌MH-3菌株提取物的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：以往有很多利用自然界野生的或栽培的各種菌類，提取各種活性成分，并制成功能性食品、飲料以及藥品。目前各種菌菇中提取生物活性物質(zhì)的技術(shù)雖然已經(jīng)成熟，但由于菌種眾多，成分極其復雜，很難弄清楚它們各自的生物活性。多年來，人們對菌菇多糖的免疫活性及抗腫瘤作用進行了大量的研究和探索。迄今為止，已開發(fā)了不少菌菇多糖制品，如姬菇、舞茸、靈芝等，且獲得了一定的社會效益和經(jīng)濟效益。但自然界存在的菌種無數(shù)，且菌中含有的成分也非常復雜，仍有很多活性物質(zhì)沒有被發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)是否也有相同或更強的生物活性仍需探索。繡球菌現(xiàn)確認世界上存在1科1屬2種，目前日本只有一個屬，分布于從北海道到關(guān)東地區(qū)的高山地帶，它是一種非常珍稀名貴的食藥用菌，夏秋季單生至群生，生于云杉、冷杉或松林的地上或樹根上，菌柄基部如根狀，與樹根相連。繡球菌是極其少有的一類蘑菇，其口感很好，但生長緩慢，人工栽培困難。明確繡球菌的基本特性，及如何充分利用它仍值得探討，特別是研究開發(fā)繡球菌中的有效生物活性物質(zhì)是一個廣闊而深遠的課題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種繡球菌MH-3菌株的提取物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供上述繡球菌MH-3菌株提取物的制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供上述繡球菌MH-3菌株的提取物在制備食品、飲料及保健品中的應用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供上述繡球菌MH-3菌株提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種繡球菌MH-3菌株(SparassisCrispa)NIBHFERMP-17221的提取物，其以葡聚糖為主要成分，尤以P-1，3-葡聚糖為活性成分。本發(fā)明使用的微生物一繡球菌MH-3菌株是屬于繡球菌屬的菌種，其已于1999年2月17日在日本工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(簡稱NIBH)保藏，保藏登記號為FE固P-17221。將含有落葉松樹屑、小碎片或其混合物隔水加熱，除去熱水可溶成分后，加入營養(yǎng)成分，制成人工栽培用菌床，進行繡球菌的人工培養(yǎng)。按此方法，大約可在二個半月左右，得到本發(fā)明所需的繡球菌MH-3菌株。所述的繡球菌MH-3菌株具有以下微生物學特性l.生物學特性繡球菌MH-3菌株屬單孢子菌，其子實體的顏色呈白色至淡黃色，由一粗壯的柄上發(fā)出很多分枝，各枝密集成一球，形似繡球花。2.成分分析下表為繡球菌MH-3的成分分析表，是財團法人日本食品分析中心的分析結(jié)果，繡球菌MH-3株的干燥粉100g中的各種營養(yǎng)素的含量。(注:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.培養(yǎng)條件首先，混合香蕉粉6g、啤酒酵母45g、蛋白胨lg、鈣0.6g、氯化鎂0.5個、蜂蜜粉2g、小麥粉100g，其次加入含有20%水分的松樹木屑lkg，再加入1.5L水，攪拌混合之后消毒滅菌5個小時，形成培養(yǎng)基。繡球菌MH-3在培養(yǎng)基上生長的最適溫度為20-25°C，PH值為6.5，濕度為80%。本發(fā)明還提供所述的繡球菌MH-3菌株的提取物的制備方法，其采用熱堿水抽提法、冷堿水抽提法或熱水抽提法。該提取方法包括以下步驟最好預先將繡球菌MH-3菌株弄成小塊或粉末。另外，根據(jù)需要，可在抽提前先進行脫脂處理將繡球菌MH-3菌株浸泡于有機溶劑，或有機溶劑與水的混合液中，進行脫脂處理。優(yōu)選利用甲基氯仿等的鹵化碳化氫物質(zhì)、乙醇、水的混合液進行脫脂處理。使用溶媒得到繡球菌MH-3菌株的提取液。溶媒可以是水溶性的或非水溶性的，優(yōu)選水溶性溶媒。所述的水溶性溶媒指水或以水為主要成分的水溶性溶劑。例如，水、添加了堿或其他鹽基物質(zhì)的堿水、添加了乙醇等有機溶劑的水溶液、添加了酸或者酸性物質(zhì)的酸性水溶液。優(yōu)選水或者堿水。非水溶性溶劑，以二甲亞砜(DMS0)，二甲基甲酰胺(DMF)等有極性的有機溶媒最為常用。以水作為溶劑抽取時，以熱水較好，水的溫度采用8CTC至125。C為宜，控制在9(TC至12(TC更好。如使用堿水，一般使用0至2(TC左右的冷堿水，或者50至75。C左右的熱堿水。提取可分階段進行。在此過程中也可以采用不同的水性溶劑量。比如采用1)多次的熱水提取2)多次的堿水提取3)—次或者多次的熱水提取后，殘渣部分的進一步提取釆用一次或者多次堿水溶劑提取等提取方法。對水溶性溶媒的使用量，沒有特別的限定，一般根據(jù)繡球菌MH-3菌株的量，或者提取后的殘渣或沉淀物的重量、精制/洗凈后處理的難易度等來決定水溶性溶媒的用量。一般來說，水溶性溶媒的使用量是繡球菌MH-3菌株、或者沉淀物或提取殘渣重量的550倍。如采用堿水提取，可采用2~20%的NaOH、K0H等苛性堿，或者采用添加了等量的溶媒輔助劑、變性劑如110%的尿素的堿性溶液。實際提取處理過程中，可參照以下實施例，適當?shù)馗淖儾襟E或條件。根據(jù)本發(fā)明提取得到的提取物，主要成分是多糖葡聚糖。進一步詳細地說，本發(fā)明提取物以含有e-l，3-葡聚糖為特征。以下實施例中所介紹的葡聚糖，即為第6基的P-1，3-葡聚糖，分子量在200萬左右。葡聚糖，特別是3-1，3-葡聚糖在生物體內(nèi)的作用，近年來一直受到人們的關(guān)注。本發(fā)明的繡球菌MH-3菌株的提取物，其主要成分就是P-1，3-葡聚糖，因而提取液是極有價值的。3-1，3-葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)如下3-葡聚糖的生物活性測定評價體系如下.-體內(nèi)抗腫瘤作用(固體癌，腹水癌，純系動物模型)；癌轉(zhuǎn)移抑制作用(白血球減少癥模型)；防止感染作用；細胞動員、活性化作用(吞噬細胞、細胞因子)；白細胞機能增進作用(吞噬細胞、NK細胞)；抗體產(chǎn)生增強作用；細胞因子產(chǎn)生作用(血中、臟器中)；體外補體活性化作用，凝固酶的修飾作用，吞噬細胞的活化作用(游走、吞噬，細胞因子產(chǎn)生)；殺細胞因子的產(chǎn)生(無活性氧)；淋巴細胞的活化作用；血小板的活化作用；細胞因子的產(chǎn)生作用；受體解析，細胞內(nèi)信息傳達。人對e-葡聚糖的應答性(經(jīng)口服)人體血中難以檢出e-葡聚糖，除了深部真菌感染癥以外。但人體中可檢測到e-葡聚糖的抗體，可認為人體中可能曾經(jīng)感染過該生物活性物質(zhì)。經(jīng)口服用P-葡聚糖，可以引起體內(nèi)的免疫反應。本發(fā)明提供繡球菌MH-3菌株的提取物在制備食品、飲料及保健品中的應用。繡球菌MH-3菌株的提取物，通過添加普通添加劑作為組成成分，可以制成液體的、固體的、粉未狀等各種形態(tài)的食品、飲料及保健品。本發(fā)明還提供繡球菌MH-3菌株提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明繡球菌MH-3菌株的提取物，具有抗腫瘤活性，該提取物通過添加各種輔料，可以制成片劑、粉未、丸藥、液劑、注射劑等各種形態(tài)的藥物。圖1是繡球菌MH-3提取物的麗R光譜分析圖2是繡球菌MH-3提取物中的P-1，3-葡聚糖對小鼠末梢血中白細胞數(shù)量的影響示意圖一；圖3是繡球菌MH-3提取物中的P-1，3-葡聚糖對小鼠末梢血中白細胞數(shù)量的影響示意圖二。具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述實施例1將繡球菌MH-3菌株粉碎成粉未，配置三氯甲烷甲醇水二200:200:60的重量比混合液，在室溫下將上述粉碎的25g干燥粉未進行2天的脫脂處理。實施例2繼實施例l取得提取物(試驗樣本2)后，進行實施例2。將添加了5yo尿素的l(m的NaOH的堿水500ml(4度)，加入到實施例1所得到的殘渣中，進行2天的提取處理，得到提取物(試驗樣本3)。透析后，再進行乙醇沉淀、脫水，以及干燥處理后，得到4.93g的冷堿提取物B。實施例3繼實施例2得到取得提取物(試驗樣本3)后，進行實施例3。將添加了5%尿素的10%的NaOH的熱堿水500ml(65度)，加入到實施例2所得到的殘渣中，進行l(wèi)小時的提取處理，得到提取物(試驗樣本4)。透析后，再進行乙醇沉淀、脫水，以及干燥處理后，得到lg的熱堿提取物C。將脫脂處理后的固體物質(zhì)，進行空氣干燥，放入高壓釜中，加入500ml的熱水，進行2小時的熱水提取，得到提取物(試驗樣品1)。再將提取后的殘渣，放入高壓釜中，加入500ml的水，進一步進行2小時的熱水提取，得到提取物(試驗樣本2)。將熱水提取所得到的提取物(試驗樣本1及2)混合在一起，加入多量的乙醇(200ml)，以5000rpm離心5分鐘，使其沉淀，將沉淀物加入200ml的水中，通過分散機進行分解，再加入等量的乙醇(4ml)，得到纖維狀的沉淀物，及上層的清液。將沉淀物通過乙醇、丙酮處理后，進行脫水干燥，得到41mg的熱水提取物A-1。將上清液進行濃縮、冷凍干燥后，得到415mg的熱水提取物A-2。實施例4對實施例13所得的提取物的主要成分葡聚糖，進行成分分析。圖l顯示了將上述熱水提取物A-1及A-2，冷堿水提取物B，熱堿水提取物C溶于0.6mlDMS0-d中的C-NMR的光譜分析結(jié)果。在圖1中，SCHWElv表示熱水乙醇l倍提取、SCCA1表示冷堿水提取1、SCCA2表示冷堿水提取2、SCHA表示熱堿水提取。如圖1所示，在85ppm附近，有3根特征性的分裂，這就是第6基葡聚糖的特征。從上述分析可知，繡球菌MH-3提取物中的葡聚糖是P-1，3-葡聚糖(第6基)。以下通過試驗例對本發(fā)明的有益效果作進一步詳細的說明試驗例l小鼠抗癌試驗6周(體重30g)的雄性(ICR)小鼠體內(nèi)注射S-180腫瘤細胞(惡性180固形肝癌細胞，細胞濃度5xl07只)，對照組10只小鼠，試驗組120只小鼠，以IO只為一組進行試驗。對每個老鼠分別移植20、100、500mPg的腫瘤組織，分別在第7，9，ll天對小鼠進行腹腔注射不同濃度的提取物(實施例1-3的熱水提取物A-1，冷堿提取物B，以及熱堿提取物C)，然后在第35天觀察腫瘤生長情況，并測定小鼠腫瘤的大小和重量。結(jié)果如下表1所示，結(jié)果顯示繡球菌MH-3的提取物對小鼠固定皮下腫瘤有明顯的抑制作用。在熱提取4倍組和熱堿水提取組可達到100%。表1繡球菌MH-3提取液對腫瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>試驗例2設(shè)3個試驗組和1個對照組，各試驗組和對照組(control)均為10只小鼠，4個組共40只。對照組小鼠灌胃生理鹽水，試驗組小鼠分別灌胃50吆、10(￥g、200Pg繡球菌MH-3提取物中的e-l，3-葡聚糖。首先，灌胃抗癌劑一環(huán)磷酰胺(CY)200mg/kg，造成小鼠的白細胞減少，然后再灌胃P-1，3-葡聚糖，觀察末梢血中白細胞數(shù)量。如圖2所示，與對照組相比各試驗組的白細胞明顯增加，本試驗證明了3-1，3-葡聚糖不經(jīng)過消化管的吸收，也可在消化管內(nèi)根據(jù)免疫反應，增強其免疫效果。并且e-l,3-葡聚糖對抗癌劑造成的白細胞減少現(xiàn)象有明顯的改善效果。試驗例3試驗分為三個組，實驗對象為雄性小白鼠，各組10只。如圖3所示，對照(生理鹽水)組、抗癌劑CY(Cyclophosphamide,環(huán)磷酰胺)組和CY+CA(環(huán)磷酰胺+繡球菌MH-3菌株的提取物)組，ip表示對小鼠釆用腹腔注射。對照組，注射生理鹽水；給小鼠注射200mg/KgCY，作為副作用小鼠的白細胞將開始減少CY組，小鼠注射200mg/Kg的CY之后，第二天開始出現(xiàn)白細胞的減少，第7天白細胞又開始回升；注射CY+CA組，第5天開始白細胞有所增加，第10天開始白細胞的增加趨于穩(wěn)定，第21天接近對照組的值。此結(jié)果表明繡球菌MH-3菌株的提取物能改善抗癌劑引起的白細胞減少現(xiàn)象。試驗例4臨床醫(yī)學試驗對14例癌癥患者進行NK細胞擴增療法并口服繡球菌腿-3株的干燥粉末(每日300mg/人)，用于治療各種癌癥患者的效果見表2(吉田醫(yī)院施行)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>其中，PR代表明顯改善(腫瘤縮小、血中癌抗原減少或正常)，CR代表完全治愈(腫瘤消失、血檢指標正常)，NC代表無變化(腫瘤大小和血中癌抗原無變化)。繡球菌粉末是在對病人進行自身細胞NK細胞擴增療法后進行，NK細胞擴增療法是用患者自取NK細胞，經(jīng)體外擴增后，再輸回患者體內(nèi)的一種免疫療法。如表2所示，14例癌癥患者進行NK細胞擴增療法并口服繡球菌MH-3后，對癌癥的治療效果明顯。權(quán)利要求1、一種繡球菌MH-3菌株(SparassisCrispa)NIBHFERMP-17221的提取物，其特征在于，其以葡聚糖為主要成分。2、如權(quán)利要求1所述的繡球菌MH-3菌株的提取物，其特征在于，所述的葡聚糖為e-1，3-葡聚糖。3、一種權(quán)利要求l或2所述的繡球菌MH-3菌株的提取物的制備方法，其特征在于，采用熱堿水抽提法、冷堿水抽提法或熱水抽提法。4、一種權(quán)利要求1或2所述的繡球菌MH-3菌株的提取物在制備食品、飲料及保健品中的應用。5、一種權(quán)利要求1或2所述的繡球菌MH-3菌株的提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種繡球菌MH-3菌株(SparassisCrispa)NIBHFERMP-17221的提取物，其以β-1，3-葡聚糖為主要成分。本發(fā)明還公開了該繡球菌MH-3菌株提取物的制備方法。此外，本發(fā)明還公開了該繡球菌MH-3菌株的提取物在制備食品、飲料及保健品中的應用以及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。文檔編號A61P35/00GK101112396SQ20061010852公開日2008年1月30日申請日期2006年7月24日優(yōu)先權(quán)日2006年7月24日發(fā)明者中島三博申請人:中島三博